Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Особенности иммунного ответа у крупного рогатого скота при применении туберкулезного анатоксина

На правах рукописи

ргб ОД

О V — $ 1 !■«/!•

СТЕБЛОВСКАЛ Светлана Юрьевна

ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО ОТВЕТА

У КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ТУБЕРКУЛЕЗНОГО АНАТОКСИНА

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Курск -1998

Работа выполнена в лаборатории кафедры эпизоотологии и паразитологии Курской государственной сельскохозяйственной академии им. проф. И.И. Иванова

Научный руководитель:

доктор ветеринарных наук, профессор Евглевский A.A. Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук, профессор Артемов Б.Т., кандидат ветеринарных наук, доцент Киптилый Ю.П.

Ведущая организация:

Московская государственная академия ветеринарной медицины

Защита состоится « ^» 1998 года в часов

на заседании специализированного ^совета К.120.25.03 при Курской государственной сельскохозяйственной академии им. проф. И.И. Иванова (г. Курск, ул. К, Маркса 70, КГСХА)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке КГСХА

Автореферат разослан « $ ytf/rff'QuÄ1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

Г.Ф. Рыжкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Туберкулез является одной ю самых распространенных и тяжелых болезней человека, животных и птиц. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в борьбе с туберкулезом в 50-60 гг. нашего века, эта инфекция была и остается серьезной проблемой в медицинской и ветеринарной фтизиатрии. Во многих отношениях туберкулез и сейчас остается таким же загадочным как и во времена Коха (А.Г. Хоменко, 1996).

Огромный резервуар возбудителя данной инфекции и отсутствие достаточно надежных я эффективных средств борьбы с туберкулезом, сводят на нет все усилия по борьбе с этой, представляющей поистине экологическое бедствие инфекцией (В.М. Авилов с соавт., 1997; М.А. Карачунский, 1996; А.Г. Хомченко, 1997; В.П. Шишков, В.П. Урбан, и др 1991.).

Перед ветеринарной наукой и практикой проблема борьбы с туберкулезом животных стоит в настоящее время еще более остро в виду невозможности применения вакцины БЦЖ, что оставляет животных беззащитными в случае инфицирования возбудителем туберкулеза. В этой связп особую значимость и актуальность сегодня приобретает разработка средств специфической профилактики туберкулеза животных, которые имели бы преимущества перед вакциной БЦЖ в отношении иммуногенностн и аллергизирующего действия (A.A. Евглев-ский, 1986,1997, Н.П. Овдиенко с соавт., 1984;).

Разработка средств специфической профилактики туберкулеза во многом сдерживается не изученностью механизмов формирования противотуберкулезного иммунитета (М.М. Авербах с соавт., 1976, 1980). Следует признать, что самым старым и вместе с тем пока единственным препаратом, используемым со времен Коха в иммунотерапии туберкулеза людей, является туберкулин (М.А. Карачунский, 1996; А.Г. Хомченко, 1996). Однако, применение туберкулппа в иммунотерапии туберкулеза людей, сдерживается нестабильными результатами и наличием в препарате сильно действующего токсина. Возможность получения туберкулезного аллергоида для специфической десенсибилизации и туберкулезного анатоксина для специфической профилактики туберкулеза долгое время не изучалось, по всей видимости, из-за «классического» представления о нестерильном иммунитете при туберкулезе (A.A. Евглевскии, 1988). В то же время резистентность организма к заражению микобакгериями туберкулеза сохраняется не только в случае полной элиминации вакцинных штаммов БЦЖ (М.М. Авербах, В.И. Литвинов, 1974), но может быть пндущгрсзапа отдель-

ными фракциями и оболочками микробактерий туберкулеза (М.М. Авербах, В.И. Литвинов, 1974, 1979; Ю.М. Краснопольский с соавт., 1985; П.И. Кокуричесв, Н.М. Налетов, 1987; Н.П. Овдненко с соавт., 1984; В.Т. Павлова, 1976; Т.Б. Яблокова, 1976; Б. В^ав^ 1988; ШЫе.а, 1975 \У.Носкеуеге.а, 1988). Указанная область исследований вызывает определенный научный и практический интерес, так как такие исследования способствуют не только прогрессу в области изучения механизма формирования приобретенной резистентности к этой инфекции, что само по себе очень важно, но могут привести к разработке более эффективного по сравнению с вакциной БЦЖ противотуберкулезного иммунного препарата(М.М. Авербах с соавт., 1976).

Все увеличивающееся распространение туберкулеза человека и животных, отсутствие в ветеринарной медицине эффективных средств профилактики туберкулеза крупного рогатого скота определили выбор темы, связанной с изучением формирования противотуберкулезного иммунитета у животных под действием нового вакцинного типа противотуберкулезного анатоксина.

Цель насто&гцей работы заключалась в изучении особенностей формирования иммунного ответа у животных при иммунизации туберкулезным анатоксином.

Для выполнения поставленной цели были определены следующие задачи исследований:

- Научное обоснование оптимизации способа получения противотуберкулезного анатоксина, не оказывающего отрицательного действия и не индуцирующего состояние повышенной чувствительности к туберкулину организма привитых животных;

- Изучить динамику синтеза отдельных классов сывороточных иммуноглобулинов и уровень клеточного иммунитета у иммунизированных различными дозами противотуберкулезного анатоксина животных в отдаленные сроки на основании чего дать научно обоснованные рекомендации оптимальной дозы препарата и срока проведения иммунизации;

- Изучить корреляцию между содержанием отдельных классов иммуноглобулинов, состоянием клеточного иммунитета и степенью напряженности противотуберкулезного иммунитета у вакцинированных животных в отдаленные сроки после иммунизации;

- Испытать в экспериментальных и производственных условиях стационарно неблагополучных по туберкулезу хозяйств протективные свойства туберкулезного анатоксина и возможность усиления защитных свойств препарата с помощью иммуномодулятора клеточного иммунитета левамизола.

