Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка ассоциированной вакцины против сибирской язвы из штамма 55-ВНИИВВиМ и я щура типов А и О

,' ' . Российская академия сельскохозяйственных наук Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии

На правах рукописи

УДК 619:616.981.51:616.988.27:615.371

СОБАКИН АЛЕКСЕЙ СЕРГЕЕВИЧ

РАЗРАБОТКА АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ СИБИРСКОЙ язвы ИЗ ШТАММА 55-ВНИИВВиМ И ЯЩУРА ТИПОВ А и О

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

Автореферат диссертации на соискание ученой стр™"" кандидата ветеринарных наук

г. Покров — 1994 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук.

Научный руководитель — академик РАСХН, доктор ветеринарных наук БАКУЛОВ И. А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Дымин Михаил Арвидович (ВНИИВВиМ),

кандидат ветеринарных наук Маничев Александр Андреевич (ВГНИИ контроля, стандартизации и сертификации вет. препаратов).

Ведущее учреждение — ВНИИ защиты животных (г. Владимир).

Защита состоится 18 марта 1994 года в ' 0 часов на заседании специализированного совета Д-120.61.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринап-ной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, г. Покров, Владимирской обл., ВНИИВВиМ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВВиМ.

Автореферат разослан « п » февраля 1994 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

Г. П. Федоров

I. ВВЕДЕНИИ

Актуальность тауц. Вахцлнздяя тавотных В современных условиях остается одной г.з основных изр в системе ярзфяд&хтгкя ч борьбы с к^екйтощгнки болезиязш* 3 рядз случаев бд&гополучяе по отдельна.? ¿олезяям определяется именно обя-ззтелнюЭ вакци-яациел киЕогиа. К числу тащи болезней относится сибирская, язва а я*ур, Поэтому вполне оЗссясвгпяш является позотка соз~ длная ессоцифрованного препарата ка основа сочетают ионопрепа-рстоз против'обеах анфекпкА.

Ло настоящего времени ассодакрованкого Бактдаяого препарата щютяэ сзбирсксй г-5р.н и яяурэ ка ьоорухенли гетсрипарнпя практика не Ег.гег, хотя потребноста в такой ваэдгЯб сутестзует.

С. эшгзоотологлчесг-ой точки эреная подобное сочетакяа са- • бкрекая я?ва + яаур тыне целесообразно, Сыешазщзх инфеиха! хота л не оянсако, однако возникновение яцура в стационарно неблагополучных по снбдрсксй язве зонах алело место а зполио воз-шхкво в <5удуце:.». Поэтому соэданлз и прамеяеаиа такого ассоциированного препарата с продидактячагкой цель» оправдано к целесообразно , Причем для его изготовления кохчо воспользоваться 1,:о— капреяаратгьк, созданакта в шел едина годи а являющимися прзпа-рггали нового еоеолз.чкя. К такогьм относятся бееяапсульяая зава1! сидкреяэверная вещяяа аз пта'.з.э зросгЛ-гл-^з 55—БШ-З^ВВпМ и ляа-.тажровааная хультуреладая вавд*яа против ящура типов I и 0.

С иммунологической точки зрения одновременная а когдкекс-яач и-мг^гмзгцая кесколькает ьюаопрвяггатаъм приводит к фооми-ровакго :п,т,ун;г?етг необ:сзд;?лэго урзвзя в отношедии яеекашеах ил!Т:гкц:юкнья згдожвензЗ* Кроке того, в рядэ случаев этот спо-

соб вакцикааид ираюдит £ потенцирована» игауянда свойств отдельные антигенов, входящих з соегаэ ассоциированных препаратов.

Одновременная тонизация ждаэтныг прохив нескольких инфекций праятачесхи удобна, безвредна я высокоэффективна.

Оценив, гакам образом, рреддолаггеь^й ^пизеютолого-укоио-кгтеску» эффеетивяоегъ йудуцего препарата, разработка зссицзшро--

БаНЙОЙ ВбЖЦННЫ ПрОТНБ СИбгрсКОЁ ЯЗВЫ KS ЕТШ&а ^:.c,i>ri"tlirr-cis

55-БНЖВВиМ, ящура тлпов i г 0 оредстаадяе? большой научный 2 Ецактгчесгай шкгерес.

Цели, и задачи лсслед^анж, Целш настоящей раому Являлась разработка эксперцкгнтельных образцов есеощкуювавяой ьек-тщян прогив сибирской язиг и omasa Bae.t.'tiM>ncic 55~ВШКШкМ е яцура ютов А Е О,

Для яшадаеетя иосгздденярг&еда предполагалось решать еле-дуювд« задала:

X. Оярадеаииь оотестшюсп' еибяреязвэндкх и я-цурши ают-геноа ij vitro £ in vivo вря их ассоциации а едпш ирмкрате. ■ 2. Определить опяшалыше соотношеаая «вбйреягвенкщ; а -щурщяс ектигедав з аосодаирозаанои препарате дяя дэагнЕешет щад-азого отвйга йагадашруеыохю кивотвого со стезе ил зещгы не цекее, чем а ваяцЕндас ыонопрепаратах срока каадок xs болезней.

3. На лабораториях еязозйне осределкть срохда ^армирования дмиукЕтета против сибирской язви а ящура после ваздкаацяя ассоциированным препаратом в фааяеяга со сроками. форзсароранзк пм-цуаатега лря геводьзовпшсс школраяаратс®. •

4. Изучай»'дакгельвос?ь персигтаицик. а лохаг&зещи! вед-

цлнного шгаша Егс.агльг-ы.? 55-ШШШЛ в организме лабораторных еивотйых, .^й.гунизлроБагагк ассопдяровяяной згкцяяой.

