Эффективность методов выявления возбудителя ящура и антител в продуктах убоя и патологическом материале

Никифоров, Виктор Викторович

Диссертации по ветеринарии → Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Эффективность методов выявления возбудителя ящура и антител в продуктах убоя и патологическом материале

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Никифоров, Виктор Викторович Владимир 2006 г.

Ученая степень: кандидата ветеринарных наук

ВАК РФ: 16.00.03

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Эффективность методов выявления возбудителя ящура и антител в продуктах убоя и патологическом материале

На правах рукописи

НИКИФОРОВ Виктор Викторович

ЭФФЕКТИВНОСТЬ МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЯЩУРА И АНТИТЕЛ В ПРОДУКТАХ УБОЯ И ПАТОЛОГИЧЕСКОМ

МАТЕРИАЛЕ

16.00.03 "Ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологней и иммунология"

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Владимир - 2006

Чч

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Научный руководитель-доктор ветеринарных наук,

старший научный сотрудник ЗАХАРОВ Валерий Михайлович

Официальные оппоненты - доктор ветеринарных наук

ДИЕВ Вячеслав Иванович (ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир); - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник МУРТАЗИН Иджал Файзирахмановнч (ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов», г. Москва).

Ведущая организация: Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии», г. Покров.

Защита диссертации состоится «19 » 2006 г. в 10 часов на заседании

диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, п. Юрьевец. С диссертацией можно ознакомится в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Автореферат разослан «» 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук ^¿/^¿£¿¿¿¿2./ Г-^Л- Семенова

Ш1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Успех организационных мер борьбы с ящуром во многом зависит от знания условий выживаемости вируса в продуктах убоя или в патологическом материале павших и вынужденно убитых животных, времени нахождения вируса в крови и тканях животных в различные стадии болезни. Кроме того, немаловажное значение имеет наличие и сохраняемость вируса у вакцинированных животных, контактировавших с больными.

Импортируемые продукты убоя животных, как правило, поступают в реализацию в замороженном состоянии, и если животное было убито в период болезни или вирусоносительства, то вирус ящура может сохраняться в органах и тканях в течение длительного времени и представлять эпизоотическую опасность (Московская область, 1995г.; Гонконг, 2005г.).

С 2000 года в лабораторию ящура и везикулярных болезней для исследования на наличие вируса ящура или его антигена поступило более 1000 проб мясопродуктов (свинины и говядины), импортируемых в Россию в виде полутуш, субпродуктов, мяса на костях, шейки, ребер, мяса в блоках из стран, неблагополучных по ящуру. Одним из экспортеров мяса в Россию является Монголия, с 2000 года неблагополучная по ящуру типа О.

Ранее проблемой индикации вируса ящура в продуктах убоя животных занимался ряд исследователей. В частности, С.А. Цветковой (1972) был предложен метод биопробы на культуре клеток, основным недостатком которого является длительность получения конечного результата. При ретроспективной диагностике Л.Б. Мезвришвили (1988) была использована непрямая реакция иммунофлюоресценции для выявления постинфекционных антител в тканях и органах животных. Кроме того, хтя проведения индикации антигена вируса ящура в органах и тканях Т.В. Тюриной (1994) был предложен метод флюоресцентных зондов, требующий последующей идентификации инфекционного агента в реакции нейтрализации.

В настоящее время при лабораторной диагностике ящура в объектах ветеринарного надзора наибольшее признание получили т

нкзн> н ая

библиотека С.-Петербург

ОЭ 200&ктЛз%2

быстрая и высокоч\ вствительная полимеразная цепная реакция (ПНР), и.ммуноферментный анализ (ИФА), позволяющие проводить прямую индикацию и специфическую идентификацию вирусного агента, реакция мнкронейтрализацин (РМН) (В.М. Захаров, Ж.А. Шажко, Т.А. Фомина, 2002; Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals O.I.E., 2004).

Таким образом, изучение эффективности различных методов, позволяющих проводить индикацию и идентификацию возбудителя ящура в продуктах убоя и патологическом материале животных, а также изучение иммунобиологических свойств штаммов, циркулирующих в последнее время в неблагополучных по ящуру странах, остается актуальной и насущной проблемой в диагностике заболевания.

Цели н задачи исследований. Целью нашей работы явилась разработка схемы исследований для прямой индикации возбудителя яшура и противояшурных антител в продуктах убоя и патологическом материале от зараженных ящуром животных методами, которые позволили бы использовать наиболее вероятные с точки зрения обнаружения возбудителя ткани и органы и проводить диагностику в минимальные сроки.

Для выполнения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- испытать различные методы очистки и концентрирования суспензии патологического материала для осуществления прямой индикации и специфической идентификации антигена вируса ящура в ИФА после экспериментального заражения животных;

- изучить возможность обнаружения генома вируса ящура в ПЦР в пробах тканей и органов и сравнить с прямой индикацей антигена в ИФА и внрусовыделением в культуре клеток;

- провести сравнительные исследования продуктов убоя до и после их созревания:

- исследовать продукты убоя после заражения животных эпизоотическим штаммом вируса яшура типа О Ха 1964/Монголия/2004 и изучить его свойства:

- изучить возможность обнаружения противояшурных антител в продуктах убоя с помощью ИФА и РМН;

- исследовать продукты убоя, полученные от вакцинированных и затем зараженных ящуром животных, которые могут являться вирусоносителями:

- изучить и сравнить возможность обнаружения вирусного генома прямой индикацией антигена вируса ящура и противоящурных антител в пишеводно-глоточной жидкости (ПГЖ).

Научная новизна. Проведены исследования по обнаружению генома вируса ящура в продуктах убоя с помощью ПЦР.

Разработана схема очистки и концентрирования суспензии патологического материала для прямой индикации антигена вируса яшура.

Осуществлена прямая индикация и специфическая идентификация антигена вируса яшура в тканях животных методом ИФА без предварительной инокуляции чувствительных биосистем.

Проведены сравнительные исследования по обнаружению вирусного генома в ПЦР и антигена в ИФА в продуктах убоя до и после "созревания".

Представлена возможность выявления специфических противояшурных антител в продуктах убоя животных с применением ИФА и РМН.

Изучена возможность обнаружения возбудителя яшура и антител в продуктах убоя после экспериментального заражения вакцинированных животных.

Проведено исследование продуктов убоя в ПЦР, ИФА и РМН на разных стадиях заболевания, после экспериментального заражения животных эпизоотическим штаммом вируса ящура типа О №1964/Монголия/2004, и изучены его иммунобиологические свойства.

Проведена сравнительная оценка возможности обнаружения генома вируса ящура в ПЦР, антигена в ИФА и антител в ИФА и РМН в различных органах и тканях на разных стадиях заболевания после экспериментального заражения.

Установлена возможность обнаружения вирусного генома, прямой индикацией антигена вируса яшура и противояшурных антител в ПГЖ.

Практическая значимость работы. Полученные результаты исследований использованы при подготовке следующих документов:

- "Методические указания по отбору, консервированию и транспортировке проб патологического материала и продуктов убоя для лабораторной диагностики ящура", утвержденные директором ФГУ "ВНИИЗЖ" 29.09.2005 г.;

- "Методические указания по исследованию продуктов убоя животных при подозрении на ящур", утвержденные директором ФГУ "ВНИИЗЖ" 02.062005 г,

- штамм вируса ящура типа О № 1964/Монголия/2004 депонирован в ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандаргазашга лекарственных средств для животных и кормов» (2004г.).

- проект "Правил профилактики и ликвидации ящура животных", который находится на рассмотрении в МСХ РФ;

- проект "Программы совместных действий государств- участию» СНГ по профилактике и борьбе с ящуром в государствах Содружества" (20062008гг.), который находится на рассмотрении в Россельхознадзоре МСХ РФ.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены и опубликованы в сборнике Международной научной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных», посвященной 45-летяю ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2003г.; Международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г.Владимир, 2004г.; также докладывались на заседании Межправительственного совета по сотрудничеству в области ветеринарии СНГ (Республика Узбекистан) в 2006г. и на ученых советах ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 2001-2005 гг.

Публикация научпых работ. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

Основные положепия, выносимые на защиту:

усовершенствованные методы очистки и концентрирования вируссодержащих суспензий из проб патологического материала;

- способы прямой индикации антигена вируса яшура в продуктах убоя животных;

- методы исследования продуктов убоя для обнаружения генома вируса ящура;

- обоснование наиболее вероятных органов и тканей зараженных ящуром животных для обнаружения возбудителя при лабораторной диагностике ящура;

- иммунобиологические свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа О №1964/Монголия/2004;

- определение противоящурных антител в тканях и органах животных методами ИФА и РМН;

- исследование пищеводно-глоточной жидкости с применением ПЦР, ИФА и РМН.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 147 страницах, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, содержит 26 таблиц, 12 рисунков и 3 приложения. Список литературы включает 237 наименований, из которых 122 отечественных и 115 иностранных.

2. Собственные исследования

Материалы и методы. Для экспериментального заражения животных были использовали штаммы вируса ящура АУИран/96, 0№1964/Монголия/2004, 01№194/Волгоградский/58, OiManisa/Турция, С1.№564/Закарпатский/72, Азия-1 Иран 58/99.

Опыты проводили в ФГУ «ВНИИЗЖ», на крупном рогатом скоте (КРС) 10 -12 - месячного возраста и свиньях в возрасте 4-5 месяцев, которых получали из хозяйств, благополучных по инфекционным заболеваниям.

Для постановки биопробы применяли мышат-сосунов в возрасте 4-7 дней. Вирусовыделение проводили на первичных и перевиваемых линиях культур клеток (KK'i СП, ПСГК-30, IB-RS-2 и ВНК-21. При культивировании

клеток и наработке вирусов применяли среду Игла и ГЛА на растворах Эрла или Хенкса с добавлением антибиотиков в рабочих концентрациях.

Подготовка материала к исследованию. В качестве материала для исследований отбирали органы и ткани животных, экспериментально зараженных вирусом ящура 10% суспензией афтозного материала, которую вводили в слизистую оболочку языка КРС и в область венчика у свиней в количестве 10 тыс. ИД5о/0,1мл. Для заражения использовали вакцинированных и невакцинированных животных. Заражение КРС проводили на 21 день после противоящурной вакцинации цельной дозой, 1/4 дозы и 1/8 дозы препарата. У КРС и свиней после убоя отбирали слизистую оболочку глотки и пищевода, слизистую оболочку языка, поверхностные шейные, надколенные, подколенные, портальные, заглоточные лимфоузлы, мышцы спины и бедра, костный мозг, подкожный жир, надпочечники, поджелудочную железу, легкие, миндалины. У КРС также отбирали подчелюстные лимфоузлы и кровь.

Патологоанатомическое исследование животных проводили совместно с доктором ветеринарных наук, профессором ФГУ«ВНИИЗЖ» А.М. Рахмановым.

Пишеводно-глоточную жидкость (111 Ж) отбирали через 1, 5 и 8 суток после заражения животных.

Различные продукты убоя отбирали через 1, 4, 5 и 8 суток после экспериментального заражения при убое вакцинированных и невакцинированных животных.

Испытуемый материал подвергали очистке путем добавления фреона-113 в количестве 20% от общего объема или хлороформа - 8% от общего объема. Дня микрофильтрации использовали мембраны МФАС-П-4, МФАС-П-3, МФАС-П-2. МФАС-П-1 ("ВЛАДИПОР") с размером пор от 0,05 до 4,5мкм.

Концентрирование вируссодержащей суспензии проводили следующими методами: осаждением полиэтиленгликолем М-6000 (ПЭГ); ультрафильтрацией через мембраны производства "ВЛАДИПОР", марок УАМ-300П, УАМ-500П, УАМ-ЮООП; мембраны производства "ЗАЛТОМШ", марки У^асеН 100; мембраны АМ1СОЫ и фильтры ГММЕЯБШЬЕ СХ-30

производства"М1ИЛРОЯЕ" с номинальной отсекаемой молекулярной массой 50000-65000 D.

Специфический антиген вируса ящура выявляли в ИФА после концентрирования 10% суспензии проб тканей и органов ультрафильтрацией. Противояшурные антитела определяли в ИФА и РМН в 33% суспензии патматериала, очищенной фреоном-113. Для выделения РНК из продуктов убоя использовали 10% суспензии ткани без предварительной очистки. Образцы исследуемой пишеводно-глоточной жидкости перед исследованием в ПНР разбавляли STE-буфером 1:1. Для исследования в ИФА и РМН проводилась предварительная очистка фреоном 113.

