Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец

На правах рукописи

УДК 619:616.98:579.852.11:578.821.21

РГ6 од

2 5 ДЕК 2000

НИКУЛИН АЛЕКСЕЙ НИКОЛАЕВИЧ

РАЗРАБОТКА АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ И ОСПЫ ОВЕЦ

16.00.03 -

ветеринарная микробиология, вирусология эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

\

на соискание ученой степени

кандидата ветеринарных наук

Покров-2000 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, профессор, академик Россельхозакадемии Бакулов И. А.,

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Балышев В.М.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Луницин А.В. (ВНИИВВиМ).

Ведущее учреждение:

Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии, г. Москва.

Защита состоится 27 декабря 2000 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д-120.61.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии по адресу: 601120, г. Покров Владимирской области, ВНИИВВиМ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВВиМ. Автореферат разослан м » ноября 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук В.Я.Савукова

ДиевВ.И. (ВНИИЗЖ),

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы.

Вакцинопрофштактике отводится значительное место в обеспечении благополучия животных по многим инфекционным болезням, которые продолжают наносить существенный ущерб животноводству многих стран мира, включая и Россию. Это в полной мере можно отнести и к таким опасным болезням овец, как сибирская язва н оспа, которые в виде отдельных очагов и спорадических случаев регистрируют на территории РФ и граничащих с ней стран, в первую очередь Южного и Юго-Восточного регионов.

Согласно данным МЭБ вспышки этих болезней регистрируют в Иране, Индии, Пакистане, Греции, Азербайджане, Узбекистане, Казахстане, Киргизии, Таджикистане, Туркмении, Молдавии.

Характер ведения овцеводства, связанный с большой концентрацией овец на ограниченных площадях, в том числе в условиях отгонного животноводства, создает благоприятные условия для возникновения и распространения этих болезней. Последнее обусловлено и тем, что возбудители сибирской язвы и оспы овец длительное время могут сохраняться во внешней среде, представляя потенциальную опасность для неиммунного поголовья животных.

В настоящее время для профилактики этих инфекций в России и странах СНГ широко применяют живые моновакцины, которые получают на основе высокоиммуногенных вакцинных штаммов 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы и штамма НИСХИ (или его вариантов) вируса оспы овец. Однако, несмотря на наличие указанных вакцинных препаратов, практическая ветеринарная служба нуждается в ассоциированной вакцине, что обусловлено совпадением неблагополучных зон, как по сибирской язве, так и оспе овец, а также необходимостью формирования иммунитета против этих болезней в короткие сроки при возникновении эпизоотии сибирской язвы и оспы в одном регионе.

Применение ассоциированной вакцины могло бы значительно снизить затраты на проведение прививок, уменьшить потери продуктивности овец вследствие стресса и травмирования животных при вакцинации.

Необходимо отметить, что проводимые ранее многочисленные попытки создания ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец не увенчались успехом. При конструировании такой вакцины в качестве исходных компонентов различные авторы ирпользовали вакцинные штаммы 1-й и 2-й вакцины Ценковского, СТИ, ГНКИ возбудителя сибирской язвы и штаммы «К», «Румынский», «Ставрополь» вируса оспы овец. Препараты, полученные на основе этих и других штаммов, были или высо-кореактогенными, или слабоиммуногенными, не обеспечивая формирование достаточно напряженного иммунитета против обеих болезней (Л.П. Дельпи и др., 1947; М.С. Кобец, 1960; А.Я. Панкратов и др., 1960; Н.В. Лихачев и др., 1967).

Цель и задачи исследования.

Цель исследований - разработать ассоциированную вакцину против сибирской язвы и оспы овец.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить возможность изготовления ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец из штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы и клонированного варианта штамма НИСХИ вируса оспы овец.

2. Определить оптимальные соотношения сибиреязвенного и оспенного компонентов в ассоциированном препарате.

3. Изготовить экспериментальные серии вакцины, изучить их иммунобиологические свойства:

культурально-морфологические; биологическую активность компонентов; безвредность и реактогенность препарата;

иммуногенность.

4. Определить напряженность и длительность иммунитета против сибирской язвы и оспы овец после введения ассоциировшгаой вакцины.

5. Определить влияние сроков и условий хранения вакцины на ее иммунобиологические свойства.

Научная новизна. Разработана ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец на основе бескапсульного, авирулентного штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы и клонированного варианта штамма НИСХИ вируса оспы овец.

Установлено, что смесь коммерческих монопрепаратов не обеспечивает формирования напряженного иммунитета против сибирской язвы у морских свинок из-за ингибирующего действия на штамм 55- ВНИИВВиМ В. апЛгаслз антибиотиков, применяемых при изготовлении вирусвакцины против оспы овец.

Практическая значимость. В результате проведенных исследований разработана и испытана в производственных условиях ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец. Использование ассоциированной вакцины обеспечивает формирование напряженного иммунитета одновременно против двух болезней, позволяет сократить число профилактических прививок и, тем самым, снизить потери продуктивности вследствие неблагоприятного стрессового воздействия на организм овец.

Разработано «Временное наставление по применению ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец ли.офилизированной» (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 28 марта 2000 года).

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИТИБП, (г. Щелково, 2000 г); Международной научно-практической конференции ВНИИВВиМ, (г. Покров, 2000 г); заседаниях ученого совета ВНИИВВиМ в 1998-2000 гг.

Публикация. По материалам диссертации опубликовано 6 печатных

работ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты разработки ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец, методов контроля и способа применения.

2. Результаты изучения иммунобиологических свойств ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец и ее испытаний в неблагополучных по этим болезням зонах России.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста; включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения.

Работа иллюстрирована 8 таблицами и 2 рисунками. Список литературы включает 163 источника, из них 33 зарубежных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. 2.1. Материалы и методы.

Бактерии и вирусы. Вакцинный штамм 55-ВНЙИВВиМ возбудителя сибирской язвы с концентрацией спор 250 -350 млн./см3. Референс-заражающая культура штамма М-71 возбудителя сибирской язвы с концентрацией спор 1 млн./см3.

Клонированный вариант вакцинного штамма НИСХИ вируса оспы овец 3 пассажа в перевиваемой культуре клеток почки овцы (ПО) с активностью 5,5 - 6,5 ^ ТЦДю/См3. Вирулентный штамм «Монгольский» вируса оспы овец с инфекционной активностью 4,2 ^ ИД50/СМ3. Питательные среды, растворы и культуры клеток. Мясопептонный агар (МПА); 2%-ный мясопептонный бульон (МПБ); мясопептонно-печеночный бульон (МППБ) под вазелиновым маслом; агар Сабуро; среда (СВК) для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба; среда Игла МЭМ

на растворе Эрла или Хенкса; перевиваемая культура клеток почки овцы (ПО).

Животные. Белые мыши живой массой 18-20 г; морские свинки живой массой 300-350 г; кролики породы ((Шиншилла» живой массой 3,0 -3,5 кг; овцы Романовской породы в возрасте от 3-х месяцев до 2-х лет. Содержание и кормление животных проводили согласно принятым нормам.

Методы. Изучение культурально-морфологических свойств вакцинных штаммов 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы и клонированного варианта штамма НИСХИ вируса оспы овец, а также иммунобиологических свойств экспериментальных серий ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец проводили в соответствии с требованиями ТУ на монопрепараты против этих болезней: ТУ 9384-025-00009064-97 «Вакцина против сибирской язвы животных из штамма 55-ВНЙИВВиМ » и ТУ 9384-014-00495549-98 «Вирусвакцина против оспы овец сухая культу-ральная».

Определение чувствительности к антибиотикам штамма 55-ВНИИВВиМ проводили согласно общепринятой методике «Определение чувствительности микробов к антибиотикам методом диффузии в агар с применением дисков», описанной Лабинской A.C. (1972).

