Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Научные основы и практические подходы к разработке новых средств аллергической диагностики и специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ

РГБ ОД На правах рукописи

;; дел 1397

Евглевский Алексей Алексеевич

Научные основы и практические подходы к разработке новых средств аллергической диагностики и специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота

16.00.03- ветеринарная микробиология, вирусология, )Ш1 юотология. микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ - 1997

Работа выполнена в Курском научно-исследовательском институте агропромышленного производства, в Курской государственной сельскохозяйственной академии.

Научный консультант : заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор Б.Т. АРТЕМОВ

Официальные оппоненты:

- доктор ветеринарных наук, профессор, академик Рос-сельхозакадемии В.А.Бусол

- доктор ветеринарных наук, профессор А.Н. Борисен-кова

- доктор ветеринарных наук, профессор В.А. Кузьмин

Ведущая организация : Московская государственная академия ветеринарной медицины.

Зашита диссертации состоится " // " 1997 г. в

_часов на заседании специализированного Совета

Д. 120.20.02 при Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины (196084, г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной академии ветерина-ной медицины.

Автореферат разослан " 9 п ШХ0Р# 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного

Совета, доцент О.В.Узюмова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальностьпроблемы. Несмотря на значительные успехи, достигнутые в борьбе с туберкулезом, эта инфекция была и остается серьезной проблемой в медицинской и ветеринарной фтизиатрии. В большинстве стран мира принята обязательная вакцинация и ревакцинация людей против туберкулеза вакциной БЦЖ, тем не менее, по данным Всемирной организации здравоохранения ( ВОЗ, 1992 ) ежегодно в мире заболевают туберкулезом 10 миллионов человек и 3 миллиона умирает. В ветеринарной медицине эта проблема усугубляется из-за невозможности применять в таком масштабе вакцинацию животных вакциной БЦЖ, что сводит на нет все усилия по борьбе с этой, представляющей поистине экологическое бедствие инфекцией (В.П.Шишков, В.П.Урбан, 1991).

Туберкулез относится к заболеваниям, при которых аллергия участвует как обязательный компонент основного патологического процесса ( Л.Е.Коляков, 1986; Д.Т.Леви с соавт., 1985; Д.Т.Леви, 1987; В.И.Литвинов с соавт., 1976 ). По своей природе это высоко специфическая реакция иммунокомпетентных клеток с аллергеном, вызвавшим эту аллергизацию ( В.Г.Галактионов, 1986; Н.В.Медуницин, 1983; В.И.Пыцкий, 1984; В.А.Фрадкин, 1990; Я.РоЬЬеПгег, 1983; Ь.Уацег е.а.,1983).

Тем не менее, ввиду широкого распространения в окружающей среде атипичных микобактерий родственных в антигенном отношении микобактериям туберкулеза, наблюдается массовое инфицирование животных и как следствие сенсибилизации их организма к туберкулину, что существенно осложняет аллергическую диагностику туберкулеза ( В.А.Бусол с соавт., 1991; А.С.Донченко с соавт., 1987,1995; А.И.Кузин, 1987; А.Х.Найманов, 1993; Н.П.Овдиенко с со-авг., 1989; 1995; 1996; В.П.Урбан с соавт.,1991; 1995; 1996;

A.Н.Шаров, 1989; Г.А.Юдин, 1987, 1990. В связи с чем, основываясь на показаниях реакции на туберкулин, не всегда представляется возможным точно поставить диагноз на туберкулез ( В.М.Авилов.

B.Ф.Пылинин, 1992; А.Б.Гуркин, 1995; О.З.Исхаков, 1987; Ю.А.Кассич с соавт., 1990; И.П.Никифоров с соавт., 1985; Н.П.Овдиенко. 1987, В.И.Пионтковский, 1984; М.А.Сафин. 1987; В.Г1.Урбан с соавт., 1985;В.Е.Шуревский, 1982 и др. ). Отсутствие достаточно надежных методов дифференциальной диагностики туберкулеза и атипичных микооактериозов обусловливает необходи-

мость совершенствования имеющихся и изыскание новых рациональных средств и методов диагностики туберкулеза крупного рогатого скота (Л.С.Донченко с соавт., 1995; А.С.Донченко, 1987; 1995; Б.Ф.Керимжанова, 1985; А.Х.Найманов, 1985; 1993; Овдиенко Н.П. с соавт., 1995; Н.И.Прокопьева, Г.А.Спиридонова, 1995; В.П.Урбан, 1996; Г.Н.Юдин, 1995 и др.).