Иммунохимические реакции, применяемые в работе. При постановке РСК для определения антигенного родства изолятов вируса ящура использовали схему РСК по 100% гемолизу с перекрестным титрованием штаммоспецифических сывороток с гомологичными и гетерологичными антигенами.

Выявление антигена вируса ящура проводили в непрямом двойном сэндвич-варианте ИФА с помощью диагностического набора, выпускаемого ФГУ «ВНИИЗЖ», согласно «Временному наставлению по выявлению антигена вируса ящура в пробах материала иммуноферментным анализом», утвержденному Департаментом ветеринарии МСХ РФ 22.04.02 г.

Обнаружение специфических противоящурных антител к вирусу яи(ура проводили в жидкофазном блокирующем сэндвич-варианте ИФА с помощью диагностического набора, выпускаемого ФГУ «ВНИИЗЖ», согласно «Наставлению по применению набора для определения противоящурных антител в сыворотках крови сельскохозяйственных животных иммуноферментным анализом», утвержденному Департаментом ветеринарии МСХ РФ 03.02.04 г.

Для определения постинфекционных противоящурных антител к неструктурным полипротеинам вируса ящура использовали наборы для определения антител к неструктурным полипротеинам вируса ящура в ИФА

фирм "Cedi-Diagnostics B.Y." (Нидерланды) и "Bommelli Diagnostics" (Швейцария).

Реакцию микронейтрализации (РМН) ставили на панелях фирмы "Costar" микрометодом согласно "Методическим указаниям по выявлению и идентификации штаммов вируса яшура", утвержденным Департаментом ветеринарии МСХ РФ 10.11.02 г.

Выделение вируса ящура проводили в сформированном монослое первичных и перевиваемых культур клеток в пенициллиновых флаконах или матрасах объемом 50 мл. Учет реакции проводили по цитопатическому действию вируса (ЦПД) каждые 24 часа при общей длительности клльтивирования 72 часа. Культуральную суспензию исследовали в ИФА на активность и специфичность. ЦПД считали специфичным при выявлении антигена вируса ящура определенного типа.

Постановка ПЦР. Выяатение фрагментов генома вируса яшура в пробах продуктов убоя и ПГЖ проводили с использованием полимеразной цепной реакции после обратной транскрипции РНК вируса яшура. При постановке ПЦР р\ ководствовались "Методическими указаниями по индикации генома вируса ящура с помощью полимеразной цепной реакции на основе амплификации консервативной области 3D гена", утвержденными Департаментом ветеринарии МСХ РФ 21.02.1997 г. ПЦР с последующим нуклеотидным секвенированием эпизоотического штамма вируса ящура О №1964/Монголия/2004 проводили с кандидатом биологических наук ФГУ «ВНИИЗЖ» A.B. Щербаковым.

3. Результаты собственных исследований

Отбор проб патологического материала и продуктов убоя. При обследовании туш с неотделенными головами отбирали пробы костного мозга, лимфатических узлов туши и отдельных органов, миндалин и надпочечников, легких, подкожного жира, слизистой оболочки глотки и пищевода, а также языка.

При исследовании полутуш КРС и свиней брали пробы мышц вместе с соединительной и жировой тканью, трубчатую кость, а также подколенные,

седалищные, надколенные, поверхностные шейные, глубокие паховые, подвздошные, поясничные, почечные, межреберные, грудные лимфатические узлы. От павших и вынужденно убитых животных отбирали лимфоузлы, костный мозг, подкожный жир, надпочечники, легкие и миндалины, слизистые оболочки заглоточной области и языка.

Подготовка проб для осуществления прямой индикации антигена вируса яшура в ИФА. При изучении эффективности методов очистки пробы патматериала отбирали через 4 суток после экспериментального заражения КРС вирусом яшура.

Для очистки 10% суспензии патматериала нами был использован хлороформ и фреон-113. Затем материал подвергли ультрафильтрации через фильтры УАМ-ЗООП. Полученные концентраты исследовали в ИФА на наличие антигена вируса ящура.

Наилучшие результаты были получены после очистки фреоном-113, т. к. при применении последнего антиген вируса яшура выявляли в диагностическом титре в 21 пробе патматериала из 27 исследуемых, а после очистки хлороформом только в 9, что говорит о преимуществе данного метода очистки тканевой суспензии. Это объясняется тем, что при очистке фреоном в суспензии тканей и органов разрушается комплекс "антиген+антитело".

Для изучения эффективности методов концентрирования использовали культуральный вирус ящура О^г 194 с титром инфекционности 7,25 1§ТДД;,у'мл. Вируссодержащую суспензию разводили 1:100, 1:1000 и 1:10000 и затем концентрировали в 100 раз указанными выше методами. Полученные концентрированные пробы культурального вируса исследовали в ИФА на наличие специфического антигена вируса ящура.

Из результатов опыта следует, что в разведении вируссодержащей суспензии (ВС) 1:100 и 1:1000 антиген вируса яшура выявлен в максимальных титрах при концентрировании ВС через фильтры марки УАМ-ЗООП, УЬгасеН 100, АМ1СОЫ, ГММЕКБГОЬЕ СХ-30. При осаждении ПЭГ антиген вируса яшура выявлен только в разведении 1:100. В разведении вируссодержащей суспензии 1:10000 антиген не выявлен.

В результате было установлено, что концентрирование вируссодержашей суспензии ультрафильтрацией более эффективно, чем остальными испытуемыми методами. Однако при концентрировании ультрафильтрацией тканевой суспензии недостатком является затрата большого количества времени (6-10 часов) по причине наличия в суспензии балластных белков даже после обработки фреоном-113. Данную проблему удалось решить путем дополнительного осветления тканевой суспензии микрофильтрашей с использованием мембран МФАС-П-4, МФАС-П-3, МФАС-П-2, МФАС-П-1, после дополнительной обработки фреоном-113, и тем самым сократить временные затраты на проведение ультрафильтрации до 30-90 минут. Наибольшее количество проб (6 проб в течение 90 минут) за одинаковый промежуток времени концентрировали с помощью фильтров Vivacell 100.

Таким образом, удалось провести прямую индикацию антигена вируса ящура в продуктах убоя животных без инокуляции культуры клеток СП и в наименее продолжительное время.

Обнаружение возбудителя в различных тканях и органах с применением ПЦР. Для обнаружения возбудителя с помощью ПЦР в максимальном количестве различных органов и тканей исследованию подвергли продукты убоя крупного рогатого скота, полученные через 4 суток после экспериментального заражения вирусом ящура OiManisa в слизистую оболочку языка.

Отобранные пробы были заморожены при минус 20°С в течение 1 часа после убоя и хранились при данной температуре до проведения исследований.

Результаты исследования продуктов убоя КРС, полученных через 4 суток после заражения, свидетельствуют о том, что геном вируса ящура обнаруживали в пробах слизистой оболочки глотки и пищевода, языка, лимфоузлов, поджелудочной железы, легких н миндалин. В пробах крови, мышц и надпочечников возбудитель ящура был не выявлен.

Сравнительные исследования продуктов убоя до и после "созревания". Для изучения возможности выявления генома вируса ящура в ПЦР, антигена в ИФА и вирусовыделения з культуре клеток СП, в продуктах убоя КРС до и

после их "созревания", исследовали пробы, полученные через 4 суток после заражения животных ящуром, замороженные при минус 20°С в течение 1 часа после убоя и пробы после выдерживания при температуре 2-4°С, в течение 24 часов (созревание).

Полученные результаты исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1

Результаты исследования продуктов убоя КРС до и после "созревания", полученных через 4 суток после заражения вирусом яшура

п=3

Патологический материал КРС Обнаружение генома в ПЦР Выявление антигена в ИФА Выделение вируса вККСП

X = ~ 3 с. (ч О и после созревания до созревания после сочрснация до созревания после созревания

Слизистая оболочка глотки и пищевода + + + + + +

Слизистая оболочка языка + + + - + +

Лимфоузлы + + + - + +

Кровь - - - - - -

Мышцы - - - - - -

Костный мозг н/и * н/и + + + +

Подкожный жир н/и н/и + + + +

Надпочечники - - - - - -

Поджелудочная железа - - - - + -

Легкие + + + + + +

Миндалины + + + + + +

Примечание: + положительно; - отрицательно; * не исследовано

При исследовании проб патматериала, замороженных при минус 20°С в течение 1 часа после убоя и после выдерживания при температуре 2 -4°С, количество положительных проб снизилось в ПЦР с 30 до 27, в культуре клеток с 39 до 27, в ИФА с 36 проб до 21, по сравнению с данными, полученными при исследовании проб, замороженных непосредственно после убоя.

В число положительных проб, полученных как при исследовании замороженного материала в течение одного часа после убоя, так и после его созревания, входили пробы лимфоузлов, костного мозга, подкожного жира, слизистых оболочек заглоточной области и языка, миндалин и легких.

Это объяснимо тем, что костный мозг защищен костной тканью, а лимфоузлы - капсулой, которые предохраняют их от смены рН в кислую сторону инактивации и разрушения вируса ящура. В подкожном жире при отсутствии мышечных волокон рН также не меняется. Выявление возбудителя ящура после созревания в слизистой оболочке заглоточной области и языка, миндалинах и легких следует связать с эпителиотропностью вируса, и как следствие этого, его максимальную репродукцию и наличие в данных тканях.

Исследование продуктов убоя после экспериментального заражения животных вирусом ящура типа О №1964/Монголия/2004 С целью обнаружения вируса ящура, его антигена и вирусного генома в продуктах убоя в различные сроки после экспериментального заражения отбирали патматериал от КРС после экспериментального заражения животных вирусом ящура 0№1964/Монголия/2004. По причине того, что Монголия, являющаяся одним из экспортеров мяса в Россию, с 2000 года неблагополучна по ящуру типа О, являлось также актуальным изучение иммунобиологических свойств данного

эпизоотического штамма.

Исследование свойств эпизоотического штамма вируса ящура типа 0.\°1964/Монголия/2004. В 2004 году в лаборатории ящура и везикулярных болезней ФГУ «ВНИИЗЖ» из поступившего афтозного материала, полученного на территории Монголии от больного крупного рогатого скота, был выделен вирус яшура типа О, и зарегистрирован под №1964/Монголия/2004.

Возникла необходимость изучить его антигенный спектр по данным РСК с др\ гими штаммами типа О. Результаты представлены в таблице 2.

Анализ результатов, приведенных в таблице 2, показывает, что штамм в1ф\ са яшура серологического типа 0№1964/Монголия/2004 отличается как от производственных 0,№194 и О,№1618 (11= 11%), так и от ранее выделенных в Монголии и Тайване эпизоотических штаммов вируса яшура типа О и имеет

наиболее близкое антигенное родство со штаммами, выделенными в Таджикистане в 2001-2002гг. (Я= 38 - 40%).

Таблица 2

Антигенный спектр вируса яшура О №1964 Монголия/2004

__по данным РСК ___

Сравниваемые штаммы Показатели

П г-

0,№194 0,02 0.65 11%

О,№1618 0,02 0.56 11%

О №1734/Приморский 0,02 | 0.53 10%

О/Гайвань 1/99 0,04 >1.0 20%

О № 1736/Грузия/2000 0,02 >1.0 14%

О/Вьетнам 21/99 0,02 >1.0 14%

О №1934/Монголия/2002 0,02 >1.0 14%

О № 1922/Таджикистан/2001 0,22 0.66 38%

О №1923/Таджикистан/2002 0,16 1.0 40%

При нуклеотидном секвенировании монгольских изолятов было установлено, что штамм вируса яшура типа 0№ 1964'Монголия/2004 резко отличается от предшественников (О/Монголия/173 5; О/Монголия/1759; О/Монголия/1934) и всех других штаммов, находящихся в коллекции лаборатории ящура и везикулярных болезней ФГУ «ВНИИЗЖ». Степень нуклеотидных различий последовательностей штамма вируса ящура типа 0№1964/Монголия/2004 и российского производственного штамма вируса ящура О) №194 составила 14,35%.

Исследование продуктов убоя в различные сроки после заражения. При заражении животных применяли вирус ящура 0№1964/Монголия/2004 в виде 10% суспензии афтозного материала, который вводили в слизистую оболочку языка КРС. Убой животных производили через 1, 5 и 8 суток после экспериментального заражения.

