Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Патогенные свойства некоторых видов микобактерий, выделенных от животных и объектов внешней среды

На правах рукописи

Толстенко Нина Гавриловна

Патогенные свойства некоторых видов мнкобактерий, выделенных от животных и объектов внешней среды

16.00.03- ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 2006

Работа выполнена в лаборатории микобактериозов Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко Российской академии сельскохозяйственных наук

Научные руководители :

- доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный

деятель науки Российской Федерации Овдиенко Николай Павлович

- кандидат медицинских наук Аникин Вячеслав Александрович

Официальные оппоненты : доктор ветеринарных наук, профессор

Бурлаков Валентин Александрович, кандидат ветеринарных наук Таранова Людмила Алексеевна

Ведущая организация - ФГУ Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов

Защита состоится « 27 « сентября 2006г. в 14 °° часов на заседании диссертационного совета Д 006.033.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко по адресу: 109428, Москва, Рязанский проспект, 24, корп. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ Автореферат разослан » 2006г.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор

Н.П.Овдиенко

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность темы. Одной из ведущих, наиболее сложных и экономически значимых проблем в инфекционной патологии животных

является туберкулез. В начале XXI века эпизоотическая обстановка в России,

несмотря на тенденцию улучшения в целом , остается напряженной.

Экономический ущерб от туберкулеза крупного рогатого скота за последние

45 лег в Российской Федерации превысил 85 млрд.рублей, при этом

животноводческая отрасль потеряла около 6 млн. голов крупного рогатого

скота, 25,3 млн.тонн молока, 1,6 млн. тонн мяса и 3,5 млн. голов приплода

(Ю.И.Смолянинов, 2005).

Решающая роль в системе противоэпизоотических мероприятий при туберкулезе животных принадлежит диагностике. Методы и средства диагностики туберкулеза достаточно разнообразны, разработка и совершенствование их продолжается со времен открытия возбудителя.

Основным методом выявления зараженных возбудителем туберкулеза животных является внутрикожная туберкулиновая проба. В некоторых стадах при убое реагировавших на туберкулин животных обнаруживают туберкулезоподобные патологические изменения. В таких случаях эпизоотический статус хозяйства определяется по результатам бактериологичекого исследования биоматериала от реагировавших на туберкулин животных ( НЛХОвдиенко, А.Х.Найманов, В.А.Ведерников, 2002).

При бакгериологичеком исследовании с использованием биопробы у морских свинок иногда обнаруживают незначительные узелковые изменения, которые затрудняют определение вида возбудителя туберкулеза. Некоторые исследователи склонны объяснять возникновение таких изменений у морских свинок с инфицированн остью животных нетуберкулезными (атипичными) микобактериями, роль которых в патологии человека, сельскохозяйственных и лабораторных животных недостаточно изучена.

По данным разных авторов (Н.ММакаревич, 1973, 1982; Т.Ф.Оттен, АЛЗ.Васильев, 2005; P.T.Davidson, 1989 ; RJ.Wallace et al., 1990; E.Wolinsky, 1992 и др.), от 10 до 24 видов нетуберкулезных микобактерий являются потенциальными возбудителями микобактериоза человека.

Многие отечественные исследователи (А.С.Донченко и соавт.,1987 ; В.С.Федосеев и соавт., 1988 ; Ю.А.Макаров, 1997, ШШрокопьева ,2004, и др.) считают , что нетуберкулезные микобактерии обусловливают только сенсибилизацию крупного рогатого скота к туберкулину для млекопитающих. Некоторые исследователи (О.В.Мартма, 1982;

H.П.Овдиенко и соавт., 1991) выявляли у реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота туберкулезоподобные изменения лимфатических узлов.

Патогенность разных видов нетуберкулезных микобактерий для животных остается пока невыясненной и дискутабельной.

Т.Ф.Оттен (2005) отмечает, что у людей, больных мшсобактериозом, со временем выявляют туберкулез. Такие же данные имеются и при исследованиях поголовья крупного рогатого скота.

Повсеместно накапливающиеся наблюдения об одновременном выделении возбудителя туберкулеза и нетуберкулезных микобактерий ставят актуальную задачу углубленного изучения патогенных свойств разных видов микобактерий, выделенных от разных видов животных.

I.2Целью исследований являлось изучение культур ально-морфологических, биохимических и патогенных свойств микобактерий, выделенных от разных видов животных и объектов внешней среды.

1.3 Основные задачи исследований:

- выяснить частоту выделения микобактерий из объектов внешней среды, от крупного рогатого скота, овец, свиней и диких животных;

- изучить кулыурально-морфологические и биохимические свойства выделенных культур микобактерий;

- изучить патогенность M.kansasii, M.xenopi, M.intracellulare, M.marinum, M.scrofulaceum , M.fortuitum для морских свинок;

- изучить патогенность M.bovis, M.avium, M.scrofulaceum и M.fortuitum для белых мышей;

- изучить патогенность M.kansasii, M.scrofulaceum для овец в сравнении с M.bovis, M.tuberculosis, M.avium.

1.4Научная новизна. Подтверждена убиквитарность нетуберкулезных микобактерий, выделенных из объектов внешней среды, из поверхности кожи, носовой слизи, спермы и биоматериала от крупного рогатого скота, овец, свиней, птицы и диких животных.

Показано , что у морских свинок, зараженных внутрибрюшинно культурами M.kansasii, M.xenopi, M.fortuitum, M.marinum и M.mtracellulare, развивается латентная инфекция с поражением сальника в области желудка с последующими репаративными процессами к 60-му дню.

Обнаружено перманентное появление у белых мышей очагового ( иногда диффузного) некроза хвоста при подкожном и внутрибрюшинном методах заражения их M.scrofulaceum;

Установлена зависимость проявления патологоанатомических изменений у белых мышей при заражении их культурой M.bovis. При подкожном заражении белых мышей M.bovis вызывают патологоанатомические изменения через 30 дней , а при внутрибрюшинном - через 10 дней и характеризуются более тяжелым течением инфекционного процесса : увеличением селезенки, образованием в печени и легких туберкулезных узелков.

Показано, что у овец M.kansasii персистируют в организме и сенсибилизируют их к туберкулину для млекопитающих и KAM, не вызывая патологических изменений. M.scrofulaceum обусловливают у овец

патологоанатомические изменения, сходные с туберкулезными. М.Ытв у овец вызывает характерные патологоанатомические изменения, а М.шЬегси1оз18, М-катави и М.аушт — только сенсибилизируют организм животных к туберкулину.

1.5.Практическая значимость. Результаты исследований включены в «Наставление по диагностике туберкулеза животных», утвержденного Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 18 ноября 2002г.

1.6Личный вклад соискателя заключается в бактериологическом исследовании биоматериала и объектов внешней среды, идентификации микобактерий, организации и проведении экспериментальных исследований на морских свинках, белых мышах и овцах, анализе и обобщении результатов исследований.

1.7Апробация работы. Материалы работы доложены на XII съезде фтизиатров РФ (Саратов,1994), на научно-практической конференции по проблеме туберкулеза и бруцеллеза сельскохозяйственных животных (Новосибирск, 1995); на Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию Северного научно-исследовательского института животноводства и ветеринарии (г. Петропавловск, Северо-Казахстанская обл., Республика Казахстан, 2003), на Международной конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики туберкулеза животных» (Москва,2003), на Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р.Коваленко (г.Москва,2006),на заседаниях ученого совета ВИЭВ(2001,2002,2003,2004гг.). Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ (2006г.).

1.8 Основные положения выносимые на защиту. Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

- результаты исследований по изучению широты распространения микобактерий;

результаты исследований по выявлению и идентификации нетуберкулезных микобактерий из биоматериала животных и объектов внешней среды;

- результаты сравнительного изучения культурально-морфологических, биохимических и патогенных свойств нетуберкулезных микобактерий.

1.9Публикания результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 научных статей.

ЫОСтруктура и объем диссертации. Диссертация изложена на страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы. Работа иллюстрирована .^Таблицами и

фотографиями. Список литературы включает-^? Источника, в том числе ^^иностранных авторов.

1. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Материалы и методы исследований. Работа выполнена в лаборатории микобактериозов Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко и на опытной базе Вышневолоцкого отдела ВИЭВ ( Тверская обл.) в соответствии с утвержденными планами научно-исследовательских работ в период 1989-2005 гг. ( 02.01М; 02.04.03Д и 02.01.01 РНТП фундаментальных и приоритетных прикладных исследований).

