Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Выживание популяций Mycobacterium avium и Mycobacterium B-5 в объектах окружающей среды

На правах рукописи

АРХИПОВА НАДЕЖДА ДМИТРИЕВНА

ВЫЖИВАНИЕ ПОПУЛЯЦИЙ MYCOBACTERIUM AVIUM И MYCOBACTERIUM В-5 В ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

16.00.06 — ветеринарная санитария, экология, зоогигиена и ветеринарно-санитарная экспертиза

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА - 2003

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ВНИИВСГЭ)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Павлова Инна Борисовна (ВНИИВСГЭ)

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор,

заслуженный деятель науки РСФСР, Закомырдин Александр Андреевич (ВНИИВСГЭ)

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и кормов - Центр качества ветеринарных препаратов и кормов (ФГУ ВГНКИ)

диссертационного совета Д.006.008.01 при ВНИИВСГЭ по адресу: 123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВСГЭ.

кандидат биологических наук Ботвинко Ирина Васильевна (МГУ им. М.В.Ломоносова)

Защита состоится «_»

2003 г. в

час на заседании

Автореферат разослан «_»

2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Е.С.Майстренко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время все возрастает число неблагоприятных экологических факторов, способствующих развитию патогенных и потенциально патогенных микроорганизмов. В этой связи одним из важных вопросов является исследование способности патогенных бактерий длительно выживать в условиях окружающей среды и адаптироваться к ним.

Одним из факторов, способствующих распространению возбудителя туберкулеза, является его циркуляция в среде обитания. По данным ряда исследователей (M.Dailloux, 1999; Coven Jerry С.Rodegers, 1999) патогенные и атипичные микобактерии (М.avium, M.fortuitum, M.kansassi и др.) обитают чаще всего в воде и почве. Изучение экологии микобактерий в окружающей среде позволит получить объективную информацию об их распространении, выживаемости, строении в популяции и изменчивости в процессе роста.

Широкое распространение возбудителей туберкулеза среди животных и человека ставит перед специалистами задачу по изысканию эффективных препаратов для дезинфекции животноводческих помещений и других объектов окружающей среды. Исследование популяций бактерий при их естественном развитии и при воздействии биотических и абиотических факторов - это один из малоизученных разделов экологии бактерий.

Цель работы. Изучить морфологические особенности и факторы выживания Mycobacterium avium и Mycobacterium В-5 в объектах окружающей среды на популяционном уровне с использованием световой и сканирующей электронной микроскопии.

Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи.

1. Разработать методические подходы к исследованию морфологии популяций M.avium и М.В-5.

2. Изучить морфологию клеток M.avium и М.В-5 в популяции в условиях их естественного роста.

3. Изучить морфологию клеток микобактерий в популяции и факторы их выживания на объектах окружающей среды (частицы комбикорма, зерна сои, скорлупа яиц, кожа кур, вода, жидкий навоз).

4. Изучить механизм действия некоторых дезинфицирующих средств на популяции M.avium и В-5.

5. Изучить антагонистическое воздействие B.subtilis, штамм «ТНП-5» на популяции микобактерий.

Научная новизна. На основании экспериментальных исследований с использованием методов световой микроскопии изучено формирование микроколоний в монослойной культуре. С использованием сканирующей электронной микроскопии изучена морфология Mycobacterium avium и Mycobacterium В-5 в популяции на объектах окружающей среды (частицы комбикорма, зерна сои, скорлупа яиц, кожа кур, вода, жидкий навоз).

Установлено, что M.avium при наличии трех основных факторов -питательный субстрат, температура 22-26°С и влажность 50-60% - способны адгезироваться к поверхности тест-объекта с последующей колонизацией и образованием покровов на поверхности колоний.

Изучена морфология и факторы выживания популяции Mycobacterium avium в воде и жидком навозе. Показано, что в жидкой среде патогенные микобактерии формируют гидрофобные микроколонии, закрытые покровами. Питательный субстрат и длительность пребывания микобактерий в жидкой среде определяют характер формирования покрова и способность клеток к адаптации в виде перехода в гетероморфизм с проявлением L-трансформации.

С использованием новой методики по определению бактерицидного действия химических дезинфицирующих средств на популяции микробных клеток и методов сканирующей электронной микроскопии изучен механизм действия композиционного состава «йодез+катапол» на клетки M.avium и М.В-5. Установлено, что устойчивость М.В-5 аналогична таковой Mycobacterium avium.

Изучен механизм действия микроба-антагониста B.subtilis, штамм «ТНП-5» на популяции клеток М.В-5.

Практическая значимость работы. В работе применяли новые методические подходы и методики для исследования микобактерий М.avium и М.В-5 на популяционном уровне с применением методов световой и сканирующей электронной микроскопии.

Разработан композиционный состав на основе йодеза и катапола, оказывающий бактерицидное действие на микобактерии. Положительный эффект новой композиции подтвержден актом комиссионной проверки в соответствии с приказом по ВНИИВСГЭ за №40 от 30.10.02 г. и утвержден 2.11.2002 г. Материалы исследований включены в «Методические рекомендации по ускоренному методу определения бактерицидной активности химических дезинфицирующих средств на популяции микробных клеток» ( п.2.4; 2.6; 2.7 ). • В эксперименте показан положительный эффект действия БАВ

микроба-антагониста B.subtilis, штамм «ТНП-5» на Mycobacterium В-5 и > Mycobacterium avium.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на:

- Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях (Воронеж, 23-25 сентября, 2002);

- Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях (Воронеж, 23-25 сентября, 2002);

- Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение сельского хозяйства горных территорий». (Горно-Алтайский НИИ сельского хозяйства СО РАСХН, 17 июня 2002 г).