Неузка незкзна. Научно обоснован и разработан новый вариант получения противотуберкулезного анатоксина, не оказывающий отрицательного действия и не вызывающий аллергизацию к туберкулину организма привитых животных. Впервые в условиях эксперимента на лабораторных животных и крупном рогатом скоте показана возможность усиления противотуберкулезного иммунитета при применении туберкулезного анатоксина, в т.ч. с пониженной антигенной нагрузкой, в сочетании с иммуномодулятором левамизолом.

Впервые в качественном и количественном отношении определена динамика формирования клеточного и гуморального иммунитета под влиянием иммунизации крупного рогатого скота туберкулезным анатоксином с разной антигенной активностью на основании чего научно обоснованы рекомендации оптимальной дозы препарата и срока проведения реиммунгоации животных.

Практическая ценность работы. Разработан, экспериментально испытан и апробирован в производственных условиях новый вариант туберкулезного анатоксина, обладающий выраженными иммуноген-ными и протективньши свойствами при заражении животных мико-бактериями туберкулеза.

На основании результатов экспериментального и производственного испытания им м ун о генных свойств туберкулезного анатоксина показана его иммунологическая и эпизоотолопгческая эффективность применения для целей специфической профилактики туберкулеза, что открывает новые подходы в системе мер борьбы с туберкулезом крупного рогатого скота.

Апрабашп рг.боты. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на ежегодных научпо-практпческпх конференциях профессорского и преподавательского состава Курской ГСХА с 1993 по 1997 гг.; на 9-ой межгосударственной межвузовской научно-практической конференции «Новые фармакологические средства в ветеринарии», С-Петербург, 1997.

Апробация диссертации проведена на расширенном заседании кафедры эпизоотологии и паразитологии Курской государственной сельскохозяйственной академии им. проф. И.И. Иванова.

Пу5л:::;гц::а ргзулътктсп псследсзйкгк"!. По материалам диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ, получено 2 удостоверения на рационализаторские предложения.

Струттрд и объем дисссртащи. Диссертационная работа изложена на 162 страницах машинописного текста и включает: введение (5 стр.), обзор литературы (30 стр.), собственные исследования (85 стр.), обсуждение полученных результатов (21 стр.), выводы н предгожензя по

.практическому использованию материалов диссертации (3 стр.). Список литературы включает 203 источника, в т.ч. 112 иностранных. Приложение на 9 страницах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Работа выполнена в условиях лаборатории эпизоотологии Курской ГСХА, в лаборатории по изучению туберкулеза Курского НИИ АПП. Основные исследования проведены в период с 1992 по 1997 гг. При проведении опытов для иммунизации животных использовали разные варианты изготовления туберкулезного анатоксина, материалом для приготовления которого являлась культуральная жидкость с максимальной аллергенной активностью 90-100 тыс. Т.Е. в 1 мл. Для усиления антигенной активности препарата в одних случаях к культур аль-ной жидкости добавляли в качестве токсина порошок туберкулина ППД-млекопитающих, а в другом варианте-инактивированную формалином культуральную жидкость подвергали концентрации на 3% геле гидроокиси алюминия, добавляемом из расчета от 10 до 30% и последующем декантировании 50-55% неактивной недостаточной жидкости.

Инактивацию экзо- и эндотоксинов М. Bovis проводили формалином, используя разную, от 0,2 до 0,8% его концентрацию и температурный режим от 37 до 45°С.

При приготовлении туберкулезного анатоксина их культуральной жидкости и порошка ППД- млекопитающих конечный продаст подвергали сорбации на геле гидроокиси алюминия, добавляемом из расчета 2-3 мг окиси на 1 мл препарата.

Контроль туберкулезного анатоксина проводили согласно требованиям предъявляемым к испытанию всех биопрепаратов на стерильность, безвредность, токсичность, остаточную аллергенную активность. Протективные свойства туберкулезного анатоксина изучали на морских свинках и крупном рогатом скоте.

Для инфицирования иммунизированных лабораторных животных использовали культуру возбудителя туберкулеза бычьего штамма №8 и штамм Балле.

В производственных условиях неблагополучных по туберкулезу хозяйств иммунизированных животных подвергали контактному инфицированию при совместном содержании их с больным туберкулезом скотом.

В период наблюдения крупный рогатый скот периодически исследовали внутрикожной пробой на туберкулин, а при убое реагирующих

животных биоматериал от них подвергали бактериологическому исследованию. При проведении бактериологических исследований использовали :- Методические указания по лабораторной диагностике туберкулеза, ВНИИБШ, 1988; - Методические указания по выделению Ь - форм микобактерий туберкулеза Л ВИ, 1989 г.

Для гистологического и цитологического исследований патологический материал фиксировали в 10% растворе формалина, срезы приготавливали из блоков, залитых в парафин; препараты окрашивали по Белыповскому на агрофильные волокна, по Циль-Нильсену на мико-баюгерии.

Динамику иммунологических изменений в организме привитых животных изучали путем определения числа и соотношения различных категорий лимфоцитов, играющих ведущую роль в противотуберкулезном иммунитете. С этой целью использовали методику, разработанную В.Л. Солодовниковым, 1982 г.