При исследовании продуктов убоя, полученных через 1 сутки после экспериментального заражения, возбудитель ящура обнаруживали с помощью ПЦР, ИФА и КК в пробах слизистой оболочки глотки и пищевода, слизистой оболочки языка, заглоточных лимфоузлов и миндалин, а также в пробах поверхностных шейных лимфоузлов и легких. В крови животных выделен

вирус в КК и обнаружен его геном в ПЦР, что связано со стадией виремии и возникновением температурной реакции у животного. При исследовании надколенных лимфоузлов, мышц спины и бедра, костного мозга, подкожного жира, надпочечников и поджелудочной железы нами был получен отрицательный результат.

Из результатов исследований продуктов убоя, полученных через 5 суток после экспериментального заражения, следует, что возбудитель ящура обнаружен в пробах слизистой оболочки глотки и пищевода, слизистой оболочки языка, во всех исследуемых лимфоузлах, легких и миндалинах животных всеми тремя методами. Кроме того, в пробах костного мозга и подкожного жира выделяли вирус ящура в КК и обнаруживали его антиген в ИФА. В пробах поджелудочной железы был выделен вирус и обнаружен вирусный геном в ПЦР. Отрицательный результат в ПЦР, ИФА и КК был получен при исследовании проб крови, надпочечников, мышц спины и бедра.

Из данных, полученных при исследовании продуктов убоя через 8 суток после экспериментального заражения, следует, что геном вируса ящура в ПЦР обнаруживали в пробах слизистой оболочки глотки и пищевода, слизистой оболочки языка, поверхностных шейных, подколенных, надколенных, портальных, заглоточных, подчелюстных лимфоузлов, надпочечников, легких и миндалин животных. Антиген вируса ящура в ИФА выявили только в пробах слизистой оболочки глотки и пищевода, языка, миндалин и легких животных. Вирус ящура в КК выделили в пробах слизистой оболочки глотки и пищевода, слизистой оболочки языка, подколенных, поверхностных шейных, надколенных, портальных, подчелюстных, заглоточных лимфоузлов, легких и миндалинах животных. Отрицательный результат получен при исследовании проб крови, мышц спины и бедра, костного мозга, подкожного жира и поджелудочной железы.

Таким образом, вирус ящура в КК и вирусный геном в ПЦР обнаруживали во все исследуемые сроки в пробах слизистой оболочки глотки и пищевода, слизистой оболочки языка, лимфоузлов, легких и миндалин, и ни одним из методов не удалось выявить возбудитель ящура в мышечной ткани.

Выявление противояшурных антител в органах и тканях вакцинированных и иевакцииированных животных после экспериментального заражения. Для изучения возможности выявления противояшурных антител в различных органах и тканях исследованию в ИФА и РМН подвергли пробы слизистой оболочки глотки и пищевода, языка, лимфоузлов, поджелудочной железы, мышц, костного мозга, надпочечников, легких, подкожного жира, полученные от КРС:

вакцинированного 1/4 дозы противояшурной вакцины и невакцинированных животных - через 4 суток после экспериментального заражения вирусом ящура типа 0|Manisa;

- вакцинированного цельной дозой и невакцинированного - через 5 суток после заражения вирусом ящура типа 0№1964/Монголия/2004;

- вакцинированного цельной дозой и 1/4 дозы и невакцинированных - через 8 суток после заражения вирусом ящура типа 0|Manisa.

На 21 день после вакцинации цельной дозой протпвоящурной вакцины титры специфических антител в сыворотке крови составляли от 6,5 до 7.5 log;, после вакцинации 1/4 дозы от 5 до 6,5 log?. У животных, вакцинированных цельной дозой, а затем контрольно зараженных вирулентным вирусом, в момент убоя наблюдалась местная форма проявления ящура, а у животных, привитых 1/4 дозы и невакцинированных - генерализованная форма яшура.

Через 4 суток после заражения антител к вирус}- ящура типа О не обнаружено как у вакцинированных, так и невакцинированных до заражения животных.

Через 5 суток после экспериментального заражения в пробах миндалин и слизистой оболочки глотки и пищевода от невакцинированных и вакцинированных животных обнаружены специфические противоящурные антитела типа О.

Специфические противоящурные антитела типа О выявлены в пробах слизистых оболочек заглоточной области, лимфоузлов, надпочечников, легких и миндалин, отобранных через 8 дней после заражения как от вакцинированных.

так и невакцинированных животных. При этом титр антител в обеих реакциях достигал 5,0-7,0 log;.

В сыворотке крови титр специфических антител через 4 суток после заражения составлял от 5 до 7 logi, через 5 суток после заражения от 5 до 10,5 iog:, а через 8 суток от 8 и выше 11 log;- Данные результаты косвенно указывают на то, что в пробах патматериала обнаружены постинфекционные противояшурные антитела.

Сравнение показателей обнаружения возбудителя яшура и протнвоящуриых антител. На рисунке 1 представлены результаты обнаружения вируса ящура в КК, его антигена в ИФА, вирусного генома в ПЦР и противоящурных антител в продуктах убоя животных, отобранных через 1, 4, 5, и 8 суток после экспериментального заражения.

80% 60% 40% 20% 0%

1 сут.

4сут.

5 сут.

8 сут.

- Геном в ПЦР

60,0%

66,6%

• Вирус в КК

56,6%

73,3%

63,3%

46,6%

Антиген в ИФА

33,3%

66,6%

53,3%

13,3%

- Антитела в ИФА и РМН 1

0,0%

12,5%

37,5%

Время после заражения

Рис. 1. Результаты обнаружения возбудителя яшура и антител в продуктах убоя в различные сроки после экспериментального заражения животных вирусом яшура

Как следует из рисунка 1, максимальная возможность обнаружения вируса яшура, его антигена и вирусной РНК наблюдается через 4 суток после экспериментального заражения.

Через 5 суток после экспериментального заражениия в продуктах убоя удалось выявить антитела (12,5%), а вероятность выделения вируса ящура и обнаружения его антигена снижается.

Через 8 суток наблюдается увеличение количества положительных на антитела проб (37,5%) и снижение возможности выделить вирус ящура и обнаружить его антиген.

Таким образом, при исследовании более 600 проб, в итоговом сравнении положительных результатов, полученных во время проведения опытов по исследованию продуктов убоя животных, установлено, что наиболее высокие и стабильные показатели наблюдались по обнаружению генома вируса ящура. Снижение возможности выявления антигена на 8 сутки после заражения животных вирусом ящура, вероятно, происходит по причине уменьшения концентрации вируса в органах и тканях за счет резкого увеличения титров специфических постинфекционных антител.

При сопоставлении результатов ПЦР и КК установлено, что доля положительных результатов как в ПЦР, так и в культуре клеток составляет 58,3% исследованных проб, отрицательных - 33,3%. Таким образом, результаты 91,6% исследуемых проб совпадают как в ПЦР, так и в культуре клеток.

Результаты исследований продуктов убоя от зараженных вирусом ящура животных с различным иммунным статусом. Для исследования продуктов убоя, полученных от животных с различным иммунным статусом, был отобран патматериал от бычков, экспериментально зараженных вирусом ящура типа С^Машза. Отбор материала производили через 4 и 8 суток после заражения контрольных (невакцинированных) животных, а также вакцинированного КРС цельной дозой, 1/4 и 1/8 дозы препарата.

В продуктах убоя животных вакцинированных цельной дозой препарата, в отличие от невакцинированных, существенно меньшее количество положительных проб в ПЦР, КК и ИФА.

Так, через 4 суток после заражения в ПЦР выявлено 73% положительных проб патматериала от неваюшнированного животного и 53% проб от вакцинированного цельной дозой. В культуре клеток обнаружено 76%

положительных проб от невакцинированного животного и 41% проб от вакцинированного, в ИФА 70% проб и 29% проб соответственно.

Через 8 суток после экспериментального заражения установлено в ПЦР 66.6% положительных проб от невакцинированного животного и 26,6% проб от вакцинированного цельной дозой препарата животного. В культуре клеток 47% положительных проб и 11,7% проб, в ИФА 17,6% и 0% проб соответственно.

При этом отмечено, что чем меньше доза введенной вакцины, тем выше была возможность обнаружения возбудителя ящура в продуктах убоя с помощью ПЦР, КК и ИФА. Это следует объяснить тем, что репликация вируса в организме зараженных животных блокируется поствакцинальными антителами и чем выше доза вакцины, тем более короткий период времени требуется для выработки антител и для нейтрализации вируса.

Независимо от дозы вакцины, геном вируса ящура в ПЦР у зараженных животных обнаружен в пробах слизистой оболочки глотки и пищевода, языка, заглоточных лимфоузлов и миндалин, а выделение вируса в ЮС наблюдалось в пробах слизистой оболочки глотки и пищевода и миндалин.

Индикация возбудителя в продуктах убоя свиней. Для изучения возможности обнаружения возбудителя ящура в продуктах убоя свиней был отобран патматериал через 4 и 8 сутки после экспериментального заражения животных вирусом ящура С1№564 в слизистую оболочку языка. Результаты исследования полученного материала в ПЦР, ИФА и культуре клеток суммированы в таблице 3.

Из результатов, представленных в таблице 3, следует, что через 4 суток после экспериментального заражения в период максимального развития клинических признаков заболевания при более яркой клинической картине, чем у КРС, возбудитель ящура обнаружен практически во всех исследуемых пробах (в ПЦР 83%, ИФА 73%, КК 80%), за исключением проб мышц и надпочечников.

Тем не менее, при исследовании тканей и органов свиней через 8 суток после заражения, в период угасания клинических признаков заболевания наолюдалось, что антиген вируса яшура в ИФА не обнаружен ни в одной из

исследуемых проб, хотя количество положительных результатов в ПИР и культуре клеток составляло 42%. что ниже, чем > КРС (66-46%).

Таблица 3

Обнаружение возбудителя яшура в продуктах убоя свиней через 4 и 8 суток после экспериментального заражения вирусом яшура типа С1 Л» 564

п=3

Патологический материал Обнаружение Выявление | Выделение вируса генома антигена | в КК СП в ПЦР в ИФА 1

дни после заражения

4 8 4 8 ! 4 8

Слизистая оболочка глотки и пишевода + + т - + +

Слизистая оболочка языка + + 1 + - +

Поверхностные шейные лимфоузлы + + + - + +

Подколенные лимфоузлы + " 1 + • !

Надколенные лимфоузлы + + ( + \ - + -г

Портальные лимфоузлы + - + -

Заглоточные лимфоузлы + + + • ! +

Мышцы - - - - -

Костный мозг н/и н/и + - +

Подкожный жир н/и н/и | + - + - 1 1

Надпочечники - 1 -

Поджелудочная железа + - 1 - - I

Легкие + - • + - + - ;

Миндалины + + + - + + 1

Примечание: + положительно; - отрицательно; * не исследовано

В связи с этим в период угасания клинических признаков заболевания вероятность обнаружения возбудителя яшура у свиней ниже, чем у крупного рогатого скота.

Измерение рН в продуктах убоя свиней и температуры проводили в мясе поросят с клиническими признаками ящура через 4 суток после заражения вирусом яшура типа Азия-1 /Иран/99, а также через 10 суток после заражения.

при отсутствии клинических признаков болезни. Измерения осуществляли в длиннейшей мышце спины, в холодильной камере, при температуре 2-4°С, с интервалом 2 часа, на протяжении 24 часов, с помощью рН-милливольтметра "рН-410" с термометром и комбинированным электродом "ЭСК-10616/7' с ножевым устройством для измерения рН в мясе и мясопродуктах. Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4

Изменения величины рН и температуры в мясе свинины через 4 и 10 суток после экспериментального заражения животных вирусом яшура

п=3

Показатели Время после убоя (час.)

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 | 22 24

рН через 4 суток 7,0 6,5 6,2 6,0 6,0 5,6 5,5 5,5 5,6 5,8 5,8 . 6.0 1 6,0

рН через 10 суток 7,0 6,2 6,0 5,8 5,7 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 5,5 | 5,5 ! 5,5

10 в мясе 37,0 26,0 19,0 13,5 12,0 10,5 9,0 7,0 6,0 6,0 5,0 1 5,0 5,0

Примечание: среднестатистическое отклонение величины рН не более+0,2.