Публикации. Результаты исследований отражены в 5 научных работах.

Структура н объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений.

Диссертация изложена на 119 страницах машинописного текста, содержит схему, 2 таблицы, 19 фотографий и 26 сканограмм. Список литературы включает 173 работы отечественных и зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы н методы исследования. Экспериментальная работа по теме диссертации проводилась в 2001-2003 г.г. в лаборатории санитарной микробиологии ВНИИВСГЭ.

В опытах использовали паспортизированные штаммы микобактерий - Mycobacterium avium, штамм № 61-97, получен из музея культур ВГНКИ ветпрепаратов, патогенен для кроликов и кур; Mycobacterium В-5 из музея культур ВНИИВСГЭ, не патогенен для лабораторных животных, устойчив к нагреванию при 60"С в течение 60 минут. Для изучения антагонистической активности использован Bacillus subtilis штамм «ТНП-5», выделенный из мерзлотных почв Якутии (Н.П.Тарабукина, 2000).

Тест-культуры микобактерий В-5 культивировали на мясонептонном агаре и на среде Левенштейна-Йенсена. Тест-культуры Mycobacterium avium культивировали на среде Левенштейна-Йенсена. Среду готовили по общепринятой методике. Периодичность пересевов на питательных средах один раз в 2-3 месяца.

Культуры микобактерий М. В-5 культивировали 2-3 суток, М. avium -7-8 суток при 37°С. Все использованные в работе культуры бактерий обладали типичными культурально-биохимическими свойствами.

Изучение антагонистической активности Bacillus subtil! is, штамм «ТНП-5» проводили на тест-культуре микобактерий сапрофитного штамма В-5. В опытах использовали вегетативные клетки В.subtilis. Для получения

вегетативных клеток культуру высевали в МПБ или МПА и инкубировали при температуре 37°С в течении 24 часов.

Световая микроскопия. Для изучения развития микобактерий в монослойной культуре использовали стерильный целлофан, предварительно нарезанный по размеру предметного стекла. Подготовленные кусочки целлофана укладывали на поверхность плотной питательной среды МПА, не допуская сморщивания и образования пузырьков воздуха под ним. Посев культуры микобактерий на поверхность целлофана проводили с помощью препаровальной иглы методом укола в трех точках. Посевы культивировали при температуре 37°С. Через 24, 48 и 72 часа участок целлофана с выросшей культурой снимали с поверхности питательной среды и помещали в чашки Петри. Фиксацию и одновременно окраску клеток осуществляли парами 1%-й осмиевой кислоты (ОбО^ в течении 1-2 минут при комнатной температуре. По истечении времени фиксации кусочки целлофана с выросшими клетками » микобактерий укладывали на предметные стекла, накрывали покровными

стеклами и изучали в световом микроскопе. , Для изучения роста единичных клеток и формирования

микроколоний на стерильное нагретое предметное стекло наносили 0,2-0,3 мл теплого агара и равномерно распределяли по всей поверхности стекла. После застывания среды на нее методом укола наносили минимальное количество клеток микобактерий. Стекло помещали в чашку Петри на влажную фильтровальную бумагу для создания влажной камеры и ставили в термостат. После подращивания проводили фиксацию и одновременно окраску клеток парами 1%-й осмиевой кислоты.

Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ). Мембранные фильтры с выросшими на них колониями микобактерий снимали с питательной среды и фиксировали парами 25%-го глутарового альдегида, затем обезвоживали в парах пропиленоксида или ацетона. Образцы препаратов напыляли платиной в течение 20 минут на установке «НИасЫ-Е-102» и просматривали на электронном микроскопе со сканирующей

приставкой «Hitachi-8010» (Япония) при ускоряющем напряжении 75 кВ и инструментальном увеличении 1-10 тыс.

Адгезию и колонизацию клеток микобактерий на объектах окружающей среды изучали с использованием сканирующего электронного микроскопа. Для этого тест-объекты (частицы комбикорма, зерна сои) автоклавировали, скорлупу яиц, кусочки кожи кур тщательно промывали теплой кипяченой водой. Обработанные тест объекты помещали на предметные стекла в чашки Петри на увлажненный стерильный бумажный фильтр, предназначенный для создания влажной камеры. Отдельные колонии микобактерий, снятые с плотной питательной среды, помещали в физиологический раствор и суспензировали на электровстряхивателе до получения гомогенной взвеси, концентрация клеток составляла 1 млрд/мл по оптическому стандарту мутности. Полученной взвесью орошали тест объекты и выдерживали их при температуре +22-+26°С в течение 3-4 суток. Контролем к опытам служили тест-объекты, не контаминированные микобактериями. Для исследования в J

СЭМ фиксацию осуществляли в растворе 4%-ного глутарового альдегида на фосфатном буфере (рН 7,0) и обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации (50°, 70°, 96° и 100").

Для экспериментального исследования морфологии и выживания клеток М.avium в жидком навозе и воде в стерильную колбу объемом 100 мл вносили 50 мл стерильной воды и 20 г нативного навоза. В контроле в колбу вносили 50 мл стерильной воды. Концентрация клеток M.avium составляла 109 кл/мл. Температурный режим хранения тест-культур составлял +22-+26"С, срок наблюдения 12 месяцев. Отбор проб проводили каждые 3 месяца. Пробы жидкого навоза фильтровали через стерильный бумажный фильтр и дозаторной пипеткой наносили в количестве 0,5 мкл в центр мембранных фильтров «Владипор» №2, помещенных на поверхность среды Левенштейна-Йенсена. Чашки термостатировали при 37°С. Через 48-72 часа учитывали рост культуры на поверхности фильтров. Для идентификации M.avium мазки из выросшей культуры окрашивали по Цилю-Нильсену. Для изучения

морфологии клеток в популяции готовили препараты для световой и сканирующей электронной микроскопии по описанным методикам.

