Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммунобиологические свойства вируса ящура типа Азия-1, штамм ь 1987/амурский/2005, и усовершенствование диагностических тест - систем

Па правах рукописи

□03057884 фомина Светлана Николаевна

иммунобиологические свойства вируса ящура

i пил лзия-1, ш1л1чм л»1987/амурскни/2005, и усовершенствование диагностических тест- систем

О

16 00 03 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

автореферат

днсссркщнм па сипсклшс ученой ыепенн кандидата ветеринарных наук

Владимир - 2007

003057884

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный цсшр охраны здоровья животных», г Владимир

Нлучиыи руководитель доктор ветеринарных наук, профессор

Михалншин Валерий Васильевич

Официальные оппоненты доктор ветеринарных наук, профессор

Мищенко Владимир Александрович

ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г Владимир,

доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник, Коломыцсв Алексей Александрович ГНУ «Всероссийский научно-

исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии»

(ВНИИВВиМ), г Покров Владимирской области

Ведущая организация ГПУ «Всероссийский научно-

исследовательский и технологический институт биологической промышленности» (ВНИТИБП), г Щелково Московской области

Защита диссертации состоится « /6 » мая 2007 г в 10 часов на заседании диссертационного совета при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу 600901, г Владимир, мкр Юрьевец, ФГУ . «Федеральный центр охраны здоровья животных»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Автореферат раюслаи « /Д, «шреля_ 2006 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, старший научный сотрудник С&-Г М Семенова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Аюуальиость темы. Ящур является одной из экономически важных болезней животных во всем мире, так как им болеют сельскохозяйственные и дикие животные многих видов (Бойко А А ,1971, Ререр X , 1971, Бурдов А Н с соавг, 1990, Захаров ВМ, 2002, ЬеГогЬап, 2003, Груздев КН с соавт, 2005) Наряду с непосредственными убьиками, причиненными вирусом ящура популяциям животных, ущерб слагается из введения торговых ограничений, которые относятся как к животным, так и к продуктам животного происхождения

Одним из основных методов профилактики ящура является сиегсмашчсская иммупи ыция сельскохомиивсппых живошых пнактивированными моио- и поливаленшыми вакцинами Непременным условием противоэпизоотичсской эффективности противоящурных вакцин является соответствие антигенных свойств производственного (вакцинного) штамма вируса ящура эпизоотическим штаммам вируса, которое определяется на основании систематического и всестороннего сравнительного изучения ашшейных свойств штаммов вируса ящура В результате этой работы решается вопрос о необходимости подготовки нового производственного штамма вируса, или о применении вакцины из ранее используемого для изготовления производственного штамма В случае Л111ШС11НОЮ 01ЛИЧИЯ эпнзоошческич Ш1.1ММОВ 01 производственного штамма и наличия угрозы широкого распространения ящура из числа выделенных эпизоотических штаммов производится подготовка нового производс1 венного ишамма вируса ящура

Эпизоотии, вызванные вирусом ящура типа Азия-1, наблюдаются в странах Азии, Среднего и Ближнего Восюка Вирус этого типа и в настоящее время представляет угрозу для этих регионов, так как вспышки ящура периодически возникают в различных государствах, в том числе и граничащих с нашей страной

Согласно новой редакции «Санитарного кодекса наземных животных МЭБ, 2006 г » диагноз на ящур устанавливается в случае

• выделения вируса от животных или продуктов животного происхождения,

• выявления антигена вируса ящура или РНК вируса от животных с клиническими признаками ящура или при подозрении на ящур,

• выявления антител к структурным или неструктурным белкам вируса ящура, не связанных с вакцинацией, в случае клинического проявления ящура или при подозрении на ящур

Поэтому особое значение приобретает проблема диагностики и профилактики этой болезни Опасность, которую представляет ящур, диктует необходимость постоянного усовершенствования методов и средств его диагностики, изучения свойств вновь выделенных эпизоотических штаммов возбудителя, определения их эпизоотической опасности и степени соответствия производственным и ранее выделенным штаммам

Долгие годы методами идентификации вируса ящура были реакции связывания комплемента (РСК) и вируснейтрализация (РН) В качестве биологического метода использовали выделение вируса в лабораторных тест-системах Совершенно уникальными возможностями обладают некоторые новые методы, такие как, иммупоферментный аннлиз (ИФА) Для пего характерна высокая чувствительность, простота постановки и быстрота получения результата По специфичности результаты ИФА согласуются с общепринятыми вирусологическими и серологическими методами, а по чувствительности имеют явные преимущества ИФА позволяет получить больше информации об антигенной структуре вирусов в отличие от традиционных серологических реакций

В связи с тем, что на Дальнем Востоке России в 2005 г был зарегистрирован ящур типа Азия-1, который экзотичен для России и занесен из Китая, возникла необходимость изучении штамма вируса ящура типа Азия-1, который был выделен в 2005 г от заболевших животных Указанные

вопросы являются актуальными, что и послужило главной целью проведения наших исследований

Цель и задачи исследований. Главной целью наших исследований было изучение иммунобиологических свойств вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005 и усовершенствование диагностического набора для выявления и идентификации вируса ящура методом иммуноферментного анализа

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

- изучить иммунобиологические свойства штамма вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005, выделенного на территории Российской Федерации в 2005 г,

- подготовить предложения по использованию штамма вируса ящура №1987/Амурский/2005 для изготовления диагностических и вакцинных препаратов,

- получить диагностические препараты на актуальные эпизоотические штаммы вируса ящура для иммуноферментного анализа,

усовершенствовать набор для идентификации в ИФА производственных и эпизоотических штаммов вируса ящура типов А, О, Азия-1,

Научная новизна.

Научная новизна состоит в том, что в результате проведенных исследований

Изучены иммунобиологические свойства штамма вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005, выделенного на территории Российской Федерации в 2005 году, который значительно отличается от вакцинных и ранее изученных эпизоотических штаммов вируса ящура типа Азия-1;

Изучены основные биологические свойства антигена вируса ящура типа Азия-1 №1987/Амурский/2005, используемого для изготовления инактивированной вакцины,

Показаны антигенные взаимоотношения между производственными и эпизоотическими штаммами вируса ящура типа Азия-1,

Получены штаммоспецифические компоненты для иммуноферментного анализа и реакции связывания комплемента на штамм вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005

Усовершенствован диагностический набор для определения антигена вируса ящура иммуноферментным анализом;

Определены оптимальные варианты постановки ИФА при выявлении и идентификации штаммов вируса ящура,

Изучена диагностическая ценность ИФА в сравнении с другими серологическими реакциями, используемыми в лабораторной диагностике вируса ящура

Практическая ценность работы. Изученный штамм вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005 депонирован в коллекции микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» и рекомендован для изготовления диагностических препаратов и противоящурной вакцины против этого типа вируса ящура

Получены диагностические препараты с использованием изученного штамма Азия-1 №1987/Амурский/2005

Усовершенствован и внедрен в производство набор для выявления антигена вируса ящура иммуноферментным анализом, ТУ 9388-13800495527-2005 от 30 Об 2006 г.