Особую значимость и актуальность сегодня приобретает разработка средств специфической профилактики туберкулеза. Недостатком применения вакцины БЦЖ является, прежде всего, образование аллергии у привитых организмов, кроме того защитный эффект БЦЖ не является абсолютным. Вакцинация предупреждает появление значительных поражений, но не профилактирует развитие туберкулезного процесса и не препятствует распространение возбудителя, что недопустимо в ветеринарной фтизиоиммунологии ( В.П.Шишков, В.П.Урбан, 1991 ). С этой точки зрения вполне очевидно, что необходима работа по изысканию новой противотуберкулезной вакцины или антигенного комплекса микобактерий, которые имели бы преимущество перед БЦЖ в отношении иммуногенности и аллергизирующего действия (М.М.Авербах, 1976; М.А.Бажин, 1984; В.С.Гуткин и др., 1987; А.Н.Кульберг, 1985; Н.П.Овдиенко с соавт., 1984; Т.Б.Яблокова с соавт., 1979, 1986.С.Вго\уш'е , 1985; \V.Hockmeyer е.а., 1988; ЫХигпе, 1984; 5.Ыа§ао е.а., 1985 и др.).

Все увеличивающееся распространение туберкулеза крупного рогатого скота в нашей стране и странах СНГ, высокая степень аллер-гизацин животных атипичными микобактериями при отсутствии надежных средств активной профилактики и острой проблемы, связанной с первичной диагностикой туберкулеза, определили выбор темы.

Цель работы. Научное обоснование разработки и апробации новых средств аллергической диагностики и специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота.

Для выполнения поставленной цели исследования проводили по двум основным направлениям:

1. Разработка метода получения экономически выгодного, экологически безопасного нативного синтетического туберкулина.

2. Разработка методов получения и применения нового вакцинного препарата, пригодного для массовой иммунизации животных против туберкулеза.

Основные задачи исследования. Разработать технологию получения экономически выгодного, с повышенными диагностическими

свойствами, специфически и биологически активного туберкулина, отвечающего требованиям современного биофабричного производства и охране окружающей среды.

Провести сравнительную оценку эффективности внутрикожной туберкулинизацни новым вариантом нативного туберкулина и серийным ППД-млекопитающих в дифференцированных тест-дозах 10 тыс. и 5 тыс. Т.Е.

Провести контролируемые испытания нативного туберкулина во внутривенной туберкулинизацни для первичной диагностики туберкулеза и дифференциации парааллергических кожных реакций на туберкулин.

Разработать рациональные методы получения и применения нового вакцинного типа препарата - туберкулезного анатоксина, пригодного для использования в ветеринарных целях.

Изучить состояние иммунитета у крупного рогатого скота, привитого и реиммунизированиого туберкулезным анатоксином, в различные возрастные периоды и разработать оптимальные схемы специфической иммунизации животных, позволяющие создать высокую непрерывную защиту их организма в угрожаемой обстановке.

Изучить иммунный статус привитых туберкулезным анатоксином животных, находящихся в условиях неблагополучных по ту беркулезу стад, и предложить порядок контроля за эпизоотической ситуацией после иммунизации животных.

Научная новизна. Научно-обоснована экономически выгодная, экологически безопасная технология получения специфически и биологически активного нативного синтетического туберкулина с уменьшенным содержанием солей, пригодного для применения во внутрикожном, внутривенном и глазном тестах. Оказана методическая и научно-техническая помощь в организации производства данного диапюстикума в Эстонии и Казахстане.

Впервые в экспериментальных и производственных опытах доказана диагностическая эффективность нативного туберкулина и преимущество данного диагностикума перед туберкулином ПГ1Д-,млекопитающих во внутрикожном и внутривенном тестах.

Научно обоснованы рекомендации по использованию разных тест-доз туберкулинов в целях дифференциации неспецифическпх реакций в стадах с парааллергическкм фоном сенсибилизации животных атипичными мпкобактериями.

Научно обоснован и разработан принципиально новый, вакцинного типа противотуберкулезный препарат под названием туберкулезный анатоксин, не оказывающий отрицательного действия и не вызывающий аллергизацию к туберкулину организма привитых животных.

Впервые в условиях эксперимента изучено в динамике состояние иммунного статуса животных привитых и реиммунизированных туберкулезным анатоксином.

Впервые в производственных условиях, стационарно неблагополучных по туберкулезу стадах крупного рогатого скота, апробированы схемы профилактической иммунизации животных туберкулезным анатоксином и отработаны элементы контроля за иммунным статусом привитых животных, позволяющие объективно оценивать \ прогнозировать развитие эпизоотической ситуации.

Практическая ценность работы. Разработан новый экономиче ски выгодный, экологически безопасный способ изготовления биоло гически активного, повышенной специфичности нативного синтети ческого туберкулина и доказана высокая диагностическая эффек тивность, достоинство и преимущество данного диагностикума пере; очищенным туберкулином ППД - млекопитающих во внутрикожнен и внутривенной пробах. Внедрение в практику данного диагностику ма отвечает современным повышенным требованиям экологическо! безопасности и продиктовано практической необходимостью реше ния тупиковой ситуации связанной с повсеместной аллергизацие1 животных нетуберкулезными микобактериями.

Разработан и широко апробированы в производственных уело виях стационарно неблагополучного по туберкулезу стад крупног рогатого скота принципиально новый вакцинный препарат - туберку лезный анатоксин, открывающий новые подходы практического ре шения проблемы активной профилактики туберкулеза в ветеринар ной фтизиоиммунологии.