Изучение воздействия химических дезинфицирующих средств на популяции клеток микобактерий. В опытах использовали 2-3 суточные культуры М.В-5 и 5-7 суточные культуры М.avium, выращенные на среде Левенштейна-Иенсена. Для исследования культуры микобактерий суспензировали в физиологическом растворе на электровстряхивателе до получения концентрации 1 млрд/мл по оптическому стандарту муиюсгп. Затем к 4,5 мл взвеси микобактерий добавляли испытуемый препарат в количестве 0,5 мл. По истечении времени воздействия препаратов на клетки микобактерий готовили десятикратные разведения бактериальной взвеси на физиологическом растворе. В чашки Петри на слой питательной среды раскладывали мембранные фильтры «Владипор» №2 и дозаторной пипеткой наносили по 0,5 мкл взвеси клеток, обработанных дезинфицирующим препаратом, из различных концентраций (109, 10®, 107, 106), таким образом, чтобы капли находились в центре фильтра и не растекались за его пределы. Капли подсушивали и помещали чашки Петри в термостат крышкой вниз и термостатировали при 37°С. Опыт сопровождался контрольными высевами взвеси тест-культуры на физиологическом растворе. Для получения достоверного результата действия препарата на культуру микобактерий чашки Петри оставляли в термостате на 10 суток. Результаты опыта учитывали по наличию видимого роста культуры микобактерий на фильтрах в разных разведениях в сравнении с контролем. После учета результатов опыта мембранные фильтры снимали с поверхности питательной среды и готовили препараты для СЭМ.

В качестве дезинфицирующих средств в опытах использовали препарат йодез, на который имеется наставление по применению, утвержденное Департаментом ветеринарии в 1999г. (№ 13-7-1729) и кагапол, утвержденный Минзравом РФ (регистрационный номер 91/146/7).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изучение морфологии клеток микобактерий в популяиии с использованием методов световой и сканирующей электронной микроскопии. В проведенных исследованиях изучали рост и развитие отдельных микроколоний в монослойной культуре методом укола на поверхность целлофана, помещенного на плотную питательную среду, а так же методом укола в тонкий слой агара (МПА), нанесенного на стерильное предметное стекло.

Оптимальные результаты были получены при посеве уколом клеток микобактерий В-5 на тонкий прозрачный слой МПА. Результаты исследования показали, что данный метод позволяет изучать формирование микроколоний из единичных клеток в монослойной культуре.

Для сохранения естественной архитектоники клеток проводили фиксацию и окраску парами 1%-й осмиевой кислоты. Через 2-3 минуты клетки окрашивались в светло- или темно-коричневый цвет и были отчетливо видны. Через 18-24 часа был виден рост клеток, объединенных межклеточным матриксом, упорядочено уложенных в микроколонии округлой формы. На более поздних стадиях развития (через 48-72 часа) клетки имели вид длинных ветвящихся нитей. На отдельных участках было видно формирование межклеточного матрикса, продуцируемого в процессе роста клетками микобактерий (рис. 1, 2).

Для исследования популяций микобактерий в СЭМ посев культуры проводили каплей на мембранный фильтр, помещенный на поверхность среды Левенштейна-Йенсена. Нами было отмечено, что культура М.В-5 отличалась от роста M.avium. Так, культура сапрофитного штамма М.В-5 через 18-24 часа разрасталась по всей поверхности мембранного фильтра в виде сливного слоя с волнистыми краями, с поверхности закрытого общей блестящей бугристой пленкой желтоватого цвета. Культура M.avium на мембранных фильтрах имела округлую форму с четко очерченными ровными краями, с поверхности закрыта плотной бугристой пленкой желтого цвета.

Отдельные колонии не просматривались. Исследование фрагментов популяций микобактерий в СЭМ показало, что клетки не выявлялись, так как с поверхности были закрыты плотным, слоистым покровом.

Предложенный метод исследования микобактерий в монослойной культуре и окраска клеток осмиевой кислотой дает возможность прижизненно изучать морфологию клеток в процессе формирования микроколоний, сохраняя при этом естественную архитектонику клеток, что нельзя добиться при окраске по Цилю-Нильсену, которая из-за жесткой обработки способствует удалению липидов, разрушает межклеточный матрикс и структуру клеточной стенки микобактерий. Исследование роста культуры микобактерий на мембранных фильтрах дает возможность выявить особенности роста клеток в популяции. Кроме того, было отмечено, что на мембранных фильтрах культуры бактерий растут в 2 раза быстрее.

Рис. 1, 2. Формирование микроколоний М. В-5 в монослойной культуре. Видно начало образования межклеточного матрикса (окраска парами 1%-й осмиевой кислоты). Световая микроскопия, х 200,400 (ориг.)

Изучение проиессов адгезии и колонизации клеток микобактерий на объектах окружающей среды в сканирующем электронном микроскопе. Целыо настоящих исследований было изучение способности популяций микобактерий к выживанию и развитию на объектах окружающей среды, таких как частицы комбикорма, зерна сои, скорлупа куриных яиц, кожа кур.