£. Определить степень изменения илглуяогеннцх свойств ассоциированной вакцины против скбзрскоЗ язвы и здурч ь процессе её хранедм.

Дать оценку безвредности, регктогешизги и икмуногея-коети аршаяения зкеперимеюальякх об^азцог асссцетрозашой вакцина против сибирской язвы я ящура на лебора-хоршас и сель-скохозяйсТЕейшсс жпвотаьа.

Научная новлзна»

Разрабогаяа ассоцилровеяягя ваылша против сябярской язвы из итачма :.:-1Ьггс1г. 55-ВБй1£Ш:2Л ж янурл тапов А а 0, ия-ддаруккцан ж&ушгтат против перечисленные болезней, харьктеря-зужаяся безхредкоегкэ, ареактогеш^егга»" сохраняющая езо:; био.югячаскне свойства в течлйие 12 гяесяцев.

Прйкг-ичесгад ,зае^етюсть.

1. Раара5огеяа ■¡гагиалога: изготешеяия эксперяетяуашш обоагцоз ассодшфозсьчой еэмшз арогав сибирской язвн аз ит«»-га 55-ВНККЗВ:$ и Я2(ура гапов А ш О,

2. Подмгоачек проэк? Нориатйшо~»ехжг-1в(?хоа дохушггшии (ШД); техялчэскяе услсзввд, инструкция по «згртовл^яия^ на-стазаегдм по пзйлен-жзо, -

Дпробазая а жфиказдщ .рабогн. Основные иатэриалн. исследований долажеяо из оноеданиях Ученого .совета В;у5ЩВз!.', научной яенферевцяи ВШЗЯйяй г.Покров, 1992 г», каадаборагориах совещаниях сиеигшпстоь ВЙЭШВаЙ. в 103ЫС&93пг,

По результатам гсссяедовянйЗ «яи'бхядаэаио 3 гкчатгшз раСс~ гы, а т&к&е под&ка заявка ла патент : "Дсооцшгрошшгая вттгла

против сибирской язве и ягура к способ профилактика этих заболеваний" о? 23.04.93 г. (принята к рассмотрению 16.06,93г.) . й 9302X010/23. (020701).

Осяовнне, иодожендя выносжцэ на эаодту:-. I. Обоснованно я праетаческоз осуществление исследсьаяяй по разработке аесбщшрованюй вакшгяк против слблрсг.ой лзш кз шташа 55~5ШШВиМ я ящура тшог А я О.

, .•2. Результаты оценки ишуиобиояагических свойств асссда-кроЕанкой ванцияылабораторша и сельсхохоаяйствзкньк :,си-

ботлыг.

' Обье?.? и структура дерсертац-та. Диссертация иалояеяа на 106 страницах ыашааопясяого текста, состоит из введения, обзора литературы, собственна* исследований, обсуждения результатов, водой х практичасКих дредяояеая!, содержат 16 таблиц н 8 рисунков, Список йссодьзовзаноЙ литературы вкшзчает 173 наяиеаова-еиЙ, из кос 55 отечественных к зарубгнлкх.

2. СОКЯЗЩНЫЙ ■ 1ЩЩ0ЕУИН'

2.1. Мртег^аблы | а методы исследований.

• Вакцкш: с) Вакцина против сибирской язвы яивотдах ®:вая ■ споровая дкофхяизирэввачая из леташа в^с.ет.Иг,тс1 е 55-ВШ/ШВиМ (серия И 78 я № 23 изготовлены IS.05.9Ir, и 11.06.Р2г. соответ-стзеяяо во ДОШОД), представляет собой взвесь атых спор бес-клпсуяькой сгирулеятной культура иташа ^.гг.-и-г-.са.г 55 и стабшшзЕруиэдй сроде;

б) Ва:-щяка протаз идура - бивалентная тлпов А^ и.О, ез . вируса, рцраязп'якогО б культура кяегок В8К-2Х (серллИ 4,

изготовлена 4.06.91г. и 6.12.92г. на Покровском завода йио-рс-парэтов (ПЗБ); вакцина представляет сусягнзшо культу рал fe-oro вируса, оч:од2нного подаэтяяеклслявкшом, ияактивлровая-ого д:тялэт;леяи«'дчом# кояцентрирозаяного сорбцией на геле идрата оклей алзюкния, содержащая сапонин. • ■

Шташн: а) возбудителя сябярокой язва М-'Л вакгршяый каа-ульнкй, вирулентный для морских сванок. 3 опыта:« с заражением ручного рогатого скота использовали Еярулеятлий шташ Ем. nthrwcia Й 73»

б) вирулентные атег.кн вяруса ящура типов А г О, адашеиро-,энные к морским ешккаы, получены из музея ВНИЯй.

Гквотяне. Еэлые мьрпг 18-20 г - 200 голов; морские езяяка ассой 350-400 г кагдая - 1550 голов; крелини порода "шяшяа* • :о 2-2,5 кг - IS голов; трупный рогатый скот от S до 3 месяцяв ■ 83 гслов.

Рглиготозлекке обраацоз ассоциировляисй- швдини с;г различил колягчегт-чр;.! сибзреязвокцых спор в прквивяых дозах орепа-ета.