Основные положения диссертационной работы, выносимые н защиту:

1. Научное обоснование применения щадящих методов во: действия на биомассу микобактерий туберкулеза при гидролизе а! лергеноактивных веществ в целях получения экономически выгодне го, экологически безопасного, биологически активного нативног

о

синтетического туберкулина с пониженным содержанием солеи и повышенной специфичностью.

2. Сравнительная оценка диагностической ценности и эффективности во внутрикожном тесте дифференцированных 10 тыс. и 5 тыс. тест -доз туберкулина ППД - млекопитающих и нативного синтетического туберкулина при исследовании крупного рогатого скота в стадах с различной эпизоотической обстановкой по туберкулезу.

3. Теоретическое обоснование и практические материалы применения внутривенной туберкулинизации нативным туберкулином при первичной диагностике туберкулеза и дифференциации параал-лергических реакций на внутрикожное введение туберкулина.

4. Научное обоснование материалов по разработке, экспериментальному и производственному испытанию туберкулезного анатоксина для активной профилактики туберкулеза крупного рогатого скота.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на ежегодных научно-практических конференциях профессорского и преподавательского состава Курской ГСХА с 1986 по 1996 г.г.; на заседаниях Ученого Совета Курской НИВС с 1987-1990 г.г.; на заседаниях Ученого Совета Курского НИИ АПП с 1991 по 1996 г.г.; на заседаниях НТС Курского областного Агропрома в 1991-1992 г.г,; на научно-производственной конференции ГУВ МСХ РФ в 1993 году; на заседаниях Ученого Совета РАСХН в 1992-1996 г.г. г. Москва; на научно-практической конференции "Основные научные исследования по проблемам туберкулеза и бруцеллеза сельскохозяйственных животных", Новосибирск, 1995; на Международном Экологическом форуме "Современные экологические проблемы провинции", Курск, 1995; на юбилейной научной конференции посвященной 100-летию Курской биофабрики "БИОК", Курск, 1996.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 40 печатных работ, издано 2 методические рекомендации. Приоритетность результатов исследований подтверждена независимой экспертизой нативного туберкулина, проведенной государственной ветеринарной лабораторией Норвегии (1994) и положительными решениями на изобретение "Способ получения туберкулезного анатоксина", N 96115761, 'Способ получения туберкулина'. N 97105315

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 245 страницах машинописного текста и включает: введение (10 стр.), обзор литературы (53 стр.), собственные исследованю (152 стр.), обсуждение полученных результатов (27 стр.), выводы и предложения по практическому использованию материалов диссертации (5 стр.). Список литературы включает 443 источника, т.ч 156 иностранных. Приложецие на 29 страницах.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в условиях лаборатории по изучению туберкулеза Курского НИИ АПП. Основные исследования проведены е период с 1986-1996 г.г.

В работе использовали серийные диагностикумы ППД-млекопитавощих, ППД-птиц, KAM (комплексный аллерген из атипичных микобактерий) и опытный образец нативного синтетическогс туберкулина, изготовленного в условиях лаборатории Курского МИТ АПП.

Изготовление нативного туберкулина проводили путем водно-температурного гидролиза биомассьЕ микобактерий туберкулеза выращенных в течение 60 дней на синтетической среде в биобутылях с объемом среды 1200 мл. Полученный культуральный фильтрат подвергали биохимическому исследованию, заключающемуся в определении белка, содержании нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов. Все данные о биохимическом составе культуральной жидкости получены согласно условий изложенных в технических требованиях контроля при изготовлении туберкулина ППД-млекопитающих (1986) ТУ-46-21-962-85.

Основными моментами в контроле нативного синтетического туберкулина являлась проверка на активность и специфичность препарата. Для сравнения использовали туберкулин РРД-млекопитающих. Активность нативного туберкулина определяли на гомологично сенсибилизированных 5-6 морских свинках. Инъекции опытного и контрольного туберкулинов проводили внутрикожно в объеме 0,1 мл в дозе 5 и 25 Т.Е. в строго идентичные участки тела. Реакцию на аллергены учитывали через 24 и 48 часов и оценивали по

А

сумме двух диаметров инфильтратов по формуле: К= —, где

В

S

А - интенсивность реакции на испытуемый, а В - на контрольный туберкулин. Для основного расчета принимали данные реакции через 24 часа. Отношение суммы диаметров контрольного и испытуемого туберкулинов не должно было превышать отклонения в пределах 10%.

Показатель специфичности различий определяли по методу предложенному 1У^§пиззоп (1991) по формуле РД=(Аа + Вв )-(Ав + Ва ), где - Аа - средняя реакция на препарат А у животных сенсибилизированных гомологичными микобактериями; Ав - средняя реакция на А - препарат, но у животных сенсибилизированных гетерологич-ными микобактериями. Вв и Ва - аналогичные реакции на В - препарат.

Статистический анализ проводили используя для оценки достоверности различий в реакциях на испытуемый и контрольный тубер-

кулины коэффициент Стъюдента:? =~т= , , где с)к и с!и

фщ +т2

средние размеры реакций на контрольный и испытуемый препараты, а Ш] и ш> -соответственно их ошибка.