Исследование опытных препаратов в СЭМ выявило на тест-объектах адгезию единичных клеток М.аушт, некоторые из которых находились в стадии деления (рис. 3). Процесс колонизации микобактериями тест-объектов характеризовался формированием межклеточного матрикса и покровов на поверхности клеток (рис. 4).

Проведенные исследования показали, что наличие трех основных факторов - питательного субстрата, влажности объекта (50-60%) и температуры окружающей среды (22-26°С) - обеспечивает клеткам микобактерий возможность адгезироваться к поверхностям биологических объектов с последующей их колонизацией и, следовательно, интенсивным размножением, что может привести к количественному накоплению клеток в среде обитания.

Изучение морфологии и факторов выживания М. avium в воде и жидком навозе. Исследование популяций M.avium, извлеченных из проб воды в различные сроки наблюдения (3,10,12 месяцев), показало, что при высеве на среду Левенштейна-Йенсена наблюдался рост культуры, с

Рис.3. Адгезия M.avium к наружной поверхности скорлупы яйца. СЭМ, х 4000.

Рис.4. Колонизация М.аушт частиц комбикорма. Видны клетки микобактерий, объединенные межклеточным матриксом.

СЭМ, х 4000.

поверхности закрытой общей плотной пленкой желтоватого цвета. Для идентификации клеток микобактерий культуру окрашивали по Цилю-Нильсену. Выявлены характерные клетки M.avium палочковидной формы.

Исследование морфологии клеток M.avium в популяции с использованием сканирующей электронной микроскопии показало, что через 3 месяца в пробах воды обнаруживаются микроколонии, с поверхности закрытые гладкими, тонкими покровами. В участках нарушения целостности покровов были видны клетки, объединенные межклеточным матриксом.

При высеве на среду Левенштейна-Йенсена культуры M.avium, хранившейся в воде в течение 10-12 месяцев был выявлен ее росг. Идентификация клеток в световом микроскопе после окраски их по Цилю-Нильсену показала характерную морфологию клеток M.avium. При исследовании в СЭМ образцов препаратов из проб воды выявлены измененные клетки на стадии L-трансформации. Изменение формы клеток свидетельствовало о нарушении целостности клеточной стенки микобактерий, что приводило к появлению шаровидных клеток протопластного типа и мелких L-форм.

При высеве проб фильтрата жидкого навоза на среду Левенштейна-Йенсена после 3-месячного хранения был выявлен сливной рост культуры, с поверхности закрытой общим слоистым покровом желтовато-коричневого цвета. Для идентификации микобактерий мазки из фильтратов жидкого навоза окрашивали по Цилю-Нильсену. Было показано, что в фильтратах наряду с типичными микобактериями присутствовала кокковая микрофлора. Исследование мазков из проб жидкого навоза, окрашенных парами осмиевой кислоты, показало, что клетки находились в ассоциации, объединенные межклеточным матриксом. Через 3 месяца в образцах из проб жидкого навоза в СЭМ выявлены микроколонии, в которых клетки закрыты с поверхности плотным покровом. При исследовании популяции M.avium в пробах жидкого навоза через 10-12 месяцев выявили наличие на поверхности микроколоний истонченных покровов, через которые просматривались

очертания клеток неправильной формы, что свидетельствует о переходе их в гетероморфизм.

Полученные данные свидетельствуют о том, что характер формирования покровов и способность клеток к адаптации в виде перехода в гетероморфизм с проявлением Ь-трансформации определяют питательный субсфат и длительность пребывания патогенных микобактерий в жидкой

среде.

Изучение действия дгшетилсульфоксид'а на популяиии клеток микобактерий. Целью настоящих исследований было изучение действия на популяции микобактерий препарата диметилсульфоксид (ДМСО), широко применяемого в медицинской практике под названием «Димексид».

В качестве тест-культуры в опытах использовали сапрофитный цпамм М.В-5. На монослойную культуру микобактерий наносили 1-2 капли 0,1-1%-го раствора ДМСО и проводили микроскопирование и фотосъемку препаратов.

Для детального исследования морфологии клеток микобактерий В-5 после воздействия на них ДМСО использовали мембранные фильтры «Владипор», помещенные на поверхность МПА в чашки Петри, на которые наносили каплю бактериальной взвеси из различных разведений в количестве 500 мкл. Концентрация клеток микобактерий в экспериментах составила 108 кл/мл. После инкубации при 37°С в течение 2-3 суток наблюдали рост изолированных колоний микобактерий в пределах диаметра фильтра при концентрации клеток 103, 104. Фильтры с выросшими колониями снимали с поверхности питательной среды и помещали в стерильные чашки Петри. На поверхность колоний наносили 50 мкл 0,1-1%-го раствора ДМСО. Экспозиция составляла 20-30 минут при температуре +20°С. По истечении указанного времени колонии микобактерий в контроле и обработанные ДМСО фиксировали парами 25%-го глутарового альдегида и готовили препараты для СЭМ.

В контрольных препаратах монослойной культуры Mycobacterium В-5 на поверхности палочковидных ветвящихся клеток выявляли массивный покров, через который были едва заметны очертания клеток. После воздействия ДМСО отмечали растворение покрова. В очагах разрушения целостности покрова хорошо дифференцировались длинные ветвящиеся клетки.

Исследование препаратов в СЭМ позволило более детально изучить механизм действия ДМСО на поверхностные структуры клеток микобактерий.

