Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:L-трансформация микобактерий, свойства и способы культивирования L-форм

На правах рукописи

СЕКИН Евгений Юрьевич

Ь-ТРАНСФОРМАЦИЯ МИКОБАКТЕРИЙ, СВОЙСТВА И СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Ь-ФОРМ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Новосибирск - 2006

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте бруцеллеза и туберкулеза животных СО РАСХН

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор

Ощепков Владимир Григорьевич

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор,

чл.-кор. РАСХН Макаров Юрий Анатольевич,

кандидат ветеринарных наук, ст. науч. сотр. Донченко Николай Александрович

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский

институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ)

Защита состоится « & » 2006 г. в часов на заседании диссертаци-

онного совета Д.006.045.01 в Государственном научном учреждении Институт экс-перимешальной ветеринарии Сибири и Дальнею Востока СО РАСХН по адресу: 630501, Новосибирская область, Новосибирский район, п. Краснообск, ИЭВСиДВ.

С диссертацией можно ознакомиться ЦНСХБ СО РАСХН Автореферат разослан 2006г.

С.И. Логинов

¿OCGQ

3S07

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Основными методами первичной диагностики туберкулеза животных в настоящее время являются аллергический, патолого-анатомический и бактериологический, результаты которых предопределяют окончательный эпизоотический статус исследуемого поголовья животных. Заболевание туберкулезом считается установленным, если оно подтверждается патологоанато-мическим методом, а при отсутствии характерных для туберкулеза видимых изменений - положительными результатами ПЦР, биологического или бактериологического исследований.

Выделение микобактерий туберкулеза из патологического материала связано с определенными трудностями в силу генетических и фенотипических особенностей возбудителя. Основные из них — медленный рост на искусственных питательных средах и способность к L-трансформации и длительной персистенции возбудителя в измененной (L-) форме (М.К. Юскавец, 1960; З.Н. Кочемасова, 1970, 1975; Н.М. Колычев, 1992; B.C. Федосеев, 1980; A.C. Донченко с соавт., 1994, 2004; Н.П. Овдиенко с соавт., 1995; Т.И. Байтерякова, 1983; Л.В. Галатова, 1993, 2001). L-траисформация микобактерий может происходить под воздействием самых различных факторов внешней среды, применяемых химиопрепаратов, защитных реакций организма (З.Н. Кочемасова, М.Н. Дыхно и др., 1980: B.C. Федосеев с соавт, 1975, 1981; М.И. Гертман, 1988; Б.И. Коган, 1990; Б.К. Керимжанова, 1992; A.C. Донченко, 1994; Ю.А. Макаров, 1997; В.Г. Ощепков с соавт., 2001, 2003). Изменение морфологии микобактерий и понижение метаболизма предполагают и особые требования к условиям культивирования их L-форм. На обычных питательных средах, применяемых при лабораторной диагностике туберкулёза. L-формы либо вообще не растут, или очень скудно растут лишь отдельные культуры. Необходимы щадящие методы обработки биоматериала и элективные питательные среды, в которых обязательно присутствуют нативные белки и вещества, стабилизирующие осмотические свойства среды. В настоящее время в ветеринарной и медицинской практике для выделения L-форм микобактерий из исследуемого материала используют полужидкую питательную среду Школьниковой в модификации Дорожковой (И.Р. Дорожкова с соавт. 1974; Ю.А. Макаров, 1997). Однако эта среда обладает сравнительно низкой информативностью (ДА. Таллер, 2001), то есть позволяет изолировать из биоматериала и объектов внешней среды патогенные микобакгерии в малом количестве. Более того, эта среда не пригодна для экспериментального получения и длительного культивирования L-форм, требуемых для проведения научных опытов. Не решают этих проблем и другие известные нам питательные среды, предложенные для культивирования L-форм патогенных микобактерий.

Цель и задачи исследования. Целью исследований явилось изучение распространенности L-форм микобактерий во внешней среде, а так же динамики их образования и свойств при культивировании на разных питательных средах.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

• изучить распространенность 1.-форм микобактерий в различных объектах внешней среды и их видовой состав;

»'ОС. Н\ЦИОНАЛЬНАЯ БИБЛИОТЕКА С.-Петербург

ОЭ 20()£акт£АУ

• определить динамику образования L-форм патогенных и атипичных микобактерий под воздействием химических препаратов;

• Разработать питательные среды для ускоренной изоляции, экспериментального получения и длительного культивирования L-форм микобактерий и провести их сравнительную оценку;

• Изучить сенсибилизирующие, реверсибельные и вирулентные свойства L-форм патогенных и некоторых видов атипичных микобактерий.

Научная новизна. Полученные данные расширяют представление об условиях и видовом составе микобактерий, способных к L-трансформации; о способах существования и биологических свойствах патогенных и атипичных микобактерий и должны учитываться при разработке общей теории инфекционного и эпизоотического процессов туберкулеза животных.

Получены патеш «Питательная среда для выделения и культивирования L-форм микобактерий туберкулеза» патент РФ № 2242511 от 20.12.2004 г. и решение ФИПС о выдаче патента «Способ реверсии L-форм микобактерий» № 2004113930/13(023123) от 02.11.2005 г.

Практическая значимость. Разработанная питательная среда ПС-1 и способ предпосевной обработки исследуемого биоматериала позволяют сократить сроки появления первичного роста L-форм микобактерий, что ускоряет проведение комплекса бактериологической диагностики туберкулеза в 1,5-2 раза. Результаты исследований использованы при составлении методических рекомендаций по изопя-ции и идентификации L-форм микобактерий из биоматериала животных (2005 г.), а 1акжс при подготовке ветеринарных специалистов в ИВМ ОмГАУ.

Апробация полученных материалов. Материалы диссертации доложены и обсуждены на ученых советах ВНИИБТЖ, (i. Омск, 1999-2005 гг.), координационных совещаниях, проходивших в ПИИЭВ (г. Москва, 2003 2005 п.), на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов Института ветеринарной медицины ОмГАУ (2000-2001 гг.), на конференции молодых ученых ВНИИБТЖ (г. Омск, 2000 г.), на Всероссийской научной конференции rio проблемам хронических инфекций ВНИИБТЖ (г. Омск, 2001 г.), Международной научно-пракшческой конференции «Современные проблемы диагностики и профилактики туберкулеза животных» (г. Москва, 2003 г.).

Публикация материалов исследований. По материалам диссертации опубликовано 8 научных статей и описание патента РФ на питательную среду ПС-1 (ВНИИБТЖ).

Внедрение результатов исследований. Результаты научных исследований вошли в методические рекомендации «Изоляция и идентификация L-форм микобактерий из биоматериала животных», утвержденные подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины РАСХН, протокол № 5 от 21.06.2005 г.

Основные теоретические положения и экспериментальные данные, изложенные в диссертационной работе, используются в научно-исследовательских лабораториях ВНИИБТЖ, в учебном процессе по микробиологии и эпизоотологии ОмГАУ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы, включающего 184 источника, в том числе 47 - иностранных, и приложений.