Качественные и количественные изменения сывороточных иммуноглобулинов в крови иммунизированных животных определяли по методу Манчини (1965 г), общий белок рефрактометрически.

Статистическую обработку на достоверность полученных данных проводили согласно методических указаний Ю.К. Батон (1988 г.)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Теоретическое обоснование инактивации аллергенных и токсических свойств туберкулина для изготовления туберкулезного аллергоида и анатоксина.

С учетом того, что в практике медицинской фтизиатрии накоплен большой экспериментальный и клинический материал о лечебном действии туберкулина и возможности повышения им резистентности организма, несомненный интерес представляет перспектива использования токсических свойств туберкулина в целях создания туберкулезного анатоксина для профилактики туберкулеза.

Первые исследования, направленные на получение туберкулезного аллергоида и анатоксина, принадлежит А.А. Евгпевскому 1986. В последующем перспектива возможности использования туберкулезного анатоксина для активной иммунопрофилактики туберкулеза была показана в целом ряде экспериментальных и производственных испытаний. Тем не менее, первые образцы туберкулезного анатоксина, обладали разной протективной активностью при испытании на морских свинках и кроликах и нуждались в совершенствовании как технологии его получения, так и повышения нммуногенных свойств препарата.

Практические подходы по изысканию оптимальных технологических режимов получения концентрированного туберкулезного анатоксина.

Разработанный ранее автором способ получения туберкулезного анатоксина не являлся оптимальным и нуждался в совершенствовании. Существенным, имеющим важное иммунобиологическое значение, недостатком данного препарата являлось необходимость использования в качестве токсина порошка туберкулина ППД-млекопитающих. В то же время, для инактивации аллергенных свойств смеси токсшсоал-лергенов мшсобактерий туберкулеза с активностью 200 тыс. Т.Е. в 1 мл требовалось добавление формалина до 0,8-1,0%, вызывающего воспалительные реакции на месте подкожных инъекций препарата, снижающие протективный эффект иммунизации.

Инактивацию туберкулопротеина культуральпой жидкости проводили, используя разную концентрацию формалина, начиная с 0,2% в течение 10 дней. Для контроля использовали аналогичную серию аллергена, но не подвергнутую обработке формалином. В результате контрольного исследования установлено, что добавление формалина в концентрации 0,2% культуральной жидкости, содержащей 100 тыс. Т.Е. мл хотя и приводит к ослаблению ее аллергенной активности, но она недостаточна для инактивации аллергенных свойств.

При контроле за снижением аллергенных свойств культуральной жидкости после обработки 0,3 и 0,4% концентрацией формалина установлено, что в первом случае максимальное снижение аллергенной активности достигло 80% и более на 9-11 день, а добавление 0,4% формалина вызвало полную инактивацию на 8-9 день. Это подтверждалось отсутствием кожных реакций у алл ер газированных БЦЖ морских свинок на внутрикожное введение туберкулезного аллергоида при наличии выраженной аллергии на параллельное введение неактивированной формальном культуральной жидкости.

При определении влияния температуры на продолжительность и степень инактивации аллергенных свойств культуральной жидкости установлено, что температуру равную 44-45°С следует считать оптимальной, так как она ускоряла реакцию между формалином и тубер-кулопротеином до 7-8 дней.

После определения оптимальной концентрации формалина и температурных условий, обеспечивающих полную инактивацию аллергенных свойств культуральной жидкости перед нами стал вопрос о доведении требуемой активности конечного продукта до 200 тыс.Т.Е. в 1 мл. Решение вопроса было достигнуто путем сорбции туберкулопротеина в культуральной жидкости на геле гидроокиси алюминия и по-

следующем его декантировании 50-55% неактивной надосадочной жидкости.

В ходе проводимых исследований установлено, что добавление к культурной жидкости 3% геля гидроокиси алюминия в количестве 1020% и 30% обеспечивает последовательное «истощение» аллергенной активности надосадочной жидкости соответственно на 50,70, 90-95% и содержание белка в ней до 0,9 мг/мл; 0,5 нг/мл; 0,1 мг/мл.

Таким образом, мы получили туберкулезный анатоксин с требуемой антигенной активностью 200 тыс. Т.Е., но концентрация формалина в нем не превышала 0,3%. Данная концентрация формалина в препарате не вызывала воспалительных реакций на месте подкожного его введения в дозе 1-2 мл морским свинкам и 5 мл крупному рогатому скоту.

Технологические преимущества изготовления последнего варианта туберкулезного анатоксина послужили основанием для проведения специального испытания на морских свинках.

Сравнительная оценка на морских свинках протективных свойств двух вариантов туберкулезного анатоксина при разных схемах иммунизации.

Порядок экспериментального испытания предусматривал одно- и двукратную иммунизацию морских свинок разными вариантами туберкулезного анатоксина.

Проведенные клинические наблюдения за состоянием морских свинок подтвердили наши предположения о том, что причиной местной прививочной воспалительной реакции у животных является слишком высокая, до 0,8-1%, концентрация формалина в предыдущем варианте его изготовления.

Применение для иммунизации морских свинок в указанных дозах последнего варианта туберкулезного анатоксина не оказало отрицательного действия на организм привитых лабораторных животных.

Спустя 15 дней после повторной иммунизации животных, морские свинки были заражены культурой возбудителя туберкулеза штамма Балле в дозе 0,00001 мг. Результаты эксперимента представлены в таблицей 1.