Установлено, что в контрольных препаратах клетки микобактерий с поверхности закрыты толстым слоистым покровом (рис.5). После обработки колоний ДМСО произошло растворение наружных покровов и изменение

Рис.5. Фрагмент популяции М.В-5 Рис.6. Воздействие ДМСО на

Сконтооль). СЭМ. х10000. популяцию М.В5. СЭМ. х 10000.

морфологии клеток. При детальном анализе выявлены уплощенные деформированные клетки, лишенные покровов, а также очаги Ь-трансформации в виде округлых клеток протопластного типа и мелких клеток (0,5-0,7 мкм) - Ь-форм (рис.6).

Данные, полученные в наших экспериментах, свидетельствуют о том, что диметилсульфоксид (ДМСО) растворяет липиды, составляющие основу покровов и клеточной стенки микобактерий, что вызывает нарушение

ее целостности и последующую Ь-трансформацию клеток с образованием Ь-форм. Популяции гетероморфных клеток микобактерий, включая Ь-формы, не способны к процессам адгезии и, следовательно, колонизации как одному из факторов накопления количества бактерий.

Полученные данные позволяют предположить, что ДМСО можно использовать в композиционных препаратах для лечения, а также для дезинфекции ветеринарно-санитарных объектов, неблагополучных по туберкулезной инфекции.

Изучение дезинфекционной активности йодеза и его композиции в отношении микобактерий. В качестве дезинфицирующих средств в отношении микобактерий были испытаны препарат йодез и его композиция с катаполом. В состав йодеза входит кристаллический йод и сополимер. Йодез обладает широким спектром действия в отношении возбудителей инфекционных болезней бактериальной, вирусной и грибковой этиологии. В состав катапола входит катионоактивное ПАВ (катамин АВ).

Для исследования бактерицидной активности были использованы 13%-е растворы йодеза. Так же были испытаны 0,5-2%-е концентрации композиционного состава йодез с катаполом из расчета 0,02 % (по ДВ). Все приготовленные препараты в указанных концентрациях были прозрачными, однородными и не имели осадка.

В опыте с йодезом установлено, что 3%-й раствор этого препарата оказывал бактерицидное действие на М.аушт и М.В-5 во всех разведениях. Видимого роста культур на мембранных фильтрах выявлено не было. В более низких концентрациях йодез не оказывал бактерицидного действия на микобактерии. Для снижения концентрации йодеза нами был подобран композиционный состав препарата, в который входил йодез в концентрациях 1, 1,5 и 2% и катапол из расчета 0,02% (по ДВ). В экспериментах показано, что композиционный состав, содержащий 1% йодеза и 0,02% катапола (по ДВ) был в 3 раза эффективнее 3%-го раствора йодеза (табл. 1).

Таблица 1. Результаты испытаний бактерицидной активности композиционного состава в отношении М.avium.

Композиционные составы % (по ДВ) Время воздействия, час Рост на питательных средах в разведениях

10"6 10"' 10'8 10

Иодез -1,0 Катапол - 0,02 Контроль - йодез-1,0 6 24 + + + +

Иодез -1,5 Катапол - 0,02 Контроль - йодез-1,5 6 24 + + + 1

Иодез - 2,0 Катапол - 0,02 Контроль - йодез-2,0 6 24 + + + t

Контроль - йодез-3,0 6 24 - - - -

Контроль - катапол-3,0 6 24 + + + + + + + +

Обозначение: (-) - отсутствие роста микобактерий, (+) - наличие роста.

Проведенные исследования показали, что М.avium и М.В-5 одинаково устойчивы в отношении испытанных дезинфицирующих средств.

Для изучения механизма действия дезинфектантов на популяции клеток микобактерий нами были исследованы образцы препарате микобактерий с использованием СЭМ. Исследования контрольных препаратов М.avium показали, что с поверхности клетки закрыты плотным слоистым покровом. На периферии покровов иногда просматривались палочковидной формы клетки. Воздействие на культуру 3%-го раствора йодеза вызывало частичное уплощение и разрушение покровов, а также деформацию клеток микобактерий.

Следующим этапом исследований было изучение механизма действия композиционного состава йодез с катаполом. Исследование в СЭМ препаратов с участков мембранного фильтра, где отсутствовал видимый рост культуры после воздействия

композиционного состава (рис.7), показало, что популяция клеток микобактерий находилась в Ь-трансформации с образованием мелких шаровидных Ь-форм размером 0,25-0,5 мкм. Выявлено полное разрушение не только липидных покровов на поверхности микроколоний, но и клеточных стенок. Отсутствие роста популяции клеток микобактерий на среде Левенштейна-Йенсена в течение 10 суток после воздействия композиционного состава свидетельствовало о полной гибели популяции микобактерий и об образовании стабильных Ь-форм.

Таким образом, проведенные исследования показали, что предлагаемый композиционный состав обладал высокой бактерицидной активностью в отношении патогенных микобактерий.

Бактерицидная активность предлагаемого композиционного состава обусловлена эффектом синергизма, в котором катионоактивные ПАВ разрушают наружные покровы микобактерий липидной природы и клеточную стенку, а йод воздействует на жизненно важные органоиды клетки, что приводит к гибели популяции микобактерий и образованию стабильных Ь-форм.

Изучение антагонистической активности В .чиЬ1Шз. штамм «ТНП-5»

Рис. 7. Ь-трансформация клеток М.аушт после воздействия йодеза с катаполом. Видны мелкие клетки - Ь-форм ы. СЭМ, х 10000.

на популяиии клеток микобактерий.