Испытание диагностической оценки нативного туберкулина проводили в экспериментальном опыте на искусственно аллергизи-рованном разными видами убитых микобактерий молодняке крупного рогатого скота и в производственных условиях благополучных и неблагополучных по туберкулезу стад.

Помимо внутрикожной пробы активность нативного туберкулина изучалась в глазной и внутривенной туберкулинизации.

При проведении бактериологических исследований использовали общепринятые методики (Методические указания по лабораторной диагностике туберкулеза, ВНИИБТ, 1988; Методические указания по выделению Ь - форм микобактерий туберкулеза ЛВИ, 1989).

Технология изготовления туберкулезного анатоксина отрабатывалась в условиях лаборатории по изучению туберкулеза Курского НИИ АПП. В процессе разработки технологии получения туберку-'лезного анатоксина использовали исходную активность культураль-ной жидкости микобактерий бовис в 50 тыс. Т.Е. и 100 тыс. Т.Е. в 1 мл.

Инактивацию токсичных и аллергенных свойств культуральной жидкости проводили 0,2% формалином из расчета на каждые 50 тыс. Т.Е.

Протективные свойства туберкулезного анатоксина изучали на морских свинках, кроликах, крупном рогатом скоте.

Для инфицирования иммунизированных животных использовали культуру возбудителя туберкулеза бычьего вида, штамм N 8 и Балле.

Динамику иммунологических изменений в организме привитых животных изучали путем определения числа и соотношения различных категорий лимфоцитов, играющих ведущую роль в противотуберкулезном иммунитете. С этой целью использовали методику, разработанную Г.Ф.Коромысловым и В.Л.Солодовниковым (1982).

Динамику изменений сывороточных иммуноглобулинов в крови иммунизированных животных определяли по методу Манчини (1965),общий белок рефрактометрически.

Производственное испытание эффективности противотуберкулезной иммунизации туберкулезным анатоксином осуществлено в 8 стационарно неблагополучных по туберкулезу стадах Ростовской и в одном Курской областей с охватом 6 тыс, голов крупного рогатого скота.

Эффективность противотуберкулезной иммунизации определяли по степени снижения эпизоотического напряжения по туберкулезу в каждом отдельно взятом стаде, учитывая некоторые иммунологические, а также бактериологические показатели надежности оздоровления.

Независимая экспертиза диагностической ценности нативного туберкулина была проведена Государственной ветеринарной лабораторией Норвегии (1994).

Статистическую обработку на достоверность полученных данных проводили согласно методических указаний Ю.К.Баюн (1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Изыскание оптимальных технологических режимов изготовления нативного синтетического туберкулина для млекопитающих.

В основу получения туберкулинов положено двухмесячное выращивание микобактерий туберкулеза на жидкой синтетической среде и стерилизация биомассы.

Культуральная жидкость после выращивания на жидкой среде микобактерий туберкулеза и отделенная от биомассы до автоклавиро-вания содержит в среднем 0,2 мг туберкулопротеина, образовавшегося, по всей видимости, за счет лизиса и частичного гидролиза микобактерий при 37°С. Основное же количество белка, до 0,7 мг/мл и более, в кулыуральную жидкость поступает после автоклавирова-ния биомассы микобактерий туберкулеза. Таким образом, туберкулин по своему происхождению является продуктом гидролиза микобактерий туберкулеза, а не биосинтеза. Это в свою очередь создает перспективы получения туберкулезных аллергенов за счет кислотного, щелочного или оптимизации режима воднотемпературного гидролиза.

Применяемая в настоящее время технология получения так называемого "очищенного" туберкулина представляет собой сложный многостадийный процесс и предусматривает ряд химических обработок в результате которых возможно изменение химической структуры белка, конфигурации аллергена с наруше-нием его специфичности (М.М.Иванов с соавт., 1974). При этом технология промышленного производства туберкулина ППД является, с одной стороны, экологически вредной для окружающей среды и здоровья людей, а с другой стороны экономически невыгодной, т.к. выход готового препарата составляет около 20%. В то же время существующая технология получения очищенного туберкулина не обеспечивает полной очистки активной и специфичной фракции культуральной жидкости от балластных неактивных веществ.

В связи с вышеизложенным, перед исследователями стояла и стоит проблема получения диагностикума по значительно упрощенной технологии и не уступающей по биологической активности и специфичности ныне применяемому туберкулину.

В этой связи заслуживает внимание сообщения французских исследователей не без оснований доказывающих, что лучшим туберкулином является синтетический туберкулин-культуральный фильт-

рат-микобактерий туберкулеза выращенных на синтетической питательной среде.

В связи с вышеизложенным в задачу наших исследований положено изыскание оптимальных технологических режимов изготовления нативного синтетического туберкулина повышенной специфичности. При этом важным вопросом являлось увеличение выхода туберкулина ю определенного объема исходной питательной среды с соблюдением условий экологической безопасности.