Для выделения культур микобактерий исследовали биоматериал от 252 голов крупного рогатого скота из различных регионов Российской Федерации , 95 овец, 5 свиней, реагировавших на туберкулин для млекопитающих, 5 кур, 73 оленей, 6 ланей, 2 муфлонов, 8 кабанов, 1 лося, 1 овцебыка, 3 фазанов, 1 грифовой цесарки, 1 райского журавля, 1 кольчатого чирка, 1 хохлатой напалидии и 1435 проб из объектов внешней среды (соскобы с кормушек, автопоилок, пробы почвы, фекалий, сена, соломы, комбикорма, торфа и других подстилочных материалов). Исследовали 98 проб носовой слизи и 70 проб смывов с кожи средней трети шеи крупного рогатого скота, 170 проб спермы быков-производителей. Пробы отбирали в соответствии с «Методическими рекомендациями по проведению лабораторных исследований при туберкулезе животных» (М., 1992).

При бактериоскопическом исследовании биоматериала от животных готовили мазки-отпечатки из внутренних органов и тканей, высушивали и красили по Циль-Нильсену. При культуральном исследовании биоматериал от животных и пробы из объектов внешней среды обрабатывали по методу А.П. Аликаевой (1967,1979). В качестве питательных сред для выделения культур микобактерий использовали среды Петраньяни, Финн-2, Левенштейна-Йенсена, Фаст-ЗЛ. Посевы культивировали на протяжении 3 месяцев при температуре 37-38°С. При появлении роста колоний на питательных средах определяли их характер , готовили мазки и красили их по Циль-Нильсену.

Культурально-морфологические и биохимические свойства микобактерий изучали в соответствии с методическими рекомендациями «Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий» (Т.Б.Ильина, 1975,1980), с приказом Минздрава СССР №558 от 08.06.78 года «Об унификации микробиологических методов исследований при туберкулезе» и с приказом Минздрава Российской Федерации №109 от 21 марта 2003года «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации».

Для определения вида возбудителя туберкулеза выделенные культуры микобактерий вводили 3-м морским свинкам и 3-м кроликам по общепринятой методике. За животными вели наблюдение в течение 3-х месяцев. Если за этот период они не погибали, проводили эвтаназию морских свинок путем декапитации с помощью гильотины, кроликов — путем воздушной эмболии, согласно «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (1978), с последующим проведением патологоанатомических, бактериоскопических, культуральных и гистологических исследований материала от всех павших и убитых животных.

Патогенность нетуберкулезных (атипичных) микобактерий изучали на 455 морских свинках, 160 белых мышах и 35 овцах.

Морских свинок разделили по принципу аналогов по 20 голов в группе. Для заражения морских свинок использовали 2-х недельные культуры следующих штаммов: М. scrofulaceum, М. marinum, М. intracellulare , М. bovis (ЦВ-1), М. kansasii, М. xenopi, М. fortuitum. Эталонные тест-культуры для идентификации получены из музея микроорганизмов ВИЭВ.

Культуры M.scrofulaceum были выделены из лимфоузлов реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота , принадлежащего совхозу "Красная пойма» Московской области. Культуры M.fortuitum выделены из лимфоузлов крупного рогатого скота, принадлежащего совхозу «Правдинский« Калининградской области. Культура M.bovis (ЦВ-1) выделена от коровы , реагирующей на туберкулин для млекопитающих, принадлежащей совхозу «Воздвиженский» Целиноградской области.

Проведены исследования на 105 морских свинках с использованием культуры 1с ( выделенной от свиней , принадлежащих совхозу им. XXII партсъезда Тверской области), обозначенная как 1с и по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам отнесена к М. intracellulare и культуры, выделенной от крупного рогатого скота, принадлежащего совхозу

«Прогресс» Пензенской области , которая по совокупности признаков определена как М.bovis.

По 5 морских свинок убивали через 10,20,30 и 60 дней после заражения с последующим проведением патологоанатомических, бактериологических и гистологических исследований материала.

Для заражения белых мышей использовали 2-х недельные культуры M.scrofulaceum, M.fortuitum, M.avium и M.bovis. Мышей риазделили по 20 голов в группе и , соответственно, заражали внутрибрюшинно и подкожно в дозе 1,0 мг взвеси культуры в 1,0 мл физиологического раствора.

По 5 мышей каждой группы убивали через 10, 20 и 30 дней после заражения с дальнейшим проведением патологоанатомических, бактериологических и гистологических исследований.

Экспериментальные исследования по изучению патогенности M.kansasii и M.scrofulaceum в сравнении с M.bovis, M.tuberculosis и M.avium провели на 35 овцах, которых разделили на 7 групп ( 6-опытных и 1- контрольную, по 5 голов в каждой).

Животным первой группы культуру M.kansasii вводили интратрахеально, затем орально — трехкратно с интервалом в 7 дней в дозе по 120 мг на животное. Овец второй группы заражали тем же способом культурой M.scrofulaceum в дозе по 120 мг на животное. Животных третьей группы так же заражали M.bovis в дозе по 12 мг на животное, четвертой — M.bovis в дозе по 120 мг на животное, пятой- M.tuberculosis в дозе по 120 мг на животное, шестой- M.avium в дозе по 120 мг на животное, животных седьмой группы не заражали (контроль).

Экспериментально зараженных овец опытных и контрольной групп содержали в течение 10 месяцев и через каждые 30 дней исследовали туберкулиновой или симультанной пробами с ППД-туберкулином для млекопитающих и комплексным аллергеном из атипичных микобактерий (KAM). Реакцию учитывали через 48 часов после введения аллергена и оценивали по величине припухлости от + до ++++.

От животных брали пробы сыворотки крови для серологических и пробы крови, молока и фекалий для бактериологических исследований.

РСК с комплексным туберкулезным антигеном УНИИЭВ и туберкулезным антигеном СибНИВИ ставили согласно «Наставлению по диагностике туберкулеза животных» , утвержденному Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР 25.02.86 г.

По окончанию срока эксперимента животных убили и биоматериал исследовали бактериологически и гистологически. Бактериологическое исследование биоматериала проб крови, молока и фекалий проводили по общепринятым методикам.

Патоморфологические исследования проводили совместно с кандидатами ветеринарных наук О.В.Якушевой и В.С.Суворовым.

Полученные в процессе работы цифровые показатели обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики. Рассчитывали средние арифметические показатели, достоверность которых определяли с помощью критерия Стьюдента (В .М.Шмидт, 1984).

Методики отдельных исследований изложены в соответствующих разделах диссертации.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Изучение частоты выделения нетуберкулезных микобактерий из объектов внешней среды, биоматериала от крупного рогатого скота, овец, свиней и диких животных.

Нами исследован биоматериал, полученный от 289 голов реагирующего на ППД-туберкулин для млекопитающих крупного рогатого скота 28 хозяйств 6 областей (Калужская, Брянская, Пензенская, Волгоградская, Калининградская, Московская) и Республики Чувашия. В этих хозяйствах проводились комплексные (аллергические, патоморфологические и

бактериологические) исследования по выяснению эпизоотического статуса поголовья крупного рогатого скота.

Одновременно в этих хозяйствах отбирали пробы из объектов внешней среды с целью выделения микобактерий. В результате исследований выделено 66 культур микобактерий, отнесенных к 8 видам ( M.gordonae, М. triviale, M.terrae, M.intracellulare, M.phlei, M.fortuitum, M.vaccae, M.flavescens). В каждой из обследованных областей выделяли разные виды микобактерий (табл.1). Только M.flavescens выделены в хозяйствах Московской обл.. Полученные результаты свидетельствуют о географическом различии микобактериального фона.

Таблица 1 — Частота выделения кулыур микобактерий из объектов

внешней среды различных областей РФ

№ п/п Наименование области Исследовано проб Выделено культур микобактерий Виды микобактерий

1. Калининградская 214 15 (7,0%) М. gordonae, М. triviale, М. terrae, М. intracellulare

2. Пензенская 869 26 (2,9%) М. phlei, М. fortuitum, М. vaccae

3 Московская 259 5 (1,9%) М. phlei, М. fortuitum, М. flavescens М. vaccae

4. Республика Чувашия 12 2 (16,6%) М. fortuitum, М. intracellulare

5. Тверская 27 1 (4,0%) М. intracellulare

6. Волгоградская 28 14 (50,0%) M.phlei, M.vaccae, M.fortuitum

7. Калужская 17 3 (17,6%) M. phlei, M. fortuitum, M. vaccae

Всего: 1426 66 (4,5%)

Обобщенные результаты исследований объектов внешней среды, окружающих животных ,на наличие микобактерий приведены в таблице 2.