Определение безвредности ассоциированной вакцины проводили путем введения кроликам и овцам 10 прививных доз препарата. Одна прививная доза содержала 10-12,5 млн. спор Вас. anthracis штамма 55-ВНИИВВиМ и 3,5 - 3,75 lg ТЦД» вируса оспы овец штамма НИСХИ.

Определение иммуногенности вакцины против сибирской язвы проводили на морских свинках, против оспы - на овцах, которым вводили по одной прививной дозе ассоциированной вакцины. Через 12 - 14 суток после вакцинации морским свинкам вводили сибиреязвенную референс-заражающую культуру штамма М-71 в дозе 1,0 млн. жизнеспособных спор, овцам - вирулентный вирус оспы овец штамма «Монгольский» в дозе 5001000 ИД 50.

Серологические исследования. Для определения поствакцинальных сибиреязвенных антител применяли реакцию непрямой гемагглютинации, которую ставили согласно Временным методическим указаниям по применению РНГА при сибирской язве, утвержденным ГУВ МСХ СССР 15.08.1980 года.

Титр нейтрализующих вирус оспы овец антител определяли в реакции нейтрализации в культуре клеток ПО, используя двукратные разведения сывороток и 100 ТЦ Дя) вакцинного штамма НИСХИ.

Кожно-аллергическая проба (КАП). Аллерген диагностический сибиреязвенный ВНИИВВиМ применяли для оценки противосибиреязвенного иммунитета согласно Наставлению по применению сибиреязвенного аллергена диагностического, утвержденному ГУВ МСХ РФ от 6.05.1993 г.

Гематологические исследования. Картину крови у овец исследовали общепринятыми методами. (Е.А. Кост, 1975, Кудрявцев А.А, Кудрявцева Л А 1974).

Статистическую обработку результатов проводили по Лакину Г.Ф. (1980).

Производственные испытания. Разработанную ассоциированную вакцину против сибирской язвы и оспы овец испытывали в хозяйствах Дагестана, Кабардино-Балкарии, Краснодарского края, Волгоградской области в соответствии с «Временным наставлением по применению ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец лиофилизированной», утвержденным Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 28 марта 2000 года

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Изучение совместимости вакцинных штаммов сибирской язвы и оспы овец и возможности использования смеси коммерческих монопрепаратов в качестве ассоциированной вакцины.

Первым этапом нашей работы явилось изучение возможности формирования иммунитета у животных, вакцинированных смесью двух коммерческих

монопрепаратов против сибирской язвы и оспы овец, изготовленных на основе штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы и клонированного варианта штамма НИСХЙ вируса оспы овец. С этой целью была приготовлена смесь, содержащая в 1 см3 по одной иммунизирующей дозе этих вакцин (12,5 млн. спор штамма 55- ВНИЙВВиМ и 3,5 lg ТЦД5о вируса оспы овец). Для оценки иммуногенности сибиреязвенного компонента этим материалом было привито 10 морских свинок. В течение 10 суток животные оставались клинически здоровыми. Суммирования реактогенности препаратов не происходило,

Безвредность смеси моновакцин определяли путем введения десяти иммунизирующих доз кроликам породы "Шиншилла" подкожно в наружную поверхность бедра в объеме 5,0 см 3 (по 2,5 см3 в каждое бедро). В течение 10 суток (срок наблюдения согласно ТУ на монопрепарат) кролики оставались клинически здоровыми, т.е. смесь вакцин в десятикратной дозе была безвредна.

После заражения вакцинированных и контрольных (10 голов) морских свинок референс - заражающим штаммом М-71 возбудителя сибирской язвы в дозе 1 млн. спор в опытной группе выжило только 40% животных при 100%-ной гибели контрольных, в то время как согласно требованиям ТУ на монопрепарат процент защиты должен составлять не менее 80 %.

Привитые смесью моновакцин овцы (2 головы) не заболели оспой после контрольного заражения их вирулентным штаммом «Монгольский» через 12 дней после вакцинации.

Таким образом, было установлено, что механическая смесь монопрепаратов не обеспечивала формирования достаточно напряженного иммунитета у морских свинок, защищающего их от гибели после контрольного заражения референс-заражающей сибиреязвенной культурой.

Культурально-морфологические свойства штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы в смеси и в исходных монопрепаратах изучали методами посева проб на МПА, МПБ, агар Сабуро для определения типич-

ности роста В. апймжпэ и отсутствия посторонней микрофлоры. Посевы ежедневно просматривали в течение 10 суток инкубирования при 37 °С. В результате установлено, что на всех средах с высевами культуры штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы наблюдался ее характерный рост, посторонняя бактериальная и грибная микрофлора в этих материалах отсутствовала. Однако в образце смеси коммерческих моновакцин слабый рост культуры сибиреязвенного микроба в МПБ появлялся лишь на 5-е сутки культивирования, в монопрепарате культура В. апйи-аив вырастала уже через 18 часов. Концентрация спор в течение 5 суток хранения смеси при температуре 4 ± 2 °С практически не снижалась и составляла 350-400 млн./ см3.

На основании полученных результатов было сделано предположение об ингибиции штамма 55-ВНЙЙВВиМ возбудителя сибирской язвы комплексом антибиотиков, которые используются при производстве вирусвак-цины против оспы овец (пенициллин и стрептомицин по 200 ЕД. / см3, по-лимиксин 50 ЕД. / см3), что было подтверждено методом диффузии в агар используемых антибиотиков, которые вызывали зону задержки роста культуры Вас. апЛпаав.

Таким образом, установлено, что антибиотики, применяемые в производстве вирусвакцины против оспы овец, ингибируют рост культуры си-биреязенного компонента в составе механической смеси коммерческих монопрепаратов, и тем самым, препятствуют формированию напряженного иммунитета против сибирской язвы у морских свинок.

2.2.2. Определение чувствительности штамма 55-ВНИИВВиМ Вас. апШгаЫэ к антибиотикам.

Учитывая полученные данные, нами была изучена чувствительность штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы к антибиотикам с целью последующего их применения при культивировании клонированного варианта штамма НИСХИ вируса оспы овец и использования этого сырья при конструировании ассоциированной вакцины

Методом диффузии в агар с применением дисков было испытано 22 антибиотика с различным механизмом действия. Установлено, что вакцинный штамм 55-ВНИИВВиМ устойчив к полимиксину, ампициллину, окса-циллину, клоксацнллину, колистину, метициллину. Эти антибиотики не вызывали задержки роста культуры Вас, аШЬгаиБ. Культура возбудителя сибирской язвы была высокочувствительна - к цефалотину, тетрациклину, но-вобиоцину, гентамицину, канамицину, хлорамфениколу (зона задержки роста составляла от 25 до 44 мм); чувствительна - к налндиксовой кислоте, карбенициллину, стрептомицину, левомецитину, неомицину, пенициллину, ванкомицину (зона задержки роста составляла от 21 до 24 мм); малочувсви-тельна - к эритромицину, линкомицину (зона задержки роста составляла от 10 до 14 мм).

Результаты изучения чувствительности штамма 55-ВННИВВиМ возбудителя сибирской язвы к антибиотикам показали, что полимиксин, который применяется в технологии производства вакцины против оспы овец, может быть использован и при изготовлении ассоциированного препарата.

Таблица 1.

Изучение иммуногенной активности сибиреязвенного компонента в различных лабораторных образцах ассоциированного препарата.