С учетом доказательства образования аллергеноактивных веществ при гидролизе микобактерий туберкулеза нами были предприняты попытки увеличить выход туберкулопротеина за счет режима (1атм), водно-температурного гидролиза, сохранив при этом в на-тивном состоянии специфические свойства препарата.

Серии проведенных опытов показали, что при увеличении продолжительности режима температурного воздействия на биомассу микобактерий туберкулеза с 30 минут до 1,5-2 часов происходит увеличение выхода туберкулопротеина до 0,90+0,02 мг/мл и соответствующей активности препарата с 50 тыс. до 75 тыс. Т.Е. в 1 мл.

Как показали исследования, дальнейшее увеличение времени стерилизации биомассы до 3-4 часов или усиление режима автокла-вирования до 1,5 атм., вызывает частичную денатурацию белков, которые выпадают в осадок и требуют удаления. Решение вопроса по увеличению выхода туберкулина было достигнуто за счет добавления в биобутыли к исходной культуральной жидкости с биомассой 1/41/5 деминерализованной воды и повторном температурном гидролизе биомассы микобактерий туберкулеза при 1 атм. в течение 1,5-2 часов. Это позволило без применения химических средств воздействия на биомассу обеспечить повторное повышение выхода аллергеноактивных веществ в культуральную жидкость до 70-75 тыс.Т.Е. в 1 мл. В тоже время в использовании для диагностической цели туберкулина с такой активностью ветеринарная служба не нуждается. Добавление деминерализованной воды к культуральному фильтрату позволяет получить туберкулин не только с требуемой активностью в 50 тыс. Т.Е. в 1 мл, но и уменьшить содержание солевых остатков среды до 0,8-0,9 мг/мл, т.е. уровень хлористого натрия в физрастворе, тем самым исключить диализ. В целом технология получения нативного синтетического туберкулина с уменьшенным содержанием солевых остатков среды при увеличении выхода конечного продукта для наглядности представлена схемой 1.

Схема 1.

1. Выращивание микобактерий туберкулеза на жидкой синтетической среде в течение 55-60 дней.

2. Стерилизация туберкулезной культуры при 1 атм. в течение 1,5 часа.

3. Добавление в биобутыли деминерализованной воды в количестве 1/4-1/5 части и повторной температурный гидролиз биомассы при 1 атм. в течение 1,5-2 часов.

4.0свобождекие культуральной жидкости от биомассы путем фильтрации через "СФ" пластины и установление рН на уровне 7,0±0,1.

5. Определение содержания белка в растворе и его активности.

6.Прибавление к культуральному фильтрату деминерализованной воды до требуемой активности.

7. Расфасовка препарата по флаконам и стерилизация при 1 атм. в течение 20 минут.

Биохимический состав нативного синтетического туберкулина и культуральной жидкости после осаждения туберкулопротеина ТХУ (трихлоруксусная кислота) и переосаждения сернокислым аммонием для сравнения приведены в таблице 1.

Таблица 1

№ п.п. Показатели мг./мл. Культуральный фильтрат

Нативный туберкулин После осаждения ТХУ После переосаждения сернокислым аммонием

1. Белок 0,7 0±0.02 0,81±0,03 0,83±0,01

2. Полисахариды 0,06±0,01 0,07±0,01 0,06±0,01

3. Липиды 0,06±0,01 0,08±0,01 0,07±0,01

4. Аллергенная

активность 50тыс. Т.Е. 50тыс. Т.Е. 50тыс.±2500

5. Потери нет 45-47% 78-80%

Представленные в таблице 1 материалы свидетельствуют о том, что при содержании в нативном туберкулине 0,70+0,2 мг/мл белка, концентрация полисахаридов, липидов, нуклеиновых кислот не имеет достоверных различий с "очищенным" туберкулином. Соответственно возникает вопрос - от чего необходимо очищать нативные ал-лергеноактивные вещества туберкулопротеина? В то же время по утверждению Д.Т.Леви (1987) активность туберкулина в кожном тесте

1 з

ГЗТ связана в основном с белком, но также и с низкомолекулярными пептидами, соединениями белка с липидами, полисахаридами и др.

Исходя из вышеизложенного следует, что в основе изготовления нативного синтетического туберкулина положена экономически выгодная, экологически безопасная технология, позволяющая устранить использование ядовитой ТХУ кислоты, ряда трудоемких и энергоемких процессов и обеспечить получение с 1 литра исходной жидкости до 10 тысяч диагностических доз вместо 500-600 доз туберкулина -ППД.

Исследование активности нативного туберкулина на различных моделях сенсибилизации морских свинок и крупного рогатого скота

Согласно действующей документации, по определению биологической активности туберкулина, испытание проводится на моделях гомологичной сенсибилизации. Для этой цели используют обычно аллергизацию морских свинок живой вакциной БЦЖ и больной туберкулезом крупный рогатый скот. Сравниваемые туберкулины считаются равными по "силе" если отношения суммы реакций на испытуемый и контрольный препараты соответствуют 1,0±0,1. При этом не предусматривается анализ полученных результатов. Не предусматривается контроль препаратоб и на моделях гетерологичной сенсибилизации. Такое положение вполне применимо при испытании серий одного и того же вида туберкулина. Но при испытании туберкулина полученного при изменении технологии его изготовления целесообразно, на наш взгляд, проведение контроля его специфической и биологической активности как на моделях гемологичной, так и гетерологичной сенсибилизации.