Таблица 2 — Результаты исследований по выделению атипичных микобактерий из объектов внешней среды

№№ п/п Объекты внешней среды Исследовано проб Выделено культур %

1. Подстилка 65 5 7,6

2. Почва 69 7 10,1

3. Соскобы со стен животноводческих помещений 155 8 5,1

4. Соскобы с полов 253 16 6,3

5. Соскобы с кормушек 261 14 5,3

6. Соскобы с навозных желобов 52 15 28,8

7. Смывы с поилок 34 11 32,3

8. Корма 17 7 41,1

9. Пробы с территории ферм 9 3 33,3

10. Пробы навоза 33 12 36,3

Всего: 948 98 10,3

Из таблицы 2 видно, что при бактериологических исследованиях выделено 98 культур микобактерий, что составляет 10,3% от числа исследованных проб. Наиболее часто нетуберкулезные микобактерии выделяли из проб кормов (41,1%), навоза (36,3%), с территории ферм (33,3%), поилок (32,3%), соскобов с навозных желобов (28,8%). В одном хозяйстве Волгоградской области из проб кормов и воды выделили 2 культуры М.аушт и

микобактерии II и III групп по Раньону. Из проб почвы выделили одну культуру М.Ытв и 2 культуры микобактерий П и III групп по Раньону.

Из биоматериала от реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота выделяли возбудителей туберкулеза и нетуберкулезные микобактерии. Наиболее часто выделяли нетуберкулезные микобактерии II и Ш групп по Раньону (табл.3).

Таблица 3 — Частота выделения микобактерий из биоматериала крупного рогатого скота ( реагировавшего на ГПТД- туберкулин для

млекопитающих)

№ Наименование областей Исследовано Выделено Группы

п/п материалов культур микобактерий

(голов) микобактерий по Раньону

1. Калужская 36 5 (13,8%) IV

2. Брянская 4 1 III

3. Пензенская 76 30 (39,4%) III-IV

4. Волгоградская 28 39 II, III и IV

5. Орловская 3 3 IV

6. Саратовская 5 4 IV

7. Калининградская .26 8 (30,7%) III-IV

8. Московская 99 4 (4,0%) IV

9. Республика Чувашия 12 2 (16,6%) III-IV

Всего 289 96 (33,2%)

В ряде случаев нетуберкулезные микобактерии изолировали параллельно с М. bovis из биоматериала от одних и тех же животных.

Культуры нетуберкулезных микобактерий чаще выделяли из брыжеечных лимфоузлов. В отдельных случаях выделяли из этих же лимфоузлов и культуры возбудителей туберкулеза. Так, из 39 культур микобактерий, выделенных в хозяйствах Волгоградской области, из брыжеечных лимфоузлов выделили 11 культур, в том числе М. tuberculosis - 1, М. bovis — 2 и нетуберкулезных микобактерий — 8 культур (П гр. по Раньону -5, III -2, IV — 1). Из заглоточных лимфоузлов выделили 9 культур (М. bovis -

1, II и IV групп по Раньону — 8). Из средостенных лимфоузлов выделили 6 культур (М. bovis — 1, II группы — 2, IV - 3).

В колхозе им. Суворова Калининградской области из биоматериала от 6 телят в возрасте до года выделили 9 культур нетуберкулезных микобактерий ( M.triviale - 3, M.intracellulare — 1, M.fortuitum- 3, M.terre- 1, M.gordone -1).

Микобактерии выделяли из средостенных ( M.triviale, M.intracellulare, M.fortuitum), предлопаточных (M.triviale) и брыжеечных (M.triviale, M.gordone, M.terre, M.fortuitum) лимфоузлов. Из кишечника выделили M.fortuitum.

При исследовании 5 проб биоматериала от 5 свиней выделили 5 культур нетуберкулезных микобактерий III группы по Раньону ( совхоз им. XXII партсъезда Тверской области ). Среди них одна культура охарактеризована как M.intracellulare.

Бактериологическим исследованием биоматериала от 95 овец выделили 15 культур M.bovis (15,7%) и 19 - нетуберкулезных микобактерий (20%). От 5 кур выделили 4 культуры М.avium и одну культуру M.intracellulare.

Исследованием биоматериала от 90 диких животных, отстрелянных в заповедниках «Аскания-Нова» о.Бирючий и «Хоперский» Воронежской области, выделили 19 культур нетуберкулезных микобактерий IY группы по Раньону (21,1%).

При исследовании биоматериала от 8 животных зоопарка ( овцебыка, фазанов, цесарки, журавля, чирка) выделили 7 культур микобактерий ( 1 культура M.bovis из биоматериала от овцебыка и 6 культур M.avium от фазанов, цесарки, журавля, чирка).

Исследованием 17 проб фекалий выделили 4 культуры нетуберкулезных микобактерий IY группы по Раньону ( 2 культуры от овцебыков и 2 - от цесарок). В одном случае выделили M.avium из фекалий вольера цесарок.

При бактериологическом исследовании 98 проб носовой слизи коров выделили 53 культуры (54,0%) нетуберкулезных микобактерий IY группы по Раньону. Из 70 проб смывов с кожи коров выделили 14 культур (20%)

нетуберкулезных микобактерий ГУ группы по Раньону. Исследованием 170 проб спермы выделили 34 культуру микобактерий : М.сНегпоАгп -1(2,7%), М^авШ - 5(13,5%), М-зте^рга^Б - 9(24,3%), МАауевсега — 1(2,7%), М.ГоПшШш — 1(2,7%), МхЬе1опе1 — 2(5,4%) и 15 культур быстрорастущих микобактерий.

Все культуры, выделенные от животных, охарактеризованы по культур ально-морфологическим и биохимическим свойствам и соответствовали референтным штаммам, что и позволило отнести их к соответствующим видам и группам микобактерий (табл.4).

Таблица 4 - Характеристика культуральных и биохимических

свойств выделенных культур

Наименование Теста M. scrofulaceum M.fortuitum Культура 1с (Mjntracellu -lare) Культура 2кр (М.Ьот) Культура ЦВ-1 (M.bovis)

Скорость роста 13 дней 7 дней 20 дней 27 дней 30 дней

Рост Т25"С + + + - -

Рост Т 37°С + + + + +

Рост Т45иС +

Рост на МПБ + + +

Пигмевтообразовавие Ф - - - -

Гидролиз Твин-80 +

Редукция нитратов + +

Аккумуляция железа +

Рост с сал.натр. + + +

Активность каталазы + + +

Термостаб.каталаза + + +

Ферментация: Мочевины + + + +

Никотинамида + + + - -

Пиразинамида + + + - -

Арилсульфатазная активность _ +

Обозначения : сал.натр. — салициловый натрий

Ф — фотохромогенные микобактерии + - отмечен рост на питательной среде +_- скудный рост на питательной среде

Результаты исследований подтверждают убиквитарность нетуберкулезных микобактерий.

2.2.2 Изучение патогенных свойств нетуберкулезных микобактерий для морских свинок и белых мышей

Перед заражением морских свинок исследовали на спонтанный туберкулез туберкулиновой пробой ППД-туберкулином для млекопитающих в дозе 25 ТЕ\ 0,1 мл.

Животных разделили по принципу аналогов в зависимости от метода заражения.

При изучении патогенных свойств выделенных микобактерий использовали алиментарный, интратестикулярный, подкожный и внутрибрюшинный методы заражения. Заражение животных проводили 2-х недельной культурой в дозе 1,0 мг в 1,0 мл физиологического раствора при алиментарном, подкожном, внутрибрюшинном и в дозе 1,0 мг в 0,2 мл физиологического раствора при интратестикулярном методе заражения.

Через 10, 20, 30 и 60 дней после заражения убивали по 5 морских свинок на каждый срок с последующими патоморфологическим и культур альным исследованиями.

В результате проведенных исследований (табл. 5,6) установлено, что наибольший процент роста культур отмечен при интратестикулярном и внутрибрюшинном методах заражения морских свинок культурой 1с, а в случае с культурой 2кр , охарактеризованная как М.Ытв, 100% рост наблюдался в течении 60 дней опыта ( срок окончания опыта).

Таблица 5 - Высеваемость культур 2кр и 1с в зависимости от метода заражения и сроков убоя морских свинок

№ п\п Культура для заражения Метод заражения Высеваемость культур через: (%)

10 дней 20 дней 30 дней 60 дней

орг. сем. орг. сем. орг. сем. орг. сем.