Образцы вакцины Кол-во животных (гол) Иммунизир. доза (млн. спор) Результаты контрольного заражения морских свинок

Выжило Пало % защиты

Ассоциирован ный препарат с комплексом антибиотиков 10 12,5 4 6 40

Ассоциирован ный препарат без антибиотиков 10 12,5 10 0 100

Ассоциирован ный препарат с полимиксином 10 12,5 10 0 100

Контроль 10 - 0 10 0

Было изготовлено 3 варианта лабораторных образцов ассоциированной вакцины: с использованием применяемого комплекса антибиотиков (пенициллин и стрептомицин по 200 ЕД./см3; полимиксин 50 ЕД./см3), только с полимиксином в концентрации 200 ЕД./см3 и без антибиотиков. Образцы вакцины были испытаны по тем же параметрам, что и смесь монопрепаратов (п. З.2.1.). Результаты этих опытов представлены в табл. 1

Как видно из таблицы, все морские свинки, вакцинированные препаратами, изготовленными без антибиотиков и с добавлением полимиксина, выжили после контрольного заражения. При иммунизации образцом вакцины, изготовленным с комплексом антибиотиков, выжило 40% животных при 100% гибели в контроле.

На всех питательных средах с высевами испытуемых образцов вакцины рост посторонней бактериальной и грибной микрофлоры отсутствовал, наблюдался типичный рост культуры штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы. Однако при использовании ассоциированного препарата, содержащего комплекс антибиотиков, отмечали задержку роста сибиреязвенного микроба.

Таким образом, в технологии изготовления ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец на основе штамма 55-ВНЙИВВиМ и клонированного варианта штамма НМСХИ, необходимо получение сырья без антибиотиков, или с применением полимиксина.

2.2.3. Определение оптимального соотношения сибиреязвенного и оспенного компонентов в ассоциированном препарате.

В проведенных ранее опытах были определены оптимальные иммунизирующие дозы штаммов 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы и НИСХИ вируса оспы овец, которые составляли для овец 10-12,5 млн. спор и 3,5 - 3,75ТЦД50, соответственно.

Так как в ассоциированном препарате компоненты должны быть взяты в дозах, обеспечивающих максимальный иммунный ответ (Выгодчи-ков В.Г, 1960), нами был изготовлен образец лиофилизированной ассоции-

рованной вакцины, прививная доза которого содержала то же количество сибиреязвенного и оспенного компонентов, что и в монопрепаратах.

При проверке иммуногенности этого образца вакцины установили, что взятое соотношение иммунизирующих доз сибиреязвенного и оспенного компонента 1:1 обеспечивает 100%-ную защиту вакцинированных морских свинок и овец после контрольного заражения. При этом наблюдалась 100%-ная гибель интактных морских свинок и переболевание оспой всех контрольных овец с характерными клиническими признаками болезни.

Титры антител в сыворотке крови вакцинированных овец на 14 сутки после прививки составили: против сибирской язвы в РИГА 1:160 -1:320, против оспы в РН 1:4 -1:8.

Таким образом, было установлено, что вакцинные штаммы 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы и клонированного варианта ННСХИ вируса оспы овец, в дозах 10 - 12,5 млн. спор и 3,5 - 3,75 ^ ТЦД50 соответственно, в составе ассоциированной вакцины индуцируют формирование напряженного иммунитета у морских свинок и овец также, как и моновакцины. Препарат не вызывает поствакцинальных осложнений.

2.2.4. Изготовление ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец.

На основании результатов экспериментов по изготовлению лабораторных образцов ассоциированной вакцины протав сибирской язвы и оспы овец и инструктивных документов по изготовлению монопрепаратов нами была отработана схема технологического процесса приготовления экспериментальной ассоциированной вакцины, которая включала следующие основные стадии:

1. Получение биологически активного сырья - концентрата спор возбудителя сибирской язвы штамма 55-ВНИИВВиМ и вируса оспы овец клонированного варианта штамма НИСХИ, выращенного в перевиваемой культуре клеток ПО.

2. Определение биологической активности полученного сырья.

3. Расчет объемных соотношений сибиреязвенного и оспенного компонентов для составления серии вакцины.

4. Составление серии - объединение биологически активного сырья и смешивание его со стабилизатором.

5. Фасовка ассоциированной вакцины во флаконы (ампулы).

6. Лиофилизация вакцины.

7. Определение биологической активности сибиреязвенного и оспенного компонентов, расчет прививных доз препарата.

8. Контроль вакцины на соответствие требованиям проекта ТУ на препарат.

9. Упаковка, транспортировка и хранение вакцины.

Было изготовлено 4 серии (135 тыс. доз.) экспериментальной ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец. Ассоциированную вакцину второй серии готовили без антибиотиков, серии № № 3, 4,5 с полимиксином. Концентрация жизнеспособных спор штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы в экспериментальных сериях препарата составляла 226 - 260 млн. спор/см3, массовая доля спор - 97 -98%, титр вакцинного штамма вируса оспы овец был в пределах 5,0 - 5,5 ТЦД5о/см3.

2.2.5. Изучение культурально-морфологических свойств вакцинных штаммов в ассоциированном препарате.

При исследовании культурально-морфологических свойств сибиреязвенного компонента ассоциированной вакцины оценивали типичность роста, морфологию, подвижность бациллы, способность к капсулообразо-ваншо, а оспенного компонента - по характеру и срокам проявления цито-патического действия в перевиваемой культуре клеток ПО. Установлено, что указанные свойства не отличаются от таковых в монопрепаратах.

На всех средах с высевами и пересевами рост посторонней бактериальной и грибной микрофлоры отсутствовал.

2.2.6. Изучение безвредности ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец.

Безвредность 4-х серий ассоциированной вакцины определяли на 8 кроликах и 8 овцах. Животным вводили десятикратную прививную дозу каждого препарата. Моновакцину против сибирской язвы вводили 2 кроликам и 2 овцам, вирусвакциной против оспы прививали 2-х овец.

Кролики, которым была введена 10- кратная доза ассоциированного препарата, в течение срока наблюдения (14 суток) оставались клинически здоровыми и на месте введения вакцины у них не отмечалось никаких изменений.

У овец на месте введения ассоциированного препарата на 2-5 сутки появлялись уплотнения диаметром 2 - 5 см, которые исчезали через 10-14 дней. В течение 14 суток животные оставались клинически здоровыми, подъема температуры тела не наблюдали,

У овец и кроликов, привитых вакциной против сибирской язвы, изменений в общем состоянии организма не отмечали.

У вакцинированных противооспенной моновакциной овец отмечались такие же изменения на месте введения препарата, как и у животных, привитых ассоциированной вакциной.

Таким образом, разработанная ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец в десятикратной прививной дозе была безвредна для овец и кроликов, как и соответствующие моновакцины.

2.2.7. Изучение иммуногенности ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец.

Изучение иммуногенности ассоциированной вакцины проводили на морских свинках и овцах, не вакцинированных против оспы и сибирской язвы. Животных иммунизировали подкожно: морских свинок в область живота, а овец в бесшерстный участок подмышечной области в прививной дозе. Напряженность иммунитета проверяли путем заражения: морских свинок референс - заражающей культурой штамма М-71 возбудителя сибир-

ской язвы в дозе 1+ 0,1 млн. жизнеспособных спор подкожно в область живота; овец - вирулентным штаммом «Монгольский» вируса оспы овец в дозе 500 - 1000 ИДзо внутрикожно на внутренней поверхности хвоста.

Для сравнения напряженности иммунитета морских свинок и овец прививали также монопрепаратами в соответствии с наставлениями по их применению.

При испытании иммуногенности ассоциированной вакцины против сибиреязвенного компонента каждой серией препарата прививали по 10 морских свинок, а против оспенного компонента - по 2 овцы. Такое же количество животных брали для оценки иммуногенности моновакцин. Результаты контрольного заражения морских свинок и овец по 4 сериям ассоциированной вакцины суммированы в табл. 2.

