Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка и испытание живой ассоциированной вакцины против Сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ГЛАВНОЕ УПРАВЛЕНИЕ ВЕТЕРИНАРИИ

ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬС.-ИЙ ИНСТИТУТ КОНТРОЛЯ, СТАНДАРТИЗАЦИИ И СЕРТИФИКАЦИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ

( ВПШ )

РАЗРАБОТКА И ИСПЫТАНИЕ ЯИВОЙ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ И ЭМФИЗЕМАТОЗНОГО МРБУННУЛА КРУПНОГО РОГАТОГО

СКОТА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология.

На правах рукописи

ПЛЕСКИХ Сергей Александрович

УДК: 619:615.371.579.852.I:352.13Э.

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 1992

Работа выполнена в лаборатории контроля и стандартизации препаратов против анаэробных инфекций и лаборатории контроля и стандартизации препаратов против сибирской язвы и листериоза животных Всесоюзного ордена Трудового Красного Знамени государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов, а также в лаборатории бактериологии Всесоюзного научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии.

Научные руководители - доктор ветеринарных наук,

профессор Л.В.Кириллов

академик ВАСХНИЛ, доктор ветеринарных наук, профессор И.А.Бакулов

Официальные оппоненты - доктор ветеринарных наук,

профессор М'.А.Сидоров (ШПБ)

доктор ветеринарных наук,

А.А.Сидорчук

(ВНИИЭВ)

Ведущая организация - Всесоюзный научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности.

л / , , . ^ ¿0

Защита состоится "¿■■с/ " ✓¿¿У/-? 1992 г. в "/i " час. на заседании специализированного совета Д. 120.85.01 при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте "контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) Главного управления ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации по адресу: 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ ветпре-паратов.

-) / "" Автореферат разослан " t>f " ¿¿-v,у . 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета

кандидат ветеринарных наук Ю.А.Козырев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Инфекционные болезни животных, включая и такие, в целом хорошо изученные, как сибирская язва и эмфизематозный карбункул крупного рогатого скота', все еще продолжают наносить определенный, а в отдельных случаях достаточно ощутимый ущерб народно^ хозяйству страны, тем более, что в современных условиях промышленного животноводства риск возникновения указанных инфекций увеличивается пропорционально концентрации животных на пастбищных участках.

Совершенствование методов и средств специфической профилактики инфекционных болезней и, в частности, разработка ассоциированных иммунизирующих препаратов является актуальной задачей, имеющей как научную, так и практическую значимость. Применение ассоциированных вакцин позволяет создавать у привитых животных иммунитет одновременно против двух или нескольких инфекций, что приводит не только к существенному снижению затрат труда ветеринарных специалистов, но и позволяет в более короткие сроки создавать стойкое благополучие поголовья по отношению к инфекционным болезням микробной и вирусной этиологии.

О высоком экономическом эффекте при применении различных ассоциированных препаратов сообщает ряд исследователей - К.И.Одарен-ко и Б.К.Ильясов, В.И.Грязин, Л.Д.Панкратов, Р.А.Кадымов, Б.Г.Трух-манов и другие.

Тем не менее, из всех биопрепаратов, применяемых в настоящее время в ветеринарии, ассоциированные составляют менее 10 процентов.

О важности затронутого нами вопроса говорит и то обстоятельство, что проблеме конструирования и применения ассоциированных вакцин неоднократно посвящались международные симпозиумы, состоявшиеся в СССР (1958), Швейцарии (1967), Югославии (1972) и других странах.

В нашей стране все поголовье крупного рогатого скота, начиная с трехмесячного возраста,ежегодно вакцинируют против антракса, а в возрасте от трех месяцев и до четырех лет - против эмфиземато:--ного карбункула.

В последние годы в нашей стране, с целью специфической профилактики сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота, применяют две ассоциированные вакцины. Одна из них, разработанная специалистами Казахского НИВИ (Горелов Ю.М., Одаренно К.И., 1990) содержит формалинизированную культуру вирулентного штамма эмфизематозного карбункула и живую культуру вакцинного сибиреязвенного штамма СТИ-1. Другая вакцина, промышленное производство которой начато в 1988 году, создана 'во Всесоюзном государственном научно-контрольном институте ветеринарных препаратов на основе двух живых микробных агентов - аттенуированных вакцинных штаммов 2/14 - эмфизематозного карбункула и СТИ-1 сибирской язвы. Благодаря использованию живой культуры штамма 2/14, обладающей низко? остаточной вирулентностью и значительно превосходящей по иммуноген-ности инактивированную формалином культуру вирулентного штамма сЮ-stridium ciiauvooi эта ассоциированная вакцина является существенно более эффективной, так как создаваемый ею у крупного рогатого скота иммунитет против эмкара наступает в более ранние сроки и „сохраняется дольше, чем при использовании ассоциированной вакцины, изготовленной на основе убитого компонента. Кроме того, при изго- ■ товлении живого препарата не нужно проводить нейтрализацию остаточного формалина, что существенно упрощает технологический процесс изготовления вакцины. Присутствие формалина даже в незначительных количествах оказывает губительное действие на жизнеспособность сибиреязвенных спор.