1. 1с Алиментарно 40 52 60 0

2. 1с Интратетсикулярно 100 100 100 100 100 100 84 100

3. 1с Подкожно 32 100 100 24

4. 1с Внутрибрюшинно 100 100 100 88

5. 2кр Алиментарно 68 88 40 -

6. 2кр Интратестикулярно 100 100 100 100 100 100 52 68

7. 2кр Подкожно 100 100 100 -

8. 2кр Внутрибрюшинно 100 100 100 -

Обозначения : орг. — выделение культуры из внутренних органов сем. — выделение культуры из семенников

Таблица 6 - Высеваемость культур в зависимости от метода заражения и сроков убоя морских свинок

№ п\п Культура для заражения Метод заражения Высеваемость культур через: (%)

10 дней 20дней 30 дней 60 дней

орг. сем. орг. сем. орг. сем орг. сем

1. М.кашдон Подкожно 12 - 100 100

2. М.капяазн Интратестикулярно 100 100 68 80 68 68 - 28

3. МЛсаизаян Внутрибрюшинно 80 16 4 4

4. М.АэПшИп Подкожно - - - -

5. М.Аойшйп Интратестикулярно

6. М.йи1ш1л1 внутрибрюшинно - - - -

7. М.хепор1 Подкожно - 100 28 4

8. М.хетюр! Интратестикулярно 100 100 100 100 64 64 8 4

9. М.хепор] Внутрибрюшинно 100 100 - 5

10. М.шагшшп Подкожно 20 - - -

11. М.шаппит Интратестикулярно 50 76 - 20 - - - -

12. М.тагтит внутрибрюшинно 24 58 20 -

13. М.ийгасе11и1аге Подкожно 100 20 7 -

14. МлМгасе11и1аге Внутрибрюшинно 100 50 50 20

15. М.ийгасеИШаге Интратестикулярно 100 100 20 50 60 66 20 -

16. М.ЫтяЩВ-!) Подкожно 4 80 20 100

17. М.Ь0ЛП!!(ЦВ-1) Интратестикулярно - 40 88 13 20 26 - 16

18. Шю\ги(ЦВ-1) Внутрибрюшинно 60 100 100 100

орг — выделение культуры из внутренних органов

сем — выделение культуры из семенников

Установлено , что у морских свинок при внутрибрюшинном заражении культурами М. kansasii, М. xenopi и М. fortuitum закономерно образуются поражения на сальнике в области желудка, которые редуцируются к 60-му дню, в то время как при заражении морских свинок культурой М. bovis патологический процесс прогрессирует.

Культуры М. kansasii и М. xenopi выделяются (100%) в первые 20 дней после заражения морских свинок, в то время как культура М. fortuitum не выделялась на протяжении всего периода опыта (60 дней), высеваемость культуры М. bovis прогрессирует. Так, если через 10 дней она составила 60%, то через 20,30 и 60 дней -100%.

Патогенность М.bovis, M.scrofulaceum, М.fortuitum и M.avium, также изучали в опытах на белых мышах.

Животных (по 20 голов на каждый метод) заражали внутрибрюшинно и подкожно в дозе 1,0 мг взвеси культуры в 1,0 мл физиологического раствора. Белых мышей убивали на 10, 20, 30 и 60 -е сутки после заражения и проводили патологоанатомические, патоморфологические и культур ально-морфологические исследования.

Таблица 7- Высеваемость культур в зависимости от метода ' заражения и сроков убоя белых мышей

№ Культура для Метод заражения Высеваемость культур

п\п заражения через: %)

10 дн. 20 дн. 30 дн. 60 дн.

1. M.bovis (ЦВ-1) Подкожный 100 40 - -

2. M.bovis(UB-l) Внутрибрюшинный 100 100 100 100

3. Mscrofulaceum Подкожный - - - -

4. Mscrofulaceum Внутрибрюшинный 100 60 - -

5. M.avium Подкожный - - - 40

6. M.avium Внутрибрюшинный - - 20 100

7. M.fortuitum Подкожный - 60 40 -

8. M. fortuitum Внутрибрюшинный - - - -

Обозначения : дн. — дни после заражения

При заражении белых мышей М.Ъстэ подкожно и внутрибрюшинно выделение исходной культуры составило 100%, причем культура была выделена во все сроки исследования. Патологоанатомические изменения (увеличение печени, образование узелков) наблюдали в течение всего опыта. Наиболее характерные изменения при внутрибрюшинном методе заражения : увеличение селезенки, пневмония и образование узелков на сальнике в области желудка.

При подкожном заражении культурой М.БсгоШасеит видимых изменений во внутренних органах не обнаружено, на 30-60 дни отмечено образование очагового некроза хвоста. При этом исходная культура не была выделена.

При внутрибрюшинном методе заражения отмечено образование точечных узелков во внутренних органах на 10 день после заражения, на 20-й — увеличение селезенки (примерно в 1,5 раза), на 30-й - очаговый некроз хвоста, на 60-й — во внутренних органах видимых изменений не наблюдали.

Выделение исходной культуры отмечали только на 10-й и 20-е дни после заражения.

При подкожном заражении белых мышей культурой М. ГоЛшШт патологоанатомических изменений не установлено. Культуру выделяли на 20-е и 30-е дни после заражения. Высеваемость культуры составляла 60 и 40% соответственно.

При внутрибрюшинном методе заражения отмечено образование незначительных узелков в печени и увеличение селезенки. Исходная культура не выделялась.

При подкожном заражении М. аушт изменений во внутренних органах не отмечено, исходная культура была выделена только на 60-й день после заражения , при этом высеваемость составила 40%.

Внутрибрюшинное заражение вызывало у белых мышей незначительное увеличение печени через 10 дней после заражения, увеличение селезенки, к

концу опыта на сальнике в области желудка — образование узелков. Высеваемость составляла 20% - через 30 дней и 100% к концу опыта.

При гистологическом исследовании материала от белых мышей, зараженных M.avium, установили слабо выраженную клеточную реакцию паренхиматозных органов, связанную с заражением. В интерстициальной ткани легких находили мелкие эпителиоидные скопления. В печени и селезенке у большинства животных выявляли мелкие, без распада, эпителиоидноклеточные гранулемы.

В результате проведенных исследований установлено, что при подкожном заражении белых мышей культурой М. bovis патологоанатомические изменения развиваются через 30 дней, а при внутрибрюшинном методе - через 10 дней и характеризуются более тяжелым течением патологического процесса: увеличением селезенки, образованием узелков в печени и легких.

Подкожное и внутрибрюшинное заражение культурой M.scrofiilaceum закономерно вызывает у белых мышей очаговый, а иногда и диффузный некроз хвоста, что может являться дифференцирующим признаком при идентификации микобакгерий.

Культура M.avium вызывала у белых мышей патологоанатомические изменения только при внутрибрюшинном методе заражения на 60-й день,

которые характеризовались незначительным увеличением печени, селезенки и »

образованием узелков на сальнике в области желудка.

2.2.3. Сравнительная оценка патогенных свойств M.scrofulaceum , M.kansasii, М.bovis, M.tuberculosis и M.avium для овец

В опытах по оценке патогенных свойств различных микобакгерий использовано 35 голов овец в возрасте 1 года, они были разбиты на группы по 5 голов в опытных и контрольной группах.

Для определения патогенности использовали 2-х недельные культуры M.scrofulaceum, M.bovis, M.tuberculosis, M.avium, MJcansasii.

Применяли интратрахеальный и алиментарный методы заражения: доза каждой культуры составляла 120 мг бакмассы разведенной в 10,0 мл физиологического раствора.

После заражения животных исследовали туберкулином для млекопитающих и KAM через каждые 30-60 дней после заражения. От животных исследовали пробы сыворотки крови в РСК, бактериологически пробы крови, фекалий и молока. Всего культурально исследовали 162 пробы крови, 92 пробы фекалий и 9 проб молока от зараженных овец.

Результаты аллергических и серологических исследований показали, что овцы, зараженные M.kansasii, реагировали на ППД- туберкулин для млекопитающих и KAM, но интенсивность реакций была разной. Через 30 дней после заражения на туберкулин реагировали 4 овцы с интенсивностью реакций в ++ и +++, на KAM — 5 овец с интенсивностью реакций в +++ и ++++. Животные реагировали на туберкулин при исследованиях через 105 и 153 дня после заражения. В дальнейшем реакции начали выпадать, в то же время на KAM они сохранялись.

При серологическом исследовании проб сыворотки крови в РСК с КТА УНИИЭВ и туберкулезным антигеном СибНИВИ, показания РСК были положительными в одном случае с туберкулезным антигеном СибНИВИ.

Овцы, зараженные M.scrofulaceum, также реагировали на туберкулин и KAM, но реакция на KAM были интенсивнее. Интенсивность реакций на туберкулин уменьшалась при повторных исследованиях.

Положительные показания РСК установили только в двух случаях при исследовании через 30 дней после заражения.

Животные, зараженные M.bovis ( независимо от дозы заражения), как правило, реагировали на туберкулин. Аналогично реагировали на туберкулин и овцы, зараженные M.tuberculosis. У овец, зараженных M.avium, аллергические реакции появились позже ( через 105 дней после заражения) и наблюдались не у всех исследованных животных.