Материалы диссертации иллюстрированы 12 таблицами, 17 рисунками.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Видовой состав и распространенность L-форм микобактерий во внешней

среде.

2. Динамика образования L-форм патогенных и атипичных микобактерий под действием химических веществ.

3. Разработка и перспективность применения питательных сред ПС-1 и ПС-2 для изоляции и изучения биологических свойств L-форм патогенных и атипичных микобактерий.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнялась в лаборатории клеточной биотехнологии Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных (ВНИИБТЖ) в соответствии с заданием 02.01.09. «Разработать теоретические и практические основы молекулярно-генетической диагностики туберкулеза животных, индикации и идентификации микобактерий из различных объектов».

Биологический материал для исследования отбирали в хозяйствах Омской, Новосибирской областей с различным эпизоотическим состоянием по туберкулезу животных, а также на Омском мясокомбинате в период с 1998 по 2005 г.

Для проведения бактериологических исследований использовались лимфатические узлы и кусочки паренхиматозных органов от 120 голов крупного рогатого скота и 56 морских свинок. Кроме этого, с целью изучения распространенности и видового состава полевых L-форм микобактерий на территории Омской, Челябинской, Курганской, Кустанайской областей было отобрано и исследовано совместно с сотрудниками кафедры эпизоотологии и организации ветеринарного дела Ура-лАВМ (Л.В. Галатова и др.) 223 пробы из объектов внешней среды (кормовые про-t ходы, кормушки, поилки, скопления навоза и др.).

Для экспериментальной L-трансформации использовали культуры музейных штаммов М. bovis шт. 8, М. bovis шт. 14, М. avium шт. 9, М. smegmatis, М. phlei, М. intracellularae.

L-трансформацию проводили двумя способами:

Первый - с использованием изониазида в концентрациях 0,01-20 мкг/мл. среды.

Второй - с применением дезинфектантов: щелочного раствора формальдегида в 3%-ной концентрации, едкого натра в 3%-ной концентрации, 1%-ного хлорамина Б, 5%-ного раствора карболовой кислоты. Опыты по L-трансформации под действием химических препаратов проводили согласно методическим указаниям о по-

рядке испытания новых дезинфицирующих веществ для ветеринарной практики (1976 г.).

Для бактериологического исследования объектов внешней среды и биоматериала от животных использовали среды Гельберга, Левенштейна-Йенсена, ФАСТ-ЗЛ, Дорожковой, приготовленные по стандартным проиисям, и среды, разработанные для изоляции и культивирования Ь-форм микобактерий во ВНИИБТЖ (ПС-1и ПС-2).

Предпосевную обработку биологического материала проводили по методу Тона (1968), а материала из объектов внешней среды - по методике Аликаевой (1964) в собственной модификации.

Культурально-морфологические свойства полученных Ь-вариантов микобактерий изучали путем их посева на полужидкие и плотные питательные среды: Дорожковой, ПС-1, ПС-2, Гельберга, ФАСТ-ЗЛ. Обращали внимание на сроки появления первичного роста, характеристику' колоний, их форму, поверхность, консистенцию, пигментообразование. В полужидких средах - на скорость и характер роста, пигментообразование.

Морфологию клеток выясняли путем проведения фазово-контрастной микроскопии.

Тинкториальные свойства культур определяли под иммерсией светового микроскопа.

Электронно-микроскопические исследования Ь-вариантов микобактерий проводили в лаборатории электронной микроскопии ИВМ ОмГАУ (проф. Т.А. Беспалова и др.).

Для пой цели использовали способ выделения и подготовки Ь-форм микобактерий для электронной микроскопии, описанный Б.И. Коганом (1988).

Грезы получали на ультрамикротоме ЛБК-8800. Изучение препаратов осуществляли на электронном микроскопе при инструментальных увеличениях от 10000 до 20000 раз с фотографированием на фотопластинки МР типа «Ядерные» и последующим 3--6 - кратном фогоувеличении.

Вирулентные свойства Ь-форм определяли на 18 морских свинках, подобранных по принципу аналогов.

Способность к реверсии Ь-форм микобактерий выясняли методом многократных пересевов на питательных средах без добавления Ь-инду пирующего фактора и на лабораторных животных пу1ем их заражения Г,-культурами с последующим убоем и бактериоло! ическим исследованием внутренних органов.

Распространенное гь Ь-форм в объектах внешней среды изучали путем отбора проб с объектов животноводческих помещений по общепринятым методикам (Н.М. Колычев, 1992 и др.) и посева их на стандартные и модифицированные питательные среды. Видовой состав Ь-форм микобактерий, находившихся на объектах внешней среды, определяли в научной лаборатории кафедры эпизоотологии и организации ветеринарного дела Уральской ветеринарной академии под руководством доцента Л.В. Галатовой. Предварительно проводилась реверсия Ь-форм в типичное бактериальное состояние. Видовую идентификацию реверсировавших культур про-

водили общепринятыми методами с использованием биохимических тестов, описанными в наставлении по диагностике туберкулеза животных, 1986, 2002.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Распространенность и видовой состав L-форм микобактерий в объектах внешней среды Для изучения вопроса распространенности L-форм микобактерий в объектах внешней среды нами было исследовано 223 пробы, взятые с объекл ов животноводческих помещений 16 скотоводческих хозяйств, имеющих различную эпизоотическую ситуацию по туберкулезу.

В пяти хозяйствах дополнительно к объектам внешней среды провели бактериологическую экспертизу молока, opianoB и лимфатических узлов коров, реагирующих на ПТТД-туберкулин для млекопитающих. Видовой состав бактериальных форм микобактерий определяли по общепринятым методикам, а видовую принадлежность L-форм - после реверсии их в типичные бактериальные формы.

При сравнении количественных показателей отмечено, что в животноводческих помещениях L-формы встречаются чаще (53%), чем морфологические неизмененные микобактерии (46%).

Морфология изолированных L-форм была разнообразной. В большинстве случаев (64%) их культуры состояли из крупных вакуолизированных образований и бесформенных зернистых скоплений. Значительно реже (22%) встречались крупные гетероморфные палочки, потерявшие кислотоустойчивость. коккоподобные мелкие сферопласты. Часть культур (14%) представляла собой длинные нитевидные, булавовидные и другие необычные формы. Выделенные культуры L-форм обладали выраженной реверсибелъностью, и после двух-семи пересевов большинство из них (56%) восстановили типичную для микобактерий морфологию, кислотоустойчивость и способность окраски по Цилю-Нильсену в красный цвет.

Определение видовой принадлежности реверсировавших L-форм показало, что относятся они к 5 видам: М. bovis, М. avium, М. diernhoferi, М. fortuitum. М. scrofulaceum. В неблагополучных по туберкулезу хозяйствах преобладали виды М. bovis (36%) и М. diernhoferi (36%), в благополучных - быстрорастущий ашпичный вид М. diernhoferi (63%).