Известные бивалентные вакцины указанного назначения во всех странах готовят на основе убитых антигенов эмфизематозного карбун-

кула, поэтому они обладают теми же недостатками, что и отечественный аналог препарата.

В СССР с 1988 года для профилактики сибирской язвы животных, применяют живую вакцину из аттенуированного бескапсульного штамма 55, созданную во Всесоюзном научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии. Вакцинный сибиреязвенный штамм 55 обладает более широким иммунологическим спектром, умеренно реактогенен, а приготовленная на его основе вакцина создает у привитых животных более напряженный и более продолжительный иммунитет против антракса, чем применяющаяся с 1942 года вакцина из штамма СТИ-1. Благодаря большей иммуногенности противосибиреязвенной вакцины, изготовленной на основе штамма 55, оказалось возможным принципиально изменить схему применения препарата и прививать животных один раз в год, вместо двукратной вакцинации предусмотренной при использовании вакцины из штамма СТИ-1.

Цель и задачи исследований. Изучить иммунологическую совместимость вакцинных штаммов вас. апШгас1з ' 55 и с1- с!1аиуое1 2/14, разработать методику приготовления и изучить свойства живой ассоциированной вакцины против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота.

Для проведения экспериментов были использованы морские свинки, кролики и крупный рогатый скот.

В ходе исследований для разрешения были поставлены следующие задачи:

1. Изучить совместимость вакцинных штаммов Вас. ап^гас1з 55 и С1. с]пашгое1 2/14.

2. Подобрать иммунологически сбалансированное соотношение сибиреязвенного компонента и антигена эмфизематозного карбункула при сведении их в одной прививочной дозе препарата.

3. Установить сроки формирования иммунитета против сибирской члвы и эмфизематозного карбункула у лабораторных животных привитых

живой ассоциированной вакциной из сибиреязвенного штамма 55 и штамма 2/14, в сравнении с монопрепаратами изготовленными по аналогичной методике из этих же штаммов.

4. Определить длительность персистирования, локализации и сроки элиминации вакцинных штаммов вас. anthracis 55 и el. chauroei 2/14 в организме морских свинок,иммунизированных ассоциированной вакциной, в сравнении с группами животных, привитых указанными антигенами раздельно.

5. Изучить продолжительность и напряженность иммунитета против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула в опытах на крупном рогатом скоте, вакцинированном живым ассоциированным препаратом из штаммов вас. anthracis 55 и el.chauvoei '2/14.

6. Определить уровень образования сибиреязвенных гемагглютини-нов в сыворотке'крови крупного рогатого скота, иммунизированного живой ассоциированной вакциной против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула через различные сроки после вакцинации.

7. Изготовить опытно-лабораторную серию живой ассоциированной вакцины против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула из штаммов вас.anthracis 55 и el. chauvoei 2/14 и испытать ее на крупном рогатом скоте в производственных условиях.

8. Изучить жизнеспособность штаммов и иммуногенные свойства образцов живой ассоциированной вакцины против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула в сравнении с монопрепаратами в процессе . длительного хранения.

9. Подготовить проект временной НТД на опытно-проМышленную серию живой ассоциированной вакцины против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота из штаммов Вас.anthracis 55 и Cl. chauvoei 2/14.

Научная новизна. Впервые получены результаты по изучению основных параметров ассоциированной вакцины против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота из штаммов Bac.anth-

гас!з 55 и с1. с11аиуое1 2/14 (оптимальное соотношение компонентов; сроки формирования иммунитета; длительность персистирования, локализации и элиминации штаммов; продолжительность и напряженность иммунитета).

Практическая значимость. Разработан способ приготовления и схема применения живой ассоциированной вакцины против сибирской язвы и эмкара из аттенуированных вакцинных штаммов 55 и 2/24. На указанный препарат разработаны проекты временных НТД: инструкция по изготовлению и контролю, технические условия изготовления, наставление по применению.