При проведении бактериологических исследований возбудитель туберкулеза в бактериальной форме у животных 1-ой опытной группы был выделен от 4 морских свинок с клинической картиной туберкулеза и еще у 3-х животных этой группы в Ь-форме.

От животных 2-ой и 3-й опытных групп возбудитель туберкулеза в бактериальной форме был выделен от двух морских свинок в каждой

группе, имевших туберкулезные поражения в печени и еще от 2-х в Ь-форме.

В 4-ой опытной группе выделить культуру возбудителя туберкулеза ни в бактериальной, ни в Ь-форме не удалось.

Полученные нами результаты исследований позволяют сделать заключение о том, что различия в технологии сравниваемых препаратов, при равной их биологической активности оказали значительное влияние на их протективные свойства при испытании на морских свинках.

Протективная активность сравниваемых вариантов

туберкулезного анатоксина (п= 11) _Таблица 1

Группа жнвотн. Вариант тубанатох-снна и порядок его пркнененвя Пало с паталогвей туберкулеза (днен) Убито с патадог. туберкулеза Характер | туб.по- [ раженнн | прш убое

45-50 50-55 55-60

I. ТА. ннахывиро-ваввый 1% формалином, доза 1 ил, подкожно, однократно 2 2 Еднижчн. туберкулезные поражен, в печенк

2. ТА. ют же, двукратно с интервалом в 10 дней, в дозе 1 + 1 их 2 тоже

3. ТА. инахтавнро-вадный 0,3% формалина, доза 1 ил, подкожно, однократно 2 тоже

4. ТА. тот же, прнвнв-ха двукратная с Ептсрввлоа 10 дкеЗ

5. Контроль 4 3 2 2 Множест венные туб-ые поражен, в печен* н легких.

Теоретическое обоснование экспериментального подхода к вопросу иммунизации животных туберкулезным анатоксином с уменьшенной антигенной нагрузкой на организм. Усовершенствованный нами вариант получения концентрирован ного туберкулезного анатоксина хотя не оказывал побочного отрица-

тельного действия на организм иммунизированных лабораторных животных, тем не менее, несет достаточно высокую антигенную нагрузку, в т.ч. повышенную концентрацию в препарате гидроокиси алюминия.

При туберкулезе, развитию специфических морфологических изменений в больном организме всегда сопутствует развивающийся дефицит Т-систеыы иммунитета, что усугубляет течение заболевания. В этой связи вполне обоснованными являются показания по применению в качестве патогенетических средств усиливающих противотуберкулезную резистентность иммуномодуляторов, среди которых особое внимание привлекает левампзол. Левамизол обладает способностью активации Т-лимфоцптов и макрофагов, что особенно важно для повышения резистентности к туберкулезу, возбудитель хоторого способен, в основном, к внутриклеточному паразнтировапшо.

Учитывая вышеизложенное, на наш взгляд вполне обоснованным, являлось проведение опытных исследований по сочетанному применению специфической иммунизации животных туберкулезным анатоксином, в т.ч. с уменьшенной антигенной нагрузкой, на фоне стимулирующего клеточный иммунитет левамизола.

Порядок экспериментального испытания предусматривал одно- и двукратную иммунизацию морских свинок туберкулезным анатоксином в дозе 1 мл и одновременное применение левамизола с активностью 2-3-4 мг АДВ.

Спустя 15 дней после повторной иммунизации животных, морские свинки всех групп были заражены культурой возбудителя туберкулеза штамма Балле в дозе 0,00001 нг/мл.

Результаты эксперимента для наглядности отражены в таблице 2.

При проведении бактериологического исследования животных 1-ой опытной группы возбудитель туберкулеза в бактериальной форме был выделен от 4 морских свинок с клинической картиной туберкулеза и в Ь-форме от 5 животных.

От животных 2-ой опытной группы возбудитель туберкулеза в бактериальной форме был выделен от 2-х морских свинок, имевших туберкулезные поражения в печени и еще от 2-х в Ь-форме.

В 3-й опытной группе возбудитель туберкулеза в бактериальной форме был выделен от 2-х морских свинок и от одной в Ь -форме.

В 4-й и 5-й опытных группах выделить культуру возбудителя туберкулеза ни в бактериальной, ни в Ь-формах из материала убитых животных не удалось.

Таким образом, проведенный нами экспериментальный опыт показал, что одновременное применение левамизола и туберкулезного анатоксина, в т.ч. с уменьшенной вдвое антигенной нагрузкой, индуциро-

в ало более выраженный защитный эффект, не уступающий эффективности иммунизации концентрированным анатоксином, что в свою очередь создает перспективу повышения резистентности организма крупного рогатого скота к заражению возбудителем туберкулеза путем совместного применения указанных препаратов. Последнее обусловило задачу проведения опытов непосредственно на крупном рогатом скоте.

Протекгавная активность туберкулезного анатоксина в зависимости от порядка иммунизации. (п=9)

____Таблица 2.

Группа ж-х Порядок применения а доза препарата Пало с патодогнеб туберкулеза в пернод (дней) Убито с паталог. туб-за через 2 нес. Харахтер туб. поражений при убое животных

45-50 50-55 55-60

1. ТА., 1 мл. однократно 2 2 едяничн. туб. поражения в печени у 2 мес. сввнох

2. ТА., 0,5+0,5 мл. - - 2 2 то же

3. ТА. 1 ид, дева-ивзода 2 мг однократно 2 то же

4. ТА. двухратно с интервалом в 10 дней, 0,5+0,5 ил, деваыизод 1нг+2ыг

5. ТА. двукратно с интервалом 10 дней 0,5 +0,5 ил, левампзол Ыг+2мг

6. Контроль 4 4 1 Множественн ые туб. поражения в печени и легких.