Для проведения опытов по изучению антагонистических свойс1в бактерий использовали метод, предложенный И.Б.Павловой (1999). В стерильные чашки Петри разливали МПА, после чего на застывшую поверхность накладывали 3-4 мембранных фильтра «Владипор» №5. Суточную культуру микроба-антагониста В. зиЫШз в концентрации 107 кл/мл в количестве 0,5 мкл наносили в центр мембранного фильтра и после подсушивания капли инкубировали при 37°С в течение 1-2 суток. Через указанное время на мембранных фильтрах наблюдали обильный рост культуры В.виЫШв. Мембранные фильтры с выросшими на них колониями осторожно снимали с поверхности МПА и на то же место укладывали новый мембранный фильтр, на который наносили взвесь клеток микобактерий в концентрации 107, 106, 105 кл/мл. Одновременно с опытом ставили контроль. Морфологическую характеристику популяции бактерий проводили путем исследования образцов препаратов в сканирующем электронном микроскопе.

Проведенные исследования показали, что в контрольных чашках наблюдался обильный сливной рост культуры М.В-5 с волнистыми краями, закрытой блестящей желтоватого цвета пленкой. Диаметр роста культуры составил в среднем 3 см.

После взаимодействия М.В-5 с БАВ, продуцируемыми В.БиЫШя, наблюдали рост изолированных колоний М.В-5 во всех разведениях (107, 106, 105 кл/мл). В зоне роста в объеме нанесенной капли отдельные колонии хорошо дифференцировались, диаметр их составлял в среднем 1 см, ч го в 3 раза меньше, чем в контроле.

С использованием методов сканирующей электронной микроскопии был изучен механизм действия БАВ, продуцируемых В.виЬиНз, на популяции М.В-5. Изучение образцов препаратов контрольной культуры М.В-5 показало, что клетки с поверхности закрыты плотным покровом, отдельные клетки не дифференцировались (рис. 8).

Рис. 8. Фрагмент популяции клеток М.В5 (контроль). С поверхности клетки закрыты массивным покровом. СЭМ х10000.

Рис. 9. Фрагмент колонии М.В5 после воздействия БАВ В.виЫШв ТНП-5. В центре видно формирование

протопластов. СЭМ х10000

Исследование препаратов, полученных из фрагментов колоний М.В-5 после воздействия БАВ, показало полное отсутствие на поверхностях клеток покровов. Клетки в виде длинных цепочек плотно прилегали друг к другу. Обнаружено множество перегородок, имеющих вид валиков, что свидетельствовало о нарушении процесса деления клеток. В отдельных участках колонии выявлены очаги Ь-трансформации, в которых наблюдались клетки протопластного типа (рис.9).

Таким образом, биологически активных вещества, продуцируемые В.БиЬиПэ «ТНП-5», угнетают синтез экзопродуктов клеток, что ведет к переходу их в гетероморфизм с нарушением деления клеток и начальным проявлением Ь-трансформации в виде атипичного деления почкованием с образованием клеток протопластного типа.

После изучения механизма действия на популяцию М.В-5 нами было проведено экспериментальное исследование роли В.зцЫШб в развитии популяции М.аушт в нативном навозе, разбавленном водой. Опыт сопровождали контролем без внесения антагониста.

После 2-3-месячного наблюдения было отмечено значительное просветление жидкой фракции навоза по сравнению с таковой в контроле. В колбе с внесенной культурой M.avium без антагониста в жидкой фракции навоза наблюдали взвешенные опапесцируюшие хлопьевидные частицы. При исследовании их в световом микроскопе были выявлены клетки М.avium, объединенные общим межклеточным матриксом в микроколонии.

В препаратах, где популяции M.avium находились в жидкой фракции с антагонистом B.subtilis, клетки M.avium располагались изолировано и не были объединены между собой в микроколонии.

Полученные данные свидетельствуют о том, что БАВы нарушают в клетках микобактерий синтез экзопродуктов липидной природы. Морфологически это характеризуется отсутствием покровов на поверхности клеток, нарушением процесса разделения клеток, что приводит к гетероморфизму с образованием очагов L-трансформации в виде клеток протопластного типа.

Такие изменения в популяции, основанные на угнетении гликопептидолипидов - основы корд-фактора, свидетельствуют о возможности перехода клеток патогенных микобактерий в атипичные формы. Можно полагать, что при правильном подборе микроба-антагониста обсемененность патогенными микобактериями таких объектов окружающей среды как вода, почва, навоз и т.д. будет снижаться. Микробы-антагонисты не загрязняют окружающую среду и являются природными регуляторами микробиоценозов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспериментальные исследования позволили выявить особенности морфологии и развития популяций M.avium и М.В5 в окружающей среде.

В монослойной культуре видно формирование микроколоний, в которых клетки находились в ассоциации за счет межклеточного матрикса липидной природы. Исследования популяций M.avium и М.В5 на поверхности мембранных фильтров, помещенных на среду Левенштейна-

Йенсена, позволили выявить различия в росте быстрорастущих (сапрофитные) культур и медленнорастущих (патогенные) микобактерий.

Несмотря на особенности строения популяций микобактерии закономерности развития и выживания у них такие же, как и у других видов бактерий. Определяющими факторами выживания популяций микобактерий в среде обитания является способность клеток размножаться на биологических объектах и проявлять адаптационную способность в виде гетероморфизма и L-трансформации.

Установлено, что устойчивость к дезинфицирующим средствам микобактерий определяется высоким содержанием липидов в популяции клеток. В этой связи в состав применяемых дезинфектантов при туберкулезной инфекции рекомендуется включать катионоактивные ПАВ.