Из таблицы 4 следует, что у свиней, убитых с клиническими проявлениями ящура, рН в длиннейшей мышце спины составляла ниже 6,0 через 10 часов после убоя, ас 16-18 часов после убоя незначительно повышалась и к 24 часам составляла 6,0. В продуктах убоя свиней без клинических признаков болезни уже через 6-8 часов после убоя значение рН было ниже 6,0, и в период с 10 до 24 часов ее величина составляла 5,5. Наиболее быстрое снижение температуры в мясе происходило в первые 6 часов после убоя и к 24 часам она достигла 5°С.

Таким образом, из полученных результатов следует, что после созревания мяса свинины от клинически здоровых животных значение рН 5.5, а в продуктах убоя клинически больных животных процесс происходит менее активно и величина рН составляет 6,0.

Исследование пищеводно-глоточной жидкости на наличие генома вируса яшура, антигена и противоящурных антител. Пишеводно-глоточную жидкость отбирали у крупного рогатого скота, экспериментально зараженного

вирусом ящура ОтМатэа на 21 сутки после вакцинации цельной дозой. 1/4 и 1/8 дозы противоящ\рной вакцины. ПГЖ. полученную через 1, 5 и 8 суток после экспериментального заражения, исследовали на наличие антигена вируса ящура в ИФА, его вирусного генома в ПЦР и обнаружение антител в ИФА и РМН.

При исследовании ПГЖ геном вируса ящура был обнаружен в 1 - 8 сутки после экспериментального заражения во всех исследуемых пробах, независимо от иммунного статуса животного. Антиген вируса ящура в пищеводно— глоточной жидкости был выявлен в ИФА с 1 по 5 сутки после экспериментального заражения, из чего следует, что проводить исследование ПГЖ на наличие антигена, без предварительного концентрирования, возможно только в первые сутки после проявления клинических признаков.

В результате исследования ПГЖ наличие специфических противояшурных антител удавалось выявить как в ИФА, так и в РМН уже через 5 суток после экспериментального заражения. Через 8 суток после заражения их обнаруживали обоими методами во всех исследуемых пробах ПГЖ, независимо от иммунного статуса животного.

Соотношение положительных результатов при исследовании ПГЖ в различные сроки после заражения представлено на рисунке 2.

□ Геном в ПЦР 100,0% 100,0% 100,0%

ВАнтиген в ИФА 88,2% 23,5% 0,0%

□Антитела в ИФА и РМН 0,0% 55,8% 100,0%

Время после заражения

Рис. 2. Обнаружение антигена вируса ящура, вирусного генома и противояшурных антител в ПГЖ

Из данных рисунка 2 следует, что при исследовании проб пишеводно-глоточной жидкости геном вируса ящура обнаруживали в 100% проб во все сроки после экспериментального заражения. Антиген вируса ящура выявляли в 88.2% проб через 1 сутки после экспериментального заражения и в 23,5% проб на 5 сутки. В эти сроки в 111Ж снижается возможность выявления специфического антигена, но в 55,8% случаев удается обнаружить противоящурные антитела.

Через 8 суток после заражения выявляемость антител в ПГЖ достигает 100% при отсутствии положительных результатов на наличие антигена вируса ящура. Таким образом, при снижении возможности прямой индикации специфического антигена в 111Ж с помощью иммунохимических реакций появляется вероятность обнаружить противоящурные антитела.

4. Выводы

1. Установлена возможность обнаружения генома вируса ящура в тканях и органах животных с помощью ПЦР и показано, что данный метод более чувствительный, чем прямая индикация антигена вируса ящура в ИФА и вирусовыделение с использованием культур клеток.

2. Показано, что для прямой индикации антигена вируса ящура без предварительной постановки биопробы могут быть использованы концентрированные методом ультрафильтрации суспензии из тканей и органов животных.

3. Положительные результаты исследований органов и тканей в ИФА и ПЦР на наличие антигена вируса ящура и вирусного генома свидетельствуют, что пробы получены от больных или переболевших ящуром животных.

4. Определена возможность обнаружения противоящурных антител с помощью ИФА и РМН в продуктах убоя животных. Антитела выявляли только после заражения как интакгных, так и предварительно иммунизированных животных.

5. Установлено, что при положительных результатах анализа органов и тканей на наличие противоящурных антител, в том числе без подтверждения

результатами анализа на вирусный антиген или геном вируса ящура, продукты убоя, полученные от невакцинированных животных, должны считаться потенциально опасными в распространении ящ\ра.

6. Показано, что для лабораторной индикации возбудителя яшура и противояшурных антител в пробах патологического материала и продуктах убоя животных целесообразно использовать следующие органы и ткани: слизистые оболочки глотки, языка и пищевода, легкие, надпочечники, миндалины, лимфатические узлы.

7. В процессе исследования продуктов убоя после заражения животных эпизоотическим штаммом 0№1964/Монголия/2004 также были изучены его свойства и установлено, что этот штамм отличается от производственного штамма 0)№194 и степень нуклеотидных различий между ними составляет 14,35%. Изучение антигенного спектра штамма вируса ящура типа 0№1964/Монголия/2004 в РСК показало, что он отличается от производственных штаммов 0]№194 и О, №1618 (11=11%) и ранее установленных эпизоотических штаммов вируса яшура типа О, но более близок к штамму, выделенному в Таджикистане в 2001 - 2002 гг. (Д= 38-40 %).

8. Полученные результаты по изучению свойств эпизоотического штамма вируса ящура типа 0№1964/Монголия/2004 дают основание предложить этот штамм в качестве нового производственного для приготовления вакцинных и диагностических препаратов.

9. Установлено, что пишеводно-глоточная жидкость пригодна для исследований методами ПЦР, ИФА и РМН для выявления генома вируса ящура, антигена, противояшурных антител и прижизненного установления факта переболевания животных ящуром.

5. Практические предложения

Полученные результаты использованы при подготовке следующих документов, одобренных ученым советом и утвержденных директором ФГУ ^Федеральный центр охраны здоровья животных»):

1. "Методические указания по отбору, консервированию и транспортировке проб патологического материала и продуктов убоя для лабораторной диагностики ящура" (утверждены 29.09.2005 г.).

2. "Методические указания по исследованию продуктов убоя животных при подозрении на ящур" (утверждены 02.06.2005 г.).

3. Штамм вируса ящура типа О №1964/Монголия/2004, который в антигенном отношении отличается от производственных штаммов (Oi№194, О,№1618) и депонирован в ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (2004г.).

4. "Правила профилактики и ликвидации ящура животных" (приложение «О порядке сбора, консервирования и доставки материалов для лабораторной диагностики ящура», одобрены ученым советом и находятся на рассмотрении в Россельхознадзоре МСХ РФ).

5. "Программа совместных действий государств - участников СНГ по профилактике и борьбе с ящуром в государствах Содружества" (дополнение в раздел 5.2. «Основные мероприятия на 2006-2008 гг.», одобрены Россельхознадзором МСХ РФ, представлены на 29-е заседание Межправительственного совета по сотрудничеству в области ветеринарии СНГ 19 апреля 2006 г., г.Ташкент, Республика Узбекистан).

б. Список опубликованных научных работ

1. Никифоров В.В, Кременчугская С.Р., Камалова Н.Е., Фомина Т.А., Егорова А.И., Пономарев А.П. Выявление антигена вируса ящура в продуктах убоя животных // Актуальн. проблемы инфекц. патологии жив-х: Матер. Междунар. науч. конф., посвяшён. 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». - Владимир, 2003.-С. 14-18.

2. Захаров В.М., Рахманов A.M., Фомина Т.А., Герасимов В.Н., Камалова Н.Е., Кременчугская С.Р., Караулов А.К., Муминов Д.М., Никифоров В.В.. Патрикеев В.Г., Фомина С.Н. Результаты эпизоотологического и серологического мониторинга по ящуру в России в 2002г. // Актуальн. вопр. зоотех. науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и

здоровья с.-х. жив.-х: Матер. 2-й Междунар. науч.-практ. конф. - Ставрополь.

2003. -С.313-317.

3. Никифоров В.В., Кременчугская С.Р., Камалова Н.Е.. Фомина Т.А.. Егорова А.И.. Пономарев А.П. Сравнительная оценка методов концентрирования вирусосодержашей суспензии для выявления антигена вируса ящура в продуктах убоя животных // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: Матер, конф. - Владимир,

2004.-С. 12-15.

4. Никифоров В.В., Кременчугская С.Р., Камалова Н.Е., Фомина Т.А., Муминов Д.М., Малкова К.С. Результаты исследования продуктов убоя КРС, экспериментально зараженного ящуром // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т.З. - С. 80-84.

5. Фомина Т.А., Спирин В.К., Егорова А.И., Щербаков A.B., Муминов Д.М., Никифоров В.В. Иммунобиологические свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа О №1964/Монголия /2004 // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. - Владимир, 2005. - Т.З. - С. 58-65.

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», тираж 90 экз.,^^^^ 2006 г.

fJ° 48

Оглавление диссертации Никифоров, Виктор Викторович :: 2006 :: Владимир

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие сведения о ящуре.

1.2. Экономический ущерб при ящуре.

1.3. Источник инфекции при ящуре.

1.3.1. Продукты убоя как источник распространения ящура.

1.3.2. Роль вирусоносительства в эпизоотологии ящура.

1.3.3. Вирусоносительство у вакцинированных животных.

1.4. Наличие и сохраняемость вируса ящура в продуктах убоя животных.

1.4.1. Патоморфологические изменения при ящуре.

1.4.2. Наличие вируса ящура в продуктах убоя в различные периоды заболевания.

1.4.3. Сохраняемость вируса ящура в продуктах убоя животных.

1.5. Обнаружение вируса ящура в продуктах убоя.

1.5.1. Подготовка проб к исследованиям!.

1.5.2. Методы лабораторной диагностики ящура.

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Никифоров, Виктор Викторович, автореферат

Ящур - это высококонтагиозное вирусное заболевание парнокопытных животных. Для него характерна тенденция к широкому распространению и эпизоотическому течению. Жесткие карантинные меры по ликвидации ящура нарушают нормальную деятельность хозяйств и предприятий, затрагивают общественные, экономические и межгосударственные связи. Эпизоотии ящура не знают географических и климатических границ и наносят огромный экономический ущерб.

Актуальность темы

Успех организационных мер борьбы с ящуром во многом зависит от знания условий выживаемости вируса в продуктах убоя или в патологическом материале павших и вынужденно убитых животных, времени нахождения вируса в крови и тканях животных в различные стадии болезни. Кроме того, немаловажное значение имеет наличие и сохраняемость вируса у вакцинированных животных, контактировавших с больными.

Ранее проблемой индикации вируса ящура в продуктах убоя животных занимался ряд исследователей. В частности, С.А. Цветковой (1972) был предложен метод биопробы на культуре клеток, основным недостатком которого является длительность получения конечного результата. При ретроспективной диагностике Л.Б. Мезвришвили (1988) была использована непрямая реакция иммунофлюоресценции для выявления постинфекционных антител в тканях и органах животных. Кроме того, для проведения индикации антигена вируса ящура в органах и тканях Т.В. Тюриной (1994) был предложен метод флюоресцентных зондов, требующий последующей идентификации инфекционного агента в реакции нейтрализации.

В настоящее время при лабораторной диагностике ящура в объектах ветеринарного надзора наибольшее признание получили такие методы, как быстрая и высокочувствительная полимеразная цепная реакция (ПЦР), иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющие проводить прямую индикацию и специфическую идентификацию вирусного агента, реакция микронейтрализации (РМН) [54, 55, 56, 93,195].

Цели и задачи исследований

Целью нашей работы явилась разработка схемы исследований для прямой индикации возбудителя ящура и противоящурных антител в продуктах убоя и патологическом материале от зараженных ящуром животных методами, которые позволили бы использовать наиболее вероятные с точки зрения обнаружения возбудителя ткани и органы и проводить диагностику в минимальные сроки.

Для выполнения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- изучить возможность обнаружения генома вируса ящура в ПЦР в пробах тканей и органов и сравнить с прямой индикацей антигена в ИФА и вирусовыделением в культуре клеток;

- провести сравнительные исследования продуктов убоя до и после их созревания;

- исследовать продукты убоя после заражения животных эпизоотическим штаммом вируса ящура типа О №1964/Монголия/2004 и изучить его свойства;

- изучить возможность обнаружения противоящурных антител в продуктах убоя с помощью ИФА и РМН;

- исследовать продукты убоя, полученные от вакцинированных и затем зараженных ящуром животных, которые могут являться вирусоносителями;

- изучить и сравнить возможность обнаружения вирусного генома прямой индикацией антигена вируса ящура и противоящурных антител в пищеводно-глоточной жидкости (ПГЖ).