Таблица 2

Результаты сравнительного изучения показателей иммуногенности

моно- и ассоциированной вакцин против сибирской язвы и оспы овец.

Наименование препарата Вид животного Колич. животных (гол.) Результаты контрольного заражения

Выжило Пало (заболело*) % защиты

Ассоциированная вакцина Морские свинки 40 36 6 90

овцы 8 8 0 100

Моновакцина против сиб. язвы Морские свинки 30 26 4 87

Моновакцина против оспы овец Овцы 6 6 0 100

Контроль Морские свинки 40 0 40 0

Овцы 6 0 6* 0

Примечание: * - вирулентный штамм «Монгольский» вызывает переболевание оспой интактных овец с характерной клинической картиной болезни.

Начало гибели морских свинок контрольной группы отмечали на вторые сутки после заражения, к пятым суткам все животные папи. Процент защиты вакцинированных ассоциированным препаратом морских свинок составил от 80 (в 4 и 5-й сериях вакцины пало по два животных) до 100%. Моновакцина предохраняла от гибели 87% морских свинок.

Все вакцинированные ассоциированной и моновакциной овцы оставались клинически здоровыми в течение всего периода наблюдения, повышение температуры тела и клинические проявления болезни отсутствовали. Контрольные животные заболевали оспой с характерными клиническими признаками.

В результате проведенных исследований установлено, что ассоциированная вакцина индуцирует формирование напряженного иммунитета у привитых животных, как против сибирской язвы, так и против оспы овец на уровне, сопоставимом с соответствующими монопрепаратами, а ее реак-тогенность не превышает реактогенности коммерческих монопрепаратов.

2.2.8. Изучение иммунного ответа у овец на введение ассоциированной вакцины серо-аллергическими методами.

В качестве дополнительных критериев сравнительной оценки им-муногенности ассоциированной вакцины и моновакцин в отношении сибиреязвенного компонента использовали кожно-аллергическую пробу (КАП). Животным через 1 месяц после вакцинации вводили сибиреязвенный аллерген, учет КАЛ проводили через 24 часа. У вакцинированных овец кожно-аллергическая проба была положительной, в месте введения аллергена отмечали появление ограниченного инфильтрата и утолщение кожной складки на 3 - 10 мм по сравнению с нормой. У контрольных животных кожно-аллергическая проба была отрицательной.

Для изучения уровня поствакцинальных антител и динамики их образования у подопытных животных отбирали пробы крови до вакцинации, на 7, 14,21,28, 35,42 сутки и через 3 , 6 месяцев после иммунизации. Проти-восибиреязвенные и противооспенные антитела определяли в реакции не-

Прямой гемагглютинации (РИГА) и реакции нейтрализации (РН) соответственно. Сыворотки крови не вакцинированных животных не содержали специфических антител. Противосибиреязвеиные а противооспенные антитела выявляли на 7-14 сутки, титр антител в РИГА составлял 1:160-1:320 и сохранялся на этом уровне в течение всего срока наблюдения, в РН - 1:2-1.4 с максимумом (1:8 - 1:16) на 21 сутки. Через 6 месяцев титр вируснейтрали-зующих антител составил 1:2-1:4.

Таким образом, исследования, проведенные с применением серо-аллергических методов, показали, что при иммунизации овец ассоциированной вакциной иммунный ответ не отличается от такового при использовании моновакцин.

2.2.9. Изучение продолжительности иммунитета у овец, привитых ассоциированной вакциной.

Напряженность иммунитета против оспы через год после иммунизации ассоциированной вакциной изучали на овцах (4 головы), путем контрольного заражения вирулентным штаммом «Монгольский» вируса оспы овец. В качестве контроля использовали овец, не вакцинированных против оспы. На 5-е сутки после заражения контрольные животные заболели оспой с характерной клинической картиной, вакцинированные оставались клинически здоровыми в течение всего периода наблюдения.

Через 12 месяцев после прививки титр вируснейтрализующих антител в сыворотках крови этих овец составлял 1:2-1:4.

Титр противосибиреязвешшх антител у привитых ассоциированной вакциной животных в эта сроки составлял 1:160, как и у овец, вакцинированных монопрепаратом против сибирской язвы.

Вакцинированные животные на протяжении всего срока наблюдения оставались клинически здоровыми. Не было отмечено влияния вакцинации на физиологическое состояние овец, в том числе на суягность, лактацию и

откорм. За период наблюдения две овцы принесли приплод - по два нор-

''1 *

мально развитых ягненка. Беременность, окот и дальнейшее развитие ягнят

были в пределах физиологической нормы, что подтверждает безвредность ассоциированного препарата.

2.2.10. Влияние сроков и условий хранения ассоциированной вакцины на ее биологические свойства.

Одним из основных критериев стабильности вакцинных препаратов является сохранение биологической активности микроорганизмов в процессе хранения. Нами была изучена сохраняемость вакцинных штаммов 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы и НИСХИ вируса оспы овец в ассоциированном препарате.

Вакцину хранили в холодильнике при минус 10 ± и 4± 2 С, при комнатной температуре (18 ± 2°С) и в термостате при 37 ± 0,5 °С. Необходимость изучения продолжительности сохранения биологической активности вакцинного препарата при 37°С объяснялась предполагаемым ее применением в южных регионах России. Через 1, 3, 6,9 и 12 месяцев хранения при выше указанных температурных режимах определяли биологическую активность вируса оспы овец в культуре клеток ПО и количество жизнеспособных спор Вас. апЛгааз на среде для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба.

Исходная биологическая активность 4-х серий ассоциированной вакцины по сибиреязвенному компоненту составляла от 226 до 260 млн. спор/см3, вируса оспы овец в пределах 5,0 - 5,5 ЩД50/см3.

В течение 12 месяцев хранения вакцины при температурах минус 10 ± 2°С и 4 ± 2 °С биологическая активность вакцинных штаммов оставалась на исходном уровне. При комнатной температуре через 12 месяцев хранения вакцины снижение количества жизнеспособных спор штамма 55-ВНЙИВВиМ составило 30%, для штамма НИСХИ вируса оспы овец - 0,5 ^ ТЦЦ50/ см3. В течение месяца хранения при 37 + 0,5 °С содержание жизнеспособных спор Вас. апЛгаш и титр вируса оспы овец в образцах ассоциированной вакцины оставались без существенных изменений. Однако уже через 3 и 6 месяцев хранения содержание жизнеспособных спор штамма 55-

ВНШВВиМ составило 175 -140 млн. и 150 - 100 млн., а титр вируса оспы овец снизился на 1,0 - 1,75 lg ТЦД50/СМ3 и 2,25 - 3,5 lg ТЦД5о/см3 соответственно.

Таким образом, биологическая активность двух вакцинных штаммов, входящих в состав ассоциированного препарата против сибирской язвы и оспы овец, сохраняется на исходном уровне в течение 12 месяцев хранения (срок наблюдения) при температурах минус 10 ± 2 С и 4± 2 С.

Культурально-морфологические свойства штаммов, входящих в состав ассоциированной вакцины, в процессе хранения оставались характерными для этих возбудителей и не отличались от таковых в соответствующих монопрепаратах,

2.2.11. Изучение иммуногенности ассоциированной вакцины через 12 месяцев хранения.

Изучение иммуногенности ассоциированной вакцины, хранившейся в течение 12 месяцев при 4± 2 °С, проводили на морских свинках и овцах, не вакцинированных против сибирской язвы и оспы. Исследования проводили с препаратами 3 и 4 серий, которыми иммунизировали по 10 морских свинок и по 2 овцы. О сохранении иммуногенности в отношении сибиреязвенного и оспенного компонентов судили по результатам контрольного заражения вакцинированных животных.