2.2.2. Изыскание питательной среды для ускоренного роста L-форм микобактерий (ПС-1)

Изыскание новой питательной среды, позволяющей в короткие сроки выделять L-формы микобактерий, проводилось в несколько этапов.

На первом этапе для конструирования питательной среды были использованы поликомпонентные солевые растворы и биолизат

Для опытов были подобраны L-формы патогенных и атипичных видов микобактерий и три модификации полужидких питательных сред на основе солевых растворов Гельберга, Хенкса и гидролизата мидий.

Контролем служила среда Дорожковой, приготовленная по стандартной прописи.

Оценку интенсивности роста микобактерий проводили визуально по пятибалльной системе: 1 балл - очень скудный рост. 2 балла — скудный, 3 балла - удовлетворительный, 4 балла хороший, 5 баллов - очень хороший.

В проведенных опытах были получены следующие результаты. Рост Г .-форм, из штаммов М. bovis на среде Дорожковой. появлялся на 21,4+1,6 -21,7+0,9 сут. Рост этих же L-форм на средах с солевыми растворами Гельберга и Хенкса отмечался на 17.3 Li,5 - 16,1 + 1.3 сут. Появление роста L-форм из М. avium шг. 9 на кон [рольной среде и опытных солевых растворах Гельберга и Хенкса обнаруживали на 10,2+1,8 7.8 - 0,9 сут. Рост L-форм из атипичных микобактерий (М intracellularae. М. xenopi) отмечали на контрольной среде и на среде с гидролизатом мидий на 10,1+1,3 - 6,3+1,1 сут, а на испытуемых средах с солевыми растворами Гельберга и Хенкса - на 7,4 Li, 2-5,1л1,3 и на 6,9) 1,3- 5,3+1,0 сут соответственно.

Интерпретируя эти результаты можно заключить, что две из трех испытанных модификаций, полученные на основе солевых растворов Хенкса и Гельберга. чоут быть использованы для успешного культивирования L-форм микобактерий.

Последующие опыты были направлены на дальнейшее ускорение первичного роста L-форм микобактерий и увеличение интенсивности накопления их бактериальной массы под воздействием предельных углеводородов.

2.2.2.1. Изучение влияния предельных углеводородов на рост L-форм микобактерий, полученных из музейных культур

В этих опытах были использованы L-формы. полученные из культур музейного штамма 8 М. bovis и два предельных углеводорода теградекан (С)4) и гексадекан (С|й). Указанные углеводороды добавляли к питательным средам, изготовленным на основе солевых растворов Хенкса и Гельберга в дозах 0,1; 0,2 и 0,4 мл. В качестве контроля служили среды без добавления углеводородов. За период наблюдения установлено, что при добавлении тетрадекана и гексадекана происходило значительное сокращение срока роста L-форм микобактерий.

Так, в первом и во втором опытах на среде, приготовленной на солевой основе Гельберга, при добавлении тетрадекана в дозе 0,2 мл, макроскопически видимый рост был получен на 12,1+1,8 сут, что в 1,4 раза быстрее, чем в контроле (17,3+1,5), а при добавлении этого углеводорода в дозах 0,1 и 0,4 - в 1,17 раза.

При добавлении гексадекана в дозе 0,2 мл первичный рост появился на 10,5 +1,1 сут. что в 1,6 раза (Р< 0,05) быстрее, чем в контрольных пробирках (17,3+1,5). При добавлении гексадекана в дозе 0,1 и 0,4 мл первичный рост отмечали на 13,1 +0,9 - 16,1+1,3 сут соответственно.

На среде Хенкса добавление тетрадекана и гексадекана не только сокращало срок визуально наблюдаемого роста, но и увеличивало интенсивность накопления бактериальной массы L-культур микобактерий. Интенсивность накопления бакмас-сы через 3-4 недели культивирования составляла около 5 баллов, тогда как в контроле -1-2 балла.

2.2.2.2. Изучение влияния углеводородов на сроки выделения L-форм микобактерий из биологического материала

Положи гельные результаты, полученные при посевах L-форм микобактерий туберкулеза на питательную среду с солевым раствором Хенкса и предельными углеводородами, позволили начать изучение влияния углеводородов на скорость выделения L-форм микобактерий из биологического материала.

С этой целью был отобран биоматериал от пяти морских свинок, зараженных полевыми культурами L-форм М. bovis и от 82 голов крупного рогатого скота из благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйств. Для исследования брали лимфатические узлы и органы (печень, легкие, селезенку), обрабатывали их по методу Гона в модификации Сумиоши и делали высевы на среды с солевым раствором Хенкса и добавлением тетрадекана и гексадекана в дозе 0,2 мл на пробирку. Эти же среды без добавления углеводородов служили контролем.

При посеве биоматериала от морских свинок на среду с солевым раствором Хенкса наиболее раннее появление видимого роста отмечали при добавлении гексадекапа — на 18,5±1,0 сут. что в 1,3 раза быстрее, чем при добавлении тетрадекана (25.4±1,0) и в 1,6 раза быстрее, чем в контрольных пробирках (29,5±],7). Наряду с ускорением первичного роста увеличивалась и интенсивность накопления бакмассы. В момент появления первичного роста на контрольных пробирках, оцениваемого в 1-2 балла, на опытной среде с солевой основой Хенкса и углеводородами рост оценивали в 4-5 баллов.

При исследовании биоматериала от 82 голов крупного рогатого скота (табл. 1) на срсдс Дорожковой, предназначенной для изоляции L-форм микобактерий, было получено 17 измененных культур микобактерий. а на испьпуемой среде с солевым раствором Хенкса и гексадеканом почти в 2 раза больше - 31 культура.

Таблица 1 - Выделение L-форм микобактерий на полужидких питательных средах

Исследуемый материал Кол-во проб Рост L-форм микобактерий на средах:

Дорожковой Хенкса (11С-1)

культур % кульгур %

Биоматериал от круп. рог. скота из благополучных по туберкулезу хозяйств 31 2 6,4 4 12,9

Биоматериал от круп. рог. скота из неблагополучных по туберкулезу хозяйств 51 15 29,4 27 52,9

ИТОГО 82 17 35,8 31 65,8

Таким образом, опыты показали, что разработанная нами полужидкая питательная среда на основе солевого раствора Хенкса и гексадекана может с успехом применяться для первичного ускоренного выделения L-форм микобактерий из биоматериала лабораторных и сельскохозяйственных животных и по своим свойствам не юлько не уступает, но и во многом превосходит питательную среду Дорожко-вой.

В дальнейшем данная пи1агельная среда названа нами ГТС-1 (ВНИИБТЖ).