Научная новизна

Проведены исследования по обнаружению генома вируса ящура в продуктах убоя с помощью ПЦР.

Разработана схема очистки и концентрирования суспензии патологического материала для прямой индикации антигена вируса ящура.

Осуществлена прямая индикация и специфическая идентификация антигена вируса ящура в тканях животных методом ИФА без предварительной инокуляции чувствительных биосистем.

Представлена возможность выявления специфических противоящурных антител в продуктах убоя животных с применением ИФА и РМН.

Изучена возможность обнаружения возбудителя ящура и антител в продуктах убоя после экспериментального заражения вакцинированных животных.

Установлена возможность обнаружения вирусного генома, прямой индикацией антигена вируса ящура и противоящурных антител в ПГЖ.

Практическая значимость работы

Полученные результаты исследований использованы при подготовке следующих документов:

- "Методические указания по исследованию продуктов убоя животных при подозрении на ящур", утвержденные директором ФГУ "ВНИИЗЖ" 02.06.2005 г;

- штамм вируса ящура типа О №1964/Монголия/2004 депонирован в ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (2004г.).

- проект "Правил профилактики и ликвидации ящура животных", который находится на рассмотрении в МСХ РФ;

- проект "Программы совместных действий государств- участников СНГ по профилактике и борьбе с ящуром в государствах Содружества" (20062008гг.), который находится на рассмотрении в Россельхознадзоре МСХ РФ.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены и опубликованы в сборнике Международной научной конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных», посвященной 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» в 2003г.; Международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г.Владимир, 2004г.; также докладывались на заседании Межправительственного совета по сотрудничеству в области ветеринарии СНГ (Республика Узбекистан) в 2006г. и на ученых советах ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 2001-2005 гг.

Публикация научных работ

По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ.

Основные положения, выносимые на защиту: усовершенствованные методы очистки и концентрирования вируссодержащих суспензий из проб патологического материала;

- способы прямой индикации антигена вируса ящура в продуктах убоя животных;

- методы исследования продуктов убоя для обнаружения генома вируса ящура;

- иммунобиологические свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа О №1964/Монголия/2004;

- определение противоящурных антител в тканях и органах животных методами ИФА и РМН;

- исследование пищеводно-глоточной жидкости с применением ПЦР, ИФА и РМН.

Заключение диссертационного исследования на тему "Эффективность методов выявления возбудителя ящура и антител в продуктах убоя и патологическом материале"

4. ВЫВОДЫ

I. Установлена возможность обнаружения генома вируса ящура в тканях и iax животных с помощью ПЦР и показано, что данный метод более гвительный, чем прямая индикация антигена вируса ящура в ИФА и ;овыделение с использованием культур клеток.

I. Показано, что для прямой индикации антигена вируса ящура без зарительной постановки биопробы могут быть использованы гнтрированные методом ультрафильтрации суспензии из тканей и органов тных. Положительные результаты исследований органов и тканей в ИФА и на наличие антигена вируса ящура и вирусного генома свидетельствуют, робы получены от больных или переболевших ящуром животных.

Определена возможность обнаружения противоящурных антител с щью ИФА и РМН в продуктах убоя животных. Антитела выявляли только г заражения как интактных, так и предварительно иммунизированных •тных.

5. Установлено, что при положительных результатах анализа органов и 1Й на наличие противоящурных антител, в том числе без подтверждения штатами анализа на вирусный антиген или геном вируса ящура, продукты , полученные от невакцинированных животных, должны считаться зциально опасными в распространении ящура.

5. Показано, что для лабораторной индикации возбудителя ящура и ивоящурных антител в пробах патологического материала и продуктах животных целесообразно использовать следующие органы и ткани: iCTbie оболочки глотки, языка и пищевода, легкие, надпочечники, (алины, лимфатические узлы.

7. В процессе исследования продуктов убоя после заражения животных эотическим штаммом 0№1964/Монголия/2004 также были изучены его гтва и установлено, что этот штамм отличается от производственного [ма 0j№194 и степень нуклеотидных различий между ними составляет

14,35%. Изучение антигенного спектра штамма вируса ящура типа 0№1964/Монголия/2004 в РСК показало, что он отличается от производственных штаммов 0]№194 и Oi№1618 (R=ll%) и ранее установленных эпизоотических штаммов вируса ящура типа О, но более близок к штамму, выделенному в Таджикистане в 2001 - 2002 гг. (R= 38-40 %).

9. Установлено, что пищеводно-глоточная жидкость пригодна для исследований методами ПЦР, ИФА и РМН для выявления генома вируса ящура, антигена, противоящурных антител и прижизненного установления факта переболевания животных ящуром.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Полученные результаты использованы при подготовке следующих документов, одобренных ученым советом и утвержденных директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»:

3. Штамм вируса ящура типа О №1964/Монголия/2004, который в антигенном отношении отличается от производственных штаммов (Oi№194, Oi№1618) и депонирован в ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (2004г.).

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2006 года, Никифоров, Виктор Викторович

1. Агабалов Г.П., Заграбян Л.И. О тканевых антителах при ящуре // Матер, науч. сес. по итогам исслед. работ АрмНИИЖиВ. Ереван, 1973. - С. 152-153.

2. Айзен М.С., Казанцева В.А., Дроздов С.Г. и др. Концентрирование вируса полиомиелита из воды на материале марки ФП // Вопр. вирусол. 1979. - № 5. -С. 554-558.

3. Айзен М.С., Пиле Э.Р. Обнаружение вирусов в пищевых продуктах // Вопр. вирусол.-1981.-№ 1.-С. 5-11.

4. Айзен М.С., Пиле Э.Р. Сохраняемость вирусов в продуктах питания // Гигиена и санитария. 1976. - № 10 - С. 75.

5. Андреев Е.В., Бойко А.А. Вирусоносительство при ящуре // Ветеринария. -1966.-№9.-С. 31-33.

6. Базаров М.А., Конюшкина Т.Б. Зависимость иммуноферментного анализа с Р лактамазанными конъюгатом от используемого субстрата // Актуальн. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. конф., посвящен. 30 - летию ВНИЯИ. -Владимир, 1988.-Ч. 1.-С. 62-63.

7. Ашмарин И.П., Васильев Н.Н., Амбросов В.А. Быстрые методы статистической обработки и планирование .экспериментов. Л.: Изд-во Ленингр. ун-та, 1974. - 78 с.

8. Березин И.В. Экологическая эпизоотология диких теплокровных животных //Вестн. с.-х. науки. 1988. -№ 5. - С. 146- 151.

9. Бойко А.А., Шуляк Ф.С. Ящур: Биолого экономический аспект проблемы. -М: Колос, 1971.-352 с.

10. Брок Т. Мембранная фильтрация. М.: Мир, 1987. - 462 с.

11. Вишняков И.Ф. Диагностика вирусных болезней животных: состояние и перспективы // Вопр. вет. вирусол., микробиол., эпизооол.: Матер, науч. конф. ВНИИВВиМ. Покров, 1992. - Ч. 2. - С. 221-230.

12. Воробьева М.М., Блинова Н.М. Концентрация и очистка вирусов, вызывающих заболевание животных // Тр. ГНКИ. 1964. - Т. 12 - С. 341-347.

13. Воробьева М.М. Очистка лапинизированного вируса ящура // Вопр. вет. вирусол.-М., 1964.-Т. 1.-С. 190-195.

14. Гетманский О.И. Инфицированные продукты убоя источник распространения ящура // Сб. науч. тр. аспирантов КиргНИИЖВ. - Фрунзе, 1968.-Т. 2.-С. 116-118.

15. Гетманский О.И. Изучение сроков сохраняемости вируса ящура в условиях Чуйской долины Киргизской ССР: Автореф. дис. канд. вет. наук. Фрунзе, 1969. -19 с.

16. Головченко А.П. Динамика накопления вируса и вируснейтрализующих антител в крови и лимфе трахеального лимфопротока крупного рогатого скота при экспериментальном ящуре // Матер. 2 годичной науч. конф. ВИЭВ. - М., 1970.-С. 20-22.

17. Гринин А.С., Титов И.Н. Очистка, концентрирование и фракционирование вирусов животных. М.:. Колос, 1971.-240 с.

18. Гриценко А.И. Выделение вируса ящура со слюной у крупного рогатого скота//Ящур. Владимир, 1968. - С. 88-89.

19. Гриценко А.И. Выявление вируса ящура в культуре клеток СП при разных дозах заражения // Актуальн. пробл. вет. вирусол. Владимир, 1983. — С. 103.105.

20. Гуленкин В.М., Байбиков Т.З., Зинковский Ю.В. и др. Методическое руководство по определению экономического ущерба и эффективностипротивоэпизоотических мероприятий при особо опасных болезнях животных (группа А). Владимир, 1996. - 86 с.

21. Гусев А.А., Бурдов А.Н., Старов С.К. и др. Выделение вируса ящура из секретов, экскретов и крови крупного рогатого скота, зараженного в разные сроки после вакцинации // Актуальн. пробл. вет. вирусол. Владимир, 1987. - Ч. 2. - С. 33-35.

22. Гусев А.А, Захаров В.М, Рахманов A.M., Яременко Н.А. Профилактика ящура в Российской Федерации // Ветеринария. 2001. -№ 5. - С. 3 - 5.

23. Гусев А.А., Захаров В.М., Фомина Т.А., Щербаков А.В. Биологические свойства вируса ящура типа 0/1685/"Московский", выделенного у свиней // Сучасш ветеринарш та технолопчш аспекта свинарства: Матер, конф. Киев, 2002.-С. 9-10.

24. Гутник Б.Е., Генералов Н.Ф. Справочник по разделке мяса, производству полуфабрикатов и быстро замороженных готовых мясных блюд. М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. - 344 с.

25. Диев В.И., Онуфриев В.П. Противоящурные антитела в органах и тканях иммунных ягнят // Матер, науч. производ. совещ. по оздоравливанию хозяйств от инфекц. и инваз. заболеваний животных. - Душанбе, 1971. — С. 5759.

26. Дукаценко В.Г. Экспертиза мяса и продуктов убоя при некоторых вирусных болезнях // Ветеринария. 1976. - № 12 - С. 84-87.

27. Джупина С.И., Свиридов А.А. К вопросу о роли вирусоносителей в эпизоотии вируса ящура // Сб. науч. работ Новосиб. НИВС. 1965. - Т. 2. - С. 73-77.

28. Дидовец С.Р. Бондаренко Г.Ф. Ящур. Киев: Урожай, 1974 - 215с.

29. Дрыгин В.В., Щербаков А.В, Перевозчикова Н.А, Гусев А.А. Использование метода секвенирования генома при изучении вируса ящура // Ветеринария. 1995.-№4.-С. 31-33.

30. Дубяга В.П., Каталевский Е.Е. Технология, развитие производства и свойства отечественных ультрафильтрационных и обратноосматических мембран // Журн. Всесоюз. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева. 1987. - Т. 32, № 6. -С. 627-633.

31. Дытнерский Ю.И. Мембранные процессы разделения жидких смесей. М.: Химия, 1975.-229 с.

32. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высш. шк., 1991. - 288 с.

33. Епифанов Г.Ф., Шалашов JI.B. Вирусоносительство у крупного рогатого скота при ящуре // Тр. Иркутской НИВС. 1976. - Т. 3. — С. 114-118.

34. Житенко П.В. Технология продуктов убоя животных. М.: Колос, 1984. -237 с.

35. Жукова И.Н., Онуфриев В.П. Изучение вирусоносительства у овец при ящуре // Актуальн. вопр. вет. вирусол. М., 1967. - Ч. 2. - С. 139-140.

36. Жукова И.Н. Изучение вирусоносительства у овец при ящуре: Автореф. дис. канд. вет. наук. Душанбе, 1971. - 20 с.

37. Замах В.П., Ермолаев Е.Г., Стенгревиц О.А. Технология производства и аппаратурное оформление получения биохимических реактивов и препаратов // Журн. Всесоюз. хим. о-ва им. Д.И. Менделеева. 1984. - Т. 29, № 6. - С. 61 -66.