Способность патогенных микобактерий развиваться и выживать в окружающей среде представляет опасность их распространения и циркуляции, что обусловливает особое санитарно-эпизоотологическое и эпидемиологическое значение возбудителя туберкулеза.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методические подходы к исследованию популяций микобактерий в монослойной культуре. Предложенные методы фиксации и окраски клеток парами 1%-й осмиевой кислоты позволяют в световом микроскопе изучать рост клеток в микроколониях и формирование межклеточного матрикса без нарушения их естественной архитектоники.

2. Методом световой и сканирующей электронной микроскопии показано, что клетки М.avium и М.В5 в популяции объединены межклеточным матриксом, от степени развития которого зависит образование на их поверхностях массивных, бугристых покровов липидной природы.

3. Показано, что для выживания микобактерий на объектах окружающей среды необходимо наличие питательного субстрата, влажности (50-60%) и

температуры (+22-26°), при которых бактерии способны адгезироваться и колонизировать поверхности биологических объектов, что может свидетельствовать о накоплении возбудителя в среде обитания.

4. С применением методов сканирующей электронной микроскопии изучена морфология популяций М.avium в пробах воды и жидкого навоза. Показано, что выживание микобактерий обусловлено существованием их в микроколониях, закрытых покровами. В жидкой среде на выживание микобактерий влияют питательный субстрат и длительность существования в ней микобактерий.

5. Установлено, что диметилсульфоксид (ДМСО) растворяет липиды, составляющие основу покровов на поверхности колоний и клеточной стенки микобактерий, что приводит к ее дефектности и последующей L-трансформации с образованием L-форм.

6. Предложенный композиционный состав (йодез с катаполом) в 1%-й концентрации при экспозиции 6 и 24 часа оказывал бактерицидное действие на культуры М.avium и М.В5.

7. Синергический эффект разработанного композиционного состава обусловлен действием катионоактивного ПАВ, содержащегося в катаполе, что позволяет снизить концентрацию йодеза в 3 раза. Механизм действия предложенного композиционного состава заключается в разрушении наружных покровов, клеточной стенки и цитоплазматической мембраны микобактерий, что ведет к образованию стабильных L-форм.

8. Установлено, что B.subtilis «ТНП-5» (продуцент БАВ) вызывает популяционную изменчивость микобактерий, характеризующуюся угнетением синтеза липидов, гетероморфизмом и L-трансформацией, что свидетельствовало о возможности перехода патогенных микобактерий в атипичные формы.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ

Материалы исследований включены в п.п. 2.4., 2.6., 2.7. «Методических рекомендаций по определению бактерицидной активности химических дезинфицирующих средств на популяции микробных клеток», утвержденных РАСХН 23.01.03.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Архипова Н.Д. Влияние диметилсульфоксида на популяцию микобактерий //Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях». - Воронеж, 2002, с.276-277.

2. Архипова Н.Д. Электронно-микроскопическое исследование популяций Mycobacterium avium на объектах окружающей среды //Материалы международной научно-практической конференции. «Актуальные проблемы болезней молодняка в современных условиях».-Воронеж, 2002, с.278-279.

3. Архипова Н.Д. Экологические аспекты выживания и развития популяции патогенных микобактерий // Международная научно-практическая конференция «Научное обеспечение сельского хозяйства горных территорий». Сб.научн.трудов.-Новосибирск.-2002.-№85.-С.105-198.

4. Архипова Н.Д. Морфология клеток микобактерий в популяции при воздействии диметилсульфоксида //Проблемы ветеринарной санитарии и экологии. Сб.научн.трудов ВНИИВСГЭ.- М.-2003.-Т.115.

5.Г1авлова И.Б., Архипова Н.Д. Выживаемость и размножение популяции Mycobacterium avium на объектах окружающей среды // Ветеринария.- 2003.- №5.-С.50-52.

Il

»

1

ВНИИВСГЭ, 2003, г.Москва, Звенигородское шоссе, 5 Заказ 76/Я.Тираж 80 экз.

I

» .6 34 9

Актуальность проблемы. В настоящее время все больше возрастает число неблагоприятных экологических факторов, способствующих развитию патогенных и потенциально-патогенных микроорганизмов.

Одним из факторов в распространении туберкулезной инфекции является циркуляция возбудителя в окружающей среде. По последним данным ряда исследователей (Dailloux М., 1999; Coven Jerry C.Rodegers,1999) показано, что патогенные и атипичные микобактерии (M.avium, M.fortuitum, M.kansassi и др.) обитают в окружающей среде, чаще всего в воде, почве. Фундаментальные исследования в области изучения популяций патогенных бактерий с использованием методов сканирующей электронной микроскопии позволяют выявить особенности развития клеток микобактерий в популяции, процессы их адгезии и колонизации на объектах окружающей среды, а также факторы их выживания.

Исследование строения, роста и изменчивости популяций бактерий при их естественном развитии и воздействии биотических и абиотических факторов являются одним из малоизученных разделов экологии бактерий.

Широкое распространение туберкулезной инфекции среди животных и человека ставит проблему изыскания научно обоснованных и эффективных препаратов для дезинфекции животноводческих помещений и других объектов ветеринарно-санитарного надзора.

Охрана окружающей среды требует новых подходов к санации различных объектов, включающих продукты питания, корма, вода, сточные воды, почва и др. Биологические подходы к решению этой проблемы, включающие микробов-антагонистов, являются наиболее безопасными и перспективными.

Изучение морфологии клеток микобактерий в популяции на объектах окружающей среды, позволяют получить объективную информацию об их строении, выживании, изменчивости в процессе роста при воздействии различных абиотических и биотических факторов.