• Ашулу с лиофшшэароватюй снолреязвепшй векданой растеряли а I т. йаз;:одог;гческого раствора» Делали 10 посяедова-■елнгых десятикратных разведений сусподзи з физиологическом «створе. Яо 1.мл каждого рагвздензя внэоюгя ;га 3 чалка Натри ШЖ л актирован: при 37°С з 1ечшше суток. В 'чашках Петря : Еырссггаа едлначянгля кодонкяьи микроорганизмов подсчмтнталя :0лкчестБ0 колонии и проводили расчет хенцвдкргдая спор в пс-:одаэн суспензии по формуле:

с = (а х v ) в , гдг

, _ nzcrn ргззедежй для дсехиг.еяюг роста да Ш1А единичных колоний,

а - среднее арл^иегическое количество колонна да трех чашках

раэведезия в; v - обьеы еусяшзш разведения в.

Объем исходной суспензии сибкреязвешщх клеток с требуе-шл содержанием cao? в I мл ассоциярованкого препарата раечк-* тызадш по формуле:

В X v

а * ..........-> ■ , где

с

с - концентрация сябяреязвенккх спор в искомой суспензии; в - требуемое кашгчестьо спор в I ад ассоциированного препарата;

v - объем £ссощшровал1Югг> препарата.

Рассчитанное гоядчество с:;бкреязЕеннсй еуспекэм ск:енш-зали с требуемым объемом-яг?урко2 вакцины. Смесь птцатзльяо переценивали в течение 5-1.0 ькя зи остгвшш при кошатяоЁ температуре ла 20*30 та периодически вэтряхиэая. Лриготовяелку» также сОбсобсм вакцину храявли при температуре 4°С. • ряррДйле^яа кшукогеннссти васт^яв. Для заражения иорск! саинок С2биреязвеа«уа кульгуру итаыыа M--7I вводили подкожно в область живота э дозе X млн .спор в объеме 0,5 щ.

Ящуром шрских свинок заражали культурой в-чрулектяого штамма sana А г 0, которуэ вводили внутрияожко, в плантариув поверхность одной из аавикх конечнос?з£ в объеме 0,1 т з дозе 10 ООО ЛДэд.'

При заражении крущ-юго рогатого скота культуру вирулентного штага® £ *7€ попевали в дсе аедатшозке кепауяи по 100 ьш спор в каздую, капсулы закдэтанг в улебшгй ьгскш весом 50-/0 i z задавала животшш..

topa вротйвосабиреязвеннш: антител определяли в реакции

непрямой гемйггяитинацш* (РИГА),, согласно действующей янсгрук-вди»

. Дополнительно статзиля кошю аллергячесную пробу (КАЛ) о сибиреязвзянш аллергеном БНЯШВиМ, согласно наставлению. ■

Титры противоящурншс антлтел определяли в реамган связывания коыше:.:ента (ВЖ), согласно инструкция.

Ксяташяащга ассоциированной вакцины против сибирской язвы л яаура бактериальной а грибковой мжройлорой определяли по ГОСТ 2SC65-89.

Безвредность ассошировггшой вшташ'- оценивали%на белых шисх, морская се»яках и кроликах.

Реазтогеншсть оценивали в течение 10 суток после Ш",уги-, зада: го нзлйчяю гозтбак&'ияльцнх ослогяенлй.

Длигсльность хргкезия эееоцгировшэюЗ вакцина проверяли по количеству ' хизнеслособннх слбпреязвегшых с лор, аетигеяно-ct;i ящурного компонента згкилчх- я ito имлушгеякости препарата.

й.ьуяогеянур активность ассоциированной гакцины по о?яо-ше.тао к сбейк ян^даик определяла по методу Сшфяэяа-Кербера, позволяющей рассчитать 50» 1№<уяязкрувдух> дозу ЦЬ'Дэд)-

Сусюгорзческая обработка результатов дуследоваадй« Цифре-зке дашше подвергала статистической обработка средних валюта и их ошибок. Достоверность статистической разпицы ь-'езду сред-hs*mii величинами определяли пс разкоспо:яу катоду- Сткодеятз-Ф;!-хера. ••-■■'

' з. ?25улътлта ксоцфвшй '

'3«ï. Опредедазяа оозг<еста.:ост;? спбирсязвенльа. кяеток '

пропжояэд'ряоя г-атагако!1 1л vitro. | к in'vive.,. .

Учитывая vo, 4ïo прогдводщурдея вышке в своэм соет&ге содер-

кдт различные химические вещества в качеств ¡гнактнза торов, а противосибиреязвеяная вйкцхва кавие шжробяые клетки необходимо было изучать жизнеспособность спор вакцинного слбкреязвея-яого вкмиа Uae.nn-ttuHciii -55-ВНШШМ! в ассоциации с коммерческой ящурной вакцаяой.

Для проведения экспериментов было изготовлено два образца ассоЕйирсваяной вакцшш К I к К 2, в объемах по 200 щ. Содер-■ зшда сибиреязвенных спор в образцах составляла 10-12 я 20-54 шн.спор/ил, соответственно. Пргшквяув дозу приникали равную I т.

• Критерием сошзатшостг аятпгенсв слуиш: . - у сибиреязвенного компонента гшэнеспособность coop, которую определяли путем васева вакщшы на глоткке питательные среди

•■дао,--

•»у ящурного коыпонзята - способности вызывать образование ком-плзтнтсвязнваэдих антител у ваэщядацгаЕайннх морских св:шок. Эти од1гты ставили трижды: сразу восяе дзтотовденая, через 6 и К '. месяцев хралеяая. ...

■ ; В результате эксперимента установлено, что концентрация дизяеспоообшк сибиреязвенных спор в ассоциированной ваадше Ергкгэтескг на снижается в течение 12 месяцев хранения (срок набдоденкя) пгц: тешературе 4°С.