При серологическом исследовании комплементсвязывающие антитела выявляли у всех животных, зараженных M.bovis. С сыворотками крови овец, зараженных M.tubercuIosis , положительные показания РСК были в двух случаях из пяти. Такие же данные были и с сывороткой крови овец, зараженных M.avium.

Результаты бактериологических исследований по выделению культур после заражения из проб крови и фекалий от овец, зараженных M.kansasii, M.tuberculosis и M.avium показывают, что культура M. kansasii выделена в двух случаях при исследовании проб крови от двух овец (№ 8840 и № 8816) и в одном случае при исследовании проб фекалий. Из пробы крови, полученной от овцы № 8840, культуру выделили через 105 дней после заражения, а из пробы крови овцы № 8816 - через 153 дня. Из пробы фекалий от овцы № 8831 выделена культура через 185 дней после заражения. Это свидетельствует о циркуляции М. kansasii в организме и выделении его во внешнюю среду.

В группе овец, зараженных M.tuberculosis, исходная культура выделена также в двух случаях - из проб фекалий, и 2- из проб крови.

От овец, зараженных M.avium, культура выделена только в одном случае, через 185 дней после заражения из крови.

При послеубойном осмотре овец не выявлено патологических

изменений. Также их не выявили и при гистологических исследованиях t

послеубойного материала.

Таким образом, возбудитель туберкулеза человеческого и птичьего видов, а также M.kansasii вызывают лишь сенсибилизацию организма животных к туберкулину.

При культуральном исследовании проб крови и фекалий от овец, зараженных M.scrofulaceum ни в одном случае не выделили исходную культуру.

От животных, зараженных M.bovis , выделили исходную культуру в 5-ти случаях, из проб крови - через 105, 185, 226 и 262 дня , и в 5-ти случаях — из проб фекалий - через 105, 153 и 226 дней после заражения. Из 9 проб молока культуру выделили в двух случаях через 153 и 226 дней после заражения.

При вскрытии убитых овец, зараженных M.scrofïilaceum, обнаруживали множественные инкапсулированные и обызвествленные очаги некроза величиной от макового зерна до лесного ореха. Большинство этих очагов имело округлую форму, очаги находились на расстоянии друг от друга и не формировали конгломератов. Отмеченные поражения локализовались в верхушечных и верхних отделах диафрагмальных долей легких. Регионарные бронхиальные лимфатические узлы были увеличены. Гистологически в легких обнаружили множественные участки творожистого некроза. В центре таких участков наблюдали отложения извести. По периферии они были окружены отдельными гигантскими, изредка эпителиоидными клетками. Тенденции к распространению данные очаги не имели и были окружены соединительнотканной капсулой.

У овец, зараженных M.bovis, патолого анатомические изменения установлены в одном случае при заражающей дозе 12 мг и в 5 случаях у овец, зараженных 120 мг. Изменения локализовались в заглоточных, подчелюстных, бронхиальных, средостенных лимфатических узлах и легких. При бактериологическом исследовании культуру M.bovis , выделили в одном из пяти случаев от овец, зараженных в дозе 12 мг, и во всех случаях при заражении в дозе 120 мг.

Таким образом, проведенные исследования показали, что M.scrofulaceum могут вызывать у овец патологоанатомические изменения, похожие на туберкулезные. Это показывает, что при постановке диагноза на туберкулез у овец следует проводить дополнительные биологические исследования.

Выводы

1. Подтверждена убиквитарность нетуберкулезных микобактерий,которых выявляли из объектов внешней среды (от 5,1 до 41,1% исследованных проб), из биоматериала реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота (от 4 до 39,4% случаев), от овец - в 10%, от диких животных - в 21,1% случаев.

2.Установлено, что подкожное и внутрибрюшинное введение культуры M.scrofulaceum вызывает у белых мышей очаговый, а иногда и диффузный некроз хвоста, что может являться дифференцирующим признаком при идентификации микобактерий.

3.Установлено, что при внутрибрюшинном заражении морских свинок культурами M.kansasii, M.xenopi и M.fortuitum закономерно поражается сальник в области желудка. Культуры M.kansasii и M.xenopi выделяются (100%) в первые 20 дней после заражения морских свинок, а культура M.fortuitum не выделяется на протяжении всего периода опыта (60 дней).

4. Культура М. bovis при подкожном заражении белых мышей вызывает патологоанатомические изменения через 30 дней, а при внутрибрюшинном

— через 10 дней после заражения, которые характеризуются увеличением селезенки, образованием узелков в печени и легких.

5.Культура М.avium вызывала у белых мышей патологоанатомические изменения только при внутрибрюшинном методе заражения на 60-й день.

6.Подкожное заражение M.fortuitum не вызывает у белых мышей патологоанатомических изменений, культуру выделяли через 20-30 дней после заражения. Внутрибрюшинное заражение вызывает образование узелков в печени.

7.Установлено, что культура M.scrofulaceum является патогенной для овец и обусловливает патологоанатомические изменения, сходные с туберкулезными. M.bovis у овец вызывает характерные для туберкулеза патологоанатомические изменения, а M.kansasii, M.tuberculosis и M.avium — только сенсибилизируют организм животных к туберкулину.

Практические предложения

1. Предлагаем использовать при идентификации культуры М.зсгоМасеит в качестве биологической модели белых мышей, а как дифференциальный признак - некроз хвоста при подкожном и внутрибрюшинном заражении последних.

2. При проведении биопробы, в случае гибели морской свинки без развития патологоанатомических изменений предлагаем проводить гистологические, латологоанатомические и культурально-морфологические исследования биоматериала от павшего животного и проведение биопробы с материалом от павшей свинки.

3. При проведении биопробы, в случае гибели морской свинки и обнаружении патологоанатомических изменений сомнительного характера, предлагается проведение патологоанатомических, гистологических и культурально-морфологических исследований биоматериала от павшего животного и проведение биопробы с материалом от павшей морской свинки.

4. При бактериологическом исследовании материала от овец необходимо проводить второй пассаж на лабораторных животных, используя биоматериал от первой морской свинки в случае отрицательной биопробы или сомнительных патологоанатомических данных.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Толстенко Н.Г. О патогенности М.всгоМасешп для морских свинок \В.И.Косенко,Н.Г.Толстенко,\\Труды.ВИЭВ, 1991 ;Т.69,-С. 123-126

2.Толстенко Н.Г. Экспериментальное изучение патогенности атипичных микобактерий.\Н.Г.Толстенко, Н.П.Овдиенко,В .И.Косенко, И.Е.Вельмискин, В.С.Суворов, С.Ю.Быкова\Тезисы докладов\\ XII съезд фтизиатров.-Саратов,1994. С.234

3.Толстенко Н.Г. Микобактериальные инфекции овец и коз \Н.П.Овдиенко,А.Х.Найманов,Н.Г.Толстенко,А.А.Энгишев,И.Е.Вельмискин,

Б.Б.Насынов, В.С.Суворов, П.Н.Пыталев, Н.И.Григорьева\\Сборник трудов П (XII) съезда фтизиатров — Саратов, 1994. С.32.

4. Толстенко Н.Г. Экспериментальный туберкулез овецА Н.П.Овдиенко,

A.Х.Найманов, В ,ШСосенко,И.ЕЗельмискин,А.А.Энгишев,В.С.Суворов, Н.Г.Толстенко С.Н.Степнова\\Труды ВИЭВ. Т.73.2003. С.31-36.

5. Толстенко Н.Г. О патогенности атипичных микобактерий для лабораторных животныхА Н.П.Овдиенко, В.И.Косенко, Н.Г.Толстенко, В.С.Суворов, О.В_Якушева,Э.Л.КолосковаА\Ветеринарная патолошя. №1-2. 2004. С.150-153.

6. Толстенко Н.Г. Патоморфологические изменения у лабораторных животных, зараженных нетуберкулезными микобактериями

\ Э.Л.Колоскова,О.В.Якушева, В.С.Суворов, НТ.Толстенко,Е.Э.Соколова \\Материалы Международной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р.Коваленко. Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных. — М., 2006. С.252.

7. Толстенко Н.Г. О патогенности нетуберкулезных микобактерий для морских свинок и белых мышей Щ.Г.Толстенко, Э.Л.Колоскова,

B.С.Суворов,Е.А.Касьянова,Е.Э.Соколова \\Материалы Международной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р.Коваленко. Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных. — М., 2006. С.З90-393.

к исполнению 18/08/2006 Исполнено 21/08/2006

Заказ № 553 Тираж: 100 экз.