2.2.3. L-трансформация патогенных и атипичных микобактерий под действием химических веществ

На модели 5-ти штаммов патогенных и атипичных микобактерий (М. bovis шт. 8 и шт. 14, BCG, М avium шт. 9, М. smegmatis) нами изучена ( -трансформация под действием дезинфектантов и антибактериального препарата изониазида, широко используемых в ветеринарной и медицинской практике. Воздействие химических веществ на микобактерии осуществляли в стерильном физрастворе, а также в условиях питательных сред, содержащих осмотический стабилизатор (сахарозу), стимулятор роста и белково-содержаший компонент (15-20% нормальной лошадиной сыворотки).

2.2.3.1. Изменение роста и морфологии микобактерий под действием дезинфектантов

В первой серии опытов, направленных на изучение возможности и диапазона L-трансформации, мы использовали только дезинфектанты в ранее указанных (раздел 2 1) концентрациях. Для того, чтобы оперативно определять жизнеспособность и условия размножения L-форм, в случае их образования, нами было решено проводить L-трансформацию непосредственно в питательных средах, в частности, на среде Дорожковой, предназначенной для I -культур, и твердых питательных средах Гельберга, ФАСТ-ЗЛ, обычно применяемых для индикации и размножения типичных по морфологии микобактерий.

В результате было установлено, что под действием большинства дезинфеци-рующих растворов могут возникать жизнеспособные L-формы как патогенных, так и атипичных микобактерий, но размножение их лучше идет п условиях полужидкой среды.

Например, сравнительно хороший рост (3-4 балла) культур, обработанных 3%-ным щелочным раствором формальдегида, хлорамином Б и 3%-ным едким натром на полужидкой среде Дорожковой. появлялся на 9-12 сут, а на плотных питательных средах Гельберга и ФАСТ-ЗЛ видимый рост этих же культур появлялся лишь на 12-21 cyi. в виде единичных мелких колоний (1-2 балла) и далеко не во всех пробирках (48-65%). Более того, культуры, обработанные 5%-ным раствором карболовой кислоты, вообще роста не дали.

Морфология клеток L-форм микобактерий характеризовалась выраженным полиморфизмом. Так, под действием 3%-ного щелочного раствора формальдегида в популяции М. bovis шт. 8 возникли крупные шаровидные образования от 2 до 8 мкм в диаметре (51%), вакуолизированные клетки до 5 мкм (47%), коккоподобные клет-

ки (2%). В популяции М. avium hit. 9 появились шаровидные тела от 3 до 6-8 мкм в диаметре (63%), вакуолизированные кле-i к и до 5-6 мкм (26%). коккоподобные клетки (10%) и зернистые палочки (1%). В культуре М. smegmatis число таких измененных клеток составляло 50, 44, 2 и 4% соответственно. У части клеток, сохранивших типичную морфолошю (15-30%), наблюдалась потеря кислотоустойчивое™, они стали окрашиваться в фиолетовый цвет.

В культуре М. bovis шт. 8, подвергнутой действию хлорамина Б, в одном и том же препарате встречались как тонкие красные палочки (до 49%), так и морфологически измененные формы, представленные диффузными массами (конгломераты), зернистыми палочками с различной интенсивностью окраски и коккоподоб-иыми образованиями (51%). К} льтура М avium шт. 9 была морфологически представлена следующими элементами: типичных палочек — 48%, зернистых палочек, слившихся между собой, — 47% и 5% мелких коккоподобных образований разного цвета и интенсивности окраски. В мазках М. smegmatis было до 59% типичных палочек, 48% зернистых и 2% коккоподобных клеток. Окраска клеток варьировала от красной до фиолетовой с различной ишенсивностью. причем интенсивность окраски у типичных клеток была больше, чем у измененных.

Под действием 3%-ного раствора едкого натра в культуре М. bovis шт. 8, наряду с типичными клетками (19%), встречались шаровидные тела тиаметром до 2-3 мкм (10%), зернистые палочки (70%), слившиеся мелкие коккоподобные сферопла-сты (1%). В культуре М. avium шт. 9 и М. smegmatis встречались такие же образования в 15,3, 80 и 2% случаев соответственно.

С целью изучения ультраструктуры L-вариантов, возникших под действием дезинфектантов, проводили электронно-микроскопические исследования Для изучения был оюбран L-вариант микобактерий, полученный in vitro под действием 3%-ного щелочного раствора формальдегида и находящийся на среднем этапе L-трансформации. В качестве контроля использовали исходный штамм М. bovis 8. находящийся в бактериальной форме.

В результат установлено, что L-формы штамма 8 М. bovis были представлены в основном круттными сферопластами рисунок цитоплазмы которых, на ультратонких срезах сглажен, но при этом содержит дополнительные мембранные структуры. Клеточная стенка сферопластов была деградированной: частично утратила ригидный слой, „разбухла" ширина ее значительно (в 5-10 раз) увеличилась за счет капсулоподобного вещества. Размножение L-клеток происходило 1гутем равновеликого и не равновеликого деления, а также образованием репродуктивных ^элементарных тел".

Следовательно, можно утверждать, что у L-форм полученных под воздействием широко применяемого дезинфектанта (3%-ный щелочной раствор формальдегида) отсутствует ригидность клеточной стенки, имеется более развитая система внутриплазматических мембран и более разнообразные способы репродукции.

2.2.3.2. Изменение морфологии, сроков и характера роста чикобактерий под влиянием изониазида

Для сопоставления динамики и интенсивности роста L-форм, полученных под воздействием дезинфектантов, мы провели также опыты по L-трансформации микобактерий под влиянием изониазида. В этой серии оытов взвеси исходных культур микобактерий мы первоначально засевали в пробирки со средой Дорожко-вой, содержащей 0.001-0,005 мг изониазида в 1 мл среды.

Очередной пересев каждой изучаемой культуры проводили на питательных средах, имеющих 3-х-кратное увеличение дозы этого препарата.

При иервичном посеве культур микобактерий, когда концентрация антимикробного препарата в среде составляла 0,001, 0.002, 0,005 мг/мл, рост культур у всех пяти изучаемых штаммов микобактерий появлялся при всех этих концентрациях изониазида.

Было установлено, что изониазид вызывает более интенсивную L-трансформацию, чем дезинфектанты. При этом, концентрация изониазида, вызывающая индукцию L-форм микобактерий, зависела от индивидуальных особенностей штамма. Так, культуры вакцинного штамма BCG сравнительно легко и с большим постоянством образовывали L-варианты. Культуры патогенных музейных штаммов М. bovis шт. 8 и шг. 14 проявляли меньшую склонность к изменению морфологии под действием этого антимикробного препарата, но при этом наблюдалось замедление их роста. Для дальнейшею выращивания этих культур микобактерий их адаптировали к постоянной концентрации антимикробного препарата, при которой не происходило замедление роста (1—3 пересева), и только после этого увеличивали дозу. Обязательным условием для 1 -трансформации и длительного культивирования L-вариантов являлось постоянное увеличение количества добавляемого в среду изониазида. При недостаточном количестве антимикробного препарата в среде в отдельных случаях происходила реверсия L-вариантов в бактериальную форму, а избыток изониазида приводил к задержке роста с последующей гибелью культуры.