У яьалувлзйрозанных аоооциировашоЁ вакциной ыорспис свк-Иок сротивоящурные антитела в НТК обнаруживали в татрах Х;32 -1:$4 на 15 дэяь после вакцинация асссачлрогацац.: препаратом. • . Однако, сибиреязвешшх актьтед в сыворотках крош морскос свд-. кок г РНГА сбраруяено не било к при контрольной зарокеяшг са-. бареязвенним штаммом H-7I все подопытные гашэтмше пали, тогда

— J.U -

как ;saвотшга ЕакдайяроЕайикэ иоЕовгжцпкой рротдзсскблрской язву из пгаша 55-ЗНЖВЗн!Д показаги 1002-яуа зызаваскосгь«

Бак проведена исследования до еыяашда щиота отсутствия жьунятета ярогкв са<5ярско£ язец ярд вакцняагш! ассо-цяировзнным препаратом, в результате ?.оторюс установлено,что двгтюютияеаеша, вшязДО в состав дротявшщрвой вакцггшг, оказщзал. токсическое действие да рзародуктивянз качества ве-гататпвшес клзток атахгла ^ 'c.^-thosia 55~ВНЙИВВг2Л» Токся-ческоа действие яа бацалн проявлялось в сргакдзкз яивотяых :: отсутствовало оря посевах яа тггатэлмнэ среди, Нейтрализацию доэтялзт!1яеж11.ыЕа осуществляли 2М растзорои тиосульфатом натрая.

• После нейтрализации дегагодэтиденяшна у однократно вахс-цшглроваяннх жзяотяях индуцировала да^яятет как дротлв сибирской лзпи, так а протяв'ячура на уровне» соотвехсявушпи конопреязратам.

Такхы образом, против зтазс ялшекдяЗ била установлена биологическая совместимость сибиреязвенных а яцуркых аатаре-ков как in vitro ».так и- ia Ylv® .

3.2. Подбор. oimuagbHKfl соотяоаенж"! антагенозв ассирглрованной вакчяаэ против сиб:грсйой язви :t 'кт/та.

Учитывая эффект возмоаяогс снижения ;п-,;уно~огдче сеого сибиреязвенного компонента i-"1 vi-'rii при Есподьзоваятз ассоциированного препарата и стабильности ищуногениого действия яЕ|урних компонентов в ассогдароьаякой важщкв яеобзддшо было осуществить в асеощгнроъанксм препарате подбор оптимально» •

го нолячества сибиреязвенного компонент«. Был:: изготовлена четыре варианта ассодаярованяол вакцины (1-4), в которц* на фоне постоянной дозк проадвоицурной агицсни кспользсвал:^ различные концентрация - (40,0; 20,0; 10,0; 5,0 цдк) анзых спор ^гс.еп^.ггс-и вакцинного щтамка 55 в I мл препарата.

Делали по четыре пятикратных раззедешш каздого гаркал-та. Каадый кз пригогсшеняшс препаратов вводили л/к в объеме 0,5 мя шести ыорским сьаякад. Одну группу кпвотних вакцинировали монопрецаратом. Через 14 суток после вакцинация всех прл-влгкх и контрольных животных зараяаяд штампом !.-71, подкожно, в дозе I мяв,спор. Результаты учитывали терез 10 суток после заратагад л расчитывали Ц-.'Лзд.

В результате экспериментов установлено, что срг использовании гариакта аосодагрсванлой вакцина с кскцедтрашгей спер 20 Ш5/кл ведгчтаа йм^ била ваименыгей п составила 0,39 Ы1к спор.» Так га было отмечено усиг.сте птуногелносгя сибиреязвенного антигена введенного б ассоциации, по сравнена с ш-куногенной акгзвкостьго мовосрекарата.

Таким образом, да праякяи дозу 20 шя сибиреязвенных спор в I и ассоциированного препарата за отдельную, введение которой обеспечивало яаябеды^ ивдувизируицее действие.

3.3. Срока 1 б*>ржтк>вания у морских свинок ужу-нятега .против сибирской яавн.п. язура после дривгздеп ассоциированной ззщкной.'

Определение сроков формирования напряженного имфнитеса против сибирской язви м тура у морских салнок, этщ>'ш:з:;рован-нях ассоциированной вакциной проведай на иорсг.:зс свинках.

Ассодаирохашузо ваквдшу с даяопрепараты ¿водг-лл морскшл

свгшкач подг'огшо з область белой дшш даота' в об&еглв С.,5 ил йоуйязяруктая доза ассоциированной Еакцинн для морских.сва-ног. к вирусу ящура составляла по типу 0-с^ - ШЩ^/ью ~ 142,3, Т!ШУ А22 - ЕнДде/мс = 165,6, а ИьДдр ¡ПТеша 2:.с."ч1;лг:-с5.г 55-ВНййВВиМ равнялась 20 :,хдя. снор, Вазцинаодэ цонодреггарата-ш против сибирской язва л ящура проводили согласно инструкция по их прямеяеняв«

Перзузо группу ыореких свивок зарааайа .через 15 суток яос-ле Еакцйяедзя» вторуэ через 10 суток, третаэ через 7. суток, четвертую через 5 суток, пятую через 3 суток. Шестую группу (контрольную) заражали олблреязвепнш и яцурянм 'вджмаш ияк-рооргашзиов на 15 день о качала вакцинации опытягос эдютшк..

Бьугря групп; хявоI яодгрулпц зараяаяя 5 голов сябл-реязвсшша вдоьаюи Н-71, о голов вирусом' я!цура тзда А, 5 годсв вирусом ящура гида 0, адаптяроваяяш к морским св?якам. Вторуэ подтрушу кьвотанх заразхадя сибиреязвенная штаммкл И-71 как оптсако ранее, животных третье?: псдгрупш Ь голов зарэкали русом типа А, 5 голов вирусом тша 0.