Апробация и внедрение. Основные материалы диссертации доложены на конференции молодых ученых БИЭВ" ВАСХНИЛ (1989 г.); на двенадцатой (1990 г.) конференции молодых ученых ВГНКИ ветпрэпаратов; на тринадцатом Пленарном заседании Межведомственной научно-методической комиссии по борьбе с сибирской язвой, Государственной комиссии по продовольствию и закупкам Совета Министров СССР и Министерства здравоохранения СССР (1990 г.); на межлабораторном совещании сотрудников ВГНКИ ветпрепаратов (1991 г.).

Живую ассоциированную вакцину против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота, изготовленную на основе аттенуированных вакцинных штаммов вас. ап-Шгас1з 55 и С1. оЬаи-уое1 2/14, испытывали в соответствии с приказом Главного управления ветеринарии СССР № 48 от 12.06.1989 г. в совхозе "Россия" и ОПХ "МИС" Петушинского района Владимирской области, которые являются неблагополучными по заболеваемости животных сибирской язвой и эмфизематозным карбункулом.

Главным, управлением ветеринарии СССР в 1991 г. утверждены: "Временная инструкция по изготовлению и контролю вакцины против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота живой ассоциированной"; "Временные технические условия

(ТУ 10.07.238-91) на вакцину живую ассоциированную и "Временное наставление по применению вакцины живой против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота живой ассоциированной".

Публикации. Основные положения диссертации изложены в четырех печатных работах.

Основные положения диссертационной работы выносящиеся на защиту.

1. Экспериментальное обоснование иммунологической совместимости и определение иммунологически сбалансированного соотношения вакцинных штаммов вас .ап-Шгасхз 55 и с1 .сЬашгоех 2/14, при сведении их в одной прививочной дозе.

2. Методика изготовления, контроля и применения живой ассоциированной вакцины против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота.

3. Экспериментальная работа по изучению свойств живой ассоциированной вакцины, изготовленной из аттенуированных. штаммов вас . ап1;11гас1з 55 и с1. сЬаиуое! 2/14.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и включает в себя введение, обзор литерутры, собственные исследования, обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения, список литературы. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 3 рисунками. Список использованной литературы содержит 203 источника, в том числе 68 иностранных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

В ходе проведенных исследований были использованы следующие виды животных: морские свинки - 1560, кролики - 9, крупный рогатый скот - 76 голов.

В опытах с заражением крупного рогатого скота использовали вирулентные штаммы Вас.ап1;11гас:1а "и 76" и С1-с11аилгоез.Р-15. При выполнении экспериментов использовали следующие вакцинные штаммы возбудителя сибирской язвы - 55, СЩ-1 и М-71; возбудителя эмкара -2/14.

Для культивирования производственных штаммов возбудителя эмфизематозного карбункула использовали мясопептонный печеночный бульон (МППБ) с кусочками печени под вазелиновым маслом. Для получения матровой расплодки и изготовления вакцины против эмфизематозного карбункула использовали питательную среду, изготовленную на основе перевара Хоттингера и печеночного экстракта с добавлением пептона Мартена. Типичность роста устанавливали путем высева культур с1-сЬаиуое1 на мясопептонный печеночный агар с добавлением глюкозы и дефибринированной крови барана, в чалшах Петри и культивированием в условиях анаэробиоза.

Для культивирования вакцинных и вирулентных штаммов вас .ап-№гас1з использовали 2%-й мясо-пептонный агар (МПА) и мясо-пептон-ный бульон - (МПБ).

Чистоту штаммов вас.ап-Шгасхз, с1. сЬаиуое! в отношении конта-минантов проверяли путем посева на среду Китт-Тароцци, МПБ, МПА и среду Сабуро.

В работе использовали следующее оборудование: микроскоп, тор-зионные весы типа В-802; потенциометр типа рН-340; термостат, холодильник, микрокалькулятор программируемый; микроанаэростат с вакуумным насосом; центрифуга с частотой вращения 10.000 об/мин.; водяную баню, шуттельаппарат.

Количество живых сибиреязвенных спор в культуре определяли путем посева последовательных десятикратных разведений культур вас. ап-ЬЬгасгз на плотные питательные среды.

о

Количество микробных тел в 1,0 см культур с1.сЬаиуое1 определяли по оптическому стандарту мутности ГИСп им. Тарасевича.