Иммунобиологические свойства туберкулезного анатоксина с разной антигенной активностью при испытании на крупном рогатом скоте. (п=5) Схема опыта представлена в таблице 3.

Исследования по определению в крови животных различных популяций лимфоцитов, составляющих ключевые звенья иммунной систе-

мы, проводили до иммунизации, а затем через 7-14-21 день и каждые 30 дней после прививки. Параллельно контролировали иммунный статус у интактных, соответствующего возраста, контрольных животных.

Таблица №3

Группа ж-х Возраст при ннну-низаццн Порядох прннепення н доза препаратов тубуркулезвый аватокснн (ТА) левамиэол

1. 3-4 МСС. ТА. (100 тыс. Т.Е. в I мл), в дозе 2 мл., подкожно, однократно -

2. -II- ТА. тот же, в дозе 2 мл., подкожно, однократно 5 мг/кг, двукратно, с интервалом 7 дней

3. ТА. тот же в дозе 2+2 мл, подкожно, двукратно с интервалом 10 дней 5 мг/кг, двукратно, одномоментно с иммунизацией

4. ТА. (200 тыс. Т.Е. в I мл), в дозе 2 мл, подкожно, однократно 5 мг/мл, двукратно с интервалом в 7 дней

5. -II- ТА. тот же, в дозе 2+2 мл, подкожно, двукратно, с интервалом 10 дней

6. 12 мсс. ТА. (100 тыс. Т.Е. в 1 мл), в дозе 5 мл, подкожно, однократно -

7. -II- ТА. тот же, в дозе 5 мл, подкожно, однократно 5 мг/кг, двукратно с интервалом в 7 дней

8. ТА. тот же, в дозе 5+5 мл, подкожно, двукратно, с интервалом 10 дней 5 мг/кг, двукратно, одномоментно с иммунизацией

9. ТА. (200 тыс. Т.Е. в 1мл), в дозе 5 мл, подхожно, однократно 5 мг/кг, двукратно, с интервалом в 7 отчей

10. -II- ТА. тот же, в дозе 5+5 мл, подкожно, двукратно, с интервалом 10 дней

Характерно то, что показатели изменения уровня Т- и В-лнмфоцитов у разновозрастных групп животных имели практически одинаковую закономерность.

Так, у животных 1 и 6 опытной группы показатели абсолютного и относительного количества содержания в крови Т-хелпкг "> тлели дос-

товерно выраженное увеличение уже на 14 день после прививки и достигли максимального значения на 21 день, начиная с 30 по 120 день наблюдалась тенденция последовательного уменьшения этих показателей, которые к 150 дню уже не имели достоверной разницы с контролем.

Показатели абсолютного и относительного количества Т-хелперов во второй опытной группе достигли максимального значения уже через 14 дней и находились на высоком уровне до 60 дня после иммунизации, сохраняясь достоверно выраженными до 120 дней. По всей видимости, однократная иммунизация животных данной возрастной группы, проведенная на фоне стимуляции клеточного иммунитета их организма левамизолом, недостаточна для индуцирования продолжительного иммунитета. У животных 3 опытной группы тенденция увеличения в крови Т-х наблюдалась до 90 дней, затем абсолютные и относительные показатели их содержания начали снижаться, тем не менее, спустя 6 месяцев, они оказались на достаточно высоком уровне по отношению к контрольной группе.

Следует отметить, что даже при однократной иммунизации концентрированным туберкулезным анатоксином у животных 4 опытной группы показатели абсолютного и относительного содержания Т-хелперов спустя 7 дней после прививки были выше по сравнению с этими показателями у животных 1 и 2-ой опытной группы и остались на достаточно высоком, по отношению к контрольной группе, уровне вплоть до 180 дней.

Двукратная иммунизация концентрированным вариантом туберкулезного анатоксина животных 5 и 10 опытной группы индуцировала более выраженную и продолжительную, до 90 дней, тенденцию нарастаний абсолютного и относительного количества Т-хелперов и спустя 180 дней их количество находилось на достаточно высоком уровне по отношению к контролю (pZ 0,05).

Важно отметить, что иммунизация животных туберкулезным анатоксином в указанных дозах не индуцировала Т- супрессию в их организме.

При изучении влияния иммунизации на активность В-системы иммунитета отмечена более поздняя тенденция стимуляции образования иммунных В-лимфоцитов. Так, достоверные изменения абсолютного и относительного количества В-лимфоцитов, по сравнению с контролем и исходными данными у животных опытных групп установлены лишь на 21 день. При этом в 1 опытной группе достоверно значимые показатели увеличения абсолютного и относительного количества В-лимфоцитов наблюдались с 30 по 60 день, в последующем четко про-

слеживалась тенденция к снижению абсолютного и относительного количества иммунных В-клеток, показатели которых в 150 дней не имели достоверной разницы с контролем.

Во 2-ой опытной группе животных максимальные показатели абсолютного и относительного количества В-клеток наблюдались с 30 по 60 день и при наметившейся тенденции к снижению этих показателей с 90 дня, тем не менее, достоверно выраженные изменения, по сравнению с контролем, сохранились и в 180 дней.

Период накопления В-клеток в 3-й и 4-й опытной группе был более продолжительным, о чем свидетельствуют более высокие и достоверно выраженные по отношению к контролю показатели абсолютного и относительного количества В-клеток в крови животных в течение всего периода наблюдения.