' Учет результатов проведан в гечеяие ХО суток после экепе-ршеятальяого заргжеяая йивошк.

'Контрольный (яеваиздняровайяке) отворяло паяя в течедке 2-4 суток от сибирской язви я в течение 1-3 суток забоделя хч5нералвзоваЕИо2 сТоркой-яцура; Клятгчеейая картина я аатолого-аяатошческяг гзмеиеяия бша характерны, для обеях вдреетдай.

Анализ ггатеряадов яолучеяяых результатов позволяет сделать ззключеяхв« что.достаточно яащизсягай А?згнитет против-сабирг сяой язвк п пцура у корс.'егх св*яок# ярлвцтзк зесоцяяроЕакйоЗ шашоС я конопредоратэщ, (Горкаруется к 15 ¿утят с «скодаа : га шаунизацаи. ' ' ■•••'..'

Такш образом, било устгковлеяо, что создайте наи^яден-дого кжуактета у ыорскя>: свдкок, ва^нлров.-щинх ассо-

цлзроваайой вакциной против аятракса ь дцура к обегал ш-фекцшл наступает практически в те асе сроки, что д у асята«., ¡лглуях-зировалных даяопрепаратави лроппз этях ялЛевдй. Кроме ?ого, совпадение сроков фэрмлроЕания им.уштета у -латных, арнвлтщ: ассоциирозаккой ваидаяой и монспрепаратами, является доюлш:-телыгь" поятверзковизм. дра&тдьности пкцуяологической сбалаксч-рованкоссд шиаггноз, аходяадх в соссве ассоцшзроваишго препарата.

3.4. Длительность, перснстеящи я. локаиззаапя вактанлого атажд 55-

В!С"33:5.1. в оргадазке иорсюгд свалок, им-глуялзировар:т ^ссоцштрошн.чой взки'лой-.

•'Опыта/, с целю определения длительности серслстироваши, локализации и сроков алшанащш" вакцкачого пгеак/л г-

55-БШ61ВВШ в организме иорсклх свинок, введенных в ессо-щ:ашя с лротивоящуряоЯ вакцинол, проводила на трех группах кл-вотных по 22 головы а кшдок.

Животных первой грушц йщгялзяровади ассоциированной Еак-цяной против сибирской язвы и ядурз. Морских: свидох второй группы ваквднироь&ли моновакциаой против сибирской яззк, кзготоз-леяно® из итажа г :■• г-с1з БЙ-ЗШБМ!.

• Через 3, б, 12 л 24 часа, С, 10, 15 п 20 суток после юку-кнзацлл убавалд по две морские ев::;-::-::! ::з кадцол группы.

Лз цеховых: к зс-гл'оточамх ('регионального л отдалелко.со от места янгекаут) ша^атлчссжх уалов ¡яшотгохх делали вксеэы в

ШШ в пробирках и на ИМ в чаппсах Петри. Посевы инкубировала при 37 °С в течение пятя суток. Из печена и селезенки делали ь-пгкп-отпечатк;, которое окраыиваля по Грэму.

3 результата исследований установлено, что культура штагг-i.*a "--г. •¡-.«'hr^eis £5-5айЗВВйЛ, введенная как раздельно, тая и в асссдокдо, бистро распространяется в организме морских сванок it у:::е через 3 часа выделяется из всех органов. Из лимфоузлов, селезеяж:, костного шзга зсслздуешх анвотаж культуру ста],?,:а 55-ЗШШБ:й ввдэляля на протядеяяи 15 суток после вак-

щырцлп.

Tarai образок, било установлено, что характер расселения ц элхапиацли бацая ващанкого ттапла 55, входящего в состав ассоциированного препарата, свидетельствует о том, что организм очень бистро вовлекается а процзсс этялунной перестрой!«, что делает осковгяпо предполояигь, что ассоциированная закцяна будет достаточно далуяоггнкой против вирулентного штамма сибирской язвы,.

3.5. Изучение; 1а:.-г/;яогеняой активности а.сссштлрр-ваяяой Еацут-та ппотпв сибирской яззн и яшуоа • з. процессе Уванаядя.

йг^'нсгекнзя гистгзнссть ассощпрсваьной ?акцивк изучалась з сравнешит с т,глуногеш1ос'.гьэ монолрепаратов против сибирской яззн и йдура. Одновременно изучалась ж;л.-уногеяность указанных в;а-.г,!:н в завлсшоега от сроков :пс хранения.

Образцу ассоциированной в&кцияц л тнопрзпаратов храаялп при трех теулерз-гупк:-*: регжмах: npri 4°0, пря комнатной теапе-рг.турз 22°С я в термостате 37°С. ¡{клуногеннув активность кссле-

дуешх препаратов вкраагли в БО^лых дозах

' (llySgQ в ш) для морских свлдок» г.оторне определяла количественным способом непосредственно перед закладкой препаратов яа хранение, а таксе через 9 л 12 месяцев хранения при указанных температурных реяшах.

3 результате -проведелчга исследован:!!! установлено, что сзежепрлготовлешая ассоциированная вакцина икдуцлрует у пра-ьитых zikbothux .состояние невосприимчивости одновременно к сибирской язве и ящуру» Через 9 месяцев хранения к.^г/когекяая активность образцов ассоцякроващгоЕ вакцшш к монопрепаратов ке изменялась ао сравнению с кпходной з случае их хранения при 4°С, Ир;: хранении вакцияк 22° я 3?°С KrJIgQ значительно снизилась. Через 12 месяцев хранения аооодаировасшол вакцины при 4~6°С, Еийувогшзая активное» сябяреяввенного когяюкелта яезлачгтйльно снизилась с 0,23 до 0,07 шш. опер, а активность ящурного гсглаояента шеа С снизилась в 2,1 pass (е 7,9 до 3,7), хотя по ткпу A осталась в пределах исходного уровня (7,0 z 6,2 соответственно).