Кммуногенную активность ассоциированной вакцины по отношению к обеим инфекциям определяли по методике Спирмэна-Кербера, позволяющей расчитывать 50%-ю иммунизирующую дозу (ИмДзд). Расчеты по полученным результатам выполняли на программируемом калькуляторе по разработанной нами программе.

Определение титров противосибиреязвенных антител определяли в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА). Для исследования использовали свежую неконсервируемую сыворотку крови вакцинированного ассоциированной вакциной крупного рогатого скота, лиофилизирован-ный эритроцитарный диагностикум, представляющий собой 2,5%-ю взвесь формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных цитоплазменным антигеном возбудителя сибирской язвы.

В качестве положительного контроля применяли противосибире-язвенную лечебно-профилактическую сыворотку, в качестве отрицательного - нормальную сыворотку крови лошади. При дифференциации поствакцинальных антител от постинфекционных, использовали 2-меркапто-этанол.

Исследования по определению сроков хранения и пригодности живой ассоциированной вакцины против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота проводили с помощью метода оценки стабильности (устойчивости биологической активности препарата и составляющих его антигенов при длительном хранении) -тест термостабильности при повышенных температурах (тест "ускоренного старения"). Этот метод позволяет количественно оценить стабильность биопрепарата и прогнозировать сроки хранения в зависимости от температуры.

Расчеты по этой методике выполняли на программируемом калькуляторе по разработанной нами программе. В программе расчитываются: константа скорости инактивации, для каждой интересующей температуры, логарифм искомого значения активности биопрепарата при любой

интересующей температуре, в любое заданное время.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Определение совместимости вакцинных штаммов Вас. ап1;Ьгас1з 55 и cl.chau.voei 2/14 при сведении их в одной прививочной дозе

При создании живых ассоциированных препаратов необходимо учитывать явление бактериоциногении - одной из форм микробного антагонизма.

Так как возбудитель сибирской язвы выделяет антрацин, который подавляет рост некоторых микроорганизмов,прежде чем приступить к основной части работы мы определили совместимость вакцинных штаммов вас. ап-ЬЬгасхз 55 и С1. сЬаитое! 2/14. При этом №1 применяли метод отсроченного антагонизма.

В результате проведенной работы было установлено, что продукты жезнедеятельности как штамма Вас. ап1;1хгас1з 55, так и штамма С1 . сЬаотое1 2/14 не угнетают микробный рост друг друга.

3.2. Подбор оптимальной концентрации антигенов в ассоциированной вакцине

Важнейшей задачей при конструировании ассоциированных препаратов является подбор оптимальных (иммуногенно сбалансированных) соотношений антигенов, входящих в его состав.

Изготовление сибиреязвенного и эмкаровского компонентов проводили согласно действующих, в настоящее время, инструкций по изготовлению и контролю соответствующих моновакцин.

Работу по подбору оптимального соотношения микробных компонентов в вакцине проводили в два этапа.

На первом этапе определяли оптимальное число сибиреязвенных спор в ассоциированном препарате.

С этой целью изготовили 4 варианта ассоциированной вакцины с

о

постоянной концентрацией (10-8 млрд микробных тел в см С1. сЬаиуоех)

эмкаровского антигена И различными концентрациями (40, 20, 10 и

о

5 млн спор в см вас .ап«1гас1э ) сибиреязвенного антигена.

Далее делали по четыре разведения каждого варианта (шаг разведения 5). Каждый из приготовленных препаратов вводили подкожно

о

в объеме 0,5 см шести морским свинкам. Одну группу животных вакцинировали монопрепаратом из штамма 55 ВНИИЗВиМ (табл. I).

Через 10 суток после вакцинации всех привитых животных и шесть контрольных (не вакцинированных) морских свинок заражали стандартной заражающей споровой сибиреязвенной культурой шт. М-71 подкожно в дозе I млн спор. Через 10 суток после заражения учитывали результаты опыта и расчитывали ИмДзд по методу Спирмэна-Кер- > бера для испытуемых вариантов ассоциированной вакцины и монокультуры шт. 55-ВНИИВВиМ б^с .апгЬгас1з .

Вариант ассоциированной вакцины с концентрацией сибиреязвен-

о

ных спор - 20 млн в см избран в качестве основного для определения оптимального количества компонента эмкара, т.к. при этом варианте величина ИмД^ была наименьшей.

3

Приняв концентрацию .20 млн сибиреязвенных спор в см , как основную, было изготовлено 4 варианта ассоциированной вакцины с содержанием антигена эмкара в количестве 10; 5; 2,5; 1,25 млрд м.т.

3

в см (табл. 2).