Апробация результатов работы. Результаты исследований по теме диссертации апробированы на научных конференциях «Золотое кольцо России» - 4-й региональной конференции, посвященной проблеме профилактики и лечения домашних животных и птицы. — Владимир, 2001, международной научной конференции, посвященной 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных» г Владимир, 2003г., 2-й международной научно-практической конференции

«Актуальные вопросы зоотехннической науки и практики, как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья сельскохозяйственных животных», г Ставрополь, 2003г, б-ом международном конгрессе ветеринарной вирусологии «Эволюция и персистенция вируса», прошедшем в гСант-Мапо во Франции в 2003 году, международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных», г Владимир, 2004

«Набор для выявления антигена вируса ящура в пробах материала иммуноферментным анализом» был представлен на выставке продукции ФГУ «ВНИИЗЖ», при проведении Всероссийского научно-практического семинара-совещания ветеринарных специалистов «Энизоотологичсский мониюринг, профилактика и меры борьбы с болезнями КРС и свиней», 2005г,г Владимир

Основные положения диссертации были доложены на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Основные положения, выносимые на защиту:

- Адаптационные свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа Азия-1 №1987 /Амурский/2005

- Результаты комплексного изучения антигенного родства штамма вируса ящура Азия-1 №1987 /Амурский/2005

- Получение штаммоспецифических диагностических препаратов на основе штамма Азия-1 №1987 /Амурский/2005

- Результаты практического применения эпизоотического штамма вируса ящура типа Азия-1 №1987 /Амурский/2005

- Диагностический набор для определения антигена вируса ящура методом иммуноферментного анализа и его практическое применение

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, список

используемой литературы, практические предложения и приложения Список литературы включает 157 источников, из них 63 источников иностранных авторов Работа иллюстрирована 20 таблицами, 3 рисунками В приложении к диссертации имеется 4 документа, подтверждающих результаты исследований и их внедрение

Автор выражает искреннюю благодарность сотрудникам лаборатории «Ящура и везикулярных болезней», лаборатории «Биотехнологии», лаборатории «Диагностики особо опасных болезней животных», Отделу биологического и технологического контроля, научной библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» за практическую помощь при выполнении и оформлении диссертации

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы Штаммы вируса ящура. В исследованиях использовались штаммы вируса ящура А22 №550, О, №194, Азия-1 №48, Азия-1 №1737/Грузия/2000, Ази я -1 № 173 О/Иран58/99, Азия-1 №1731/Таиланд2/95, Азия-1 /Ирак1/73, Азия-1 №1960/Таджикистан/2004, Азия-1/Шамир 3/89, Азия-1/Пакистан 1/54

Впервые выделенный в Российской Федерации штамм вируса ящура типа Азия-1 № 1987/Амурский/2005

Вакцины. Вакцины, используемые в данной работе, включали инактивированные сорбированные коммерческие и экспериментальные серии, изготовленные ФГУП «Щелковский биокомбинат» и ФГУ «ВНИИЗЖ», а также инактивированные эмульсионные вакцины производства фирмы «Bayer AG» (Германия)

Животные. В опытах использовался крупный рогатый скот 8—10 месячного возраста, черно-пестрой породы, массой 250 - 295 кг Все животные были получены из благополучных по инфекционным болезням хозяйств Владимирской области

Для получения штаммоспецифических сывороток, проверки иммуногенности производственной и экспериментальной вакцин, адаптации и титрования вируса ящура использовали клинически здоровых морских свинок массой 400-450 г и кроликов, массой не менее 2,5-3,0 кг.

Культуры клеток. В качестве чувствительной тест-системы для титрования вирусов, их репродукции и постановки реакции нейтрализации использовались монослойные культуры перевиваемых клеток почки новорожденного сирийского хомячка (ВНК-21), почки сибирского горного козерога (ПСГК-30) и почки свиньи (IB-RS-2), а также культура первично -трипсинизированных клеток почки поросят (СП)

Оборудование. В опытах использовались, спектрофотометр - ридер «Униплан» (Россия), С02 -инкубатор «Sanyo» (Япония), ламинарный шкаф «Babcock-BSH» (ГДР), инвертированный микроскоп «Olimpus» (Япония)

Адаптация эпизоотических изолятов вируса ящура к культуре клеток и лабораторным животным. Адаптацию вируса к культуре клеток и лабораторным животным проводили общепринятым методом.

Вирус считали адаптированным к организму морских свинок, если первичные афты образовывались через 20-26 часов, а генерализация процесса наступала через 48 часов, инфекционная активность не менее 4,5 lg ИД50.

Первичную и перевиваемые культуры клеток инокулировали 10% суспензией в дозе 0,1 мл В последующих пассажах для заражения использовали культуральные суспензии Вирус считали адаптированным к культуре клеток, если он вызывал выраженное ЦПД, через 18-24 часа после инфицирования

Выделение вируса ящура. Выделение вируса ящура с использованием чувствительных культур клеток осуществляли согласно «Методическим указаниям по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура» утвержденным Департаментом ветеринарии МСХ РФ 10 11 2002

Реакция связывания комплемента. При выполнении данной работы идентификацию штаммов вируса ящура, определение комплемент-

связывающей активности и специфичности полученных антигенов и сывороток проводили путем постановки РСК в соответствии с ГОСТ 25384 « Методы лабораторной диагностики ящура»

Изучение антигенного родства методом РСК выполняли согласно «Методическим указаниям по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура», утвержденным Департаментом ветеринарии МСХ РФ 10 11.2002

Реакция нейтрализации. Реакция ставилась на планшетах фирмы «Costar» микрометодом согласно «Методическим указаниям по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура», утвержденным Департаментом ветеринарии МСХ РФ 10 И 2002г

Имунноферментный анализ. Выделение вируса ящура в патологического материала методом ИФА выполняли согласно «Временному наставлению по применению набора для выявления антигена вируса ящура иммуноферментным анализом», разработанному в ФГУ «ВНИИЗЖ» и утвержденному Департаментом ветеринарии МСХ РФ 22 04 2002.

Выявление и определение уровня антител к вирусу ящура в сыворотке крови осуществлялось с помощью «Набора для выявления антител к вирусу ящура иммуноферментным анализом» производства ФГУ «ВНИИЗЖ» согласно «Методическим указаниям по выявлению и идентификации штаммов вируса ящура», утвержденным Департаментом ветеринарии МСХ РФ 10 11 2002г, коммерческих наборов, полученных из BCJI (Пирбрайт, Великобритания)

Определение иммуногенной активности противоящурных вакцин.

Иммуногенные свойства противоящурных вакцин определяли на основании ТУ 9384-007-00495527-200 «Вакцина против ящура сорбированная моно- и поливалентная (из вируса, выращенного в клетках ВНК-21)» от 02 02 2000г

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Изучение иммунобиологческих свойств штамма вируса ящура Азия-1 типа №1987/Амурскнй/2005 До 2005 года ящур, вызванный вирусом ящура типа Азия-1, не регистрировался на территории Российской Федерации Однако, в 2005 году ситуация значительно осложнилась, в связи с заносом экзотического для страны, вируса ящура типа Азия-1 в Амурскую область, Хабаровский и Приморский края, Читинскую область

Первый очаг ящура типа Азия-1 был зарегистрирован в июне 2005 года в с Буссе Свободненского района Амурской области В связи с наличием на территории РФ единственного очага ящура типа Азия-1, с учетом действующего законодательства и рекомендаций МЭБ, 18-19 июня 2005 г все животные в данном неблагополучном пункте были отчуждены и уничтожены

Однако, во второй половине августа 2005 года новые очаги ящура типа Азия-1 были зарегистрированы почти одновременно еще в двух регионах в Хабаровском и Приморском краях в населенных пунктах, расположенных на границе с Китаем В это же время поступило сообщение о возникновении ящура и в Монголии

В Хабаровском крае ящур был установлен в Бикинском и Вя)емском районах Более широкое распространение ящур типа Азия-1 получил в Приморском крае Всего в 9 неблагополучных по ящуру пунктах Приморского края заболело более 1000 голов КРС