Цель работы. Изучить морфологические особенности и факторы выживания Mycobacterium avium и Mycobacterium В-5 в объектах окружающей среды на популяционном уровне с использованием световой и сканирующей электронной микроскопии.

Для решения этой проблемы были поставлены следующие задачи.

1. Разработать методические подходы к исследованию популяций Mycobacterium avium и Mycobacterium В-5.

2. Изучить морфологию клеток M.avium и М.В-5 в популяции в условиях их естественного роста.

3. Изучить морфологию клеток микобактерий в популяции и факторы их выживания на объектах окружающей среды (частицы комбикорма, зерна сои, скорлупа яиц, кожа кур, вода, жидкий навоз).

4. Изучить механизм действия некоторых дезинфицирующих средств на популяции M.avium и М.В-5.

5. Изучить антагонистическое воздействие B.subtilis штамма «ТНП-5» на популяции микобактерий.

Научная новизна. На основании экспериментальных исследований с использованием методов световой микроскопии изучено формирование микроколоний в монослойной культуре. С использованием сканирующей электронной микроскопии изучена морфология Mycobacterium avium и

Mycobacterium B-5 в популяции на объектах окружающей среды (частицы комбикорма, зерна сои, скорлупа яйца, кожа кур, вода, жидкий навоз).

Установлено, что клетки М.avium при наличии трех основных факторов - питательный субстрат, температура (+22-26°) и влажность (6070%) - способны адгезироваться к поверхностям тест-объектов с последующей колонизацией и образованием покровов на поверхности колоний.

Изучена морфология и факторы выживания популяции Mycobacterium avium в воде и жидком навозе. Показано, что в жидкой среде патогенные микобактерии формируют гидрофобные микроколонии, закрытые покровами. Питательный субстрат и длительность пребывания микобактерий в жидкой среде определяют характер формирования покрова и способность клеток к адаптации в виде перехода в гетероморфизм с проявлением L-трансформации.

С использованием новой методики по определению бактерицидного действия химических дезинфицирующих средств на популяции микробных клеток и методов сканирующей электронной микроскопии изучен механизм действия композиционного состава «йодез+катапол» на клетки микобактерий. Установлено, что устойчивость М.В-5 аналогична таковой Mycobacterium avium.

Изучен механизм действия микроба-антагониста B.subtilis, штамм «ТНП-5» на популяции клеток М.В-5.

Практическая значимость работы. В работе применяли новые методические подходы и методики для исследования М.avium и В-5 на популяционном уровне с применением методов световой и сканирующей электронной микроскопии.

Разработан композиционный состав на основе йодеза и катапола, оказывающий бактерицидное действие на микобактерии. Положительный эффект новой композиции подтвержден актом комиссионной проверки в соответствии с приказом по ВНИИВСГЭ за №40 от 30.10.02 г. и утвержден 2.11.2002 г. Материалы исследований включены в «Методические рекомендации по ускоренному методу определения бактерицидной активности химических дезинфицирующих средств на популяции микробных клеток» ( п.2.4; 2.6; 2.7 ), утвержденный РАСХН 23.01.2003г.

В эксперименте показан положительный эффект действия БАВ микроба-антагониста В.БиЫШэ, штамм «ТНП-5» на М.аушт и В-5.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны методические подходы к исследованию популяций микобактерий в монослойной культуре. Предложенные методы фиксации и окраски клеток парами 1%-й осмиевой кислоты позволяют в световом микроскопе изучать рост клеток в микроколониях и формирование межклеточного матрикса без нарушения их естественной архитектоники.

2. Методом световой и сканирующей электронной микроскопии показано, что клетки M.avium и М.В5 в популяции объединены межклеточным матриксом, от степени развития которого зависит образование на их поверхностях массивных, бугристых покровов липидной природы.

3. Показано, что для выживания микобактерий на объектах окружающей среды необходимо наличие питательного субстрата, влажности (50-60%) и температуры (+22-26°), при которых бактерии способны адгезироваться и колонизировать поверхности биологических объектов, что может свидетельствовать о накоплении возбудителя в среде обитания.

4. С применением методов сканирующей электронной микроскопии изучена морфология популяций M.avium в пробах воды и жидкого навоза. Показано, что выживание микобактерий обусловлено существованием их в микроколониях, закрытых покровами. В жидкой среде на выживание микобактерий влияют питательный субстрат и длительность существования в ней микобактерий.

5. Установлено, что диметилсульфоксид (ДМСО) растворяет липиды, составляющие основу покровов на поверхности колоний и клеточной стенки микобактерий, что приводит к ее дефектности и последующей L-трансформации с образованием L-форм.

6. Предложенный композиционный состав (йодез с катаполом) в 1%-й концентрации при экспозиции 6 и 24 часа оказывал бактерицидное действие на культуры М.аушт и М.В5.

7. Синергический эффект разработанного композиционного состава обусловлен действием катионоактивного ПАВ, содержащегося в катаполе, что позволяет снизить концентрацию йодеза в 3 раза. Механизм действия предложенного композиционного состава заключается в разрушении наружных покровов, клеточной стенки и цитоплазматической мембраны микобактерий, что ведет к образованию стабильных Ь-форм.

8. Установлено, что В.БиМШБ «ТНП-5» (продуцент БАВ) вызывает популяционную изменчивость микобактерий, характеризующуюся угнетением синтеза липидов, гетероморфизмом и Ь-трансформацией, что свидетельствовало о возможности перехода патогенных микобактерий в атипичные формы.