Установлено, что после введения морским свинкам референс-заражающей культуры штамма М-71 возбудителя сибирской язвы выжило 80% животных при 100% гибели в контроле. Вакцинированные овцы не заболели после заражения их вирулентным штаммом «Монгольский», а контрольные животные переболевали оспой с характерной клинической картиной.

Проведенные опыты показали, что ассоциированная вакцина сохраняет свои иммуногенные свойства в течение 12 месяцев хранения при 4± 2°С (срок наблюдения).

2.2.12. Исследование крови овец, привитых ассоциированной вакциной.

Гематологические исследования проводили у овец романовской породы, которые были разделены на 3 группы. Животных 1-ой группы иммунизировали ассоциированной вакциной в прививной дозе. Овцам 2-ой группы вводили 10-кратную прививную дозу. Третья группа служила контролем Первичная реакция на введение ассоциированной вакцины зависела от дозы вводимого антигена (Рис. 1).

180

80 -1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1

о \ п- ъ Л ^ Г§> ф ^ ^ / Срок исследования, сутки

1 доза (лейкоциты) -о-10 доз (лейкоциты)

-а- 1 доза (лимфоциты) -*-10 доз (лимфоциты)

Рис.1 Изменение общего количества лейкоцитов и лимфоцитов у овец при введении одной и десяти прививочных доз ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы.

При иммунизации животных одной прививной дозой на 1-е сутки отмечали незначительное повышение общего количества лейкоцитов с 6,б±0,5 до 7,4±0Д тыс. в см3 (на 11,4±1,8 % от исходного значения), при введении 10-кратной прививной дозы - с 7,5 ± 0,3 до 9,6 ± 0,5 тыс. в см3 (на 28±0,8 % от исходного значения). На вторые сутки отмечали незначительное их снижение. Максимальное увеличение количества лейкоцитов наблю-

дали на 5-е сутки, которое составило 11,3±1,9 тыс. в см3 (170,5 ± 28,7 % от исходного значения) при введении одной прививной дозы и 12,3 ± 1,5 тыс. в см3 (164 ±20 % от исходного значения) при введении 10-кратной дозы, далее отмечали их снижение. Однако, у овец, вакцинированных 10-кратной прививной дозой, это повышение было более устойчивым, а снижение плавным. На 7-е сутки уровень лейкоцитов составил 11,5±1,2 тыс. (153%), а на 14-е - 9,5±2,0тыс. (132%).

При определении лейкоцитарной формулы у животных, иммунизированных прививной дозой вакцины, наблюдали повышение абсолютного количества лимфоцитов на 5 - 14 сутки (122 - 114 % соответственно), в то время как при проверке на безвредность (10-кратаая доза) повышение было более стойким и значительным, начиная с первых суток и достигало на 5 - 14-е сутки 151,3 - 182,8% от исходного. Максимум нейтро-филов отмечали на 5-е сутки (137,6 % от исходного значения). В остальные сроки повышение их уровня было не столь значительным.

Изменения уровня эритроцитов и гемоглобина были менее выраженными и составляли 10,3±0,5 млн. и 9,0±0,8 г %, соответственно. Эти показатели были в пределах физиологической нормы.

Таким образом, введение вакцины вызывало незначительные изменения в крови подопытных животных. Анализ гематологических показателей в целом свидетельствует о том, что разработанную нами ассоциированную вакцину против сибирской язвы и оспы овец можно отнести к слабым раздражителям, не оказывающим отрицательного воздействия на организм животных.

2.2.13. Испытания ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец в производственных условиях.

Перед испытанием ассоциированной вакцины в производственных условиях вакцина была комиссионно апробирована в ОБТК института. Иммунобиологические свойства вакцины соответствовали требованиям ТУ на монопрепараты (ТУ 9384-025-00008064-97 «Вакцина против сибирской яз-

вы животных из штамма 55-ВНИИВВиМ», ТУ 9384-014-00495549-98 «Ви-русвакцина против оспы овец сухая культуральная»)

Производственные испытания вакцины проводили в хозяйствах Дагестана, Кабардино-Балкарии, Краснодарского края, Волгоградской области. Вакцину применяли согласно разработанному Временному наставлению по применению ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец лиофилизированной, утвержденному Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 28 марта 2000 года.

Ассоциированной вакциной было привито более 5000 голов овец различных возрастных групп. У привитых животных не наблюдали поствакцинальных осложнений. Животные оставались клинически здоровыми в течение всего срока наблюдения. Через 30 дней после прививки у овец в СПК Николаевский и СПК Фурмановский Волгоградской области были взяты пробы крови с целью определения в сыворотках поствакцинальных антител. Титр противосибиреязвенных антител в РИГА составлял 1:160 -1:640, в РН с вирусом оспы овец 1:2 - 1:16. Во всех регионах, где испытыва-лась вакцина, сохранялось эпизоотическое благополучие по сибирской язве и оспе овец.

Таким образом, разработанная ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец с положительным результатом была апробирована в неблагополучных по этим болезням регионах России и может быть рекомендована для широких производственных испытаний в ветеринарной практике.

3. Выводы

1. Антибиотики, применяемые в производстве вирусвакцины против оспы овец, ингибируют рост культуры сибиреязенного компонента в составе смеси коммерческих монопрепаратов против этих болезней, препятствуя формированию напряженного иммунитета против сибирской язвы у морских свинок.

2. Установлена совместимость антигенов возбудителя сибирской язвы и вируса оспы овец в ассоциированной вакцине, изготовленной без антибиотиков или с использованием полимиксина.

3. Разработана ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец на основе штамма 55-ВНИЙВВиМ возбудителя сибирской язвы и клонированного варианта штамма НИСХИ вируса оспы овец, прививная доза которой содержит 10-12,5 млн. спор возбудителя сибирской язвы и 3,5-3,75 ^ ТДД50 вируса оспы овец, что обеспечивает формирования напряженного иммунитета против этих болезней.

4. Ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец ареакто-генна и безвредна в прививной и десятикратной дозах соответственно.

5. Ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец обеспечивает формирование напряженного иммунитета против обеих инфекций через 14 суток после вакцинации продолжительностью не менее 12 месяцев, вызывая образование вируснейтрализующих противооспенных и противосибиреязвенных антител в титрах 1:4-1:16 и 1:160-1:320, соответственно.

6. Культурально-морфологические и иммунобиологические свойства Вас. апШгас15 и вируса оспы овец в ассоциированном препарате не отличаются от таковых в монопрепаратах и не изменяются в течение 12 месяцев хранения при минус 10 ± 2°С и 4 ± 2 °С.

7. При введении ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец в прививной дозе у животных возрастает общее количество лейкоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов, достигая максимума на 5-е сутки. Картина крови восстанавливается до исходных значений к 28 - 30 сут-

- кам, что дополнительно свидетельствует о безвредности препарата.

4. Практические предложения.

В результате проведенных исследований разработаны:

- ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец, которая рекомендована для применения в неблагополучных по этим болезням зонах России;

- «Временное наставление по применению ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец лиофилизированной», утвержденное Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 28 марта 2000 года.

5. Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Числов Ю.В., Косяченко Н.С., Никулин А.Н. Определение чувствительности сибиреязвенных вакцинных штаммов к антибиотикам.// Диагностика, профилактика и меры борьбы с особоопасными и экзотическими болезнями животных: Мат-лы Межд науч.- практ. конф., посвященной 40-летию ВНИИВВиМ, Покров, 1998, с. 331.

2. Никулин А.Н., Косяченко Н.С., Глухарева E.H., Щетникова. JI.A. Ассоциированная иммунизация овец против сибирской язвы и оспы. // Проблемы инфекционных и инвазионных болезней в животноводстве на современном этапе: Тез. докл. Межд. конф., посвящ. 80-летию МВА им. К.И. Скрябина. Москва, 1999, с. 120-121.