В декабре 2005г в Дальневосточном федеральном округе было выявлено два новых неблагополучных по ящуру пункта в двух районах, пограничных с Китаем Единичные случаи заболевания зарегистрировали в с Куприяново Михайловского района Амурской области иве Котиково Вяземского района Хабаровского края В 2006 г были отмечены вспышки ящура типа Азия-1 п с Средняя Борзя Калганского района Читинской области иве Куропатино

Тамбовского района Амурской области, расположенных вблизи границы Китая

Следуем ошейки, чю исследования, проведенные Л В Щербаковым с соавт (2006), показывают, что данные вспышки ящура вызваны вирусом, аналогичным штамму Азия-1 №1987/Амурский/20005

Биологические свойства вируса ящура штамма Азии-1 №1987/Амурский/20005

Из вируссодержащих материалов (афты), полученных от больного КРС из эпизоотического очага, готовили 10% суспензию материала, которую использовали для заражения клеточных культур СП, ПСГК-30, ВПК-21, 1В-1*8-2 Культивирование вируса проводили в плоских стеклянных сосудах (матрасах) емкостью 50 и 1500 см1

Вирус считали адаптированным, если 90-100% ЦПД в монослое культуры клеток наступало через 18-26 часов после заражения Полученные результаты представлены в таблице 1

Таблица 1

Биологические свойства эпизоотического штамма вируса ящура

Азия-1 № 1987/Аму рскни/2005.

Сшлема репродукции вируса Кол-во пассажей Время проявления бполо!ичсской активном и, часы Характсрисшка.цитированною м.перн.им

Л Kl н иное п. в 1'СК I игр вируса, lg 1 ЦД50/мл Содержание, мк|/мл

ОВБ 146S 146 S +75S

СИ 3 18-24 1 4 6,0±0 25 - - -

па К-30 3 18-20 1 4 6,33±0 25 0,54 0,2 0,29

IB-RS-2 3 18-20 1 8 7 66±0,25 1,4 0,47 1,0

ВНК-21 3 18-20 1 12 8,25±0,25 0,79 0,4 0,68

Морские свинки 6 21-24 - 5,5±0,25 - - -

Изучение чувствительности лабораторных животных к вирусу ящура типа Азия-1 №1987 /Амурский/2005 проводили на морских свинках путем

введения вирусосодержащей суспензией в плантарную поверхность задних лапок методом туннелирования Вирус считали адаптированным к морским свинкам, если в течение 2-3 последовательных пассажей он вызывал у 95% морских свинок образование первичных афт через 18-26 часов, а генерализацию не позднее 5 суток после заражения (таб. 1)

Результаты показывают, что изолят Азия-1 №1987 /Амурский/2005 адаптирован на третьем пассаже, вызывая 100% ЦПД через 18 часов после инокуляции культуры клеток Комплементсвязывающая активность в РСК составила 1 8-1 12 Наибольшее накопление вируса происходит в культуре клеток ВНК-21 и 1В-118-2 в титрах 7,66-8,25 ^ ТЦЦ5о/см3

Кроме того, данный штамм был адаптирован к культурам клеток СП и ПСГК-30 Активность в РСК составила 1 4, вирус накапливается в титрах 6,33-7,66 ^ ТЦЦ50/см3

У морских свинок полное созревание афт с большим количеством афтозной жидкости на месте введения наблюдали через 21-28 часов после введения вируса на уровне 5-6 пассажа

Изучение антигенного родства штамма вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005 Антигенное родство исследуемого эпизоотического штамма Азия-1 №1987/Амурский/2005 с другими штаммами вируса ящура данного типа изучали в РСК по 100% гемолизу с вычислением «Я» по формуле Архетти и Хорсвала Данные исследования проведены совместно с сотрудниками лаборатории ящура и везикулярных болезней ФГУ «ВНИИЗЖ» к в н. В К Спириным, к в н А И Егоровой, ветеринарным врачом Т Ф Кошецян

Результаты изучения двустороннего антигенного родства вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005 с производственными и эпизоотическими штаммами этого типа, выделенными ранее, представлены в таблице 2

Таблица 2

Антигенный спектр штамма вируса ящура серологического типа Азия-1 №1987/Амурский/2005 по данным РСК

Сравниваемые штаммы Показатели антигенного родства штаммов

Г1 Г2 R%

Азия-1 №48 Азия-1 № 1987/Амурский/2005 0,16 0,42 26

Азия-1 №173 7/Грузия/2000 Азия-1 № 1987/Амурский/2005 0,08 0,22 13

Азия-1 №1730/Иран 58/99 Азия-1 №1987/Амурский/2005 0,07 0,64 23

Азия-1 №1731/Таиланд 2/95 Азия-1 № 1987/Амурский/2005 0,22 0,80 42

Азия-1 №1960/Таджикистан/2004 Азия-1 № 1987/Амурский/2005 0,28 0,56 40

Азия-1/Шамир 3/89 Азия-1 № 1987/АмурскиЙ/2005 0,20 0,15 17

Азия-1 /Пакистан 1/54 Азия-1 № 1987/Аму рский/2005 0,23 0,14 18

Азия-1 /Иран 1/73 Азия-1 № 1987/Аму рский/2005 0,18 0,60 33

Анализируя данные таблицы 2, следует отметить, что согласно критериям Бруксби (1968) эпизоотический штамм Азия-1 №1987/Амурский/2005 отличается от всех исследованных штаммов вируса ящура типа Азия-1 и значительно отличается от вакцинных штаммов Азия-1 №48 И Азия-1 Шамир 3/89 (R% составило 26% и 17% соответственно) Кроме того, он отличается от ранее выделенных эпизоотических изолятов вируса ящура типа Азия-1.

В связи с тем, что, по данным Всемирной справочной лаборатории, вакцина из штамма Азия-1 /Шамир 3/89 имеет широкий антигенный спектр, нами было проведено определение антигенного родства эпизоотического штамма Азия-1 №1987/Амурский/2005 и этого вакцинного штамма в РН В нашей работе использовались сыворотки крови молодняка КРС, отобранной на 21 сутки после иммунизации двумя сериями моновалентной эмульсионной инактивированной вакцины против ящура типа Азия-1 /Шамир 3/89 и одной серией инактивированной эмульсионной вакциной против ящура типов «А22,0, Азия-1» фирмы «Bayer AG»

Вначале сыворотки крови вакцинированных животных исследовались индивидуально в РН и ИФА для определения титра вируснейтрализующих противоящурных антител Данные представлены в таблице 3

Таблица 3

Степепь антигенного родства (Г|) вируса Азня-1 1987 по отношению к штамму Aiiiti-1 Shamir 3/89

11аимснованпс вакцины

№№ Вакцина из штамма Азия-1 /Шамир 3/89 трехвалентная

из штаммов

животных моновалентная №1 моновалентная №2 A¡2, О, Азия-1

РН ИФА РН ИФА I'll ИФА

1 0,25 0,26 0,17 0,24 0,35 0,23

2 0,20 0,24 0,28 0,25 0,4 0,25

3 0,25 0,25 0,20 0,20 0,3 0,25

4 0,30 0,2 0,15 0,19 0,36 0,24

5 0,22 0,25 0,22 0,25 0,32 0,21

Некоторые исследователи (Rweymamu ММ, 1984, Шажко ЖА, 1986, Мищенко В А, 1988, Patón DJ, 2005) считают, что использование индивидуальных проб сывороток крови при определении антигенного родства может стать причиной диагностических ошибок Поэтому необходимо использовать пул сывороток