Каждым вариантом ассоциированной вакцины -подкожно иммунизировали морских свинок, на дозу брали по б животных. Аналогичным об<- . разом и в тех же количествах прививали морских свинок монопрепаратом изготовленным из шт. й-.оЬаиуое! 2/14. Через 10 суток после вакцинации всех иммунизированных и шесть контрольных животных заражали внутримышечно сухой споровой культурой шт. Р-15 эмкара в дозе 20 ЛДс,о в сочетании с 10%-ным хлористым кальцием.

Через 7 суток пойле заражения учитывали результаты опыта.

Проверка иммуногекной активности сибиреязвенного антигена в зависимости от его концентрации в ассоциированной вакцине

Наименование препарата (варианты вакцины) : Содержание :Кол-во за-:сиб.язвенных Сраженных :Кол-во вы-: :кивших жи- : млн.спор

:спор :см3 в 0,5 ¡животных :вотных

Ассоциированная вак- 20 млн. б 6

цина 2/14- 8-10 млрд/см3 4 55-40 млн/см3 800 млн. тыс. б б • 4 2 1,79

160 тыс. 6 -

Ассоциированная вак- 10 млн. б б

цина 2/14 -8-10 млрд/с: 55-20 млн/см3 3 О м ¿ 400 млн тыс. ' 6 6 б 3 0,4

80 тыс. 6 -

Ассоциированная вакцина 5 млн. б б

2/14 - 8-10 млрд/см3 I млн. , б 3 0,58

55-10 млн/см3 200 40 тыс. тыс. б 6 2

Ассоциированная вакцина 2,5 млн. б б

2/14 - 8-10 млрд/см3 500 тыс. б 3 0,5

о 55-5 млн/см 100 20 тыс. тыс. б 6 _

Моновакцина 5 млн. б 4

55-10 млн/зм3 I 200 40 млн. тыс. тыс. б б 6 2 I 1,71

Контроль

10

Проверка иммуноген^ости антигена эмфизематозного карбункула в зависимости от его концентрации в ассоциированной вакцине и в сравнении с иммуногенност&ю монопрепарата

Наименование препарата:Содержание ми-:Кол-во за-:Кол-во

варианты вакцины :кробных тел :раженных :выжив- :млрдтм.т.

: о :животных :ших жи-: _:в 0,5 см_:_:вотных :_

Ассоциированная вакци- 5-4 млрд 6 5 0,62

на 55-20 млн/см3 0,8-1 млрд 6 5

2/14 - 8-10 млрд/см3 160-200 млн 6 -

32-40 млн 6 -

Ассоциированная вакци- 2-2,5 млрд • 5 5

на 55-20 млн/см3 400-500 млн. 6 4 0,24

2/14 - 4-5 млрд/см3 80-100 млн; 6 2

16-20 млн. 6 -

Ассоциированная вакци- 1-1,25 млрд 6 3

на 55-20 млн/см3 200-250 млн. 6 5. 0,13

2/14 - 2-2,5 млрд/см3 40-50 млн 6 I

8-10 млн 6 2

Ассоциированная вакци- .500-625 млн 6 5

на 55-20 млн/см3 100-125 млн. 6 3 0,06

2/14 - 1-1,25 млрд/см3 20-25 млн. 6 3

4-5 млн. 6 I

Моновакцина 4-5 млрд. 6 . 4

2/14 - 8-10 млрд/см3 0,8-1 млрд. 6 3 0,36

160-200 млн. 6 4

32-40 млн. 6 I

Контроль

6 I

В результате проведенных исследований изменения иммуногенной активности культур с1.с1шиуое1 2/14 и вас. аггЫ1гас1э 55 ВНИИВВиМ, в зависимости от их: концентрации при ассоциации друг с другом, мы определили, что оптимальным соотношением антигенов является следующее - 20 млн сибиреязвенных спор и 1-2 млрд микробных тел возбуди-

3

теля эмкара в см .

При этом соотношении антигенов не наблюдается конкуренции между ними, а в отношении сибиреязвенного компонента было отмечено усиление его иммуногенности, по сравнению с иммуногенной активностью монопрепарата.

3.3. Сроки формирования иммунитета у морских свинок против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула после прививки живой ассоциированной вакциной

Ассоциированную вакцину вводили морским свинкам подкожно в область живота в объемной дозе 0,5 см , содержащей 10 млн сибиреязвенных спор и 2 млрд м.т. с1 .о11аиуое1 , монопрепараты - таким же способом и в таких же концентрациях.