С учетом вышеизложенного испытание активности и специфичности нативного туберкулина провели используя следующие модели сенсибилизации животных убитыми культурами микобакте-рий: бовис, авиум, БсгоМасеит , попсЬгото§ешсит.

Результаты контрольных испытаний специфической и биологической активности опытного образца нативного синтетического туберкулина в отношении туберкулина РРД- млекопитающих приведены в таблице 2 и 3.

м

Таблица 2

Результаты испытания туберкулинов на морских свинках сенсибилизированных разными видами микобактерий в тест-дозе 5 Т.Е. (п-5)

Туберкулин Средние размеры реакций в мм при сенсибилизации

бовис авиум всегоЫасеит попсУ1готодеп1сит

РРД 11,3±0,7 6,2±0,5 6,2±0,6 6,6±0,8

Нативный 11,2±0,5 5.8±0,7 5,9±0,4 5,8±0,7

Достоверность Р>0,05 Р>0,05 Р?0,05 Р>0,05

Таблица 3

Результаты сравнительного испытания на морских свинках специфичности туберкулинов при использовании в качестве тест-дозы 25 Т.Е.

Туберкулин РРД Нативный Достоверность Средние размеры реакций в мм при сенсибилизации

боаис авиум зсегоМасеит попс11готодеп1сит

18,2±0,7 17,9±0,8 Р>0,05 10,1+0,65 9,8±0,6 Р>0,05 9,8±1,0 7,2±1,1 Р<0,05 10,1±1,0 8,3±1,1 Р<0,05

Таким образом, результаты исследований показали, что размеры эритемы реакций на туберкулин в дозе 5 и 25 Т.Е. у гомологично сенсибилизированных морских свинок, как и следовало ожидать, были практически одинаковыми, т.к. не имели достоверно значимых различий.

Различия между средней величиной реакций в дозе 5 и 25 Т.Е. не имели статистически значимой разницы и на моделях сенсибилизированных птичьим видом микобактерий. В то же время интенсивность реакций на препараты была достоверно ниже на моделях гете-рологической сенсибилизации атипичными микобактериями. В частности, достоверно значимые показатели по интенсивной кожных реакций были получены на моделях сенсибилизации М.зсгоГи1асеит и М.попсЬгото§еп1сит в тест-дозе 25 Т.Е.

Тем не менее, следует признать, что модели сенсибилизации морских свинок могут служить лишь близкой имитацией тех процессов, которые происходят в условиях естественного инфицирования у крупного рогатого скота. В то же время, мы решили проверить спе-

цифическую активность данных туберкулинов в разных тест-дозах и на моделях искусственной аллергизации молодняка крупного рогатого скота.

Исследование специфической активности в разных тест-дозах нативного туберкулина на экспериментально аллергизированном крупном рогатом скоте

Целенаправленную аллергизацию крупного рогатого скота провели автоклавированными культурами микобактерий бовис, ави-ум, БсгойИасешп, попсЬгоп^ешсит путем подкожной инъекции суспензии состоящей из 10 г. микобактерий, 10 мл. гидроокиси алюминия, 80мл. физраствора из расчета 5 мл. на животное.

Изучая специфичность аллергических реакций на туберкули-ны использовали в тест-дозах 5 и 10 тыс.Т.Е. Результаты испытания специфичности туберкулинов на моделях указанной аллергизации крупного рогатого скота приведены в таблице 4.

Таблица 4

Результаты сравнительного испытания туберкулинов на экспериментально аллергизированном разными видами микобактерий крупном рогатом скоте.

Кол-во Вид Выявлено реагирующих животных со средней

жив-х сенсиби- интенсивностью кожной реакции в мм.

лизации РРД - млекопитающих Синтетический РРД - птиц

10тыс. Т.Е. 5тыс. Т.Е. Ютыс. Т.Е. 5тыс. Т.Е. 5тыс. Т.Е.

25 М. бовис 25 24 25 25 2

9,1 ±0,4 5,4±0,4 8,8±0,4 4,9±0,2 3

25 М.авиум 11 5 9 3 25

4,4:10,4 3 4,3±0,1 3 3,5±0,4

25 М. БСгоТи- 21 3 12 3 10

1асеит 4,7±0,3 3 4,5±0,4 3 3,3±0,2

25 М.попсЬга- 22 5 11 6 9

тодешсит 4,2±0,3 3,4±0,2 4,1 ±0,2 3,2±0,4 3,3±0,2

Из данных, приведенных в таблице 4 следует, что оба туберкулина обладают практически равной биологической активностью в тест-дозах 10 тыс. и 5 тыс. Т.Е. при исследовании гомологично сенсибилизированных животных. Тем не менее следует подчеркнуть, что при снижении аллергенной активности РРД-туберкулина до 5 тыс. Т.Е. существенно повышается диагностическая ценность при исследовании гетерологично сенсибилизированных животных. В част-

ности, в 2 раза меньше реагировало животных сенсибилизированных М.авиум, в 7 раз - М^сгойЛасешп, в 4 раза - М.попсЬгоггк^ешсит.