7 образцов есеошшрованной вакцина и монопрепаратов, на-ходйшпгхся в течение 12 месяцев прз ко^кэтяой температуре (22° С) й в термостате (37°С), шууногеяная активность значительно снизилась, причем у образцов вакдан, хранившихся щи 37°С в большей-сеейейа»"

Геки.: образом, щя' хранение вакцшш прп 4°С количество зшшх сибиреязвенные сдор сдинаетея в пределах существенно не влиявших не дацуногеяпосга. препарата. При хракежи ассоциированной вакцина при более высоких температурах яаблэдаетея ана-члтельчое сянжедаге вгадшогеаностя как егбяреягвояяего- ксглволея-та, гак я ящурного.

Получение сначенлк "¿фрг» ассоциированной вакцина в отяо-вскпл япуродго ¿'ктлгека, ог::детельотзуцт, что храюгть ассс-ц:;::рэ£ШГлГ,":> з:;КХ1ну более 12 г.:еслцев 4°С лз целесообразно.

3.6. Оценка экс!;ерлв,еигальн?дс образцов ассоциированной .-вакшт протяв сибирской язви и ящура в сдик па лабораториях ^.ягптнцх..

Для осуцесгздожя оценки знеяершгеятальнме образцов ассо-цгарованзоГ; вапшнк прекгв сибьрско* язвн и ящура било взго» тончено для образца ассоциированной вакцина против сяблрекой язеы 'л яиура:

1} образец (2S.II.9IrJ, который ежемесячно исследовали на наличие айзяеспособкшс сибиреязвенных спор г ¡вдукогеяность« Соразец хранили пря теютературе 4°С в течение 12 месяцев?

2} образец (23.12.£2г.), который хранили при аналогичные условиях ц оцея'лзалц на лабораториях животных по тестам стерильности, безвредности, резктогеяностя, лммукогеяяоегл я деятельности хранения.

Проверь стерильности образцов ассоциированной вакцинн проводили по ГООГ 23035-89. , ^

Изучение безвредности образцов ассоциированной ваквдки провод?«!' на балле морсст евпкках а кроликах, йкьотлнз-

был:", кодоброяк по щлдодяу аналогов. 5ащ;яу вьодаяй яодкойно в трех-пят:: щк-л'яой доие. 3? язвофяоя тли' {1§йдаяаяиа а се^в-;:.:е 1С суток. '■.•■' ■.'•'..■-'■

Сбрзецц аесгаки:ропаяяой гшдаш пробив сзакрской язвн я ■ ящуре б;;лк безгрегда ддл балах мазей, короК^ сдонок ц кр'олжго*.

Сценку агуаогея^оогя соргзцов асссцк,:ро5'ЗяяоЗ Про-

водила яа порсках сз:-шках. Били подобраны во принципу аналогов три rpyníni жйво5?йкх. Животных двух груш иьгдуяиааровали шсоцааровшюй вакциной« Третью группу гздсдьзогада в качестве контрольных 2SB0THHX. Через 14 дней после вакцинация ' брала кровь-у всех яовотявх для асследовагей в серодогаческях к аллергических реакциях. К 15 дна после вакаажщни животных заракаш-r возбудителями сибирской язвы, е ящура.

Морские свягкя кмелк высокие показателя противосибнре-язвеняого кклунитета: татр аятат^л з ШГА в цервой группе составил 1:80 - 1:160, во второй - 1:160 - 1:320; величина КАП -10,5- 12?,ai и 11,5 - 14 ш соответственно. Сыворотки крозз ин-тактньк кивотнкх (контроль) не содержали сабкраязвэняих антител» Кокяо-адлерп;ческая гроба была отрицательной. Все дар-oses свяйке пршиша .как яервш, так я вторая образцов ассо-цаароваяшй вакщяш, вssasux после заракеяля их скбярзязБея-вт капсуяьяш шгашш íi-71, - тогда как все коаззкишше паля. Титр вротизоящуряш: ачтятея в НЖ у прявитых знзэтнкх составил X:16-1:32 в первой группе и 1:32-1:£4 во второй» При за-■ ранения треках евшие вирусом ящура установлено, что все не привитие яааэтйые ^контроль) заболела генерализованной формой ящура» тогда как корскае ошза> приватяе ассоциированной вакциной.» обладали жаувят&ст* • .

Изучение реагаогепностп на шрекях свинках показало, что образцы ясследуэшк вакцин яерзактогекш,

В результате исследований установлена, что образцы ассоциированной ваипаы являлись стерааяшк, безвредпшя, ареах-тогеянша. Свсхсепрнготовяеннаг вакцина-(обраоен Г> 2) создавала наиряя&шшй IOC.I-кнй. туяктет против сцбчрско" язвы и ящу-

ра типов А и 0. При хранения валищи длительности до 12 мзся-. цез, напряженность шг^нитета к сибиреязвенному штешу М-71 п вирусу яцура типа А сохранялась, а к вирусу ящура типа 0 уменьшалась до 50", (В ппедчарптельных опытах- установлено, что на-прж-.еншш иммунитет сохранялся до 9 месяцев).

Таким образом,нам представляется ярсдпочтательвык иг.поль-зованяе для иклуяЕзгции г-гаотнш: ассоциированной ®акцяяыг заготовленной яз ссегжгтрг,готовд епцих сер^й монопрепаратов и обеспе-чивавдк МО^-ную защиту прошв ящура а сибирской язва..