Заражение животных сибирской язвой и эмкаром проводили выше описанным способом, на 3, -5, 7 и 10 сутки после вакцинации.

В каждый срок указанными вирулентными культурами заражали по 5 привитых каждым препаратом и 5 контрольных (не вакцинированных) животных. Через 10 суток после заражения.учитывали результаты.

Напряженный иммунитет против сибирской язвы и эмкара у морских свинок, привитых.как ассоциированной вакциной, так и монопрепаратами, формируется через 10 суток после их иммунизации. Через 7 суток выжило 40 и 80% животных привитых ассоциированной вакциной и зараженных соответственно возбудителями антракса и эмкара; 6Сморских свинок привитых сибиреязвенным монопрепаратом и 80% привитых вакциной против эмкара. В более ранние сроки заражения выживаемость иммунизированных животных не превышает 40%.

Также нами было отмечено, что: формирование напряженного иммунитета у морских свинок привитых живой ассоциированной вакциной против антракса и омкара наступает в те же сроки, что и у животных привитых монопрепаратами против' указанных инфекций.

3.4. Длительность персистирования и локализации вакцинных штаммов Вас . anthracis 55 и Cl. chauvoei 2/14 в организме морских свинок, иммунизированных живой ассоциированной вакциной

Способность живых микроорганизмов слабовирулентных штаммов определенное время находиться в организме иммунизированных животных вызывая, так называемую вакцинную генерализацию, в значительной мере определяет их иммуногенность.

Опыты были проведены на 3 группах морских свинок по 22 головы в каждой. Животных I группы иммунизировали ассоциированной вакциной из шт. вас. anthracis 55 ВНЖВВиМ и Cl. chauvoei 2/14, II и III групп - монопрепаратами из этих штаммов.

Через 3, 6, 12, 24 часа' 5, 10, 15 и 20 суток после иммунизации убивали по 2 животных из каждой группы.

Из пахового и заглоточного (регионарного и отдаленного) лимфатических узлов, печени, селезенки, сердца, костного мозга убитых животных делали посевы в МПБ, МППБ под вазелиновым маслом с кусочками печени, на МПА в пробирках. Посевы инкубировали при 37 °С в течение 5 суток. В случае появления микробного роста в МППБ выращенную культуру рассеивали в чашки Петри с кровяным агаром Цейссле-ра, а затем инкубировали при анаэробных условиях в термостате при 37 °С в течение двух суток. Из печени и селезенки делали мазки-отпечатки, которые окрашивали по Граму.

В результате проведенных исследований установлено: что культуры шт. вас . anthracis 55 и с Л, chauvoei 2/14, введенные как раздельно, так и в ассоциации друг с другом, быстро распространяются в организме морских свинок и уже через 3 часа выделяются из всех органов.

Это говорит о том, что организм животных очень быстро вовлекается в процесс иммуногенной перестройки и,следовательно, можно говорить, что у них формируется напряженный иммунитет.

Из лимфоузлов, селезенки и костного мозга исследованных животных культуры вышеуказанных штаммов выделяли на протяжении 15 суток после вакцинации.

Диссеминация и элиминация указанных штаммов в организме морской свинки введенных как раздельно, так и совместно совпадают по времени. Больше всего микробных культур было выделено из селезенки, костного мозга и лимфоузлов.

3.5. Иммуногенные свойства живой ассоциированной вакцины против сибирской язвы и эмкара в процессе длительного хранения

Нами была изучена иммуногенная активность ассоциированной вакцины, в сравнении с иммуногенностью монопрепаратов против сибирской язвы и эмкара, в зависимости от сроков их хранения. Чтобы иметь возможность количественно оценить иммуногенную стабильность препарата и прогнозировать сроки их хранения в зависимости от температуры мы применили метод "ускоренного старения".

Образцы ассоц. и моновакцин хранили при трех температурных режимах - в холодильнике (4-6 °С), при комнатной температуре (22-24 °С) и в термостате (36т37 °С). Иммуногенную активность исследуемых препаратов, выражали в ИмДзд (см3) для морских свинок и-определяли количественным способом перед закладкой на хранение, через 8 и 13 мес.

Из представленных в таблице данных видно, что свежеприготовленные моно и ассоциированные вакцины обладают высокой иммуногенной активностью по отношению к обеим инфекциям.