ООО «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 Москва, Варшавское ш., 36 (495) 975-78-56 (495) 747-64-70 www.autoreferat.ru

Одной из ведущих, наиболее сложных и экономически значимых проблем в инфекционной патологии животных является туберкулез. В начале XXI века эпизоотическая обстановка в России, несмотря на тенденцию улучшения в целом, остается напряженной. Экономический ущерб от туберкулеза крупного рогатого скота за последние 45 лет в Российской Федерации превысил 85 млрд. рублей, при этом животноводческая отрасль потеряла около 6 млн. голов крупного рогатого скота, 25,3 млн. тонн молока, 1,6 млн. тонн мяса и 3,5 млн. голов приплода (Ю.И.Смолянинов, 2005).

Решающая роль в системе противоэпизоотических мероприятий при туберкулезе животных принадлежит диагностике. Методы и средства диагностики туберкулеза достаточно разнообразны, разработка и совершенствование их продолжается со времен открытия возбудителя.

Основным методом выявления зараженных возбудителем туберкулеза животных является внутрикожная туберкулиновая проба. В некоторых стадах при убое реагировавших на туберкулин животных обнаруживают туберкулезоподобные патологические изменения. В таких случаях эпизоотический статус хозяйства определяется по результатам бактериологичекого исследования биоматериала от реагировавших на туберкулин животных ( Н.П.Овдиенко, А.Х.Найманов, В.А.Ведерников, 2002).

При бактериологичеком исследовании с использованием биопробы у морских свинок иногда обнаруживают незначительные узелковые изменения, которые затрудняют определение вида возбудителя туберкулеза. Некоторые исследователи склонны объяснять возникновение таких изменений у морских свинок с инфицированностью животных нетуберкулезными (атипичными) микобактериями, роль которых в патологии человека, сельскохозяйственных и лабораторных животных недостаточно изучена.

По данным разных авторов (Н.М.Макаревич, 1973, 1982; Т.Ф.Оттен,

A.В.Васильев, 2005; Р.ТЛЭа^&оп, 1989 ; Ю^аНасе А а1., 1990; Е^оИпэку, 1992 и др.), от 10 до 24 видов нетуберкулезных микобактерий являются потенциальными возбудителями микобактериоза человека.

Многие отечественные исследователи (А.С.Донченко и соавт.,1987 ;

B.С.Федосеев и соавт., 1988 ; Ю.А.Макаров, 1997, Н.И.Прокопьева, 2004, и др.) считают , что нетуберкулезные микобактерии обусловливают только сенсибилизацию крупного рогатого скота к туберкулину для млекопитающих. Некоторые исследователи (О.В.Мартма, 1982; Н.П.Овдиенко и соавт., 1991) выявляли у реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота туберкулезоподобные изменения лимфатических узлов.

Патогенность разных видов нетуберкулезных микобактерий для животных остается пока невыясненной и дискутабельной.

Т.Ф.Оттен (2005) отмечает, что у людей, больных микобактериозом, со временем выявляют туберкулез. Такие же данные имеются и при исследованиях поголовья крупного рогатого скота.

Повсеместно накапливающиеся наблюдения об одновременном выделении возбудителя туберкулеза и нетуберкулезных микобактерий ставят актуальную задачу углубленного изучения патогенных свойств разных видов микобактерий, выделенных от разных видов животных.

Целью исследований являлось изучение культуральноморфологических, биохимических и патогенных свойств микобактерий, выделенных от разных видов животных и объектов внешней среды.

Основные задачи исследований:

- выяснить частоту выделения микобактерий из объектов внешней среды, от крупного рогатого скота, овец, свиней и диких животных ;

- изучить культурально-морфологические и биохимические свойства выделенных культур микобактерий;

- изучить патогенность М.капзаБП, М.хепорь МлШ;гасе11и1аге, М.таппит, М.8СгоШ1асеит, М.ГогШкит для морских свинок;

- изучить патогенность М.Ь^б, М.аушт, М.зсгоАдксеит и М.йэгинШт для белых мышей;

- изучить патогенность М.капзаэИ, М.зсгойИасешп для овец в сравнении с М.Ьоу1б, М.шЬегси1оз18, М.аушт.

Научная новизна. Подтверждена убиквитарность нетуберкулезных микобактерий, выделенных из объектов внешней среды, из поверхности кожи, носовой слизи, спермы и биоматериала от крупного рогатого скота, овец, свиней, птицы и диких животных.

Показано, что у морских свинок, зараженных внутрибрюшинно культурами М.капБазн, М.хепор!, М.й)гйпШт, М.таппит и Млп1гасе11и1аге, развивается латентная инфекция с поражением сальника в области желудка с последующими репаративными процессами к 60-му дню.

Обнаружено перманентное появление у белых мышей очагового ( иногда диффузного) некроза хвоста при подкожном и внутрибрюшинном методах заражения их М.зсгойПасешп;

Установлена зависимость проявления патологоанатомических изменений у белых мышей при заражении их культурой М.Ытэ. При подкожном заражении белых мышей М.Ьоу1з вызывают патологоанатомические изменения через 30 дней, а при внутрибрюшинном - через 10 дней и характеризуются более тяжелым течением инфекционного процесса: увеличением селезенки, образованием в печени и легких туберкулезных узелков.

Показано, что у овец М.капБази персистируют в организме и сенсибилизируют их к туберкулину для млекопитающих и КАМ, не вызывая патологических изменений. М.зсгоАЛасешп обусловливают у овец патологоанатомические изменения, сходные с туберкулезными. М.Ьоу1б у овец вызывает характерные патологоанатомические изменения, а

МЛиЬегсЫс^Б, М.капзаБп и М.аушт - только сенсибилизируют организм животных к туберкулину.

Практическая значимость. Результаты исследований включены в «Наставление по диагностике туберкулеза животных», утвержденного Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 18 ноября 2002г.

Личный вклад соискателя заключается в бактериологическом исследовании биоматериала и объектов внешней среды, идентификации микобактерий, организации и проведении экспериментальных исследований на морских свинках, белых мышах и овцах, анализе и обобщении результатов исследований.

Апробация работы. Материалы работы доложены на XII съезде фтизиатров РФ (Саратов, 1994), на научно-практической конференции по проблеме туберкулеза и бруцеллеза сельскохозяйственных животных (Новосибирск, 1995); на Международной научно-практической конференции, посвященной 40-летию Северного научно-исследовательского института животноводства и ветеринарии (г.Петропавловск, Северо-Казахстанская обл., Республика Казахстан, 2003), на Международной конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики туберкулеза животных» (Москва,2003), на Международной научно-практической конференции, посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р.Коваленко (г.Москва,2006),на заседаниях ученого совета ВИЭВ(2001,2002,2003,2004гг.). Основные положения, выводы и практические предложения, изложенные в диссертации, обсуждены и одобрены на межлабораторном совещании научных сотрудников ВИЭВ (2006г.).

Основные положения выносимые на защиту. Полученные экспериментальные данные позволяют вынести на защиту следующие основные положения:

- результаты исследований по изучению широты распространения микобактерий; результаты исследований по выявлению и идентификации нетуберкулезных микобактерий из биоматериала животных и объектов внешней среды;

- результаты сравнительного изучения культурально-морфологических, биохимических и патогенных свойств нетуберкулезных микобактерий.

Публикациярезультатовисследований. По материалам

5. Выводы

1. Подтверждена убиквитарность нетуберкулезных микобактерий,которых выявляли из объектов внешней среды (от 5,1 до 41,1% исследованных проб), из биоматериала реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота (от 4 до 39,4% случаев), от овец - в 10%, от диких животных - в 21,1% случаев.

2.Установлено, что подкожное и внутрибрюшинное введение культуры M.scrofulaceum вызывает у белых мышей очаговый, а иногда и диффузный некроз хвоста, что может являться дифференцирующим признаком при идентификации микобактерий.

3.Установлено, что при внутрибрюшинном заражении морских свинок культурами M.kansasii, M.xenopi и M.fortuitum закономерно поражается сальник в области желудка. Культуры M.kansasii и M.xenopi выделяются (100%>) в первые 20 дней после заражения морских свинок, а культура M.fortuitum не выделяется на протяжении всего периода опыта (60 дней).

4. Культура М. bovis при подкожном заражении белых мышей вызывает патологоанатомические изменения через 30 дней, а при внутрибрюшинном

- через 10 дней после заражения, которые характеризуются увеличением селезенки, образованием узелков в печени и легких .

5.Культура M.avium вызывала у белых мышей патологоанатомические изменения только при внутрибрюшинном методе заражения на 60-й день.

6.Подкожное заражение M.fortuitum не вызывает у белых мышей патологоанатомических изменений, культуру выделяли через 20-30 дней после заражения. Внутрибрюшинное заражение вызывает образование узелков в печени.