3. Никулин А.Н., Бакулов И.А., Селянинов Ю.О. Проблемы создания ассоциированных вакцин против инфекционных болезней овец.// Вестник Россельхозакадемии, 2000, № 4, с.21-24.

4. Никулин А. Н., Бакулов И. А., Косяченко Н.С., Щетникова Л. А., Горшкова Т. Ф. Изучение биологических свойств вакцинных штаммов Вас. anthracis и вируса оспы овец в процессе хранения экспериментальной ассоциированной вакцины // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Тез. докл. Всерос науч.-практ. жонф., посвящ. 30-летию ВНИТИБП. Щелково, 2000, с. 168-170.

5. Никулин А. Н., Бакулов И. А., Бальппев В.М., Селянинов Ю.О., Глухарева E.H., Жестерев В.Й., Бадаев Ф.А. Оценка иммуногенности и безвредности экспериментальной ассоциированной вакцины против сибирской

язвы и оспы овец // Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов: Тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф., посвящ. 30-летию ВНИТИБП. Щелково, 2000, с. 170-172.

6. Грехова Н.В., Никулин А.Н., Косяченко Н.С., Селянинов Ю.О., Балышев В.М. Клинико-гематологические изменения при иммунизации овец ассоциированной вакциной против сибирской язвы и оспы // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особоопасными, экзотическими и зооан-тропоцозными болезнями животных: Сб. статей Межд. науч.-практ. конф. ВНИИВВиМ. Покров, 2000, с. 243-246.

Вакцинопрофилактике отводится значительное место в обеспечении благополучия животных по многим инфекционным болезням, которые продолжают наносить существенный экономический ущерб животноводству во многих странах мира, включая и Россию. Это в полной мере можно отнести и к таким опасным болезням овец как сибирская язва и оспа, которые в виде отдельных очагов и спорадических случаев регистрируются на территории РФ и граничащих с ней стран в первую очередь Южного и Юго-Восточного регионов.

Согласно данным МЭБ вспышки этих болезней регистрируются в Иране, Индии, Пакистане, Греции, Азербайджане, Узбекистане, Казахстане, Киргизии, Таджикистане, Туркмении, Молдавии.

На основе суммарного показателя неблагополучных по сибирской язве пунктов за последние 10 лет максимальная опасность возникновения эпизоотических очагов прогнозируется в следующих регионах России: Дагестан, Чечня, Ингушетия, Северная Осетия, Кабардино-Балкария, Ставропольский край, Краснодарский край, Ростовская область, Саратовская, Самарская, Пензенская, Белгородская, Воронежская, Тамбовская, Курская, Орловская, Тульская, Оренбургская области, Башкортостан и Татарстан. Высока вероятность появления болезни в Волгоградской, Липецкой, Омской областях и Алтайском крае. Повышенный риск осложнения обстановки по сибирской язве существует во всех республиках Северного Кавказа (И.А. Бакулов, и др., 1996; В.А. Ведерников, и др. 1996).

С 1984 по 1994 г. Российская Федерация была благополучной по оспе овец и коз. В декабре 1994 г болезнь была установлена сначала в Дагестане, затем и в Ставропольском крае, где было зарегистрировано по 5 неблагополучных пунктов, в которых заболело оспой 2807овец.

За период 1995-1999г. оспа овец была зарегистрирована в Дагестане, Ставропольском крае, Калмыкии, Карачаево-Черкессии, Ростовской, Волгоградской, Астраханской, Курганской и Читинской областях.

Характер ведения овцеводства, связанный с большой концентрацией овец на ограниченных площадях, в том числе в условиях отгонного животноводства, создает благоприятные условия возникновения и распространения этих болезней. Это обусловлено и тем, что возбудители сибирской язвы и оспы овец длительное время могут сохраняться во внешней среде, представляя потенциальную опасность для не иммунного поголовья животных.

В настоящее время для профилактики этих болезней в России и странах СНГ применяют живые моновакцины, которые получают на основе в ы сок о имм у н о гс I {н ы х вакцинных штаммов 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы, и штамма НИСХИ, а также полученных на его основе вариантов вируса оспы овец. Однако, несмотря на наличие этих препаратов, практическая ветеринарная служба нуждается в ассоциированной вакцине, что обусловлено совпадением неблагополучных зон по сибирской язве и оспе овец в некоторых регионах РФ, а также необходимостью формирова ния, при некоторых эпизоотических ситуациях, в короткие сроки иммунитета против этих болезней.

Следует отметить, что при использовании моновакцин в хозяйствах возникают трудности с составлением прививочного календаря, поскольку при формировании полноценного иммунитета между отдельными прививками требуется соблюдение определенного интервала. Применение ассоциированной вакцины могло бы значительно снизить затраты на проведение прививок, уменьшить потери продуктивности овец вследствие стресса и травмирования животных при вакцинации.

Необходимо отметить, что проводимые ранее многочисленные попытки создания ассоциированной вакцины против этих болезней не увенчались успехом. При конструировании такой вакцины в качестве исходных компонентов различные авторы использовали вакцинные штаммы 1-й и 2-й вакцины Ценковского, СТИ, ГНКИ возбудителя сибирской язвы и штаммы "К", "Румынский", "Ставрополь" вируса оспы овец (Бе1ру Ь. Р. с соавт., 1947; Кобец М.С., 1960; Панкратов А.Я. с соавт., 1960; Лихачев Н.В. с соавт., 1967). Препараты, полученные на основе этих и других штаммов, были или высокореактогенными, или не обеспечивали формирования достаточно напряженного иммунитета против этих болезней

Цель и задачи исследования.

Цель исследований - разработать ассоциированную вакцину против сибирской язвы и оспы овец.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1 Определить возможность изготовления ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец из штамма 55 ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы и клонированного варианта штамма НИСХИ вируса оспы овец.

2 Определить оптимальные соотношения сибиреязвенного и оспенного компонентов в ассоциированном препарате.

3 Изготовить экспериментальные серии вакцины, изучить их иммунобиологические свойства: культурально-морфологические; биологическую активность компонентов; безвредность и реактогенность препарата; иммуногенность.

4. Определить напряженность и длительность иммунитета против сибирской язвы и оспы овец у восприимчивых животных после введения ассоциированной вакцины.

5. Определить влияние сроков и условий хранения вакцины на ее иммунобиологические свойства.

Научная новизна.

Разработана ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец на основе бескапсульного авирулентного штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы и клонированного варианта штамма НИСХИ вируса оспы овец.

Установлено, что смесь коммерческих монопрепаратов не обеспечивает формирования напряженного иммунитета против сибирской язвы у морских свинок из-за ингибирующего действия на штамм 55- ВНИИВВиМ Вас. агйЬгааБ антибиотиков, применяемых при изготовлении вирусвакцины против оспы овец.

Практическая значимость.

В результате проведенных исследований разработана' и испытана в производственных условиях ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец. Использование ассоциированной вакцины обеспечивает формирование напряженного иммунитета одновременно против двух болезней, позволяет сократить число профилактических прививок и, тем самым, снизить потери продуктивности вследствие неблагоприятного стрессового воздействия на организм овец.

Разработано "Временное наставление по применению ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец лиофилизированной"''' (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 28 марта 2000 года).

Апробация работы.

Материалы диссертации доложены на:

Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 30-летию ВНИТИБП, (г. Щелково, 2000 г);

Международной научно-практической конференции,

ВНИИВВиМ (г. Покров, 2000 г); заседаниях ученого совета ВНИИВВиМ, 1998-2000 гг.

Публикация.

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты разработки ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец, методов контроля и способа применения.