Исходя из этого, каждую группу сывороток (таблица 3) объединяли в пул для нивелирования индивидуальных различий В пулы входили сыворотки, имеющие приблизительно одинаковые титры антител Каждую смесь сывороток исследовали в РН с вирусом ящура следующих штаммов вируса ящура Азия-1/1Памир 3/89, Азия-1 Иран 58/99, Азия-1 № 1987/Амурский/2005

Параллельно с PII сыворотки были исследованы в жидкофазном блокирующем вариатс ИФА В реакции использовались ппактивированные

копаемipiipouniuibic лишены шишмои вируса ящура Лзия-1 /Шампр 3/89, Азия-1 Иран 58/99, Азия-I №1987/Амурский/2005

IJc3y;ibiaibi данных исслсдоваиий представлены в таблице 4

Таблица 4

Слепень aiiiai eiiiioi о роде та (г,) штммои вируса шцура Алш-1

№ пула иммунных сывороток к вирусу ящура штамм Азия-1 /Шамир 3/89 Азия-1 №1987/Амурский/2005 Азия-1 Иран 58/99

PI1 ИФА PII ИФА

1 пул 0,25 0,25 0,7 0,5

2 пул 0,18 0,25 0,5 0,5

3 пул 0,35 0,25 0,7 0,5

В результате проведенных опытов установлено значение антигенного родства - Г|, равное 0,25 в ИФА для штамма Азия-1 №1987/Амурский/2005, что по критериям D J Patón (2005) свидетельствует о значительном отличии эпизодическою пзоляы от вакцинного штамма, следовательно вакцина, изготовленная из штамма Азия-1 Шамир 3/89, не будет защищать от нолевою и юля 1.1 Аши-1 №1987/Амурский/2005

Полученные данные исследования совпадают с резулышами омы юн осуществленными в лаборатории диагностики особо опасных болезней животных ФГУ «ВНИИЗЖ», А В Щербаков с соавт (2006) Результаты филогенетического анализа показали, что изоляты вируса ящура, выделенные в Амурской области, Хабаровском и Приморском краях, значительно отличаются от вакцинного штамма, а также от эпизоотических штаммов вируса ящура типа Азия-1, выделенных до 2005г

Изучение иммунобиологических cboHcib вируса шнура Ллш-1 №1987/Амурскии/2005 на мо|>ских свинках

При сравнительной оценке иммуногенной активности использовалась экспериментальная моповалентная инактивированная сорбированная вакцина из иламма Азия-1 №1987/Амурскии/2005 Иммуногенпую акшвпоспь данной вакцины сравнивали с моновалентной сорбированной вакциной из штамма Азия-1 Иран 58/99

При определении иммуноюппой активности каждого препарата использовали по 128 морских свинок и 4 i руины морских свинок, по 6 животных в каждой, для контроля Вакцины инокулировали в цельном виде и в разведении 13, 1 9 и 1 27, разведения делали на фосфатном буферном растворе Каждое разведение вакцины вводили 8 морским свинкам, которых содержали в отельных вольерах

Вакцину вводили внутримышечно в объеме 2 см3 в область правого и левого бедра по 1 см3 одновременно

Каждую вакцину исследовали на иммуногенпую активность против вирусов ящура Азия-1 №48; Азия-1 /Иран 58/99, Азия-1 «Шамир» и Азия-1 №1987/Амурский/2005, адаптированных к организму морских свинок Всем вакцинированным жнвошым через 21 cymi после иммунизации и контрольным животным вводили вирус ншрадермалыю в плантарную поверхность правой задней лапки в дозе 104 ryWO.lcM3 Учет результатов заражения проводили через 3, 5 и 7 суток и оценивали по генерализации ящурного процесса на передних и левой задней лапках Генерализацией считали образование вторичных афт хотя бы на одной лапке, в которую не вводили вирус Контроль вакцины считали действительным, если контрольные животные заболевали генерализованной формой ящура

Результаты изучения иммуногенной активности моновалентных инактивированных противоящурных вакцин из штамма Азия-1 №1987/Амурский/2005 и штамма Азия-1 Иран 58/99, при контрольном

заражении гомологичными и гетерологичными вирусами морских свинках (МС) представлены в таблице 5

Таблица 5

Перекрестное испытание на морских свинках нммуногенной активности вакцины из вируса ящура Азня-1 Иран 58/99 и вируса ящура Азия-1 №1987/Амурскнн/2005

Накнипа из пмлмма вируса ящура Вакцина из штамма вируса

Штаммы ВЯ Азия-1для контрольного заражения Лзия-1 Ирам 58/99 ящура Лзия-1 №1987/Лмурский/2005

ИмДм г, по ИмД5„ ГЩ» г, по пд5„ ИмДя Г| по ИмД50 ПД50 Г| по ПД»)

№48 0,072 0,75 27,78 0,75 0 23 0,2 8,69 0,2

Иран 58/99 0,054 1 37,04 1 0,23 02 8,69 0,2,

/Шамир 3/89 0,063 0,86 31,75 0,86 0,065 0,69 30,76 0,69

№1987 /Амурский/2005 0 098 0,55 20,4! 0,55 0,045 1 42,5 1

Примечание ИмДзо - 50% иммунизирующая доза в прививном объеме для МС, ПДчо - 50% протективная доза в прививном объеме для МС

Из приведенных в таблице 5 данных видно, что в прививном объеме вакцины из штамма Азия-1 №1987/Амурскнй/2005 содержалось 42,5 ПД50МС к гомологичному штамму, а к гетерологичным - Азия-1 №48 - 8,69 ПД50МС, Азия-1 /Иран 58/99 - 8,69 ПД50МС, Азия-1 «Шамир» - 30,76 ПД50МС

В то же время количество ПД50МС в прививной дозе вакцины из штамма Азия-1 Иран 58/99 по отношению к гомологичному возбудителю составляет 37,04 ПД50МС, а к гетерологичным Азия-1 №48 - 27,78 ПД50МС, Азия-1 «Шамир» - 31,75 ПД50МС и Азия-1 №1987/Амурский/2005 - 20,41 ПД50МС соответственно

Проведенные исследования показывают, что штамм Азия-1 №1987/Амурский/2005 по иммунобиологическим свойствам отличается от штаммов Азия-1 №48, Азия-1 /Иран 58/99, Азия-1 «Шамир» (п = 0 2, 0,2, 0,69 соответственно)

Вакцина из штамма Азия-1 Иран 58/99 иммуногенна в отношении гетерологичных штаммов Азия-1 №48, Азия-1 «Шамир» и менее иммуногенна в отношении штамма Азия-1 №1987/Амурский/2005.

Результаты изучения иммунологических свойств инактивированной сорбированной вакцины против ящура типов О1 — А22 — Азия-1

В связи с возникновением вспышек ящура типа Азия-1, вызванных отличающимся возбудителем (степень антигенного родства по данным РСК 26%), была изучена иммуногенность и протективная активность коммерческой инактивированной сорбированной вакцины против ящура типов А22 - 0| — Азия-1 на крупном рогатом скоте

С этой целью были сформированы две партии животных по 17 голов в каждой Каждая партия животных содержалась в отдельном боксе Животных в каждой партии разделили на 4 группы, три группы по 5 животных и одна группа по 2 головы — контрольная группа

Группы по 5 голов были иммунизированы в дозах 2,0 см3, 0,5 см3, 0,125 см3, контрольные животные не иммунизировались

На 21 сутки после иммунизации одну партию животных заразили производственным штаммом вируса ящура, гомологичным возбудителю, используемому в вакцине Вторая партия животных была заражена эпизоотическим вирусом (Азия-1 № 1987/Амурский/2005).