Так, 3-й пересев изучаемых культур проводили на полужидкой питательной среде Дорожковой. содержащей 0,02, 0,04, 0,08 мг/мл изониазида Рост культуры вакцинного штамма BCG появлялся уже на 14 сут на питательной среде, содержащей 0,02 мг/мл изониазида. Полученные культуры на среде Дорожковой образовывали округлые, матовые, взвешенные в полужидкой среде колонии. Они хорошо эмульгировались в физиологическом растворе, по Граму и Цилю-Нильсену окрашивались в бледно-розовый цвет и были представлены клетками овоидно-кокковидной формы размером 0.9 -1,6 мкм.

На питательной среде, содержащей 0,04 мг/мл антимикробного препарата, рост культур проявлялся на 14—18 сут. В нативных мазках, наряду с коккоподобны-ми клетками, отмечались удлиненные палочки paJMepoM до 1.5-2,0 мкм и шаровидные клетки с различной плотностью цитоплазмы.

С повышением дозы добавляемого в питательную среду изониазида (0,08 мг/мл) рост культур становился скудным и появлялся в более поздние сроки куль-

тивирования на 17-23 сут. Изменялась и форма колоний: они становились округлыми, часто с неровными краями, плохо эмульгировались в физиологическом растворе и состояли из полиморфных клеток разной величины и формы. При пересевах такие колонии давали рост только на питательных средах с той же или меньшей концентрацией антимикробного препарата

Культуры М. avium шт. 9 и М. smegmatis на средах с концентрацией антимикробного препарата 0,08 мкг/мл не изменяли свои первоначальные свойства. Рост их в виде мелких, взвешенных колоний появлялся на 8-14 сут. На 4-5 пересеве, когда доза изониазида составляла 0,2, 0,4 мкг/мл, гетероморфизм изучаемых культур становился более выраженным. В мазках из культур преобладали шаровидные клетки размером 0,9-1,5 мкм различной оптической плотности, удлиненные палочки размером 1,5-2,0 мкм с четкими или расплывчатыми контурами и гранулярными включениями.

С каждым последующим пересевом на питательные среды с увеличивающейся дозой изониазида (0,4- 2 мкт'мл) в культурах преобладали шаровидные клетки разной оптической плотности с зернистыми включениями размером 4-7 мкм, гигантские эллипсоидные клетки шириной 1,0-2,5 и длиной 4,0-6,0 мкм, содержащие крупные гранулы.

Степень и характер изменений культур под влиянием антимикробного препарата во многом зависел от состава среды. В полужидкой среде Дорожковой при наличии нормальной лошадиной сыворотки и осмотических стабилизаторов длительное пассирование L-форм было затруднено. На такой среде культуры L-форм росли в виде единичных мелких колоний. С увеличением числа пересевов выращивать L-формы становилось все сложнее. Основная грудность заключалась в том, что диапазон концентрации изониазида, при которой культуры росли в виде L-форм. сокращался, при его низкой концентрации происходила реверсия большинства культур в бактериальную форму, а посевы на среды, содержащие изониазид в более высокой концентрации, приводили к гибели всей популяции, поэтому для L-трансформации приходилось очень тщательно подбирать дозу вносимого в среду изониазида.

Тем не менее нам удалось получить относительно стабильные L-формы М. bovis шг. 8 и шт. 14 после 8-10 пересевов на питательной среде Дорожковой с концентрацией антимикробного препарата 1-2 мкг/мл.

Полученные L-формы были представлены гигантскими вакуолизированными клетками или овоидными клетками с мелкой зернистостью. Культуры закрепили свои свойства, полученные в процессе L-трансформации, и при длительном культивировании на питательных средах без индуцирующего фактора сохраняли хорошую энергию роста и не реверсировали в бактериальную форму.

Таким образом, можно утверждать, что процесс изменчивости у микобакте-рий патогенных и атипичных видов под воздействием изониазида происходит однотипно, но для L-трансформации атипичных микобактерий требуется большая концентрация антимикробного препарата.

2.2.3.3. L-трансформация микобактсрий под действием изониазида в среде ПС-2 (ВНИИБТЖ)

При использовании среды ПС-1 для L-трансформации микобактерий в нее так же, как и в среду Школьниковой в модификации Дорожковой, был добавлен изо-ниазид в концентрации от 0,001 до 20 мкг/мл питательной среды. Этот вариант среды был назван ПС-2.

При посеве на полужидкую питательную среду ПС-2, даже предварительно не адаптированных культур микобактерий, не происходило их гибели, хотя отмечался несколько замедленный рост (20-23 сут). При 2-3-кратном пересеве происходила полная адаптация и L-трансформация культур.

Замегное отличие в L-трансформации микобактерий в среде ПС-2 от среды Школьниковой в модификации Дорожковой состояло в том. чю не требовалась первичная адаптация культур микобактерий к повышающимся дозам изониазида. Культуры М. bovis шт. 8. шт. 14 давали первичный рост при концентрации антимикробного препарата в среде от 0.1 до 2 мкг/мл среды. Рост культур отмечался на 5-6 сут после посева Для стабилизации полученных L-форм микобактерий проводили два персссва с этой же дозой изониазида. Культуры атипичных микобактерий М. avium шт. 9, М. smegmatis имели повышенную устойчивость к действию изониазида, поэтому для их L-трансформации мы использовали повышенное содержание антимикробного препарата в среде ПС-2 (10-20 мкг/мл).

2.2.4. Вирулентные и сенсибилизирующие свойства L-форм микобактерий

Показатели вирулентности изучали у L-форм микобактерий, полученных из музейных культур М. bovis шт. 8 и шт. 14.

В опыте использованы 18 морских свинок массой 300-350 гр. и 5 культур L-форм, полученных под воздействием 3%-ного щелочного раствора формальдегида и изониазида.

В качестве контроля использовали исходный музейный штамм М. bovis 8.

Установлено, что у морских свинок, которые были заражены культурами L-форм микобактерий (опытная), патологоанатомические изменения были менее выражены, чем у контрольных. Но при этом все же было отмечено что у части животных (40%) имелись единичные и даже множественные очаги некроза характерные для туберкулеза.

Сенсибилизирующие (аллергизирующие) свойства L-форм микобактерий, полученных при воздействии 3%-ного щелочного раствора формальдегида, изучали на тех же морских свинках, на которых изучалась их вирулентность. Аллергические исследования проводили с помощью ППД-туберкулина для млекопитающих 4-х кратно: перед заражением и через 30, 60, 90 дней после него. ППД-туберкулин вводили в кожу брюшной стенки в дозе 25 ME. Реакцию учитывали через 24-48 часов. Результат исследований представлены в табл 2.

Таблица 2 - Результаты аллергических исследований опытных и

контрольных свинок

I руппы морских свинок Кол-во живот- Процент реаг ируюших на ПГ1Д-туберкулин

ных 30 сут. 60 сут. 90 сут.