При этом интенсивность реакций составила в среднем 3 мм, против 4,4 на тест-дозу в 10 тыс. Т.Е.

При использовании нативного туберкулина в тест-дозе 10 тыс. Т.Е., относительно туберкулина - РРД в аналогичной дозе было выявлено реагирующих соответственно 81,8% аллергизированных М.авиум, 57,1 - М.зсгой^асеит, 50,0% - М.попсЬгото§етсшп без достоверно значимой разницей в показателях интенсивности реакций.

Относительно туберкулина РРД в тест - дозе 5тыс.Т.Е. на на-тивный туберкулин в аналогичной концентрации реагировало 60% животных аллергизированных М.авиум, 100%-М.БсгМасеит, 80%-M.nonchromogenicum.

В то же время нами получены результаты свидетельствующие о высоких специфических свойствах туберкулина РРД-птиц. Так, при исследовании животных сенсибилизированных М.бовис только у 2 бычков наблюдалась реакция в пределах Змм утолщения кожной складки, что несомненно должно иметь определенное диагностическое значение в дифференциальной диагностике специфических реакций на туберкулины для млекопитающих.

Следует отметить, что относительно специфичности показаний реакций на РРД-млекопитающих и нативный туберкулин у гетероло-гично сенсибилизированных животных, последний имеет вполне определенное преимущество в отношении количества выявляемых реагирующих, без достоверно значимых показателей в интенсивности аллергических реакций. Это дало нам основание для проведения специальных испытаний туберкулиновых аллергенов в разных тест-дозах непосредственно в производственных условиях неблагополучных и благополучных по туберкулезу стадах.

Испытание активности туберкулинов в разных тест-дозах обусловливалось обстоятельством повсеместной аллергизации крупного рогатого скота атипичными микобактериями и, как следствие обилием реагирующих на туберкулин животных. В связи с чем в нашей стране стал вопрос о снижении вдвое концентрации туберкулина в диагностической дозе. Сама по себе такая постановка вопроса не нова и, в практике туберкулодиагностики разных стран с учетом эпизоотической обстановки по туберкулезу, фоном парааллер-гической сенсибилизации, уровнем ведения животноводства применяют разные диагностические дозы туберкулина (П.П.Овдиенко, 1988).

Поэтому, по вполне понятным обстоятельствам это, пусть и не основное направление в нашей работе, имело место при испытании активности и специфичности сравниваемых туберкулинов. С другой стороны проведение подобных исследований обусловливалось еще тем обстоятельством, что согласно действующему положению регламентировалось применение в симультанной пробе, для дифференциации парааллергических реакций, РРД-птиц или KAM соответственно в 2 и 4 раза уступающих по аллергенной активности РРД-млекопитающих. Значительные различия по аллергенной активности между этими аллергенами, тем не менее, до последнего времени не брались в расчет, что по нашему мнению не совсем оправдано.

Затронув проблему дифференциации парааллергических реакций мы провели анализ исследований по определению туберкулиновой чувствительности у животных, стационарно неблагополучного по туберкулезу стада, при снижении аллергенной активности сравниваемых туберкулинов с 10 тыс. Т.Е. до 5 тыс.

Таблица 5

Сводные данные испытания активности и специфичности ралныч тест-доз туберкулинов на больном туберкулезом крупном рогатом скоте совхота «Поныровскин»

Серия опытов Количество исследовании X животных Выявлено реагирующих животных с интенсивностью кожной реакции в мм

РРД- млекопитающих Нативный туберкулин РРД - птиц

10 тыс. Т.Н. 5 тыс. Т.Е. 10 тыс. Т.Е. 5 тыс. Т.Е. 5 тыс. Т.Е.

Первая серия опытов, май 1990 г. -.1) первая туиеркулишпация 6) повторная на 72 часу 1000 903 97 11,1 + 1,3 97 6,7+1,1 97 10,8+1,9 97 6,6+0,7 5 3 мм

Вторая серия опытов.

февраль 1991 г.