38. Захаров В.М., Байбиков Т.З., Рахманов A.M. и др. Ящур у диких животных // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзотическими и зооантропозными болезнями животных: Сб. статей междунар. науч.-практ. конф. Покров, 2000. - С. 49 - 51.

39. Зограбян Л.И., Искандарян С.А., Арутюнова Г.М. К изучению продолжительности постинфекционного иммунитета у крупного рогатого скотаразных возрастных групп при ящуре // Матер, науч. сес. по итогам исслед. работ. АрмНИИЖиВ. Ереван, 1973. - С. 143-144.

40. Иммунологические методы исследований / Под ред. И. Лефковитса, Б. Перниса. М.: Мир, 1988. - 530 с.

41. Калитина Т.А. Разработка метода концентрации энтеровирусов при вирусологических исследованиях мяса // Вопр. вирусол. 1978. - № 5. - С. 621625.

42. Кленина Н.В., Лебедева Е.Н., Антонов B.C. Получение очищенных препаратов вируса ящура из различных животных тканей при помощи хлороформа // Вопр. вет. вирусол. М., 1964. - Т. 1 — С. 196 - 202.

43. Климов Н.М., Малахов Л.Г., Грибанов В.Н. Химический метод очистки и концентрации вируса ящура и испытание его антигенных и иммуногенных свойств//Тр. MB А. 1960. - Т. 30.- С. 180-182.

44. Кочемасова З.Н., Ефремова С.А., Рыбакова A.M. Санитарная микробиология и вирусология. -М.: Медицина, 1987. 352 с.

45. Кротков В.Г., Патрикеев В.Г. Вирусовыделение у овец при различных формах течения ящура // Актуальн. вопр. вет. вирусол.: Тез. докл. науч. -теорет. конф., ноябрь 1990 г. Владимир, 1990. - С. 21-22.

46. Кругликов Б.А., Седов В.А., Тарасенко Т.А. Основные факторы, влияющие на развитие и угасание эпизоотии ящура // Ветеринария. 1993. - № 11. - С. 24 -26.

47. Кругликов Б.А., Сухарев И.О., Седов В.А., Тарасенко Т.А. Вирусоносительство при ящуре //Ветеринария. 1997. - № 3. - С. 16-20.

48. Либерман Г., Вагнер С., Вацель В. Опыт определения концентрации вируса ящура физическим методом // СЭВ. Матер, симп. по пробл. "Профилактика и эффект, борьба с ящуром". Владимир, 1981.-С. 51.

49. Липатов Н.Н., Марьин В.А., Фетисов Е.А. Мембранные методы разделения молока и молочных продуктов. М.: Пищевая пром - сть, 1976. - 168 с.

50. Мезвришвили JI.Б. Выделение вируса ящура из органов и тканей экспериментально зараженных животных. // Актуальн. пробл. вет. вирусол. и микробиол.: Тез. докл. конф. молодых ученых. Владимир, 1987. - С. 55-56.

51. Методические указания по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура: Утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 10.11.02. Владимир, 2002. -31 с.

52. Методические указания по индикации генома и штаммовой дифференциации вируса ящура методом полимеразной цепной реакции и секвенированием гена VP1: Утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 21.02.97.-Владимир, 1997.

53. Методические указания по индикации генома вируса ящура с помощью полимеразной цепной реакции на основе амплификации консервативной области 3D гена: Утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 21.02.97. — Владимир, 1997.

54. Мищенко В.А., Базаров М.А., Конюшкина Т.Б. и др. Иммуноферментный метод при диагностике ящура // Вопр. вирусол. 1991. - Ч. 4. - С. 341 - 342.

55. Мищенко В.А., Камалова Н.Е., Никешина Т.Б. и др. Иммуноферментный метод в диагностике респираторно-репродуктивного синдрома свиней // Вирусн. бол. с.-х. жив.-х: Тез. докл. науч.-практ. конф. Владимир, 1995. - С. 53.

56. Мищенко В.А., Тюрина Т.В., Базаров М.А. и др. Индикация вируса ящура в продуктах убоя животных // К новой стратегии борьбы с ящуром: Междунар. конф. Владимир, 1991.-С. 161-162.

57. Муравьев В.К., Онуфриев В.П. Постинфекционный и поствакцинальный иммунитет у овец при ящуре // Вопр. вет. вирусол. М., 1966. - 4.2. - С. 455 — 463.

58. Муравьев В.К., Никонов В.И., Гусев А.А.и др. Изучение противоящурного иммунитета у свиней // Ветеринария. 1978. - № 1. — С. 41 - 44.

59. Нагуманов Ф.М. О вирусовыделении при бессимптомном течении ящура у овец//Актуальн. вопр. вет. вирусол. М., 1967. - 4.2. - С. 140-141.

60. Оковытый А.С. Научные основы селекции производственных вакцинных штаммов вируса ящура // Пробл. инфекц. патол. с.-х. ж-ных: Тез. докл. конф. — Владимир, 1997. С. 45-47.

61. Первиков Ю.В., Эльберт Л.Б. Иммунные комплексы при вирусных инфекциях. М.: Медицина, 1984. - 158 с.

62. Петренко Б.Г., Андреев Е.В. Противоящурная кристаллвиолетовая вакцина // Науч. тр. УНИИЭВ. 1962. - Т. 28. - С. 5 - 26.

63. Петрянов И.В. Волокнистые фильтрующие материалы ФП. М.: Колос, 1968.-67 с.

64. Пилле Э.Р. Вирусы крупного рогатого скота и методы их выявления // Вопр. вирусол. 1975. - № 3. - С. 260-268.

65. Пономарев А.П. Механизм стабилизации и инактивации вируса ящура при воздействии физико-химических факторов: Автореф. дис. докт. биол. наук. — Владимир, 1996. 48 с.

66. Поплаухин С.Г., Епифанов Г.Ф., Шалашов J1.B. О продолжительности сохранения вируса ящура в крови животных, переболевших ящуром // Ветеринария. 1968. - №3. - С. 34 - 35.

67. Поплаухин С.Г. Жизнеспособность ящурного вируса в продуктах убоя // Сельское хоз-во Сибири. 1962. - № 9. - С. 65 - 66.

68. Поплаухин С.Г. О продолжительности выживания вируса в продуктах убоя крупного рогатого скота // Ветеринария. 1961. № 10. С. 70 71.

69. Поплаухин С.Г. О сохраняемости вируса в субпродуктах и эмбрионе крупного рогатого скота, больного ящуром // Сб. науч. работ Алтайской НИВС. 1969.-Вып. 2.-С. 120-122.

70. Простяков А.П., Онуфриев В.П., Лубошников А.Г. и др. Разработка оптимальных условий очистки лапинизированного вируса ящура // Вопр. вет. вирусол. М., 1966. - Т. 2. - С. 24 - 30.

71. Рахманов A.M. Патологоанатомические изменения у крупного рогатого скота при экспериментальном заражении вирусом ящура Азия 1 // К новой стратегии борьбы с ящуром: Тез. докл. междунар. конф. - Владимир, 1991. — С.24-25.

72. Рахманов A.M., Бреславец В.В., Дороговцев А.А. и др. Патоморфология и дифференциальная диагностика ящура у свиней // Диагн., патоморф., патогенез и профилакт. болезней в пром. животноводстве: Межвуз. науч. сб. Саратов, 1990.-4.2.-С. 12-13.

73. Рахманов A.M., Жучкова Л.Г., Лядский М.М. и др. Развитие патоморфологических изменений у овец при ящуре // Патоморф., патогенез и диагн. болезней с.-х. животных: Науч. Тр. ВАСХНИЛ. М.: Колос, 1980. - С. 148-150.

74. Ререр X. Ящур / Пер. с нем Г. А. Сурковой; под ред. П. В. Малярца. М.: Колос, 1971.-314с.

75. Рожанская Т.Н., Аверьянова Е.В., Андреева Т.В. и др. Использование ультрафильтрации в процессах выделения ингибиторов ферментов // Тез. докл. всесоюз. конф. по мембранным методам разделения смесей. Владимир, 1981. -С. 208-209.

76. Салажов Е.Л. Вакцинопрофилактика и диагностика ящура крупного рогатого скота // Курской биофабрике и агробиологической пром.-ти России — 100 лет: Тез. докл. науч. произв. конф. - Курск, 1996. - С. 249 - 255.

77. Сальников М.Д., Поплаухин С.Г. Роль реконвалесцентов в эпизоотии ящура // Сб. науч. работ Алтайской НИВС. 1972. - Вып. 3. - С. 107-109.

78. Санитарный кодекс наземных животных МЭБ. 14 изд. Париж, 2005. - С. 114-126.

79. Саркисян Р.А. Течение и профилактика ящура у овец // Изв. с.-х. наук. -Арм. ССР, 1974.-№ 10.-С. 59-63.

80. Саркисян Р.А., Хухоров В.М., Пронина Н.А. Выявление вируса ящура в некоторых секретах, экскретах и в крови у экспериментально инфицированных овец//Ящур. Владимир, 1974. - Т. 2. - С. 134.

81. Свиридов А.А. О вирусоносительстве при ящуре // Ветеринария. 1953. -№8.-С. 18-19.

82. Семенов В.И. Вопросы ящура: ветеринарные службы предлагают // Главный зоотехник. 2004. - №6. - С. 9 -10.

83. Сергеев В.А. Размножение вирусов животных в культуре ткани // Матер. Всесоюз. конф. по вопр. вет. вирусол. М., 1964. - С. 54 - 56.

84. Сергеев В.А. Размножение вирусов животных в культуре ткани: Автореф. дис. докт. биол. наук. М., 1967. - 30 с.

85. Сибгатулин Р.С., Равилов А.З. Динамика накопления и свойства вируснейтрализующих антител у крупного рогатого скота после вакцинации // Уч. зап. КВИ.- 1975.-Т.19.-С. 15-19.

86. Смертин В.П., Обидор В.Л. Роль вирусоносительства при возникновении вспышек ящура в условиях Новосибирской области // Науч. тр. ин-та. эксперим. ветеринарии Сибири и Дал. Востока. 1979. - Вып. 3. - С. 17-18.

87. Собко А.И., Прохоров В.Н. Методы идентификации штаммов вируса ящура//Ветеринария. 1971.-№5.-С. 110-113.

88. Собко А.И., Цветкова С.Н., Гриценко А.И. и др. Выявление вируса ящура в продуктах убоя // Ветеринария. 1973. - № 9. - С. 40-41.

89. Спирин В.К., Глобенко Л.А., Кремечугская С.Р. Методы диагностики болезней с везикулярным синдромом // Соврем, аспекты вет. патологии ж-ных: Матер, конф., посвящен. 40-летию ВНИИЗЖ. Владимир, 1998.- С. 71-80.

90. Способ очистки биологических жидкостей: А. с. 880441 СССР, МКИ В 01 13/00/ Г.А. Ягодин, Ю.М. Лопухин, Е.В. Юртов, А.З. Граф.- 4 с.

91. Справка об оценках последствий эпидемии ящура в Великобритании и мерах правительства по их устранению. / Б.м. /, /Б.г./. - 2 с. - Preprint.

92. Сюрин В.Н. Частная ветеринарная вирусология: Справ, кн. М.: Колос, 1979.-472 с.

93. Текерлеков П., Кунев Ж. Устойчивост на шапния вирус в продукта от животинеки произход: Обзор. София, 1984. - 76с.

94. Тихоненко Т.И. Методические основы биохимии вирусов. М.: Медицина,1973.-382 с.

95. Толокнов А.С., Дудников А.И., Рыбаков С.С. и др. Взаимодействие вируса ящура с клетками в организме морских свинок // Пробл. инфекц. Патологии с.-х. животных: Тез. докл. конф. Владимир, 1997. С. 39-40.

96. Узюмов B.JI. Ультраструктура и свойства вируса ящура. Фрунзе: Кыргызстан, 1970. - С. 73 - 79.

97. Усович А.Т., Лебедев П.Т. Применение математической статистики при обработке экспериментальных данных в ветеринарии. — Омск, 1970.

98. Фомина Т.А., Гусева Е.В. Лабораторная диагностика ящура и других болезней, протекающих с везикулярным синдромом: Обзор лит.-Владимир: ВНИИЗЖ, 1995.-43 с.