Более выраженную стимуляцию В-системы иммунитета мы наблюдали у животных 5-ой и 10-ой опытных групп, где достоверно выраженные изменения (pZ0,05) в показателях абсолютного и относительного количества В-клеток наблюдались с 14 дня и сохранились на высоком уровне в конце периода наблюдения.

Анализируя результаты исследований по динамике изменений общего белка у животных всех 10 опытных групп следует отметить хорошо выраженную тенденцию увеличения содержания общего белка в сыворотке крови. При этом, более интенсивное и продолжительное увеличение наблюдалось в 3-4, 8 и 9 опытных группах по сравнению с остальными и контролем.

Иммунологическая перестройка организма животных в ответ на введение туберкулезного анатоксина характеризовалась последовательным синтезом и накоплением в сыворотке крови иммуноглобулинов класса М и G. При этом максимальные показатели содержания JeM в сыворотке крови животных 1-ой и 6-ой опытных групп наблюдались в период от 30 до 60 дней, после чего наметилась тенденция к уменьшению концентрации J, М и в 120 дней она уже не имела достоверно значимых различий в сравнении с контрольной группой животных.

Во 2-ой и 7-ой опытной труппе максимальные показатели синтеза иммуноглобулина класса М в сыворотке крови наблюдались с 60 по 90 день, при продолжительности достоверно значимых различий до 120 дней.

У животных 3-й и 8-ой опытной группы максимальные показатели синтеза макропгобугпшовых антител в сыворотке крови животных наблюдались с 60 по 120 день, а достоверно выраженные различия по сравнению с показателями контрольной группы животных сохранились до 150 дней.

Следует считать, что синтез макрогпобулиновых антител у животных 4-й и 9-ой опытных групп имел практически идентичную закономерность, что у их сверстников из 3-й и 8-й опытных групп.

Наиболее высокая иммунная реакция наблюдалась у животных 5-й и 10-й опытных групп, где высокий и достоверно выраженный уровень накопления макрогпобулиновых антител в сыворотке крови регистрировался на протяжении всего периода наблюдения.

Более существенные различия у животных опытных групп наблюдались в отношении синтеза и накопления иммуноглобулина класса G как показателя выработки специфических антител.

Наработка специфических антител на туберкулезный анатоксин в 1-й и 6-й опытных группах достигла максимального уровня на 60 день (р Z0,05) и при снижении данного показателя в 120 дней достоверно значимой разницы с соответствующими возрастными группами животных не отмечалось.

Животные 2-й и 7-й опытных групп реагировали на туберкулезный анатоксин более интенсивно и продолжительно, в частности, достоверно значимые показатели уровня накопления JgG, по сравнению с контрольной группой, наблюдались до 120 дней (р ¿0,05).

У животных 3-й и 8-й так же как у 4-й и 9-й опытных групп достоверно выраженные, по отношению к соответствующей группе сверстников, показатели уровня JgGнаблюдались и в 180 дней.

Наибольшей по интенсивности и продолжительности иммунологическая реакция в отношении синтеза J4G наблюдалось у животных 5 и 10 опытных групп. В частности, к 30 дню опыта содержание специфических антител в сыворотке крови у этих животных в 1,6 раза превышало соответственный качественный показатель у аналогичной контрольной группы сверстников.

Полученные данные свидетельствуют о том, что туберкулезный анатоксин обладает достаточно выраженными антигенными свойствами в отношении формирования у животных иммунологической перестройки организма. Установленное положительное действие на иммуногенез организма животных сочетания прививки туберкулезным анатоксином с иммуномодулятором клеточного иммунитета левамизолом может иметь особое значение в случае необходимости иммунизации животных с пониженной резистентностью к туберкулезной инфекции, в т.ч. в стадах стационарно неблагополучных по туберкулезу.

СИ{внка шилуногенных и протективных свойств туберкулезного анатоксина при испытании на молодняке крупного рогатого скота в условиях туберкулезного изолятора.

В экспериментальных условиях нами была проведена двукратная иммунизация 33 телят в благополучном по туберкулезу хозяйстве, после чего их разместили на неблагополучной по туберкулезу ферме, вперемежку с больными животными. Иммунизация животных туберкулезным анатоксином вызвала выраженную реакцию клеточного и гуморального иммунного ответа в частности, уровень общего белка в сыворотке крови бычков достиг показателя 8,9±0,14 г%, против фоновых 7,56±0,4 г%. Уровень иммуноглобулина класса М увеличился с 2,5±0,4мг/млдо 4,3±0,2 мг/мл. Наиболее показательным был рост синтеза иммуноглобулина класса О, уровень которого достиг 14,5±0,6 мг/мл против фоновых 9,2±0,5 мг/мл.

Перестройка Т-снстемы иммунитета проявилась увеличением Т-хелперов и уменьшением Т-супрессоров. Уровень В-ллнфоцитов имел хорошо выраженную тенденцию увеличения от 16,4±0,7 тыс/мкл до 33,7±0,4 тыс/мкл. Результаты последующих отдаленных исследований представлены в таблице №4.

Данные таблицы свидетельствуют, что общий показатель Т-лимфоцитов, как и Т-супрессоров не имели достоверной разницы у реагирующих и нереагирующих к туберкулину животных. В то же время, в популяции Т-хелперов имели место более выраженные количественные показатели среди ареактшзных к туберкулину, по сравнению с реагирующими на туберкулин животными.