7.Установлено, что культура M.scrofulaceum является патогенной для овец и обусловливает патологоанатомические изменения, сходные с туберкулезными. M.bovis у овец вызывает характерные для туберкулеза патологоанатомические изменения, а M.kansasii, M.tuberculosis и M.avium -только сенсибилизируют организм животных к туберкулину.

6. Практические предложения

1. Предлагаем использовать при идентификации культуры M.scrofulaceum в качестве биологической модели белых мышей, а как дифференциальный признак - некроз хвоста при подкожном и внутрибрюшинном заражении последних.

2. При проведении биопробы, в случае гибели морской свинки без развития патологоанатомических изменений предлагаем проводить гистологические, патологоанатомические и культурально-морфологические исследования биоматериала от павшего животного и проведение биопробы с материалом от павшей свинки.

3. При проведении биопробы, в случае гибели морской свинки и обнаружении патологоанатомических изменений сомнительного характера, предлагается проведение патологоанатомических, гистологических и культурально-морфологических исследований биоматериала от павшего животного и проведение биопробы с материалом от павшей морской свинки.

4. При бактериологическом исследовании материала от овец необходимо проводить второй пассаж на лабораторных животных, используя биоматериал от первой морской свинки в случае отрицательной биопробы или сомнительных патологоанатомических данных.

2.5. Заключение

Приведенные литературные данные показывают, что уже достаточно изучены биология возбудителя туберкулеза, методы его выделения и культивирования. В системе противоэпизоотических мероприятий при туберкулезе крупного рогатого скота диагностика была и остается на первом месте. Основным методом лабораторной диагностики туберкулеза продолжает оставаться бактериологический метод, позволяющий выделить культуру возбудителя. Однако, накопленные к настоящему времени данные о его полиморфизме, свидетельствуют о необходимости индикации не только возбудителя в измененной форме, а и контроля эпизоотической ситуации туберкулеза.

Все применяющиеся в диагностике туберкулеза методы аллергического, патоморфологического, бактериоскопического, культурального, биологического и гистологического исследований обладают большой диагностической ценностью, однако они не в состоянии удовлетворить ни лабораторных, ни практических специалистов. Именно в диагностике многие задачи еще не решены. Особую остроту приобрел вопрос о специфичности реакций на туберкулин для млекопитающих. Это связано с выявлением во многих благополучных стадах реагирующих животных, у которых не удается подтвердить туберкулез при лабораторном исследовании соответствующего биоматериала.

В большинстве случаев, их связывают с инфицированностью животных атипичными микобактериями, которые имеют общие антигены с микобактериями туберкулеза бычьего вида (M.bovis), используемыми при изготовлении туберкулина для млекопитающих (В.А. Соловьев и Н.П. Овдиенко, 1991; Ю.Я. Кассич и соавт., 1991).

В результате при выявлении парааллергических реакций нередко создается ситуация ложного неблагополучия соответствующего стада, что приводит к необоснованным затратам на оздоровительные мероприятия.

Со времени открытия R. Koch (1882) возбудителя туберкулеза лабораторная диагностика этого заболевания в течение ряда десятилетий ограничивалась почти исключительно данными бактериоскопического исследования. С целью повышения количества положительных результатов были предложены методы накопления, позволяющие концентрировать содержащиеся в исследуемом материале микобактерии для обнаружения их микроскопическим методом. В дальнейшем были разработаны методы обогащения микобактериями туберкулеза патологического материала, основанные на гомогенизации их с последующей концентрацией микобактерий в небольшом объеме: седиментацией или флотацией. Для обогащения исследуемого материала применяли микроэлекрофоретический метод (П.С. Бескровный, 1971; Т.Ф. Оттен, Б.И. Вишневский, H.H. Качанова, 1986, и др.).

Усовершенствование методов индикации микобактерий туберкулеза ведется и по пути изыскания новых, более совершенных питательных сред, содержащих в своем составе вещества, стимулирующие рост микобактерий.

Биологический метод исследования при туберкулезе применяется с момента открытия возбудителя этой инфекции и не потерял своего значения и до настоящего времени. Этот метод также постоянно совершенствовался.

Испытывались различные методы заражения подопытных животных. И этот метод считается наиболее эффективным для выделения микобактерий.

В последнее время широко изучаются молекулярно-генетические методы выявления микобактерий, позволяющие по-новому взглянуть на проблему туберкулеза в целом и микобактерий в частности.

Усовершенствование разных методов выделения микобактерий туберкулеза позволило выявлять не только возбудителей туберкулеза, а и нетуберкулезные микобактерии, проблема которых становится все более актуальной с течением времени (Т.Б, Ильина, М.П. Зыков, 1979; Т.Ф. Оттен с соавт., 2004, 2005, и др.)

В связи с появлением новых видов микобактерий стал остро вопрос об их классификации, которая постоянно совершенствуется, но не совсем отвечает запросам ветеринарной практики. Тоже самое касается и классификации нетуберкулезных микобактерий.

Число известных науке видов нетуберкулезных микобактерий довольно велико. Имеются явные межвидовые различия в степени патогенности и в культуральных свойствах, но проблема научно обоснованной классификации микобактерий пока не решена. Широко используется не вполне совершенная группировка Яипуоп (1959), основанная на различиях в быстроте роста бактерий и характере пигментообразования при их культивировании. По мнению самого автора, а также 1.К. 'М^гГеПег (1975), эта группировка не может быть признана научной классификацией, так как она не отражает генетической близости различных микобактерий, а также их патогенности для человека и животных. Вместе с тем, такая группировка удобна и в настоящее время ею пользуется большинство исследователей.

За последние годы установлена этиологическая роль для человека некоторых нетуберкулезных кислотоустойчивых микобактерий в возникновении заболеваний, иногда клинически не отличимых от различных форм туберкулеза легких. Они выявляются у 1-2% больных легочным туберкулезом. Более часто их находят при поражении лимфатических узлов, кожи и подкожного жирового слоя.

Патогенная роль для человека установлена для M.avium, M.kansasii, М battey, M.fortuitum, M.xenopi, M.ulcerance и др.

Главной «виной» нетуберкулезных микобактерий справедливо считают сенсибилизацию инфицированного скота к туберкулину для млекопитающих. Публикации последних лет наглядно подтверждают распространенность и эпизоотологическую значимость этого явления.

Выделяли культуру этих микобактерий и из патологически измененного лимфоузла теленка (С.Д. Басыбеков, 1982; В.П. Урбан и О.В. Мартма, 1973). M.intracellulare, M.xenopi, M.ulcerans (нефотохромогенные атипичные микобактерии) считаются потенциально патогенными для людей, а микобактерии комплекса avium-intracellulare часто оказываются возбудителями микобактериозов у свиней, а иногда и у крупного рогатого скота (H.H. Козлов, 1983; И.Т. Нечваль, 1986; Kantor et al., 1987). Доказана патогенность этих микобактерий для цыплят.

Много сообщений о доказательствах патогенности представителей группы быстрорастущих микобактерий. По данным Tsukamura et al. (1978), Т.Б. Ильиной и соавт. (1978), M.fortuitum, M.chelonei потенциально патогенны для людей. M.fortuitum нередко выделяли из лимфоузлов крупного рогатого скота, и изредка - и из неизмененных лимфоузлов свиней. M.fortuitum, M.smegmatis, M.vaccae иногда вызывают маститы у коров. M.fortuitum и M.chelonei в отдельных случаях выделяли из содержимого абсцессов у собак и кошек. Известно немало сообщений о выделении культур быстрорастущих микобактерий из биоматериала от кур и других видов птиц (P.Stuart et P.Harvey, 1951; K.Peterson, 1965; Schurmann, 1967; Seeger, 1968; K.K. Тяхнас, 1975; G.Kunkle et al., 1983).

JI.M. Ходун с соавт. (2000) считают, что не установлена корреляционная связь проявления аллергической реакции на туберкулин с персистенцией в организме животных нетуберкулезных микобактерий: частота выделения и видовой состав нетуберкулезных микобактерий у реагирующих и не реагирующих на туберкулин животных практически не различались.

Нередко при проведении биологических исследований у лабораторных животных обнаруживают некоторые патологические изменения, не связанные с туберкулезом, что затрудняет специалистов в определении вида микобактерий туберкулеза.

Поэтому, важно изучить особенности развития патологии у лабораторных животных, зараженных нетуберкулезными микобактериями, выделенными от крупного рогатого скота и других видов животных.

3. Собственные исследования.