Через 8 мес. иммуногенная активность образцов ассоциированных и моновакцин,хранящихся в условиях холодильника,практически не изменилась по сравнению с исходной. ИмД^ образцов находящихся

Изменение иммуногенной активности ассоциированной вакцины и монопрепаратов в процессе хранения при различных температурных режимах

Наименование : препарата : ИмЦ50 (см^)

Время и условия хранения

Исходная 3 месяцев 12 месяцев

Холод. : Комната :Термостат : Холод. : Комната ¡Термостат

Ассоциирован, вакцина (си-биреяз.компонент) 0,02 0,026 0,076 .0,38 0,077 0,099 0,38

Ассоциирован, вакцина (эмка-ровский компонент 0,076 0,076 0,076 0,099 0,076 0,076 0,2

Моновакцина против антракса 0,034 0,07 0,18 0,7 0,17 0,85 0,85

Моновакцина против змкара 0,045 0,045 0,11 0,17 0,034 0,06 0,29

при комнатной температуре и в термостате значительно возросла. Причем, ассоциированная вакцина оказалась более устойчива к термоинактивации по отношению к обеим инфекциям, чем монопрепараты.

Через 12 мес. хранения ассоциированной вакцины при температуре 4-6 °С иммунологическая активность ее эмкаровского компонента осталась исходной, а сибиреязвенного компонента хотя и снизилась с 0,02 до 0,77 см3, но продолжала оставаться на высоком уровне.

Иммунологическая активность образцов ассоциированной вакцины и монопрепаратов находящихся в течение 12 мес. при комнатной температуре и в термостате значительно снизилась.

С целью выяснения причин снижения иммуногенной активности сибиреязвенной вакцины и сибиреязвенного компонента ассоциированной вакцины, мы определили концентрацию живых спор вас . ап1;}1гас18

о

55 в 1,0 см образцов этих препаратов,находящихся в условиях трех выбранных нами, температурных режимах, через 4, 8 и 12 мес. хранения.

В результате проведенных исследований установили, что концентрация живых сибиреязвенных спор в образцах ассоциированной и моновакцины,находящихся в.условиях холодильника снизилась незначительно, в допустимых пределах с 20,1 до 19 млн. спор в 1,0

о

см . В образцах находящихся при других температурных режимах снижение концентрации живых сибиреязвенных спор оказалось значительным. Надо отметить, что во всех случаях концентрация живых спор Вас. ап1Ьгас1э55 в ассоциированной вакцине была выше, чем в монопрепарате .

3.6. Динамика образования сибиреязвенных гемагглютининов в сыворотке крови крупного рогатого скота иммунизированного живой ассоциированной вакциной против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула

Результаты проведенной работы на лабораторных животных легли в основу при изготовлении опытно-лабораторной партии живой асссци-

ированной вакцины, которой были однократно привиты 311 голов крупного рогатого скота в двух хозяйствах Владимирской области, неблагополучных по сибирской язве и эмкару. Препарат вводили

о

п/к в дозе 2,0 см .

Через 4, 7 и 12 мес. у 40 случайно выбранных животных определяли титры сибиреязвенных гемагглютининов в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) с сибиреязвенным антигенным эритро-цитарным диагностикумом.

Полученные результаты свидетельствуют, что средняя геометрическая титров сибиреязвенных гемагглютининов в сыворотке крови крупного рогатого скота остается практически неизменной на протяжении 12 мес. после иммунизации (срок наблюдения).

3.7. Продолжительность иммунитета у крупного рогатого скота иммунизированного живой ассоциированной вакциной против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула

Наиболее объективным; показателем напряженности иммунитета является устойчивость вакцинированных животных к экспериментальному заражению вирулентными культурами, в сравнении с заражением интактных животных.

Экспериментальное заражение животных сибирской язвой и эмфизематозным карбункулом проводили'через 6 и 12 мес. после вакцинации вирулентными штаммами: Вас.ал^гасХэ № 76 перорально и С1. сЬаиуое1 Р-15 - парентерально.

За клиническим состоянием животных вели наблюдение в течение 10 суток с момента заражения.

Все невакцинированные животные погибли на 5-6 сутки от антракса и 2-3 от эмкара с характерными для указанных инфекций клиническими признаками и патологоанатомическими изменениями. У однократно вакцинированных живой ассоциированной вакциной животных и зараженных сибирской язвой и эмкаром, не отмечалось клини-

ческого проявления указанных заболеваний.