99. Хухоров В.М., Пронина Н.А., Гетманский О.И. и др. Экспериментальное изучение вирусоносительства при ящуре типа О // Актуальн. пробл. вет. вирусол.: Тез. докл. к конф. Владимир, 1978. - С. 164-166.

100. Цветкова С.А. Обнаружение вируса ящура в продуктах убоя животных: Автореф. дис. канд. вет. наук. Покров, 1972. - 16 с.

101. Цветкова С.А. Результаты исследований по обнаружению вируса ящура в продуктах убоя овец и свиней // Ящур. Владимир, 1970.- С. 79-80.

102. Цветкова С.А., Собко А.И. Результаты исследований по обнаружению вируса ящура в продуктах убоя крупного рогатого скота // Ящур. Владимир,1974. Т. 2. С. 144-145.

103. Черняев Ю.А. Разработка методов ускоренной идентификации вируса ящура: Автореф. дис. докт. вет. наук. Покров, 1977. - 34 с.

104. Черняев 10. А., Собко А.И. Реакция пассивной гемагглютинации вируса ящура // Ветеринария. 1972. - № 1. - С. 102-104.

105. Шажко Ж.А. Антитела и антигены для лабораторной диагностики ящура: ГОСТ 29312-92. М.: Изд-во стандартов, - 1992.- 10 с.

106. Шажко Ж.А., Данилюк В.Н. Оптимизация условий проведения ИФА при титровании антигенов вируса ящура // Вирусн. и микробн. болезни ж-ных.: Сб. науч. тр.- Владимир, 1995. С. 97-100.

107. Шажко Ж.А., Мищенко В.А., Маслова Н.С. и др. // Матер. 2-го симпоз. специалистов стран-чл. СЭВ по пробл. "Профилакт. и эффективная борьба с ящуром, а также создание высокоэффективных противоящурных вакцин". — София, 1998.-С. 125-131.

108. Шажко Ж.А., Мищенко В.А., Шуть Н.Н. и др. Оптимизация иммуноферментного метода на фильтровальных мембранах для выявления вируса ящура и протвоящурных антител // Бюл. ВИЭВ. 1985. - Вып. 58.- С. 6267.

109. Шажко Ж.А. Обоснование методических основ современных схем лабораторной диагностики ящура и других везикулярных болезней // Соврем, аспекты вет. патологии, ж-ных: Матер, конф., посвящен. 40-летию ВНИИЗЖ. -Владимир, 1998.- С. 28 29.

110. Шахгильдян И.В., Михайлов М.И., Онищенко Г.Г. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика). М.: ГОУ ВУНМЦМЗ РФ, 2003. - С. 98 - 124.

111. Шесточенко М.А. Люминесцентная микроскопия при вирусных инфекциях // Ветеринария. 1966. -№ 6. - С. 12-15.

112. Щербаков А.В., Андреев В.Г., Дрыгин В.В., Гусев А.А. Молекулярная эпизоотологя ящура в России и странах СНГ // Аграрная Россия. 2002, №2. -С. 8-11.

113. Эрнст Б., Тесман Д. Иммуногистология. Иммунологические методы / Под ред. X. Фримеля. -М.: Мир, 1979. С.373 -413.

114. Яременко Н.А., Хухоров В.М., Пронина Н.А. Выделение ящура больными свиньями // Актуальн. пробл. вет. вирусол. Владимир, 1986. - С. 148-149.

115. Яременко Н.А., Пронина Н.А. Эпизоотическое значение инфицированных вирусом ящура мясных продуктов // Актуальн. вопр. вет. вирусол. Владимир, 1976.-4.1.-С. 183-185.

116. Abu-Elzein Е.М.Е., Crowther J.R. Differentiation of FMD virus strains using a competition enzimelinked immunosorbent assay // J. Virol. Methods.-1982.-V.3 -P. 355-365.

117. Armstrong R.M., Barnett I.T.R. An enznsyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection and quantification of antibodies against swine vesicular disease virus (SVDV) // J. Virol. Methods. 1989. - V. 25, № 1. - P. 71-78.

118. Bachrach H.L., Galliz J.J., Hess W.R., Patty R.E. A plaque assay for foot and mouth disease virus and kinetics of virus reproduction // Virology. 1957. - V. 4, № 2. - P. 224-236.

119. Baibikov T.Z., Gusev A.A., Zakharov V.M., Rakhmanov A.M. Recent FMD outbreaks in the Russian Federation // FMD Newsletter. 1996. - V. 1, №4. - P. 7-8.

120. Barya M.A., Afzal H. Persistence of foot and mouth disease in lymf nodes and blood of experimentally infected buffalo-calves in West Pakistan // Res. Vet. Sci. -1969.-V. 10, №4.-P. 321-325.

121. Baumgarten A. Viral immunodiagnosis // The Yale J. Biol, and Med. 1980. -V. 53.-P. 71-83.

122. Bekkum J.G. van, Straver P.J., Bool P.H., Frenkel S. Donnes complementaries sur la persistance du virus aphteux infectant chez des bovins exposes a des souches du virulent//Bull. Off. Intern. Epizoot. 1966.- V. 65, № 11-12.-P. 1949-1965.

123. Bekkum J.G. van, Frenkel H.S., Frederiks H.H.I., Frenkel S. Observations on the carrier state of cattle exposed to foot-and-mouth disease virus // Tijdschr. Diergeneesk. 1959. - Bd 84, № 20. - P. 1159 - 1164.

124. Bouma A., Dekker A., de Jong M.C.M. No foot-and-mouth disease virus transmission between individually housed calves // Vet. Microbiol. 2004. - V. 98. -P. 29-36.

125. Brooksby J.B. Symp. Series Immunobiol. Standart.- Basel etc, 1968. V.8, P.ll.

126. Brooksby J.B., Gallowey I.A. Observations sur la distribution et la determination des types immunologiques du virus en rapport avec les etudesСepizootologiques sur la fievre aphteuze // Bull. Off. Intern. Epizoot. 1958. - V. 50. — P. 509-516.

127. Buckley L.S., Osborn R.W., Pereira H.G. Laboratory diagnosis of foot-and-mouth disease and swine vesicular disease // Bull. Intern. Epizoot. 1975. - V. 83. -P. 123-129.

128. Buroous R. The persistence survival of foot-and-mouth disease virus in sheep • // J. Hyg. Camb. 1968. - V. 66, № 4. - P. 663-640.

129. Buroous R. Stadies on the carrier state of cattle expozed to foot-and-mouth disease virus // J. Hyg. Camb. 1966. - V. 64, № 1. - P. 81-90.

130. Carpenter Т.Е., Thurmond M.C., Bates T.W. A simulation model of intraherd transmission of foot-and-mouth disease with reference to disease spread before an•• after clinical diagnosis // J. Vet. Diagn. Invest. 2004. -V. 16. - P. 11-16.

131. Catalog Handbook of Fine Chemicals "Aldrich" 1986-1987, USA. 306 p.

132. Clavijo A., Wright P., Kitching P. Developments in diagnostic techniques for differentiating infection from vaccination in foot-and-mouth disease // Vet. J., 2004. -V. 167.-P. 9-22.

133. Cottral G.E., Bachrach H.L. Foot and mouth disease viraemia // Proc. Annu. Meet. USLSA. 1969. - V. 72. - P. 383 - 399.

134. Cottral G.E., Cailiunas P., Camtion R.G. Detection survival of foot-and-mouth disease virus limf nodes of cattle throughout course of infection // Proc. Annu. Meet.

135. USLSA. 1963. - V. 67. - P. 463 - 472.

136. Cottral G.E., Cox B.F., Baldwin D.E The survival of foot-and-mouth disease virus in cured and uncured meat // Amer. J. Vet. Res. 1960. - V. 21, № 81. - P. 288297.

137. Cox B.F., Cottral G.E., Baldwin D.E. Fuzer studies on the survival of foot-and-mouth disease virus in cured and uncured meat // Amer. J. Vet. Res. 1961. - V. 22, № 87. - P. 224-226.

138. Crowther J.R., Abu-Elzeine E.M.E. Application of the enzyme-linked immunosorbent assay to the detection and identification of foot-and-mouth disease virus // J. Hyg. Camb. 1979. - V. 83. - P. 513-519.

139. De Diego M., Brocchi E., Mackay D.K.J., De Simone F. The non-structural polyprotein 3 ABC of FMD as a diagnostic antigen in ELISA to differentiate infected from vaccinated cattle // Arch. Virol.-1997.-V. 142, N 10. P. 2021-2033.

140. Dekker A., Gijsen E. The possible use of native foot-and-mouth disease nonstructural protein ЗА in a serologikal screening test // Vet. Q. 1998.- V.20, Suppl 2. P. S27-S28.

141. De Mello P.A., Honigman M.N., Fernandes M.V. Supervivencia en bovinos del virus modificado de la fievre aftoza // Proc. 5th Congr. Panamer. Vet. Med. Zootech. 1967. - V. 1. - P.58-68.

142. Dhenin Le., Dhenin Lo., Choay J., Thely M. Contribution a l'etude de la septecimie virale au cours des la fievre aphteuse du coboaue et du bovine // Arch, exp Vet. Med. 1961.-V. 15, №2.-P. 267-271.

143. Dhennin L., Froun A., Gioquel L. et al. Risque de dissemination du virus afteuzpar la charcuterie crue //Bull. Acad. Vet. France 1980. - V. 53. - P. 315-322.

144. Disease Information O.I.E. 2005. -V. 18, № 12. - P. 90-91

145. Donn A., Martin L.A., Donaldson A.I. Evaluation of a PCR method fo the detection of persistent FMD in carrier cattle // Europ. Commiss. Control FMD: Sess. Res. Group Stand. Techn. Comm. Vienna, Austria, 19-22 Sept. 1994. Rome, 1994.-P. 16-19.

146. Economic evaluation of foot-and-mouth disease: final report. Ireland, 2002. -124 p.

147. Economic evaluation of foot-and-mouth disease: final report. United Kindom, 2002. - 125 p.

148. El-Shehawy L.E., El-Kilany S., Daoud A.M. 3ABC ELISA for the diagnosis of FMD in Egiptian sheep // Europ. Commiss. Control FMD: Open Sess. Res. Group Stand. Techn. Control FMD. Chaina, Crete (Geece), 12-15 Oct. 2004. P. 52.

149. Ferris N.P., Donaldson A.J. An enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of vesicular stomatitis virus antigen // Vet. Microbiol. 1988. - V. 18, № 3/4. - P. 243-248.

150. Foster M.} Cook A., Cedillo L., Parkhouse R.M. Serological and cellular immune responses to non-structural proteins in animals infected with FMDV // Vet. Q. 1998.- V.20, Suppl 2. - P. S28 - S30.

151. Gallis J.J., Mc. Kercher P.D. Dissemination of FMDV through animal product // Bovin. Pract. 1980. - № 15. - P.l 70 - 174.

152. Gailiunas P., Cottral G.E. The occurrence and survival of foot-and-mouth disease virus in bovin synovial fluid // Bull. Off. Intern. Epizoot. 1964. - V. 61, №1.2.-P. 1-14.

153. Gessler A.E., Bender C.E., Parkinson M.C. A new and rapid method for isolating viruses by selective flluorocarbon de proteinization // New York Acad. Sci. 1956.-V. 18.-P. 707-718.

154. Gibson C.P., Donaldson A.I. Exposure of sheep to natural infection of foot-and-mouth disease virus // Res. Vet. Sci. 1986. - V. 41. - P. 45-49.

155. Gomes I., Monteiro E.M., Darsie G.C. et al Supervivencia do virus da fiebre aftosa tipo Oi em carcacas de ovinos infectados experimentalmente, antes e apos о processo de maturacao // Bol. Centr. Panam. Fiebre Aftosa. 1994. -V. 60. - P. 4959.

156. Growther J.R., Abu-Elzien E.M.E. Application of the enzyme linced immunosorbent assay to the delection and identification of FMD virus // J. Hyg. Camb.-1979.-V. 83.-P. 513-519.

157. Gruia M., Danes M., Borca M. Liguid phase blocking ELISA in FMD antibodydetection // Stud, and Res. Vet. Med. 1995. - N 3. -P. 22-25.

158. Haas В., Sorensen K.J. Comparison of ELISAs for the differentiation of infection from vaccination by detection of antibodies to the non-structural protein

159. ЗАВС of foot-and-mouth disease virus // Europ. Commiss. Control FMD: Sess. Res. Group Stand. Techn. Comm. EU FMD. Cesme, Izmir, Turkey, 17-20 Sept. 2002. -Rome, 2002.- P. 248-253.