На восьмые сутки после контрольного заражения провели отбор проб крови от всех животных и убой животных с их последующим патологоанатомическим исследованием

Результаты опытов по определению иммунологической активности коммерческой серии сорбированной противоящурной вакцины против гомологичного и гетерологичного штаммов вируса ящура Азия-1 приведены в таблице 6

Таблица 6

Иммунологическая активность коммерческой инактивированной сорбированной вакцины против ящура типов 0( - А1г — Азия-1 против гомологичного и гетерологичного штаммов вируса ящура Азня-1

Вирус ящура типа Азия-1 для контрольного заражения Титры антител (1о§г) в сыворотках крови КРС, привитых вакциной в дозе 2 0 см3 к вирусу Результаты контрольного заражения ПД5о

Производственный №48 Азия-1 № 1987 /Амурский/2005 Прививная доза вакцины (см3)

РН ИФА РН ИФА 20 05 0 125

Производственный №48 7,6 7,0 53 5,0 4/5 4/5 3/5 10 56

Эпизоотический Азия-1 № 1987/ Амурский/2005 5,2 5,0 74 7,0 3/5 2/5 2/5 35

Примечание числитель - количество животных устоявших против прямого заражения штаммом вируса ящура Азия -1 №1987/ Амурский/2005, знаменатель — всего животных в группе

Представленные в таблице 6 данные свидетельствуют о том, что в прививной дозе вакцины содержалось 10,56 ПД50 к производственному штамму вируса ящура и только 3,5 ПД50 к эпизоотическому штамму вируса

На основании полученных данных нами была определена степень одностороннего антигенного родства по протективному действию инактивированной сорбированной вакцины против ящура типов А22 - 0[ — Азия-1 Результаты исследования степени антигенного родства представлены в таблице 7

Таблица 7

Степень одностороннего антигенного родства производственного и

эпизоотического штаммов вируса ящура типа Азия-1

Вирус ящура для контрольного заражения П

производственный Азия-1 № 1987/Амурский/2005 по ПД50

РН ИФА РН ИФА

производственный 1 1 0,23 0,25 0,33

Азия-1 № 1987/Амурский/2005 0,19 0,25 1 1

Полученные данные, обобщенные в таблице 7 показывают, что штамм Азия-1 № 1987/Амурекий/2005 значительно отличается от ранее выявленных иламмов вируса ящура типа Азия-!

В завершении работы по изучению иммунобиологических свойств вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005 были обобщили данные по степени антигенного соответствия (п) эпизоотического возбудителя с производственными штаммами вируса ящура типа Азия-1 - таблица 8

Таблица 8

Антигенное соответствие эпизоотического возбудителя вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005 и производственных штаммов

Азия-1 №48 и Азия-1 Шамир 3/89

Метод определения Азия-1 №48/Азия-1 №1987/Амур(,ки1|/2005 Азия-1 Шамир 3/89/ АЛ1Я-1 №1987 /Амурский/2005 /

РСК 0,16 0,20

141 с сыворотками морских свинок 0,18 0,19

РН с сыворотками КРС 0,19 0,18-0,25

ИФА с сыворотками КРС 0,25 0,25

По ИМД50 МС 0,20 0,69

По11Д,«МС 0,20 0,69

Результаты таблицы 8 творя 1 о том, что исследуемый изолят значительно отличается от производственных штаммов вируса типа Азия-1

Усовершенствование метода выявления антигена вируса ящура в ИФА

Были проведены исследования по разработке чувствительного и специфичного двойного сэндвич варианта ИФА для выявления и прямого типирования вируса ящура в полевых образцах эпителиальной ткани, а также в материале, полученном от экспериментально зараженных животных

Получение специфических реагентов для ИФА Получение антигена для ИФА. Культуру клеток ВНК-21, выращенную в монослое, заражали вирусом ящура типов А22№550, О №194, Азия-1 №48, Азия-1 № 1987/Амурский/2005, адаптированным к указанным клеткам в течение 4-5 последовательных пассажей, из расчета 0,1 ТЦД5о/клетку и инкубировали при 37-38°С После полной дегенерации монослоя, вызванной действием вируса, жидкость из матрасов сливали Полученные вируссодержащие суспензии концентрировали с помощью 8% ПЭГ м м 6000 Приготовленный концентрат очищали от балластных примесей путем суспендирования в нем 10% хлороформа с последующим центрифугированием при 3000 g в течение 20 минут

Концентрат (200 кратный) вируса ящура инактивировали АЭЭИ, который добавляли в вируссодержащую суспензию в концентрации 0,025 % Инактивацию проводили при 26°С в течение 16-18 часов Полученный инактивированный антиген проверяли на специфическую активность в ИФА и отсутствие остаточной вирулентности путем инокуляции в монослой культуры клеток СП При отсутствии остаточной вирулентности с активностью в ИФА 1 100 и выше из антигена выделяли НбБ компонент путем седиментирования в градиенте хлористого цезия-сахарозы

Получение антительных препаратов. Иммуноглобулины, необходимые в качестве препаратов антител для создания твердофазного нммуносорбента и препарата для обнаружения антигена, выделяли из специфических сывороток крови кроликов и морских свинок

Получение улавливающих антител (антитела для сенсибилизации планшет) В качестве доноров использовали кроликов, которых иммунизировали концентрированным, инактивированным 1468 компонентом вируса ящура типов А22№550, О №194, Азия-1 №48, Азия-1 № 1987/Амурский/2005 содержащими 100-130 мкг/мл вирусспецифического

белка Животных иммунизировали трехкратно Через 14 дней после последней иммунизации животных тотально обескровливали

Специфическую активность улавливающих антител определяли с помощью непрямого варианта ИФА

Получение детекторных антител. Морских свинок иммунизировали препаратами 1468 компонента вируса ящура типов А2г№550, О №194, Азия-1 №48, Азия-1 №1987/Амурский/2005 содержащих 20-40 мкг вирусспецифического белка при двукратной схеме иммунизации

Активность улавливающих антител определяли с помощью непрямого варианта ИФА

Определение специфичности каждого компонента проводили в сэндвич варианте ИФА с антигенами всех типов, которые используются для комплектования набора (А22№550, О №194, Азия-1 №48, Азия-1 № 1987/Амурский/2005) Используемые препараты антигенов и антител использовали в рабочих титрах В качестве отрицательных контролей использовались гетерологичные антигены вируса ящура и суспензия культуры клеток ВНК-21 Результаты опытов по определению оптимальных концентраций для улавливающих, детекторных антител представлены в таблице 9

Таблица 9

Активность специфических диагностических компонентов в ИФА

Тип Антитела для Детекторные Антиген

антигена сенсибилизации антитела

планшет

А22 №550 1-10000 1 5000 1-150

О, №194 1 3000 1 1000 1 100

Азия-1 №48 1 5000 1.3000 1 400

Азия-1 №1987 1 6000 1-2000 1 100

Антитела для сенсибилизации планшет, детекторные антитела и антигены обладали специфической активностью В качестве конъюгата использовались диагностические антитела против Ig G (H+L) морской свинки, конъюгированные пероксидазой (антивидовой конъюгат) производства НИИЭМ им Н Ф. Гамалеи РАМН (г Москва) Этот препарат оказался эффективным при введении в разрабатываемую тест-систему, стабилен при длительном хранении и удобен для стандартизации

В качестве субстрата применяли пероксидазный субстрат АБТС производства фирмы «Sigma» (США)