Таблица 4

Продолжительность иммунитета к сибирской язве и эмфизематозному карбункулу у телят привитых живой ассоциированной вакциной

Инфекции Животные .•Результаты заражения

:6 месяцев :12 месяцев

Сибирская язва Имму н и з ир о ванные 5/5 5/5

Контрольные 3/0 3/0

Эмфизематозный Иммунизированные 5/5 5/5

карбункул Контрольные ■ 3/ 0 3/0

Примечание: Числитель - количество зараженных животных Знаменатель - количество выживших животных

ВЫВОДЫ

, I. Разработана и изучена в лабораторно-практических условиях живая жидкая ассоциированная вакцина против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота на основе живой концентрированной гидроокись алюминиевой вакцины из штамма cl.ehauvoei 2/14 и споровой культуры авирулентного сибиреязвенного штамма Bac.anthracis 55 ВНИИВВиМ.

2. Установлено, что штаммы cl.ehauvoei 2/14 и Bac.anthracis 55 являются совместимыми, так как антрацин, выделяемый сибиреязвенным микробом, не угнетает рост и жизнедеятельность cl.ehauvoei 2/14, продукты жизнедеятельности которого в свою очередь не оказывают негативного влияния на рост и развитие клеток штамма

Вас .ап1;11гас1з 55.

3. Подобраны оптимальные, иммунологически сбалансированные соотношения антигенных компонентов, входящих в состав ассоциированной вакцины: 20,0 млн. живых сибиреязвенных спор и 1-2 млрд микробных клеток эмфизематозного карбункула.

4. Отмечено увеличение иммуногенной активности сибиреязвенного компонента, по сравнению с иммуногенностью монопрепарата, имеющего аналогичную концентрацию спор штамма Вас .ап-Шгас1з 55.

5. При иммунизации морских свинок живой жидкой ассоциированной вакциной отмечается быстрое вовлечение организма животных в процесс иммунной перестройки, вследствие чего у них формируется стойкий иммунитет к обеим инфекциям уже к 10 суткам с момента вакцинации.

6. Продолжительность напряженного иммунитета к сибирской язве и эмфизематозному карбункулу у крупного рогатого скота вакцинированного живой ассоциированной вакциной составляет не менее 12 мес. после вакцинации.

7. Нативная ассоциированная вакцина сохраняет свои иммуно-генные свойства по отношению к обеим инфекциям при ее хранении в условиях холодильника (4+2°) на протяжении не менее 12 мес. с момента ее изготовления.

8. Живая ассоциированная вакцина безвредна, умеренно реак-тогенна для лабораторных животных.

9. Массовая иммунизация крупного рогатого скота живой жидкой ассоциированной вакциной против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула экономически целесообразна, повышает производительность труда ветеринарных специалистов, уменьшает затраты связанные с проведением вакцинаций и является иммунологически полноценной.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Предлагается к внедрению в ветеринарную практику живая жидкая ассоциированная вакцина против сибирской язвы и эмфизематозного карбункула крупного рогатого скота. Рекомендуется ее применение в хозяйствах неблагополучных и угрожаемых по заболеваемости сибирской язвой и эмкаром крупного рогатого скота в комплексе с организационными и ветеринарно-санитарными мероприятиями.

2. По материалам проведенной работы разработана и утверждена временная нормативно-техническая документация (инструкция по изготовлению и контролю, технические условия и наставление по применению препарата).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Определение иммуногенной активности живой ассоциированной вакцины против сибирской язвы и эмкара из штаммов 55 и 2/14 в процессе хранения / Плеских С.А., А.А.Маничёв и др.: Тезисы докладов 13 Пленарного заседания Межведомственной комиссии по борьбе с сибирской язвой./ Актуальные вопросы профилактики сибирской язвы.- M., 1990. - С. 108-109.

2. Подбор оптимального соотношения компонентов в живой ассоциированной вакцине против сибирской язвы и. эмкара./ Плеских С.А., Кириллов Л.В. и -др.- Тр. ин-та ВГНКИ ветпре парато в.- М., 1989.- С. 17-23.- '

3. Сроки формирования иммунитета у морских свинок, иммунизированных ассоциированной вакциной против сибирской язвы и эмкара из штаммов 55 и 2/14 /Плеских С.А., Сторожев Л.И. и др.: Тезисы докладов 13 Пленарного заседания Межведомственной комиссии по борьбе с сибирской язвой / Актуальные вопросы профилактики сибирской язвы.- M., 1990.- С. I09-II0.

4. Результаты испытания живой ассоциированной вакцины против сибирской язвы и эмкара из штаммов 55 и 2/14./Плеских С.А., Ипатенко Н.Г. и др.: Тезисы докладов 13 Пленарного заседания Межведомственной комиссии по борьбе с сибирской язвой /Актуальные вопросы профилактики сибирской язвы.- М., 1990,- С. П0-П2.