Характерным на протяжении всего периода наблюдения было стабильно высокое содержание в сыворотке крови реагирующих и нереагирующих на туберкулин опытных животных иммуноглобулина класса в.

Уровень иммуноглобулина класса М у нереагирующих на туберкулин бычков имел выраженный и достоверный количественный показатель до 10 месяцев, после чего прослеживалась тенденция к снижению количества иммуноглобулина этого класса. В сыворотке крови реагирующих на туберкулин животных уровень М был значительно выше, чем у ареактивных, что можно объяснить персистированием в организме реагирующих животных мпкобактерий туберкулеза.

Принимая во внимание, что состояние ПЧЗТ на туберкулин, спустя 12 месяцев было выявлено у 9 из 30 оставшихся опытных животных, на фоне всех, к этому времени реагирующих контрольных животных, то можно утверждать, что протективный эффект иммунизации составил

Динамика изменения иммунного статуса бычков в условиях

туберкулезного изолятора _Таблица 4

Сроки исследован Состояние ПЧЗТк туберкулин Общий белок г% Иммуноглобулин мг/мл Количество лимфоидных клеток в крови (тыс/мл) и (%)

М С Т-х хелперы Т-с В-клетки

До прививки - 7,5б±0,4 2,5±0,4 9,2±0,5 2,8+0,1 Зб,5± 1,2 0,5±0,01 3,9±0,01 1,2±.0,001 16,4±0,7

После прививки до ввода в изолятор 8,9±0,14 4,3±0,2 14,5±0,6 4,2±0,1 48,3±1,2 0,3±0,01 3,2±0,1 2,7±0,4 33,7±0,4

Через 4,5 мсс. - 9,1 ±0,4 4,0±0,3 14,2±0,5 4,1±0,1 46,2±1,1 0,4±0,01 3,8±0,1 2,6±0,1 31,8±0,4

Через 8,5 мсс. + 9,4±0,3 8,9±0,2 4,8±0,4 4,2±0,2 12,7±0,8 12,2±0,4 4,2±0,1 46,5±1,1 4,2±0,1 45,9± 1,4 0,4±0,01 3,7±0,1 0,5±0,01 3,7±0,1 2,5±0,01 36,3±0,1 2,5±0,01 34,2±0,3

Через 10 мсс. 9,4±0,7 8,9±0,6 4,9±0,6 4,1±0,4 14,2±0,5 14,1±0,3 4,1±0,1 47,9± 1,3 4,1±0,1 47,8± 1,2 0,4±0,01 3,8±0,1 0,5±0,01 3,8±0,1 2,6±0,2 36,2±0,7 2,6±0,1 35,0±0,1

Через 12 мсс. + 9,5±0,3 8,9±0,8 5,0±0,3 3,9±0,2 12,8±0,4 13,2±0,б 4,1±0,1 47,5± 1,2 4,1 ±0,1 473±1,4 0,4±0,01 3,7±0,1 0,4±0,01 3,6±0,2 2,5±0,1 37,1 ±0,1 2,5±0,1 29,4±0,8

не менее 70%, что соответствует требованиям предъявляемым к «убитым» вакцинам и анатоксинам.

Оценка иммуноэпизоотологической эффективности туберкулезного анатоксина при оздоровлении стационарно неблагополучного по туберкулезу стада.

Производственные испытания иммуноэпизоотологической эффективности туберкулезного анатоксина были проведены на 500 головах крупного рогатого скота, в т.ч. на 300 коровах.

Молодняк крупного рогатого скота не реагировал на туберкулин ни до иммунизации, ни после ее проведения, в то время как количество реагировавших на туберкулин коров накануне иммунизации составило 42 головы, у 5 из которых была выявлена положительная реакция на внутривенную туберкулиновую пробу. При убое 5 коров, реагировавших положительно на внутривенную пробу, у всех из них на секции были выявлены деструктивные поражения туберкулезного характера, локализиующиеся преимущественно в легочных и заглоточных лимфатических узлах.

Ввиду большой вероятности отсутствия активного туберкулезного процесса у остальных реагировавших на туберкулин коров была проведена специфическая иммунизация животных туберкулезным анатоксином с одномоментной стимуляцией их организма левамизолом .

Иммунизация животных туберкулезным анатоксином способствовала активации клеточного и гуморального иммунитета, причем более выраженные показатели наблюдались среди нереагировавших на туберкулин коров. В сыворотке крови этих животных количество общего белка через 2 мес после иммунизации достигло 7,52±0,4 г% против фоновых 7,52±0,4 г%. Достоверно выраженные изменения иммунобиологической реактивности организма иммунизированных животных наблюдались в сторону увеличения Т- хелперов с 36,3±1,2 % до 46,1±1,3%, В-лимфоцитов с 19,3±0,5% до 32,5±0,1% и уменьшения Т-супрессоров; в последовательном накоплении иммунноглобулинов класса М до 4,3±0,5 мг/мл и О до 32,7±0,5 мг/мл против фоновых 2,4±0,3 мг/мл и 15,2±0,5 мг/мл.

При анализе иммунологических изменений в отдаленные периоды наблюдения после иммунизации прослеживалась тенденция снижения количества общего белка и иммуноглобулинов класса М в сыворотке крови у нереагировавших на туберкулин коров при стабильно высоком содержании иммуноглобулинов класса О как у реагировавших так и у нереагировавших на туберкулин животных. Изменения в Т- и В-

системе иммунитета были не столь выраженными и оставались практически неизменными.