Оптимизация условий постановки ИФА

В результате проведенных исследований определен ряд параметров для оптимизации постановки ИФА с целью использования его для контроля вируссодержащего сырья Установлено, что иммобилизацию улавливающих антител необходимо проводить в течение 16-18 часов при 4°С в 0,1 карбонатно-бикарбонатном буфере рН 9,5-9,6. Для последующих стадий ИФА использовали фосфатно-буферный раствор рН 7,4-7,6 с добавлением 0,01% Твин-20. Время инкубирования на всех этапах реакции - 1 час при температуре 37°С

В качестве блокирующего раствора использовали 10% эмбриональную сыворотку КРС

Сравнительная оценка сэндвич-варианта ИФА и РСК

Для изучения зависимости между результатами определения чувствительности ИФА и РСК были исследованы 14 проб, содержащих антигены вируса ящура антигены, полученные в культуральной системе (ВНК-21 и СП), суспензии афт КРС, лапинизированный вирус В качестве отрицательного контроля использовали биологические системы, в которых культивировался вирус — культуральные суспензии ВНК-21 и СП

В ходе опыта были получены данные, показывающие, что результаты ИФА соответствуют данным, полученным в РСЖ при исследовании данных проб Результаты исследований проб антигенов вируса ящура типов А22-№550, О №194, Азия-1 №48 и контрольных образцов культур клеток методом иммуноферментного анализа приведены в таблице 10

Таблица 10

Результаты проверки набора для выявления антигена вируса ящура

в пробах материала иммуноферментным анализом

Наименование антигена Тип диагностической системы

А 22 о, Азия-1

РСК ИФА РСК ИФА РСК ИФА

1 Агг №55010% культ сусензия + + - - - -

2 Лгг №550 1464 компоненты + + - - - -

3 Л22 №550 33% суспензия оф г КРС + н - - - -

4 Лгг№55() копи кулмуральнля сусп 1 1 - - - -

5 О, №194 10% культур суспензия - - + + - -

6 О, №194 1465 компоненты - - + + - -

7 О, №194 лапинизированный - - + + - -

8 О, №194 33% суспензия афт КРС - - + + - -

9 Азия-1 №48 10% культ суспензия - - - - + +

10 Азия-1 №48 НбБ компоненты - - - - + +

11 Азия-1 №48 33% сусп афт КРС - - - - л +

12 Азия-1 №48 33% сусп афт КРС - - - - + +

13 Азия-1 №48 33% сусп афт КРС - - - - + +

14 Азия-1 №48 33% сусп афт КРС - - - - + +

15 суспшзня КК Ш1К-21 - - - - - -

16 суспипия КК СМ - - - - - -

Представленные данные в таблицею показывают, что результаты, полученные с помощью ИФА соответствуют данным, полученным в РСК На основании полученных результатов нами были проведены расчеты чувствительности и специфичности диагностического набора Расчет проводили по методу «латинского квадрата» описанного Дудниковым С А , 2005 Согласно расчетам чувствительность и специфичность данного набора составляет 100%

24

3. выводы

1 Изучены иммунобиологические свойства штамма вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005, выделенного па территории Российской Федерации в 2005 году, который отличается от вакцинных и ранее изученных эпизоотических штаммов вируса ящура типа Азия-1 (R% от 13 до 42), что необходимо учитывать при разработке мер профилактики ящура в России

2 Установлено, что вирус ящура Азия-1 штамм №1987/Амурскии/2005 адаптируется к культуре клеток ВНК-21, IB-RS-2 и ПСГК-30 в течение трех пассажей Наибольшее накопление вируса происходит в культуре клеток 1B-RS-2, в титре 7,66 Ig ТЦД5о/см3 (в количестве 1 мкг/см3 146S +75S

KOMIIOIIC1I i он)

3 В опытах на морских свинках установлено, что в прививнои дозе инактивированной вакцины из штамма вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005 содержится 42,5 ПД50 к гомологичному возбудителю и 8,69 ПД5о к вирусу Азия-1 №48 и Азия-1 Иран 58/99, а к Азия-1 /Шамир 3/89 - 37,04 ПД50 В прививной дозе препарата из вируса Азия-1 Иран 58/99 содержалось 37,04 ПД50 к гомологичному и 20,41 ПД50 к Азия-1 №1987/Амурский/2005

4 В опытах на КРС установлено, что в прививной дозе коммерческой инактивированной сорбированной вакцины против ящура типов А22, 0|, Азия-1 №48 содержалось 10,56 ПД50 против гомологичного возбудителя и 3,5 ПД50 к вирусу Азия-1 №1987/Амурский/2005

5 Штамм Азия-1 №1987/Амурский/2005 депонирован в коллекции микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» и рекомендован для изготовления диагностических и вакцинных препаратов, как отличающийся по антигенным, иммуногенпым и протсктивным свойствам от производственных и ранее выделенных эпизоотических штаммов

6 Получены диагностические препараты (антиген, гипериммунные сыворотки, улавливающие и детекторные антитела) для РСК и ИФА на вирус ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005

7 Оптимизированы параметры постановки ИФА с целью использования его при выявлении и идентификации вируса ящура в патологическом материале, полученном от больных животных

8 Усовершенствован диагностический набор, основанный на иммуноферментном анализе, для выявления и идентификации антигена вируса ящура в афтозном материале и суспензиях патологического материала

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются следующие материалы, полученные при выполнении диссертационной работы

1 Штамм вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005, пригодный для получения диагностикумов и вакцин, депонированный в коллекции микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов».

2 Специфические диагностические поликлональные антитела против вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005 для использования в РСК и ИФА

3 Набор для выявления антигена вируса ящура иммуноферментным методом (ТУ 0388-138-00495527-2005 от 30 06 2006г )

5. Список опубликованных работ по материалам диссертации

1. Иммунобиологические свойства эпизоотического штамма №1737 Азия /Грузия/2000 вируса ящура / В.К Спирин, Т А Фомина, H Е Камапова, С.Н. Фомина, А К Караулов И Золотое кольцо России : Матер 4 региональн конф , посвящен пробл профилактики и лечения домашних жив-х и птицы -Владимир,2001.-С 51-52

2 Стандартизация методов выявления противоящурных антител в соответствии с требованиями МЭБ /НЕ Камалова, С.Н. Фомина, С Р Кременчугская, Т А Фомина, Т H Лезова, Л А Быкова // Актуальн пробл инфекц патологии жив-х матер Междунар. науч конф, посвящен 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» - Владимир, 2003 - С 35-38

3 Результаты изучения иммунобиологических свойств эпизоотических штаммов вируса ящура типа Азия-1, выделенных в Закавказье /ТА Фомина, В К Спирин, А В Щербаков, А И Егорова, В В Дрыгин, С.Р Кременчугская, С.Н. Фомина // Аюуапьн пробл инфекцион патологии жив-х: матер Междунар науч конф , посвящен 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» - Владимир, 2003 - С. 32-34

4 Результаты эпизоотологического и серологического мониторинга по ящуру в России в 2002г / В M Захаров, А М. Рахманов, Т А Фомина, В H Герасимов, H Е Камалова, С Р Кременчугская, А К Караулов, Д M Муминов, В В Никифоров, В Г Патрикеев, С.Н. Фомина // Актуальн вопр зоотехн науки и практики как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья с.-х жив-х: матер 2-й Междунар науч -практ конф - Ставропль, 2003 -С313-317