Опытные - заражены L-формами М. bovis шт. 8 и 14 15 13,3 46,6 80

Контрольные - заражены типичной культурой М. bovis шт.8 3 100,0 100,0 100,0

Аллергические исследования зараженных животных показали, что L-формы микобактерий способны вызывать сенсибилизацию организма к ППД-туберкулину. Из таблицы видно, что через 30 дней после заражения чувствительность к туберкулину отмечена у 2-х (13,3 %) морских свинок, через 60 дней - у 7-ми (46,6 %) животных, а к 90 дню — у 12-ти (80%) морских свинок.

По интенсивности реакции были различны: в пределах от 5 до 7 мм. Животные контрольной группы, зараженные типичной культурой штамма 8 М. bovis, реагировали во все сроки исследования. Реакции характеризовались ярко выраженным воспалительным отеком от 5 до 10 мм.

Таким образом, результаты исследований показали, что L-формы микобактерий обладают сенсибилизирующими свойствами и вызывают у животных аллергическое состояние. Важно отметить, что при бактериологическом исследовании патологическою материала от животных опытных групп выделены не только L-формы микобактерий, но и культуры М. bovis в типичной бактериальной форме. Это свидетельствует, с одной стороны, о возможности длительной персистенции L-форм в организме животных, а с другой, - о способности части их популяции к реверсии.

2.2.5. Динамика реверсии L-форм патогенных и атипичных микобактерий in vitro и in vivo

Нами изучена способность к реверсии L-кулыур, полученных экспериментально, а также выделенных от крупного рогатого скота и объектов внешней среды.

Для реверсии L-форм патогенных и атипичных микобактерий in vitro их пересевали на полужидкие питательные среды и твердую среду ФАСТ-ЗЛ. Пересевы проводили через 25-30 дней после появления первичною роста. В результате этих исследований было установлено, что в исходное бактериальное состояние реверсировало 81 культура (55,4%). Реверсия L-форм, выделенных из биоматериала крупного рогатого скота, происходила в основном при первых двух пересевах. У культур, полученных экспериментально под действием дезинфектантов, восстановление исходных свойств наблюдалось также при первом-втором пересеве, а у полученных под воздействием изониазида несколько позднее - на 5-6 пересеве.

Следует также отметить, что значительная часть культур (43,3%), выделенных от крупного рогатого скота, прекращала свой рост при первом-втором пересеве.

Реверсия жизнеспособных культур происходила как на полужидких, так и плотных питательных средах. На плотной питательной среде Гельберга рост куль-тур-ревертантов был, как правило, скудный, в виде единичных мелких колоний. Если в среду добавляли предельные углеводороды (тетрадекан, гексадекан) и нормальную сыворотку крупного рогатого скота (15-20%), то рост культур-ревертантов отмечался в виде множественных колоний округлой формы.

При реверсии на среде Дорожковой и ПС-1 рост происходил в верхней части среды в виде мелких колоний, напоминающих манную крупу.

При микроскопии культур-ревертантов в мазках, окрашенных по Цилю-Нильсену, отмечали зернистые палочки, полиморфные зерна, окрашенные в синий или бледно-розовый цвет. На плотных средах без добавления углеводорода некоторые культуры (20%) оказались нежизнеспособными и при дальнейших пересевах не давали роста.

При пассировании L-форм микобактерий через организм лабораторных животных, реверсия происходила как правило при первом - втором пассаже. Морских свинок заражали подкожно в область паха культурами L-форм в дозе 1 мл микробной взвеси. Животных убивали через 30 дней. При осмотре внутренних органов в печени обнаруживали небольшие очаги некроза, характерные для туберкулеза.

При посеве из внутренних органов и лимфатических узлов лабораторных животных выделяли культуры микобактерий в бактериальной форме. Микроскопически выявлены зернистые и обычные палочки, окрашенные по Цилю-Нильсену в красный цвет.

Следовательно, можно заключить, что реверсия L-форм микобактерий, полученных экспериментально и выделенных от животных, происходит почти в одни и те же сроки. При этом часть L-форм, полученных экспериментально, а также выделенных из организма крупного рогатою скота и объектов внешней среды, способна достигать полной реверсии, то есть полного восстановления морфологии, тинкто-риальных и других биологических свойств.

ВЫВОДЫ

1. L-трансформация микобактерий - широко распространенное в природе явление, происходящее как в организме животных, так и во внешней среде. Этому явлению подвержены патогенные и атипичные виды микобактерий. В объектах внешней среды длительно благополучных и оздоровленных от туберкулеза хозяйствах преобладают L-формы M.fortuitum, М. scrofulaceum, М. diernhoferi; в неблагополучных - М. bovis и М. diernhoferi.

2. L-трансформация патогенных и атипичных микобактерий, возникающая под действием химических веществ, имеет ту же последовательность образования и полиморфизм L-форм, что и при других факторах L-трансформации. Быстрее и ин-

тенсивнее этот процесс происходит под влиянием иэониазида, 3%-ного щелочного раствора формальдегида, медленнее - при воздействии 3%-ного едкого натра и хлорамина Б.

3. L-формы, образующиеся на полужидких питательных средах в первоначальной стадии L-трансформации под воздействием 3%-ного щелочного раствора формальдегида, морфологически представлены в основном округлыми кокковид-ными образованиями (сферопластами) размером 2-3 мкм. Их ультраструктура отличается от типичной бактериальной клетки тем, что у L-вариантов отсутствует ригидный слой клеточной стенки, имеется более развитая система внутрицитоплазма-тических мембран и более разнообразные способы репродукции.

4. L-культуры пато1 енных микобактерий, введенные в дозах 10 ЕД по оптическому стандарту мутности, способны длительно (более 3 месяцев) приживаться в организме животных и вызывать у 80% их носителей сенсибилизацию к ППД-туберкулину для млекопитающих. У морских свинок, зараженных L-культурой М. bovis шт. 8, наиболее выраженные реакции на этот аллерген возникают на 90 сутки после инфицирования.

5. L-формы микобактерий возникшие под воздействием дезинфектантов (3%-го щелочного раствора формальдегида, 3%-го едкого натра и др) и изониазида способны реверсировать в исходное бактериальное состояние как на питательных средах, предназначенных для культивирования L-форм (среда Школьниковой в модификации Дорожковой, ПС-1 и др.), так и в организме животных. Это явление может осуществляться и у патогенных, и у атипичных видов микобактерий.

6. Питательная среда ПС-1 (ВНИИБ'ГЖ), разработанная на основе солевого раствора Хенкса, обладает лучшими диагностическими качествами, чем среда Школьниковой в модификации Дорожковой, и можег быть использована как для ускоренной изоляции L-форм микобактерий. так и быстрого накопления их бакмас-сы.

7. Питательная среда ПС-2 (ВНИИБТЖ), содержащая L-т расформирующие и стабилизирующие компоненты (изоииазид, насыщенный минерально-солевой раствор). позволяет получать экспериментальные L-формы, а так же длительно более 10 мес. сохранять их основные культурально-морфологические свойства.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Методические рекомендации «Изоляция и идентификация L-форм микобактерий из биоматериала животных», утверждены подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины СО РАСХН, протокол № 5 от 21.06.2005 г.