При контроле за иммуноаллергическим состоянием организма коров, зараженных возбудителем туберкулеза, на что указывает положительный конечный тест на туберкулин накануне иммунизации, отмечено полное редуцирование состояния ПЧЗТ на туберкулин у 33 животных спустя 2 месяца после иммунизации, что подтвердилось и при переисследовании на туберкулез спустя 6 месяцев.

ВЫВОДЫ

1. В основу изготовления нового варианта противотуберкулезного анатоксина положена инактивация 0,3-0,4% формалином экзо-эндотоксина культуральпой жидкости М.бовис с максимально возможной антигенной активностью 90-100 тыс. Т.Е./мл. и концентрация биологически активных веществ на геле гидроокиси алюминия с последующим декантированием неактивной надосадочной жидкости.

2. Полученный новый вариант противотуберкулезного анатоксина безвреден для животных и не индуцирует состояние ПЧЗТ к туберкулину.

3. Иммунизация противотуберкулезным анатоксином здоровых животных па 7-14 день вызывает выраженную иммунологическую реакцию организма, обеспечивая высокие показатели синтеза иммуноглобулинов класса М до 4,75±0,04 мг/мл, в до 17,6±0,4 мг/мл против фоновых 2,17±0,03 мг/мл и 9,7±0,2 мл/мл. Активация клеточных показателей характеризуется увеличением Т-хелперов до 4,8±0,43 тыс/мкл; 48,3±1,3%., В-лимфоцитов до 2,9±0,1 тыс/мкл; 24,7±1,4 тыс/мкл; без индукции синтеза супрессорных клеток.

4. Уровень иммунного ответа определяется интенсивностью антигенного воздействия. В наших опытах двукратная иммунизация здоровых животных в дозе 500 тыс. к 1 ылн. инактивированных формалином туберкулиновых единиц обеспечивала одинаковое начало иммунного ответа и сохранение его на протяжении 4-5 и 6 месяцев.

5. Специфическая иммунизация животных противотуберкулезным анатоксином в сочетании с иммуномодулятором левамизолом вызывает более выраженную начальную иммунологическую реакцию н позволяет повысить резистентность организма к заражению возбудителем туберкулеза.

6. При оздоровлении неблагополучных по туберкулезу стад крупного рогатого скота с использованием туберкулезного анатоксина, проделггггельпостт. и уровень иммунитета может определяться сопос-

тавленнем количественных показателей сывороточных иммуноглобулинов М у реагирующих и нереагирующих на туберкулин животных и при достоверно выраженной их разнице показана реиммунпзации поголовья.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ.

Результаты диссертационной работы подтверждают приоритет разработки кафедрой эпизоотологии и паразитологии Курской ГСХА нового, вакцинного типа противотуберкулезного препарата, не имеющего противопоказаний для применения в ветеринарных целях и могут быть использованы:

- в качестве рекомендаций по дальнейшему изучению противотуберкулезного анатоксина в других НИИ нашей страны;

- для широкой производственной апробации дозы и схемы применения противотуберкулезного анатоксина, в т.ч. для проведения специальных государственных контролируемых испытаний;

- при иммунизации животных стационарно неблагополучных по туберкулезу стад, имеющих пониженную резистентность к туберкулезной инфекции, рекомендуется сочетание специфической прививки противотуберкулезным анатоксином с иммуномодулятором левамизолом.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Полученные результаты используется в Украинском НИИЭВМ, Курском НИИ АПП, в военном совхозе «Надежда» МВО.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ:

А. Статьи

1. Евпиевский A.A., Ковалепко А.М., Сгебловская С.Ю., Воробьева Н.В. Иммуногенные и протектпвные свойства вакцины БЦЖ и туберкулезного анатоксина при туберкулезе крупного рогатого скота.// Курский ЦНТИ, №13-95.

2. Евглевский A.A., Коваленко А.М., Сгебловская С.Ю. Оценка протективной активности разных вариантов туберкулезного анатоксина при испытании на морских свинках. //Мат. НПК посвящ. 25-летию ф-та вет.мед.КГСХА, 1996, с.25-26.

3. Сгебловская С.Ю., Евглевский A.A. Динамика изменений сывороточных иммуноглобулинов у крупного рогатого скота при иммунизации туберкулезным анатоксином.// Мат. НПК.,КГСХА,1996, с.35-36.

4. Стебловская С.Ю. Евглевский A.A. Активность Т- и В- систем иммунитета у здорового крупного рогатого скота при иммунизации туберкулезным анатоксином.// Мат.НПК, КГСХА, 1996, с.39-42.

5. Евглевский A.A., Сгебловская С.Ю. Оценка протективных и им-муногенных свойств туберкулезного анатоксина на молодняке крупного рогатого скота.//Мат. 9-й межгосударственной НПК, С-Петербург, 1997 с. 156.

6. Сгебловская С.Ю. Евглевский A.A. Изучение протективных и иммуногенных свойств туберкулезного анатоксина при испытании на морских свннках.//Мат 9-й межгосударственной НПК, С-Петербург, 1997, с 164.

7. Евглевский Ал.А., Евглевский Ан,А., Стебловская С.Ю. оценка протективных свойств туберкулезного анатоксина и динамика изменений иммунологического статуса молодняка крупного рогатого скота при содержании в условиях туберкулезного изолятора.//Труды КГСХА, 1997.

Б. Рационализаторские предложения

1. Способ повышения иммунологического статуса телят.//№ 148/1, 1996 г.

2. Метод фармакологической коррекции иымунодефицитов телят в ранний постнатальный период через систему «мать-шюд»//КГСХА № 150/3, 1996 г.