3.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в лаборатории микобактериозов (ранее лаборатория эпизоотологии, диагностики и профилактики туберкулеза и паратуберкулеза Всероссийского научно-исследовательского института экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко и на опытной базе Вышневолоцкого отдела ВИЭВ (Тверская область) в соответствии с утвержденными планами научно-исследовательских работ в период в рамках Российской научно-технической программы фундаментальных и прикладных исследований и в соответствии с утвержденными планами научно-исследовательских работ в период 19892005 гг. (задания 02.01.Д. программы О.сх.61, 02.01М; 02.04.03Д и 02.01.01).

Для выделения культур микобактерий исследовали биоматериал от 252 голов крупного рогатого скота, 95 овец, 5 свиней, реагировавших на туберкулин для млекопитающих, 5 кур, 73 оленей, 6 ланей, 2 муфлонов, 8 кабанов, 1 лося, 1 овцебыка,3 фазанов, 1 грифовой цесарки, 1 райского журавля, 1 кольчатого чирка, 1 хохлатой напалидии и 1435 проб объектов внешней среды (соскобы с кормушек, автопоилок, пробы почвы, фекалий, сена, соломы, комбикорма, торфа и других подстилочных материалов).

Исследовали 98 проб носовой слизи и 70 проб смывов с кожи средней трети шеи крупного рогатого скота, 170 проб спермы быков-производителей. Пробы отбирали в соответствии с «Методическими рекомендациями по проведению лабораторных исследований при туберкулезе животных» (М., 1992).

При бактериоскопическом исследовании биоматериала от животных готовили мазки-отпечатки из внутренних органов и тканей, высушивали и красили по Циль-Нильсену. При культуральном исследовании биоматериал от животных и пробы из объектов внешней среды обрабатывали по методу А.П. Аликаевой (1967,1979). В качестве питательных сред использовали о среды Петраньяни, Финн-2, Левенштейна-Иенсена, Фаст-ЗЛ. Через 2-3 дня пробки пробирок парафинировали, посевы культивировали на протяжении 36 месяцев при температуре 37-38°С. При появлении роста определяли характер колоний, готовили мазки и красили их по Циль-Нильсену.

Культурально-морфологические и биохимические свойства миобактерий изучали в соотвествии с методическими рекомендациями «Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий» (Т.Б.Ильина, 1975,1980), с приказом Минздрава СССР№558 от 08.06.78 года «Об унификации микробиологических методов исследований при туберкулезе» с приказом Минздрава Российской Федерации №109 от 21 марта 2003 года «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации».

Определение вида возбудителя туберкулеза проводили путем заражения чистой культурой 2-3-х морских свинок и 2-3-х кроликов по общепринятой методике. За зараженными лабораторными животными вели наблюдения в течение 3-х месяцев. Если за этот период они не погибали, проводили эвтаназию морских свинок путем декапитации с помощью гильотины, кроликов - путем воздушной эмболии, согласно «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (1978), с последующим проведением патологоанатомических, бактериоскопических, культуральных и гистологических исследований материала от всех павших и убитых животных.

Патогенность нетуберкулезных (атипичных) микобактерий изучали на 455 морских свинках, 160 белых мышах и 35 овцах по данным патологоанатомических, культуральных и патоморфологических исследований.

Морских свинок разделили по принципу аналогов по 20 голов в группе.

Для заражения морских свинок использовали 2-х недельные культуры следующих штаммов: М^сгойЛасеит, Млп1гасе11и1аге, М.Ьоу}б (ЦВ-1), М.АэгШкит. М.таппит, М.кштзп, М.хепорь Эталонные тест-культуры для идентификации получены из м узея микроорганизмов ВИЭВ.

Культуры М.БсгоМасеит были выделены из лимфоузлов реагировавшего на туберкулин крупного рогатого скота , принадлежащего совхозу "Красная пойма» Московской области. Культуры М.ГогШкит выделены из лимфоузлов крупного рогатого скота, принадлежащего совхозу «Правдинский« Калининградской области. Культура М.Ытэ (ЦВ-1) выделена от коровы , реагирующей на туберкулин для млекопитающих, принадлежащей совхозу «Воздвиженский» Целиноградской области.

Проведены исследования на 105 морских свинках с использованием культуры 1с ( выделенной от свиней , принадлежащих совхозу им. XXII партсъезда Тверской области), обозначенная как 1с и по культурально-морфологическим и биохимическим свойствам отнесена к М. ш1гасе11и1аге и культуры, выделенной от крупного рогатого скота, принадлежащего совхозу «Прогресс» Пензенской области , которая по совокупности признаков определена как М.Ытэ.

По 5 морских свинок убивали через 10, 20, 30 и 60 дней после заражения с последующим проведением патологоанатомических, бактериологических и гистологических исследований материала.

Для заражения белых мышей использовали 2-х недельные культуры М.БСгоГи1асеит, М.АэгииШт, М.аушт и М.Ыжб. Мышей риазделили по 20 голов в группе и , соответственно, заражали внутрибрюшинно и подкожно в дозе 1,0 мг взвеси культуры в 1,0 мл физиологического раствора.

По 5 мышей каждой группы убивали через 10, 20 и 30 дней после заражения с дальнейшим проведением патологоанатомических, бактериологических и гистологических исследований.

Экспериментальные исследования по изучению патогенности М.капБазп и М.зсгоНИасеит в сравнении с М.Ьоу1з, М.ШЬегси1оз18 и М.аушт провели на 35 овцах, которых разделили на 7 групп ( 6-опытных и 1- контрольную, по 5 голов в каждой).

Животным первой группы культуру М.капзазп вводили интратрахеально, затем орально - трехкратно с интервалом в 7 дней в дозе по 120 мг на животное. Овец второй группы заражали тем же способом культурой М.зсгоГЫасеит в дозе по 120 мг на животное. Животных третьей группы так же заражали М.Ьоу1б в дозе по 12 мг на животное, четвертой - М.Ышб в дозе по 120 мг на животное, пятой- М.ШЬегси1оз18 в дозе по 120 мг на животное, шестой- М.аушт в дозе по 120 мг на животное, животных седьмой группы не заражали (контроль).

Экспериментальное зараженных овец опытных и контрольной групп содержали в течении 10 мес. и через каждые 30 дней исследовали туберкулиновой или симультанной пробами с ППД-туберкулином для млекопитающих и комплексным аллергеном из атипичных микобактерий. От животных брали пробы сыворотки крови для серологических исследований. Реакцию учитывали через 48 часов после введения аллергенов и оценивали по величине припухлости в крестах от + до ++++.

От животных брали пробы сыворотки крови для серологических и пробы крови, молока и фекалий для бактериологических исследований.

РСК с комплексным туберкулезным антигеном (КТА) УНИИЭВ и туберкулезным антигеном СибНИВИ ставили согласно «Наставлению по диагностике туберкулеза животных», утвержденному Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР 25.02.86г. с участием сотрудников лаборатории.

По окончанию срока эксперимента животных убили и материал исследовали бактериологически и гистологически. Бактериологическое исследование биоматериала проб крови, молока и фекалий проводили по общепринятым методикам.

Для взятия проб молока вымя овцы предварительно обмывали теплой водой с мылом, высушивали стерильным полотенцем, протирали соски 70%-ным спиртом. Первые струйки молока сдаивали в отдельную посуду. Из каждой доли вымени выдаивали не менее 30 мл молока.

Отобранные пробы молока центрифугировали в течение 20 мин. при 3000 мин"1. Средний слой отсасывали и удаляли, осадок и верхний жировой слой молока обрабатывали 6%-ным раствором серной кислоты в течение 20 мин., смесь взбалтывали и центрифугировали 15 мин при 3000 мин'1. Надосадочную жидкость удаляли, из осадка делали посевы на питательную среду Левенштейна-Иенсена.

Пробы фекалий в количестве 30-50 г отбирали из прямой кишки. Обработку фекалий проводили по методу Венота и Моро. Фекалии в количестве 2-4 г растирали в ступке, разбавляли 25%-ным раствором поваренной соли до жидкой консистенции, пропускали через марлевый фильтр, брали в центрифужную пробирку 3-5 мл фильтрата, добавляли 1 мл авиационного бензина, встряхивали и центрифугировали при 3000 мин"1 в течение 15 мин. Из нижней части образовавшегося кольца делали посевы на и среду Левенштейна-Иенсена.

Пробы крови обрабатывали по методу Гона.

Патоморфологические исследования проводили совместно с кандидатами ветеринарных наук О.В.Якушевой и В.С.Суворовым.

Полученные в процессе работы цифровые показатели обрабатывали общепринятыми методами вариационной статистики. Рассчитывали среднее арифметические показатели, достоверность которых определяли с помощью критерия Стьюдента (В.М.Шмидт, 1984).