2. Результаты изучения иммунобиологических свойств ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец и ее испытаний вакцины в неблагополучных по этим болезням зонах России.

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 103 страницах машинописного текста; включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения.

5. Выводы

1. Антибиотики, применяемые в производстве вирусвакцины против оспы овец, ингибируют рост культуры сибиреязенного компонента в составе смеси коммерческих монопрепаратов против этих болезней, препятствуя формированию напряженного иммунитета против сибирской язвы у морских свинок.

2. Установлена совместимость антигенов возбудителя сибирской язвы и вируса оспы овец в ассоциированной вакцине, изготовленной без антибиотиков или с использованием полимиксина.

3. Разработана ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец на основе штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы и клонированного варианта штамма НИСХИ вируса оспы овец, прививная доза которой- содержит 10-12,5 млн. спор возбудителя сибирской язвы и 3,5-3,75 ^ ТЦДзо вируса оспы овец, что обеспечивает формирования напряженного иммунитета против этих болезней.

4. Ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец ареактогенна и безвредна в прививной и десятикратной дозах соответственно.

5. Ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец обеспечивает формирование напряженного иммунитета против обеих инфекций через 14 суток после вакцинации продолжительностью не менее 12 месяцев, вызывая образование вируснейтрализующих противооспенных и противосибиреяз-венных антител в титрах 1:4-1:16 и 1:160-1:320, соответственно.

6. Культурально-морфологические и иммунобиологические свойства Вас. ап-ШгааБ и вируса оспы овец в ассоциированном препарате не отличаются от таковых в монопрепаратах и не изменяются в течение 12 месяцев хранения при минус 10 ± 2°С и 4 ± 2 °С.

7. При введении ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец в прививной дозе у животных возрастает общее количество лейкоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов, достигая максимума на 5-е сутки. Картина кро

88 ви восстанавливается до исходных значений к 28 - 30 суткам, что дополнительно свидетельствует о безвредности препарата.

6. Практические предложения.

В результате проведенных исследований разработаны:

- ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец, которая рекомендована для применения в неблагополучных по этим болезням зонах России;

- «Временное наставление по применению ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец лиофилизированной», утвержденное Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 28 марта 2000 года.

2.5. Заключение.

Таким образом, анализ эпизоотической ситуации и данных литературы свидетельствует о необходимости создания ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец. Для этого необходимо установить совместимость антигенов вакцинных штаммов этих возбудителей их количественные соотношения в разрабатываемом препарате, испытать его реакто-генность, безвредность и иммуногенность, а также продолжительность индуцируемого иммунитета.

3. Собственные исследования. 3.1. Материалы и методы. 3.1.1. Материалы. 3.1.1.1. Бактерии и вирусы.

Вакцинный штамм 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы с концентрацией 250 -350 млн./см .

Референс-заражающая культура штамма M-7I с концентрацией спор 1 млн./см .

Клонированный вариант вакцинного штамма НИСХИ вируса оспы овец 3 пассажа в перевиваемой культуре клеток ПО с активностью 5,5 - 6,5 lg ТЦДзо/см1.

Вирулентный штамм «Монгольский» вируса оспы овец, 20% суспензия кожных поражений и подкожной клетчатки овец 3-го пассажа с инфекционной активностью 4,2 lg ИД5()/см".

3.1.1.2. Питательные среды, растворы и культуры клеток: мясо-пептонный агар (МПА); мясо-пептонный бульон (МПБ) 2%-ный; мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) под вазелиновым маслом; агар Сабуро; среда (СВК) для выделения и культивирования сибиреязвенного микроба; среда Игла МЭМ на растворе Эрла или Хенкса; смесь Никифорова; синька Лефлера; забуференный физиологический раствор рН 7,2-7,4; перевиваемая культура клеток почки овцы (ПО).

3.1.1.3. Животные: белые мыши живой массой 18-20 г; морские свинки живой массой 300-350 г; кролики породы «Шиншилла» живой массой 3,0 - 3,5 кг; овцы Романовской породы в возрасте от 3-х месяцев до 2-х лет.

Содержание и кормление животных проводили согласно принятым нормам.

3.1.1.4. Оборудование: холодильники низкотемпературные ("Ке1ута1ог", США) и бытовые отечественного производства; термостаты; роллерные установки стеллажно-ярусного типа, разработанные и изготовленные во ВНИИВВиМ для промышленного культивирования клеток и вирусов; реактор для суспензионного культивирования Вас. апЙггаЫз, разработанный и изготовленный во ВНИИВВиМ; аппарат для лиофильной сушки (Еёуагз, Англия); микроскопы МБИ-2 (ЛЮМАМ, Ленинград) и инвертированные (Ор1;оп, Германия); \ магнитная мешалка; милливольтметр рН-121; камера Горяева; весы аналитические.

3.1.2. Методы.

Изучение культурально-морфологических свойств вакцинных штаммов 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы и клонированного варианта штамма НИСХИ вируса оспы овец, а также иммунобиологических свойств экспериментальных серий ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец проводили в соответствии с требованиями ТУ на монопрепараты против этих болезней: ТУ 9384-025-00009064-97 "Вакцина против сибирской язвы животных из штамма 55-ВНИИВВиМ" и ТУ 9384014-00495549-98 "Вирусвакцина против оспы овец сухая культуральная".

3.1.2.1. Определение культурально-морфологических свойств штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы

Типичность роста культуры штамма 55-ВНИИВВиМ определяли на питательных средах МПБ, СВК по характерному росту и по отсутствию гемолиза на кровяном агаре.

Однородность штамма 55-ВНИИВВиМ определяли путем высева культуры на 1,3 %-ный агар из триптического перевара сердца по наличию однородных (круглых, приподнятых над поверхностью агара, выпуклых, желтовато-белых, шероховатых, диаметром 3-4 мм) колоний. Учитывали - количество диссоциативных форм колоний.

Морфологические свойства штамма 55-ВНИИВВиМ определяли в мазках бульонных кулыур окрашенных по Грамму, по наличию грамполо-жительных однородных палочек и коротких цепочек фиолетового цвета, а также блестящих (неокрашенных) спор овальной формы, находящихся в центре вегетативной клетки или вне ее и отсутствию инволюционных форм бактерий (извитые, округлые и т.д.).

Подвижность бацилл штамма 55-ВНИИВВиМ определяли просмотром 18-24 часовой бульонной культуры под микроскопом в препарате "висячая" или "раздавленная" капля.

Капсулообразование бацилл определяли в мазках-отпечатках из внутренних органов и брюшного эксудата белых мышей, павших после введения культуры штамма 55-ВНИИВВиМ, окрашенных синькой Лефлера или по Романовскому-Гимза.

Массовую долю спор в культуре штамма 55-ВНИИВВиМ определяли в неокрашенных препаратах ("висячая или раздавленная" капля). Для этого из 104 разведения вакцины на предметном стекле готовили "раздавленную каплю" по общепринятой методике. Приготовленные препараты просматривали под микроскопом в фазовом контрасте при кратности увеличения х 400. Просматривали 10 полей зрения и в каждом поле зрения отдельно подсчитывали количество бактериальных клеток и спор.

Массовую долю спор С] в процентах в испытуемой вакцине вычисляли по формуле:

С] -----------100

Икл где : С1 - искомый процент спор;

Иш - количество обнаруженных спор;

Ыкл - общее количество бактериальных клеток (споровых и вегетативных);

100 - постоянный коэффициент.

Содержание жизнеспособных спор расчитывали по формуле после подсчета колоний выросших при высеве десятикратных разведений культуры на питательных средах СВК и МПА.:

N5+ N6 С =------------и 5 где: С - число жизнеспособных спор в 1 см" вакцины (млн.);

N5- среднее арифметическое число колоний, выросших в чашках при посеве из разведения 10°; N6 - среднее арифметическое число колоний, выросших в чашках при посеве из разведения 10~6; 1,1 постоянный коэффициент.