5 Foot-and-mouth disease virus type Asia-1 in Transcaucasia diagnosis and immunobiological properties / T.A. Fomina, V.M Zakharov, V К Spirin, N.E Kamalova, A V Scherbakov, S R Kremenchugskaya, S.N. Fomina // 6Л Int Congr. Vet. Virol Virus Persistence and Evolution Proc - Saint-Malo, France, 2003.-P. 120

6 Получение рекомбинантного неструктурного ЗА белка вируса ящура и его использование для дифференциации постинфекционных и поствакцинапьных антител в непрямом варианте твердофазного ИФА / С.Н. Фомина, А С Яковлева, А В Щербаков, Т А Фомина, Н Е Камапова // Пробл монитор и генодиагност инфекцион бол ж- ных Матер Междунар научн конф молодых ученых, 24-26 марта 2004 г - Владимир, 2004 - С 67-68

7 Современные методы контроля иммуногенности противоящурных вакцин и оценки иммунитета /НЕ Камапова, С Р Кременчугская, В М Захаров, В И Диев, В Ю Кулаков, С.Н. Фомина, М В Жильцова // Сб науч тр ВГНКИ -М , 2005 - Т 66 - С 39-45

8 Разработка и применение иммуноферментной тест-системы для определения аитител к неструктурным белкам вируса ящура /А В Щербаков, А С Яковлева, А В Каньшина, Н В Вавилова, С.Н. Фомина, С Р Кременчугская, Н С Мудрак // Тр Федерального центра охраны здоровья животных - Владимир, 2006 -Т 4 - С 26-39

9 Фомина С Н Комплексное изучение антигенного родства штаммов вируса ящура типа Азия-1 /С.Н. Фомина //Вет патология -2006 -№4 - С 34-37

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны

здоровья животных» Тираж 90 экземпляров, апрель 2007 г

Актуальность темы. Эпизоотии ящура, вызванные вирусом типа Азия-1, наблюдались в странах Азии, Европы, Среднего и Ближнего Востока. Вирус этого типа и в настоящее время представляет угрозу для этих регионов, так как вспышки ящура периодически возникают в различных государствах, в том числе и граничащих с нашей страной. Следовательно, угроза возникновения болезни в России существует постоянно, в особенности в регионах на границе с Китаем, Монголией, странами Средней Азии и Закавказья (27, 28 ,63, 88, 106, 119, 128).

Принимая во внимание опасность возникновения ящура в нашей стране и возможность больших экономических потерь, особое значение приобретает проблема профилактики этой болезни. Согласно Международному ветеринарно-санитарному кодексу, ящур относится к особо опасным инфекционным болезням (43). Поэтому защита государства от ящура и разработка мер быстрой диагностики, ликвидации и профилактики является первостепенной задачей.

Возбудитель ящура по своим биологическим свойствам отличается высокой контагиозностью, широком кругом восприимчивых животных множеством типов и подтипов, длительной сохраняемостью в организме переболевших естественно восприимчивых животных и во внешней среде (8, 92, 130).

Вирус ящура обладает высокой антигенной вариабельностью. Такой уровень генетической вариабельности вируса в пределах одного генотипа приводит к возникновению новых изолятов, которые отличаются по степени вирулентности и иммуногенности от ранее выделенных штаммов вируса ящура (7, 45, 65,76, 96, 98, 112).

Опасность, которую представляет ящур, диктует необходимость постоянного усовершенствования методов и средств его диагностики, глубокого изучения свойств вновь выделенных в полевых условиях штаммов возбудителя, определения их эпизоотической опасности и степени соответствия производственным и ранее выделенным штаммам (111, 117). В настоящее время одним из основных методов профилактики ящура в нашей стране является систематическая иммунизация сельскохозяйственных животных инактивированными моно- и поливалентными вакцинами в зонах, угрожаемых по данной болезни (пограничные районы, регионы, где в последние годы регистрировали вспышки ящура, территории вокруг биопредприятий), а, в случае вспышки ящура - экстренная вакцинация всех восприимчивых к ящуру животных в неблагополучном очаге и в угрожаемой зоне (13,17, 18, 19).

Особую опасность представляют эпизоотии ящура, вызванные вирусом, отличающимся в антигеном отношении от производственных штаммов. Этот факт может свести на нет, или значительно снизить эффективность профилактических прививок моно - и поливалентными противоящурными препаратами (54,79, 83, 89).

Непременным условием противоэпизоотической эффективности противоящурных вакцин является соответствие антигенных свойств производственного (вакцинного) штамма вируса ящура эпизоотическому.

Следует отметить, что при отборе производственных штаммов вируса ящура учитывается широта их антигенного спектра (способность защищать привитых животных от заражения гетерологичными штаммами вируса того же типа), но не все производственные штаммы вируса ящура создают достаточно напряженный иммунитет против других вариантов того же типа (42, 50, 54, 72, 93,311,).

В особенности это относится к вирусу типа Азия-1. Вакцина, изготовленная из вируса производственного штамма Азия-1 №48, оказалась недостаточно эффективной при ее использовании против эпизоотических штаммов вируса ящура этого типа (14,52,89),

Это обуславливает необходимость постоянного изучения свойств выделенных штаммов вирусов.

Систематическое изучение эпизоотических штаммов необходимо не только для классификации вирусов, что имеет важное теоретическое значение, но и в плане сравнительного исследования антигенных свойств эпизоотических и производственных штаммов, из которых готовятся вакцины.

Систематическая угроза заноса и распространение ящура на территории Российской Федерации заставляют внимательно следить за эпизоотической обстановкой по ящуру в мире, а также своевременно проводить диагностику и изучение иммунобиологических свойств штаммов для выбора лучших, при изготовлении специфических препаратов (15, 41,42, 72, 102, 133).

Традиционными методами идентификации вируса ящура долгие годы были реакции связывания комплемента (7, 12, 34, 48, 77) и вируснейтрализации (77). В качестве биологического метода использовали выделение вируса на лабораторных тест-системах (34, 77). Включение этих методов в схему лабораторной диагностики ящура было обусловлено рядом важных преимуществ. Так РСК, при наличии соответствующих по специфичности диагностикумов, возможно в течение 1,5-2,5 часов идентификацию не только типовой, но и вариантной принадлежности возбудителей, вызывающих болезни, протекающие с везикулярным синдромом (ящур, везикулярный стоматит, везикулярная экзантема и везикулярная болезнь свиней) (8, 92). Однако на специфичность этой реакции могут оказывать влияние многие факторы. В этом отношении более специфичной можно считать реакцию нейтрализации, с помощью которой можно определять антитела, ответственные за иммунитет. Но для ее выполнения необходимы особые условия ветеринарно-санитарного порядка, наличие биологической тест-системы, а для получения информации требуется от 3 до 10 дней . Кроме того, имеются данные о том, что не всегда результаты серологических методов соответствуют биологическим. На этом основании предпринимались попытки разработать другие более объективные иммунохимические реакции. Однако большинство из этих методов оказались менее пригодны для лабораторной диагностики ящура из-за недостаточной чувствительности (реакция диффузной преципитации), или не способности дифференцирования типов возбудителя (метод флюоресцирующих антител, радиоиммунный анализ) (38, 92) и его вариантов (реакция пассивной гемагглютинации) (7).

В этом отношении совершенно уникальными возможностями обладают некоторые новые методы, такие как, иммуноферментный анализ (22, 34, 35, 98, 116, 117, 140). Для него характерна высокая чувствительность, простота постановки и быстрота получения результата. По специфичности его результаты коррелируют с общепринятыми вирусологическими и серологическими методами, а по чувствительности имеют явные преимущества. Они позволяют получить больше информации об антигенной структуре и происхождении вирусов по сравнению с традиционными серологическими реакциями. Недостаточная типоспецифичность ИФА на начальном этапе использования успешно преодолевается с помощью двойного сандвич-варианта (152). Благодаря этому открылись перспективы совершенствования схемы лабораторной диагностики ящура за счет применения ИФА не только для типирования, но и субтипирования эпизоотических штаммов возбудителя (102, 110).