2. Полученные научные данные рекомендуем использовать в учебном процессе, при чтении лекций по микробиологии и эпизоотологии на факультетах ветеринарной медицины.

список

опубликованных работ по теме диссертации

1. Патент РФ № 2242511 «Питательная среда для выделения и культивирования L-форм микобактерий туберкулеза» / Соавт.: В.Г. Ощепков. Л.А.Таллер: опубл. 20.12.2004.

2. Распространенность, видовой состав и биологические свойства L-форм микобактерий в объектах внешней среды / Соавт: В.Г. Ощепков, В.П. Дитковский, JI.B. Галатова // Актуальные проблемы бруцеллеза и туберкулеза животных: Сб. науч. тр. РАСХН СО ВНИИБТЖ. - Омск, 2001С. 119-131.

3. Влияние дезиифектантов на L-трансформацию патогенных и атипичных микобактерий // Матер. Всерос. науч. конф.: Сб. науч. тр. ВНИИБТЖ.- Омск, 2001. -С. 185-187.

4. Л-траисформация микобактерий под действием химических веществ и свойства культур рсвертантов / Соавт.: В.Г. Ощепков, Л.А.Таллер // Инфекционная патология животных: Сб. науч. тр. РАСХН СО ВНИИБТЖ. - Омск, 2001.- С. 207211.

5. Сравнительное изучение модификаций полужидкой среды Дорожковой для культивирования L-форм микобактерий / Соавт Л.А. Таллер // Инфекционная патология животных: Сб. науч. тр. РАСХН СО ВНИИБТЖ. - Омск, 200L- С. 224-226.

6. Способы предпосевной обработки биоматериала для изоляции L-форм микобактерий,' Соавт.: Л А. Таллер, В.Г. Ощепков. Г.М. Дюсенова // Матер. Между-нар. науч. конф. посвященной 175-летию аграрной пауки Сибири: Сб. науч. тр. ВНИИБТЖ.- Омск, 2003. - С. 29-31.

7. Изучение сенсибилизирующих свойств L-форм микобактерий на лабораторных животных ' Соавт. Л А. Таллер 11 Матер Междунар. науч. конф. посвященной 175-летию аграрной науки Сибири: Сб. науч. тр. ВНИИБТЖ.- Омск, 2003. - С. 151-153.

8. Использование питательной среды Г1С-1 для выделения измененных форм микобактерий ' Соавт. Л.А. Таллер Н Матер Междунар. науч. конф. посвященной 35-летию СО РАСХН- Сб науч тр СО РАСХН. ВНИИБТЖ,- Омск, 2004. С. 6770

9. Индикация L-форм микобактерий из биоматериала животных как дополнительный метод лабораторной диагностики туберкулеза / Соавт. Л А Таллер // Актуальные проблемы ветеринарной медицины: Матер. 4-й мсжрег. науч.-практ. конф., посвященной 100-летию И.В. Окунпова: Сб. науч. тр. СО РАСХН. ВНИИБТЖ. - Омск, 2005,-С. 214-216.

СЕКИН Евгений Юрьевич

Ь-ТРАНСФОРМАЦИЯ МИКОБАКТЕРИЙ, СВОЙСТВА И СПОСОБЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ Ь-ФОРМ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Подписано к печати 06.04.2006. Формат бумаги 60x84 1/16. Печать оперативная. Гарнитура Times New Roman Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз.

ГНУ ВНИИБТЖ СО РАСХН

Отпечатано с оригинал-макета в типографии ООО «Вариант-Омск» 644043, г. Омск, ул. Коммунистическая, 45. Тел./факс: 251-434

¿ooeft

9507

Актуальность проблемы. Диагностика является одним из основных звеньев как профилактических, так и оздоровительных мероприятий при туберкулезе животных, в том числе крупного рогатого скота. Арсенал средств и методов диагностики туберкулеза достаточно богат и разнообразен.

Основными методами первичной диагностики туберкулеза животных в настоящее время являются аллергический, патологоанатомический и бактериологический, результаты, которых предопределяют окончательный эпизоотический статус исследуемого поголовья животных, а также в целом фермы или хозяйства (А.С. Донченко с соавт., 1994, 2004; К.В. Шумилов, Н.П. Овдиенко, А.Х. Найманов и др. 2002; В.И. Околелов, 2000, 2002; JT.A. Таллер, 1995, 2001 и др.). Заболевание туберкулезом считается установленным, если подтверждается данными патологоанатомической экспертизы, а при отсутствии характерных для туберкулеза видимых изменений - положительными результатами бактериологического исследования. Бактериологическое исследование, в свою очередь, осуществляется бактериоскопическим, культуральным и биологическим методами.

Вместе с тем, выделение микобактерий туберкулеза из патологического материала связано с определенными трудностями в силу генетических и фенотипических особенностей возбудителя. Основные из них — медленный рост на искусственных питательных средах и способность к L-трансформации и длительной персистенции возбудителя в измененной (L-) форме. L-трансформация микобактерий может происходить под воздействием самых различных факторов внешней среды, применяемых химиопрепаратов, защитных реакций организма (З.Н. Кочемасова, М.Н. Дыхно с соавт., 1980; B.C. Федосеев с соавт., 1975, 1981; В.Г. Ощепков с соавт., 2001, 2003 и др.). При этом микробная клетка частично или полностью утрачивает свою клеточную стенку. Изменение морфологии микобактерий и понижение метаболизма предполагают и особые требования к условиям культивирования их L-форм, так как они либо вообще не растут на обычных питательных средах, применяемых при лабораторной диагностике туберкулёза, либо растут лишь отдельные культуры. Необходимы щадящие методы обработки биоматериала и элективные питательные среды, в которых обязательно присутствуют нативные белки и вещества, стабилизирующие осмотические свойства среды (B.C. Федосеев, 1975; JI.B. Галатова, 1993; Ю.А. Макаров, 1997 и др.). В настоящее время в ветеринарной и медицинской практике для выделения L-форм микобактерий из исследуемого материала используют полужидкую питательную среду Школьниковой в модификации Дорожковой (И.Р. Дорожкова с соавт. 1974, Ю.А. Макаров, 1997; Наставление по диагностике туберкулеза животных, 2002, 2004). Однако эта среда обладает сравнительно низкой информативностью (JI.A. Таллер, 2001), то есть позволяет изолировать из биоматериала и объектов внешней среды патогенные микобактерии лишь в малом количестве. Более того, эта среда не пригодна для экспериментального получения и длительного культивирования L-форм, требуемых для проведения научных опытов. Не решают этих проблем и другие известные нам питательные среды, предложенные для изоляции L-форм патогенных микобактерий: Н.П. Овдиенко, Е.А. Асташова, B.C. Суворов, 1995; Г.Г. Мордовской и Е.А. Птицина, 1982 и др.