3.7. Изучение т.туногеняой активности ассоцтаро-вашюй[ вгкцякп против сибирской язвы и, яшура в опита на'крупное рогатом скоте»

Результаты проведенлых отлов ка морских свишсах легли а основу при испытан;® ассоцпрсваялсй вакцети на крупной рогатой скоте.

. Опыт по проверке пм/уютота у крупного рогатого скота, згкщшнроваяного гсооцмированнш препаратом, был шставтея на юсыд! телятах в возрасте 5-5 пес. Вамшу вводила однократао подксняо в области сре^че!:-трота яея в дозе 1,0 пл.

Наличие- дг.сукзтеТ8 у крупного рогатой» скота против акт-раса устанавливали методом апскерамеяталыгого зарат.енпя шзированшп: и контрольных (нозашпигрошшых) аявоткнх ксру-левгавк Етам:.о:л возбудителя сибирской азвн через месяц с не-ыента ви'гитац^:. 2араг.;еяла подвергали 5 вакцинированных и 3 . контрольна (яен£:;щ:и1:ф0зал;:1зс) ждаэтинх..

Згре:;сек1!0 зего'удлтелегл антракса ярогодж пероралыю тит-

. роваякой на. телятах дозой полевого штагл.-д 76 г-.^.спиггес^з. Едрудеятяуи сибцреязвекцуа культуру помещали .в желатиновую капсулу с содерншиек 200 шк. с спор в указанном объеме.

Для определения присутствия сабкреязвеликх антител в скво ротке крови животных, ваицшщгавашшх ассоциированной вакциной, дрименяля реакцию неврямой гемЕГГлптипацид (РНГА) с си<5йреязвеяяда актдгеннш эрлтроцитарпкм дааг^осгньуыоы.

Вторда тестой слукста кожо-аялерглческая лроба с сибиреязвенным аллергедоы ЫШВВиМ. •

, Оценку ижуяатета против явгура проводили с вомошья ?СК. В результате проведенная исследований установлено, что ассоциированная вакцина создавала вдуяитет у провитнх животных как против сибирской язви, так к против яаура, У вах-яишровал-ккх телят отмечали ввеокие показателе гфотйвослбкрелзвеляого лшуаятета: титр ентател'в ШГА сосхагтд 1:160 - 1:Л20; г.озчно-аллсрпиоская проба бша' лсдоглгаяькой.. В месте введения аллергена отмечала незначягальну» припухлость й' гнпершзо. Кокна^ складка увелстллась ¿.средней на 3-4 ш. Сыворотка кревя ш-тактанх (контроль) казстнкх не содержали свбиреязваяньх антител, ксшкь-аллергаческая про^а бта отрицательной. Титр протн-вокщуряых антител в РСК у прдштых гахвотных состава 1:32 -1:64, что говорит о достаточном уровне защити':с данной лнфек-цак.

- - Все тлукизировашке агвоткне, додвергавэлеся контрольному зараяенда,. оказались гаатоешшна от возбудителя в-;рупштю-го дтет/л tpe.stitbre.ci8 76, яря глэели всех ксеаролмшх (невазцаклроЕаякд) телят. ■ "-'■

Полученные даллвс позводййт сделать загдачепла о ш<г, чхе

ассоциированная вакцина против сибирской язвы я ящура создает у однократно привитых ннвотных нмг.суннтет достаточной напряженности. Одновременно- необходимо ответить, что в течение всего периода наблюдения у клзотшк, ишунлзированных ассоциированной BaiaptHoi: и зараженных возбудителен сибирской язвой, не отмечалось клинического проявления указанных дирекций. . '.

Тахам образом, после однократной ;шуяязац:ш. ассоциированной вакциной против сибирской ябвы i едура создается яаяряг.ен-нкй lOOfJ-яий пп-.угитет против сибирской язви. Наблюдается. интенсивная и стабильная продукция протявосибнреязвеянцх я. противен яцурякх антител, свгздетельствухяйя'о глубокой ' яшуяологпческой перестройки организма апкотша: после парентерального введения ум ассоциированного препарата.

3.8. Испытание экснер:гг.:е'итгльного -образца аасо-' Парованной вакцины против сибирской язва'. и я!?;ра кз.крупном рогатом скота в ;,<ивот-яоводческои хозяйстве. * ■

По разработанной на»,и технологии били изготовлеян экспериментальные образцы ассоциированной зеыдо®, которые прогш. ко-ьтасеионнве испытания в институте % били' рекомендованы: к испытанию в животноводческом хозяйстве.

Йсдктаяие ассоциированной занцкнк было проведено на базе -<Ж "Усатовское" Красиокутского района Саратовской области.

Телятам S-ти месячного возраста арививаля врзздэду- в дозе I на подкожно, однократно, в области средней .трети'оеа, Дяя контроля использовали монопрепарати против 'снбирсиза яэви и лротиг яцура, которпе^рлиояяли согласно наставлений' во их вршеяемшр, .

Испытание иымуаогешшГ активности проводили с помощко ' серологических реакцлй (РИГА я РСК). Дополнительно ставили ко:шо~аллерг:1ческук пробу, Серологические н аллергические г.с-еяедовапая сроводкдд.. через 14 дке2 после вакцштахцы.

■ За состоянием привитых завогнях велись ялияхческце наблюдения, результата которых показали, что реетдегя ка месте введения вакщшн отсутствовала, тешература тела оставалась в пределах физиологической нормы. ...