Титр вируса определяли титрованием штамма в суспензии перевиваемой культуре клеток ПО. Титр расчитывали по Риду и Мен чу и выражали в тканевых цитопатических дозах (ТЦДзо/см'5).

3.1.2.3. Определение массовой доли влаги.

Массовую долю влаги в лиофилизированной вакцине определяли согласно ГОСТ 24061.

3.1.2.4. Определение безвредности.

Испытание на безвредность проводили путем введения животным (2 овцы и 3 кролика) 10 прививных доз ассоциированной вакцины. Одна прививная доза содержит 10-12,5 млн. спор штамма 55-ВНИИВВиМ и не 3.53,75 ТЦДзо вакцинного штамма НИСХИ вируса оспы овец.

3.1.2.5. Определение иммуногенности.

Испытание иммуногенности вакцины против сибирской язвы проводили на морских свинках (10 голов), против оспы - на овцах (2 головы). Морским свинкам и овцам вводили по 1 прививной дозе ассоциированной вакцины. Через 12-14 суток после вакцинации морским свинкам вводили сибиреязвенную референс-заражающую культуру штамма М-71 в дозе 1,0 млн. жизнеспособных спор, овцам вирулентный вирус оспы овец штамма «Монгольский» в дозе 500-1000 ИД50.

3.1.2.6. Серологические исследования.

3.1.2.6.1. Реакция непрямой гемагглютинации (РИГА).

Реакцию непрямой гемагглютинации применяли для определения поствакцинальных сибиреязвенных антител, которую ставили согласно "Временных методических указаний по применению РНГА", утвержденных ГУВМСХ СССР 15.08.1980 года.

3.1.2.6.2. Реакция нейтрализации (РН).

Реакцию нейтрализации ставили для определения титра антител против оспы овец со 100 ТЦД50 штамма НИСХИ в культуре клеток ПО с двукратным разведением сывороток.

3.2.7. Кожно-аллергическая проба (КАП).

Аллерген диагностический сибиреязвенный применяли для оценки противосибиреязвенного иммунитета согласно действующему наставлению по применению сибиреязвенного аллергена диагностического, утвержденного ГУВ МСХ РФ от 6. 05 1993 г.

3.1.2.8. Гематологические исследования

Картину крови у овец изучали после вакцинации ассоциированным препаратом и контрольного заражения животных вирулентным штаммом. В крови определяли количество эритроцитов, лейкоцитов, содержание гемоглобина и выводили лейкоцитарную формулу. Количества элементов крови определяли общепринятыми методами. При изучении отдельных форм лейкоцитов мазки крови фиксировали метанолом и красили по Романовскому -Гимза. (Кост Е.А., 1975, Кудрявцев А.А, Кудрявцева Л.А, 1974).

3.1.2.8. Определение чувствительности штамма 55-ВНИИВВиМ к антибиотикам проводили согласно общепринятой методике "Определение чувствительности микробов к антибиотикам методом диффузии в агар с применением дисков", описаной Лабинской A.C. (1972).

3.1.2.9. Производственные испытания.

Разработанную ассоциированную вакцину против сибирской язвы и оспы овец испытывали в хозяйствах Дагестана, Кабардино-Балкарии, Краснодарского края, Волгоградской области в соответствии с «Временным наставлением по применению ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец лиофилизированной», утвержденным Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода РФ 28 марта 2000 года

3.1.2.10. Статистическая обработка результатов.

Полученные результаты подвергали статистической обработке общепринятыми методами, используемыми в биологии (Лакин Г.Ф., 1980). Достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по разностному методу Стьюдента-Фишера, согласно которому для большинства биологических экспериментов уровень вероятности Р>0,05 свидетельствует об отсутствии закономерных отличий между сравниваемыми величинами

3.2. Результаты собственных исследований.

3.2.1. Разработка лабораторного образца ассоциированной вакцины против сибирской язвы и оспы овец.

При разработке ассоциированных вакцин в первую очередь должны решаться следующие проблемы: совместимость компонентов вакцины, способность нового сочетания индуцировать равноценный иммунитет против каждой из инфекций. Реактогенность и безвредность вновь предлагаемого согчетания, так как в некоторых случаях реактогенность ассоциированного препарата может быть выше, чем у исходных моновакцин. 3.2.1.1. Изучение совместимости вакцинных штаммов сибирской язвы и оспы овец и возможности использования смеси коммерческих монопрепаратов в качестве ассоциированной вакцины.

Первым этапом нашей работы являлось изучение возможности формирования иммунитета у животных, вакцинированных смесью двух коммерческих монопрепаратов против сибирской язвы и оспы овец, изготовленных на основе штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы и клонированного варианта штамма НИСХИ вируса оспы овец. С этой целью была приготовлена смесь, содержащая в 1 см3 по одной иммунизирующей дозе этих вакцин (12,5 млн. спор штамма 55- ВНИИВВиМ и 3,5 ^ ТЦД50 вируса оспы овец). Для оценки иммуногенной активности сибиреязвенного компонента этим материалом было привито 10 морских свинок. В течение 10 суток животные оставались клинически здоровыми. Суммирования реак-тогенности препаратов не происходило.

Безвредность смеси моновакцин определяли путем введения десяти иммунизирующих доз кроликам породы "шиншилла" подкожно в наружную поверхность бедра в объеме 5,0 см 3 (по 2,5 см 3 в каждое бедро). В течение 10 суток (срок наблюдения согласно ТУ на монопрепарат) кролики оставались живы, т.е. смесь вакцин в десятикратной дозе была безвредна.

После заражения вакцинированных и контрольных (10 голов) морских свинок референс - заражающим штаммом М-71 возбудителя сибирской язвы в дозе 1 млн. спор в опытной группе выжило 40% животных при ] 00% гибели контрольных, в то время как согласно требованиям ТУ на монопрепараты процент защиты должен составлять не менее 80%.

Привитые смесью моновакцин овцы (2 головы) не заболевали оспой после контрольного заражения их вирулентным штаммом "Монгольский" через 12 дней после вакцинации.

Таким образом, было установлено, что механическая смесь монопрепаратов не обеспечивала формирования достаточно напряженного иммунитета у морских свинок, защищающего их от гибели после контрольного заражения референс-заражающей сибиреязвенной культурой.

Культурально-морфологические свойства штамма 55-ВНИИВВиМ возбудителя сибирской язвы в смеси и в исходных монопрепаратах изучали методами посева проб на МПА, МПБ, агар Сабуро, для определения типичности роста В. атИгасхБ и отсутствия посторонней микрофлоры. Посевы ежедневно просматривали в течение 10 суток инкубирования при 37 °С. В результате установлено, что на всех средах с высевами культуры штамма 55-ВНТШВВиМ возбудителя сибирской язвы наблюдался ее характерный рост, посторонняя бактериальная и грибная микрофлора в этих материалах отсутствовала. Однако, в образце смеси коммерческих моновакцин слабый рост культуры сибиреязвенного микроба в МПБ появлялся лишь на 5-е сутки культивирования, в монопрепарате характерный рост культуры В. апЛгаа'Б наблюдали уже через 18 часов (табл. 1). Микроскопия мазков методом «раздавленной капли» подтверждала наличие в материале возбудителя сибирской язвы.

Концентрация спор в течение 5 суток хранения смеси при темперап л туре 4 ± 2 С практически не снижалась и составляла 350-400 млн./ см . Активность вакцинного вируса оспы овец также оставалась на исходном уровне, его цитопатогенное действие в культуре клеток ПО проявлялась в те же сроки, что и в монопрепрате.