160. Hamblin C., Armstrong R.M., Hedger R.S. A rapid enzymlinked immunosorbent assay for the detektion of foot-and-mouth disease virus in epithelial tissues // Vet. Microbiol. 1984. - V. 9, № 5. - P. 435-443.

161. Have P. An assessment of guidelines for treatment of meat from a FMD vaccination zone // Europ. Commiss. Control FMD: Sess. Res. Group Stand. Techn. Comm. EUFMD. Gerzensee, Berne, Switzerland, 16 19 Sept. 2003. - P. 149-152.

162. Hess W.B., Bachrach H.L., Galliz J.J. Persistence of foot-and-mouth disease virus in bovin kidneys and blood as related to the occurrence of antibodes // Amer. J. Vet. Res. 1960.-V. 21. - P. 1104-1106.

163. Ivonne L. Archetti, Amadori M., Donn A. et al. Detection of FMD virus-infected cattle by assement of antibody response in oropharyngeal fluids // J. Clinical Microbiol. 1995. - V. 33. - P. 79- 84.

164. Kaaden O., Eissner G., Bohm H.O. Untersuchungen uber MKS-Virus dauerausscheider bei Vakzinierten und experimentelle infizierten Rindern // Zbl. Vet. Med. R.B. 1970. - Bd 17, H. 4. - S. 486-496.

165. Kapil S., Ahuja K.L., Prasad S. Persistence of foot-and-mouth disease virus type Asia-1 in secretions of vaccinated and unvaccinated calves folowing experimental infection // Rev. Sci. Techn. Off. Intern. Epizoot. 1986. - V. 5, № 3. -P. 715-721.

166. Kitching R.P. Problems of diagnosis of foot-and-mouth disease in domestic animals // FMD: Control strategies: Proc. Int. Sump. 2-5 June 2002 Lyons, France. Paris etc, 2002. - P. 353 - 359.

167. Korn G. Experimented Untersuchungen zum Virusnachweis im Inkulationsstadium der Maul-und-Klauenseuche und zu ihrer Pathogenese // Arch, exp. Vet. Med. 1957. - Bd 11, № 4. - S. 637-639.

168. Kunter E. Die Tenazitat der Maul-und-Klauenseuche-Virus im Zentralnervensystem experimentell infizierter Rinder // Arch. exp. Vet.-med. 1958. -Bd. 12,H. 6.-S. 841-860.

169. Locher F., Suryanarayana V.V.S., Tratschin J.D. Rapid detection and characterization of foot-and-mouth disease virus by restriction enzyme and nucleotide sequence analysis of PCR products // J. Clin. Microbiol. 1995. - V. 33, № 2. - P. 440-444.

170. Lubroth J., Brown F. Identification of native foot-and-mouth disease virus nonstructural protein 2C as a serological indicator to differentiate infected from vaccinated livestock // Res. Vet. Sci. 1995. - V. 59, N 1. - P. 70-78.

171. Mackay D.K.J. Differentiating infection from vaccination in foot-and-mouth disease // Vet. Q. 1998.- V.20, Suppl 2. - P. S2 - S5.

172. Mackay D.K.J., Forsyth M.A., Davies P.R. et al. Differentiating infection from vaccination in foot-and-mouth disease using a panel of recombinant, non-structural proteins in ELISA // Vaccine. 1998. - V.l6, N 5. - P. 446-459.

173. Mackay D.K.J., Forsyth M.A., Davies P.R., Salt J.S. Antibody to the nonstructural proteins of foot-and-mouth disease virus in vaccinated animals exposed to infection // Vet. Q. 1998.- V.20, Suppl 2. - P. S9 - SI 1.

174. Malirat V., Bergmann I.E., Neitzert E. et al. Detection of cattle exposed to foot-and-mouth disease virus by means of an indirect ELISA test using bioengineer nonstructural polyprotein 3ABC // Vet. Q. 1998. - V. 20, Suppl. 2. - P. S24 - S26.

175. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals O.I.E. Paris, 2004.-V. l.-P. 110-118.

176. McVicar J.W., Sutmoller P. Foot-and-mouth disease: the agar gel diffiizion precipition test for antibody to virus infection-associated (VIA) antigen as a tool for epizootologic surveys // Amer. J. Epidemiol. 1970. - V. 92, № 4. - P. 273-278.

177. McVicar J.W., Graves J.H., Sutmoller P. Growth of foot-and-mouth disease virus in the bovine pharynoc // Proc. Meet. USA Anim. Helth Assoc. 1970. - V. 74. - P. 230-234.

178. Meier F. Duration of persistence of foot-and-mouth disease virus in and its excretion by infected pigs // Mh. Tierheilk. 1959. - Bd 11. - S. 109-123.

179. Moonen P., Boonstra J., Hakze van der Honing R. et al. Validation of LightCycler-based revers transcription polymerase chain reaction for the detection of foot-and-mouth disease virus //J. Virol. Meth. 2003. - V. 113. - P. 35-41.

180. Ф 200. Pages W.H. La importancia de las areas libres de fiebre aftosa para los paises impotadores de productos у subproductos pacuarios // Rev. Sci. Off Intern. Epizoot. -* 1982.-V. 1,№3. P. 741-772.

181. Parida S., Paton D., Cox S. et al. Secretory Ig A as an indicator of oropharyngeal FMDV replication // Europ. Commiss. Control FMD: Open Sess. Res. Group Stand. Techn. Control FMD. Chaina, Crete (Geece), 12-15 Oct. 2004. P. 57.

182. Paton D. J., Parida S., Anderson J. Detection of FMD infection in vaccinated animals // Europ. Commiss. Control FMD: Sess. Res. Group Stand. Techn. Comm. EUFMD. Gerzensee, Berne, Switzerland, 16-19 Sept. 2003. P. 44-51.

183. Perry B.D., Randolf T.F. The economics of foot-and-mouth disease its control and its eradication // FMD: Control Strategies: Proc. Int. Sump. 2-5 June 2002 Lyons, France. Paris etc, 2002. - P. 23 - 41.

184. Prasad J.I., Kumar S. Persistence of foot-and-mouth disease virus type "Asia -1" istades in the excretions and secretions of experimentally infected cattle // Indian J. Anim. Sci. 1981. - V. 51, № 9. - P. 834-837.

185. Rasmussen T.B., Uttenthal A., de Strieker K. et al. Development of a novel ® quantitative real-time RT-PCR assay for the simultaneous detection of all serotypesof foot-and-mouth disease virus // Arch. Virol. 2003. V.148. - P. 2005-2021.

186. Reid S.M., Ferris N.P., Hutchings G.H., Alexandersen S. Diagnosis of foot-and-mouth disease virus by automated RT-PCR // Europ. Commiss. Control FMD: Sess. Res. Group Stand. Techn. Comm. EU FMD. Cesme, Izmir, Turkey, 17-20 Sept. 2002.-P. 203-209.

187. Richman D.D, Cleveland P.H., Redfield D.C. et. al. Rapid viral diagnosis // J. Inf. Dis. 1984. - V. 149, № 3. - P. 298-310.

188. Rohrer H., Oiechnowitz A.F. Maul-und-Klauenseuche. Jena; Fischer, 1980. -708 S.

189. Rosado J. M.M. Papel de las canales subproductos del cerdo en la difusion de la fiebre aftosa//HygiaPecoris. -1981. V.3,№ l.-P. 173-176.

190. Ryan E., Durand S., Brownlie J., Alexandersen S. The pathogenesis of FMD in young lambs // Europ. Commiss. Control FMD: Open Sess. Res. Group Stand. Techn. Control FMD. Chaina, Crete (Geece), 12 15 Oct. 2004. - P. 38.

191. Salt J.S. The carrier state in foot-and-mouth disease. An immunologikal rewiev // Br. Vet. J. - 1993. - V. 149. - P. 207-223.

192. Sammin D., Paton D., Hutchings G. et al. Serological responses in relation to vaccination and infection in Zimbabwe cattle following outbreaks of FMD // Europ.

193. Commiss. Control FMD: Open Sess. Res. Group Stand. Techn. Control FMD. • Chaina, Crete (Geece), 12-15 Oct. 2004. P. 47.

194. Savi P., Baldelli В., Morozzi A. Presence et some persistence du virus aphteux dans les viandes de porcins et de bovins et dans leurs produits derives // Bull. Off. Intern. Epizoot. 1962. - V. 57, № 5-6. - P. 853-890.

195. Sharma S.K., Murty D.K. Foot-and-mouth disease in sheep: pattern of virus excretion and distribution in the experimentally infected animals // Indian J. Anim. Sci. 1981. - V. 51, № 1. - P. 61-66.

196. Shen F., Chen P.D., Walfield A.M. et al Differentiation of convalescent animals from those vaccinated against foot-and-mouth disease by a peptide ELISA //

197. Vaccine. 1999. - V.17, N 23-24. - P. 3039 - 3049.

198. Shin J.-H., Sohn H.-J., Choi K.-S. et al. Identification and isolation of foot-and-mouth disease virus from primary suspect cases in Korea in 2000 // J. Vet. Med. Sci. -2003.-V. 65, № l.-P. 1-7.

199. Skinner H.H., Henderson W.M., Brooksby J.B. The use of unveaned whit mice in foot and mouth disease research // Nature. 1952. - V. 169. - P. 794 - 799.

200. Sutmoller P., Gaggero C.A. Foot-and-mouth disease carriers // Vet. Rec. -1965. V. 77, № 33. - P. 968-969.

201. Terpstra C. Pathogenesis of foot-and-mouth disease in experimentally ifected pigs // Bull. Off. Intern. Epizoot. 1982. - V. 77, № 5-6. - P. 859-874.

202. Terreran M.T., Netto P. Observacoes sobre a persistencia do virus de febre • aftosa em orgaos de suinos inoculados experimentalmente // Biologico. 1983. - V.49,№9-10.-P. 253-254.

203. Tewari S.C., Kant R., Prasad S. et.al. A note on the use of bovine kidney cells culture for recovery of foot-and-mouth disease virus from field samplex // Bull. Off. Intern. Epizoot. 1980. - V. 92, № 2-4. - P. 167-169.

204. Trautman R., Bennet C.E. Neutralisation and protection bioassays for foot-and-mouth disease virus // FAMD Bull. -1978. № 5. - P. 23.

205. Uhlman W. Die Persistent des Maul-und-Klauenseuche-Virus in Fleisch geschlachteter naturlich und experimentell infizierter Rinder und Schweine // Bull. Off. Intern. Epizoot. 1962. - V. 57, № 5-6. - P. 824-847.

206. Waldman O., Reppin N. Die Dauer der Infektiositat der Mundschleimhaut bei der Maul-und-Klauenseuche-Virus des Rindes // Arch. Wiss. Prakt. Tierhield. 1927. - Bd. 55. - S. 407-429.

207. Waldman O., Trautwein K., Pyl W. Die Persistent des Maul-und-Klauenseuche-Virus im Korper Durchseuchter Tiere und diene Ausscheidung // Zbl. I. Orig. 1955. - Bd. 162, № 4. - S. 230-238.

208. Wesslen Т., Albertson P.A., Philipson L. Concentration of animal viruses using two phase systems of aqueous polymer solutions // Arch. ges. Virusforsch. -1959. V. 9, № 4. - P. 510 - 520.

209. Wisniewski J. The appearence and survial of foot-and-mouth disease virus in bovin carcasses of diseased animals // Bull. Inst. Vet. in Pylawy. 1963. - V. 7, № 4. -P. 57-56.

210. Yadin H. Small ruminants as FMD virus carriers // Europ. Commiss. Control FMD. Rep. Res. Group Stand. Tech. Comm., Vladimir, Russian Federation, 20-22 Sept., 1995.-Rome, 1995. App. 3. - P. 26-32.

211. Yang P.C., Chu R.M., Chung W.B., Sung H.T. Epidemiological characteristics and financial costs of the 1997 foot-and-mouth disease epidemic in Taiwan // Vet. Rec. 1999. - V. 145, № 25. - P.731 - 734.

212. Zhang Z., Alexandersen S. Detection of carrier cattle and sheep persistently infected with foot-and-mouth disease virus by a rapid real-time RT-PCR assay // J. Virol. Meth. 2003. - V. 111. - P. 95-100.