Актуальность усовершенствования существующих питательных сред для изоляции, экспериментального получения и длительного культивирования L-форм патогенных микобактерий, а также отсутствие необходимых научных сведений о распространенности явления L-трансформации у патогенных и атипичных микобактерий, обнаруживаемых во внешней среде, и предопределили направленность нашей работы.

Цель исследований. Изучить распространенность L-форм микобактерий во внешней среде, а также динамику их образования и свойства при культивировании на разных питательных средах.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

• изучить распространенность L-форм микобактерий в различных объектах внешней среды и их видовой состав;

• определить динамику образования L-форм патогенных и атипичных микобактерий под воздействием химических препаратов;

• разработать новые питательные среды и способы для ускоренной изоляции, экспериментального получения и длительного культивирования Lф форм микобактерий и провести их сравнительную оценку;

• изучить сенсибилизирующие, реверсибельные и вирулентные свойства L-форм патогенных и некоторых видов атипичных микобактерий.

Научная новизна.

Полученные данные расширяют представление об условиях и видовом составе микобактерий, способных к L-трансформации; о способах

И существования и биологических свойствах патогенных и атипичных микобактерий и должны учитываться при разработке общей теории инфекционного и эпизоотического процессов туберкулеза животных.

Найден более надежный способ предпосевной обработки биоматериала при изоляции L-форм патогенных и атипичных микобактерий.

Получены патент «Питательная среда для выделения и культивирования L-форм микобактерий туберкулеза» патент РФ № 2242511 от 20.12.2004 г. и решение ФИПС о выдаче патента «Способ реверсии L-форм микобактерий» № 2004113930/13(023123) от 02.11.2005 г. щ

Дана сравнительная оценка питательных сред И.Р. Дорожковой и

• ВНИИБТЖ. щ Практическая значимость и внедрение результатов исследований.

Разработанная питательная среда ПС-1 и способ предпосевной обработки # исследуемого биоматериала позволяют сократить сроки появления первичного роста L-форм микобактерий, что ускоряет проведение комплекса бактериологической диагностики туберкулеза в 1,5-2 раза. Результаты исследований использованы при составлении методических рекомендаций по изоляции и идентификации L-форм микобактерий из биоматериала животных (2005 г.), а также при подготовке ветеринарных специалистов в ИВМ ОмГАУ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на ученых советах ВНИИБТЖ (г. Омск, 1999 - 2005 гг.), координационных ® совещаниях, проходивших в НИИЭВ (г. Москва, 2003-2005 гг.), на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов института ветеринарной медицины ОмГАУ (2000, 2001 гг.), на конференции молодых ученых ВНИИБТЖ (г. Омск, 2000 г.), на «Всероссийской научной конференции по проблемам хронических инфекций», ВНИИБТЖ (г. Омск, 2001 г.), Международной научно-практической конференции «Современные <6 проблемы диагностики и профилактики туберкулеза животных» (г. Москва,

2003 г.). Основные положения диссертации, выводы и практические предложения доложены, обсуждены и рекомендованы к защите на межлабораторном заседании сотрудников ВНИИБТЖ (2005 г.).

Основные положения, выносимые на защиту;

1. Видовой состав и распространенность L-форм микобактерий во внешней среде.

2. Динамика образования L-форм патогенных и атипичных }[*> микобактерий под действием химических веществ.

3. Разработка и перспективность применения питательных сред ПС-1 и ПС-2 для изоляции и изучения биологических свойств L-форм патогенных и атипичных микобактерий.

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 8 научных статей и описание патента РФ на питательную среду ПС-1 (ВНИИБТЖ).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 127 страницах компьютерного набора и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, списка использованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 12 таблицами и 17 рисунками. Список литературы включает 184 источника, в том числе 47 иностранных авторов

4. ВЫВОДЫ

1. L-трансформация микобактерий - широко распространенное в природе явление, происходящее как в организме животных, так и во внешней среде. Этому явлению подвержены патогенные и атипичные виды микобактерий. В объектах внешней среды длительно благополучных и оздоровленных от туберкулеза хозяйствах преобладают L-формы M.fortuitum, М. scrofulaceum, М. diernhoferi; в неблагополучных - М. bovis и М. diernhoferi.

2. L-трансформация патогенных и атипичных микобактерий, возникающая под действием химических веществ, имеет ту же последовательность образования и полиморфизм L-форм, что и при других факторах L-трансформации. Быстрее и интенсивнее этот процесс происходит под влиянием изониазида, 3%-ного щелочного раствора формальдегида, медленнее - при воздействии 3%-ного едкого натра и хлорамина Б.

3. L-формы, образующиеся на полужидких питательных средах в первоначальной стадии L-трансформации под воздействием 3%-ного щелочного раствора формальдегида, морфологически представлены в основном округлыми кокковидными образованиями (сферопластами) размером 2-3 мкм. Их ультраструктура отличается от типичной бактериальной клетки тем, что у L-вариантов отсутствует ригидный слой клеточной стенки, имеется более развитая система внутрицитоплазматических мембран и более разнообразные способы репродукции.

4. L-культуры патогенных микобактерий, введенные в дозах 10 ЕД по оптическому стандарту мутности, способны длительно (более 3 месяцев) приживаться в организме животных и вызывать у 80% их носителей сенсибилизацию к ППД-туберкулину для млекопитающих. У морских свинок, зараженных L-культурой М. bovis шт. 8, наиболее выраженные реакции на этот аллерген возникают на 90 сутки после инфицирования.

5. L-формы микобактерий возникшие под воздействием дезинфектантов

3%-го щелочного раствора формальдегида, 3%-го едкого натра и др.) и изониазида способны реверсировать в исходное бактериальное состояние как на питательных средах, предназначенных для культивирования L-форм (среда Школьниковой в модификации Дорожковой, ПС-1 и др.), так и в организме животных. Это явление может осуществляться и у патогенных, и у атипичных видов микобактерий.

6. Питательная среда ПС-1 (ВНИИБТЖ), разработанная на основе солевого раствора Хенкса, обладает лучшими диагностическими качествами, чем среда Школьниковой в модификации Дорожковой, и может быть использована как для ускоренной изоляции L-форм микобактерий, так и быстрого накопления их бакмассы.

7. Питательная среда ПС-2 (ВНИИБТЖ), содержащая L-трансформирующие и стабилизирующие компоненты (изониазид, насыщенный минерально-солевой раствор), позволяет получать экспериментальные L-формы, а так же длительно - более 10 мес. сохранять их основные культурально-морфологические свойства.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Методические рекомендации «Изоляция и идентификация L-форм микобактерий из биоматериала животных», утверждены подсекцией «Инфекционная патология животных в регионе Сибири и Дальнего Востока» отделения ветеринарной медицины СО РАСХН, протокол № 5 от 21.06.2005 г.

2. Полученные научные данные рекомендуем использовать в учебном процессе, при чтении лекций по микробиологии и эпизоотологии на факультетах ветеринарной медицины.