В связи с появлением на территории России вируса ящура типа Азия-1, возникла необходимость изучения свойств данного вируса.

Цель и задачи исследований. Главной целью наших исследований было изучение иммунобиологических свойств вируса ящура Азчя-1 №1987/Амурский/2005 и усовершенствование диагностического набора для выявления и идентификации вируса ящура методом иммуноферментного анализа.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить иммунобиологические свойства штамма вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005, выделенного на территории Российской Федерации в 2005 г.;

- подготовить предложения по использованию штамма вируса ящура №1987/Амурский/2005 для изготовления диагностических и вакцинных препаратов;

- получить диагностические препараты на актуальные эпизоотические штаммы вируса ящура для иммуноферментного анализа;

- усовершенствовать набор для идентификации в ИФА производственных и эпизоотических штаммов вируса ящура типов А, О, Азия-1.

Научная новизна.

Научная новизна состоит в том, что в результате проведенных исследований:

Изучены иммунобиологические свойства штамма вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005, выделенного на территории Российской Федерации f 2005 году, который отличается от вакцинных и ранее изученных эпизоотических штаммов вируса ящура типа Азия-1 (R% от 13 до 42);

Изучены основные биологические свойства антигена вируса ящура типа Азия-1 №1987/Амурский/2005, используемого для изготовления экспериментальной вакцины;

Показаны антигенные взаимоотношения между производственными и эпизоотическими штаммами вируса ящура типа Азия-1;

Получены штаммоспецифические компоненты для иммуноферментного анализа и реакции связывания комплемента на штамм вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005;

Усовершенствован диагностический набор для определения антигена вируса ящура типов А, О, Азия-1;

Определены оптимальные варианты постановки ИФА при выявлении и идентификации штаммов вируса ящура;

Практическая ценность работы. Изученный штамм вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005 депонирован в коллекции микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» и рекомендован для изготовления диагностических препаратов и противоящурной вакцины против этого типа вируса ящура.

Получены диагностические препараты на основании изученного штамма Азия-1 № 1987/Амурский/2005.

Усовершенствован и внедрен в производство набор для выявления антигена вируса ящура иммуноферментным анализом, ТУ 9388-138-004955272005 от 30.06.2006 г.

Основные положения, выносимые на защиту.

- Адаптационные свойства эпизоотического штамма вируса ящура типа Азия-1 №1987/Амурский/2005.

- Результаты комплексного изучения антигенного родства штамма вируса ящура Азия-1 №1987 /Амурский/2005.

- Получение штаммоспецифических диагностических препаратов на основе штамма Азия-1 №1987 /Амурский/2005.

- Результаты практического применения эпизоотического штамма вируса ящура типа Азия-1 №1987 /Амурский/2005.

- Диагностический набор для определения антигена вируса ящура методом иммуноферментного анализа и его практическое применение.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ, в том числе 1 работа в издании, рекомендованной ВАК РФ для публикации материалов кандидатской диссертации.

Апробация работы. Результаты исследований по теме диссертации апробированы на научных конференциях: «Золотое кольцо России» - 4 региональной конференции посвященной проблеме профилактики и лечения домашних животных и птицы. - Владимир, 2001; международной научной конференции, посвященной 45-летию ФГУ «ВНИИЗЖ» «Актуальные проблемы инфекционной патологии животных» г. Владимир, 2003г.; 2-й международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы зоотехннической науки и практики, как основа улучшения продуктивных качеств и здоровья сельскохозяйственных животных», г. Ставрополь, 2003г.; 6-ом международном конгрессе ветеринарной вирусологии «Эволюция и персистенция вируса» прошедшем в Сант-Мало, Франция в 2003 году; международной научной конференции молодых ученых «Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных» г. Владимир, 2004.

Набор для выявления антигена вируса ящура в пробах материала иммуноферментным анализом» был представлен на выставке продукции ФГУ ВНИИЗЖ, при проведении Всероссийского научно-практического семинара-совещания ветеринарных специалистов «Эпизоотологический мониторинг, профилактика и меры борьбы с болезнями КРС и свиней» 26-30 сентября 2005г., г. Владимир.

Основные положения диссертации были изложены на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах, включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, список использованной литературы, практические предложения и приложения. Список литературы включает 156 источников, из них 63 источника иностранных авторов. Работа иллюстрирована 20 таблицами, 3 рисунками. В приложении к диссертации имеется 4 документа, подтверждающих результаты исследований и их внедрение.

6.ВЫВОДЫ

1. Изучены иммунобиологические свойства штамма вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005, выделенного на территории Российской Федерации в 2005 году, который отличается от вакцинных и ранее изученных эпизоотических штаммов вируса ящура типа Азия-1 (R% от 13 до 42), что необходимо учитывать при разработке мер профилактики ящура в России.

2. Установлено, что вирус ящура Азия-1 штамм №1987/Амурский/2005 адаптируется к культуре клеток ВНК-21, IB-RS-2 и ПСГК-30 в течение трех пассажей. Наибольшее накопление вируса происходит в культуре клеток IB-RS-2, в титре 7,66 lg ТЦД50/см3 (в количестве 1 мкг/см3146S +75S компонентов).

3. В опытах на морских свинках установлено, что в прививной дозе инактивированной вакцины из штамма вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005 содержится 42,5 ПД50 к гомологичному возбудителю и 8,69 ПД50 к вирусу Азия-1 №48 и Азия-1 Иран 58/99, а к Азия-1 /Шамир 3/89 - 37,04 ПД50. В прививной дозе препарата из вируса Азия-1 Иран 58/99 содержалось 37,04 ПД5о к гомологичному и 20,41 ПД50 к Азия-1 № 1987/Амурский/2005.

4. В опытах на КРС установлено, что в прививной дозе коммерческой инактивированной сорбированной вакцины против ящура типов А22, Оь Азия-1 №48 содержалось 10,56 ПД5о против гомологичного возбудителя и 3,5 ПД50 к вирусу Азия-1 №1987/Амурский/2005.

5. Штамм Азия-1 №1987/Амурский/2005 депонирован в коллекции микроорганизмов ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» и рекомендован для изготовления диагностических и вакцинных препаратов, как отличающийся по антигенным, иммуногенным и протективным свойствам от производственных и ранее выделенных эпизоотических штаммов.

6. Получены диагностические препараты (антиген, гипериммунные сыворотки, улавливающие и детекторные антитела) для РСК и ИФА на вирус ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005.

7. Оптимизированы параметры постановки ИФА с целью использования его при выявлении и идентификации вируса ящура в патологическом материале, полученном от больных животных.

8. Усовершенствован диагностический набор, основанный на иммуноферментном анализе, для выявления и идентификации антигена вируса ящура в афтозном материале и суспензиях патологического материала.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются следующие материалы, полученные при выполнении диссертационной работы:

1. Штамм вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005 пригодный для получения диагностикумов и вакцин, депонированный в ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов».

2. Специфические диагностические поликлональные антитела против вируса ящура Азия-1 №1987/Амурский/2005 для использования в РСК и ИФА

3. Набор для выявления антигена вируса ящура иммуноферментным методом (ТУ 0388-138-00495527-2005 от 30.06.2006г.)