Исследования лротлзоскбвреязвенпых антител показали-, что прививка телят как ассоциированной вакциной, так и монопрзпа-ратом индуцирует у ¿бх одинаковое накопление антител до 1:80. 1:160. Толе самое наблюдается я'вря исследования комплекент-овязиващях ангцтзл вируса щура, татр которых, составил 1:32 -1:64, в обоях случаях, Кожнснзялергячесшг проба показала уге-лачение кокйой сетвдкп.ца 4-5-ьа:. Контрольное (неваквдяировая-? ные) йпвотпие давалй отрицательные результаты в исследуемых тестах.. 1 ' ;

Таким образом» ассоциированная вакцля;; ¡то показателям безвредности, реажгог&шюстя и докунэгеяцости не уступает со~ ответствумцим монСлрепаретги вакцин против сибирской язвы л яцура,•.

В и ВО Д Ы .

I» Разработка к изучена в экспералснте ассоциированная • вшяаа оротий сибирской язвы аз ишака 55-ЗНГ£!1Ш.1 ц щура тльов к ж 0 ла основе сочетания шнопрепйратов новою поколе-

2. Ватйавя коотонедт протлютстурноК закщш - диэтилэтц-

легаши, препятствующийразмшкешо 1п пуст вегетатавшс кле--ток сябпреязЕешгого зчвд.тяяого ¡¡гаав&з Езе.гяй^аеЛз а обра- : ' зоссалсо ¡¿клуш-тета против сибирской язвы. Нейтрализация даэПпл-зтстешг.сяа позволила обеспечить ЮО^-нуп загшу йривитаре ш-вотянх КРОТ2В- сибирской язвы к 85-9ЦЗ-цую защиу прояви ядура .

ТШОВ А п 0.

3« Показала возмотссть создаяяя ассоциированной вакцина на основе ппакткз; розашгаго вирусиого препарата и айвой бакте-ряальной культуры с учетом вложив, на неё инактяваторЛв вкруса и предварительной юс нейтраллгадая.

4. Подобраны слтшлалыше, 1гялунологЕческа сбалакслрован-яне' соотношения аятигчгн.чых когтюяеятоз, входящих в состав ас-соця;*рол£НЕой вавдшы 20-25 шщ.спор вакцинного штаг.»»- сибирской яззк, 4,5 таг 146 з компонента вируса ящура Тша А, 5,8 мкт - типа 0 в I да препарата. : • . •'"

5. Отмечено увеличение н.злуясгеяясй активности сибиреязвенного компонента, входящего в. ассоциированную вакцину, по сравяетл с .тауногеяяостыо мояопрепаратз, имеющего апалогкч-кук кояцектрацио спор штажа ?чс.й»гшгг.е1е ■ 55-БНИИЕБиУ.

6. При гаг-лунязадж! морсюгх спинок ассоцакрованной загаш-:юй отмечается вовлечение организма :гавотньх в течение - первых 3-х 'часов в 'процесс вмзунной перестройка и формирование стойкого пилунитета к обешл днйемшягл к 1-г15 суткам с момента . вакцинации. •

Дссоцгшровчякая вшэдяа сохраняет свои ишунодогаче-екпг сзо£с?Ъа по отналепги :; сибирской язве я ящура типа А в процессе хргпеяяя прп тгмтературэ на лретаиениг 12 ме-

сяцев (срой аебяпденая) с новеита её изготовления. йллуноген-

нссть протявояцуряой вакцины типа 0 за этот период езязялесь на 501.

3. Проведен с полскяггльгпз! результатом опэт по испытанию ассоциированной вакцлнн в условна ;жвотнозодческого хоас:цства.

9. Ассоциированная шгщинз против сибирской язвн я яцура обеспечавает прочный тщугштет против обеих инфекций, безвредна, уверенно реактегеяна дая лабораториях и сельскохозяйственных лшотянх z соответствует требованиям, предъявляемы?.; к профилактическим препаратам подобного рода.

. 6. ПРАХЕ-ЛЭИСЙ ПШйОЕЗШ

I. Предлагается г. вяедрекиз в ветер:.нарную прикину аосо-цкироваинаа вакцяна против • сябярсиой язвы аз итмаж 5с-ВБ2'Э2:£Л я якура типов А п 0.

2. Подготовлен проэгт временной нордатсвно-техаичесшГ! документация ira'изготовлению, контролю я прп.'.:еяекао ассоци::рован-ной вакцияы против сибирской язвы и ящура (17, инструкция, наставление).

Слисок работ, опубяякоЕатшх' по -теме диссертации

1. Собака: A.C., Баьулсв Ii.А., Гаврялов Б.А., Чяслов S.3. Изучение »тзкеспссобнэстя спор с&оиреязаешюго гакципясго атагл-wa ьь~ш.'й'3£><£1 б скосе с протявоящураой вакциной'/вопроси ве~ 'теркнаркой Вирусологии, ьсдуроочологик и эпизоотология. î'esncH докладов научлой лэиференцка ВаГГЬЗ:^;, Покров, 10У2, -с,20ö-2С2.

2. Гакулов Ii,А.,■ Гагрллов В.А., Собакин A.C. Создание ассо-

ялнроваппоЯ кшпгкы вротзв сибирской язвв и язщгра с использованием мэяопрспаратов нового поколанят//Доклады РАСХНД993, Г- а,-с.58—41.

0. Собака; А.З. Ьсяктатаэ эгопергалеэтальных образцов ас-соцявроваяно» вакцкну против спбярмгой язву, и ляург/ЛВетерп» • нар!1я",1е^3, П-12,-с.20-23.

4, Затзка на патент !? 53021010/13' (02С7С1). "Ассоциированная взтадяна против сибирской язвы я ящура я способ" профилактика отггх заболеваний" от 23.04.23?. Принята к.рассмотрев шта IG.C6.93 г. : •