а)первая т>беркулинизация 1X62 207 198 207 199 2

10,2+1,2 6,2+0,9 9,8+1,4 6,0+1.1 3 мм

6) понтормая па 72 часу 1655 7 14 6 12 3

8,1+0.4 7,7+0.6 7.0+1,1 6,9+1,3 3 мм

Результаты исследований (Таблица 5) показали значительную вариабильность показаний доз-тестов внутрикожной пробы, Так, количество реагирующих больных туберкулезом животных в летний, наиболее благоприятный для организма животных период, было одинаковым на сравниваемые туберкулины в дозе 10 тыс. и 5 тыс. Т.Е. При этом интенсивность кожных реакций при испытании туберкулинов в тест-дозе 5 тыс. Т.Е. в 97% случаев было выше 5 мм. При проведении аллергических исследований в зимний период наблюдалось снижение иммуноаллергического состояния организма животных, выражавшееся в неполном выявлении количества инфицированных животных на первое введение туберкулинов как в дозе 10 тыс. Т.Е., так и в тест-дозе 5 тыс. Т.Е. Повысить диагностическую ценность аллергического метода исследований в этот период удавалось при повторном , на 72 часу, введении туберкулина. Тем не менее на тест-дозу туберкулинов в 5 тыс. Т.Е. выявлялось 98-99% реагирующих животных в неблагополучном по туберкулезу стаде относительно числа реагирующих на туберкулин с активностью 10 тыс. Т.Е. Причем это относилось в равной степени как к туберкулину РРД, так и к нативному. Следует отметить, что количество реагирующих на туберкулины РРД и нативный в дозе 5 тыс. Т.Е. с интенсивностью кожных реакций 5 мм и выше составляло 88%, а на туберкулины в дозе 10 тыс.Т.Е.-92%. В целом незначительные различия между количественными показателями, а также довольно высокий уровень чувствительности больных туберкулезом или инфицированных М.бовис животных на туберкулины в тест-дозе 5 тыс. Т.Е. послужили основанием для проведения подобных исследований в благополучных по туберкулезу стадах.

Ретроспективный анализ данных туберкулодиагностики, с применением туберкулинов с разной аллергенной активностью, выявил значительные колебания результатов во внутрикожном тесте. Детальное изучение причин этой вариабельности позволил выявить следующее. Число реагирующих на туберкулин РРД-млекопитающих в дозе 5 тыс. Т.Е. составляло в среднем 55-60% в отношении количества реагирующих животных на дозу в 10 тыс. Т.Е. Эти данные в целом согласуются с выводами А.Х.Найманова (1993), полученными им при проведении собственных исследований. В то же время количество реагирующих на нативный туберкулин в дозе 10 тыс.Т.Е. также составляло 50-60% от числа реагирующих на туберкулин РРД в аналогичной дозе.

Таблица 6

Испытание специфичности туберкулинов в разных тест-дозах в благополучных по туберкулезу стадах.

Наименование хозяйства Исследовано животных Реагировало на туберкулины

ППД - млекопитающих Нативный ППД-птиц

Ютыс. Т.Е. 5тыс. Т.Е. Ютыс. Т.Е. 5тыс. Т.Е. 5тыс. Т.Е.

Гвардеец 47 21 23 17 74

960 5,8±1.1 4,2±0,9 5,2+1,1 4,2±0,7 5,6±0,8

Дружба 142 75 82 65 356

972 6,1 ±0,8 4,б±0,8 5,9±1,1 4,5±0,9 5,7±1,2

Путь к комму- 114 40 47 33 178

низму 1982 4,9±1,2 3,7±1,3 4,7±0,8 3,2±0,8 4,9±0,6

Кр. Октябрь 73 21 39 18 131/КАМ

МТФ Сухая 1615 4,6±1,2 3,4±0,7 4,4±1,1 3,3±0,5 4,6±0,8

МТФ Б,- ниэов- 43 13 21 5 86

цеео 820 4.7*1,2 3,2±0,8 4.610.8 3,3±0,5 4,8±1,1

Эти данные согласуются с выводами В.П.Урбан (1991), Н.С.Козлова, А.Н.Зинченко (1985); Б.Ф.Керимжановой (1995). Количество реагирующих на нативный туберкулин в тест-дозе 5 тыс. Т.Е. составило 30-40% от числа реагирующих на РРД в дозе 10 тыс. Т.Е. По всей видимости тест-доза туберкулинов в 5 тыс. Т.Е. является близкой к минимальной туберкулиновой чувствительности при исследовании крупного рогатого скота в условиях нашей страны и, на данном этапе вполне может быть внедрена в практику туберкулоди-агностики по крайней мере в благополучных по туберкулезу хозяйствах. В то же время следует отметить, что попытки провести дифференциацию кожных реакций применяя в симультанной туберкули-низации туберкулины для млекопитающих и птиц даже с равной аллергенной активностью не имели успеха ввиду большого количества несовпадений реакций на данные диагностикумы и недостоверной выраженности их интенсивности. Выделение в 2-3 раза большего количества реагирующих животных на птичий туберкулин или KAM, по сравнению с туберкулином для млекопитающих, позволяет более уверенно судить лишь о общем парааллергическом фоне сенсибилизации нежели с туберкулезной инфекции.

Полученные данные о большей специфичности нативного туберкулина во внутрикожном тесте были подтверждены и во внутривенной туберкулинизании, основанной на провоцировании температурной реакции у больных туберкулезом животных.

Применение внутривенной туберкулинизации нативным туберкулином позволило установить заболевание крупного рогатого скота туберкулезом в 11 хозяйствах Курской области с ранее невыясненной эпизоотической обстановкой по туберкулезу. Достоверность положительных температурных реакций при внутривенной туберкулинизации во всех случаях подтверждалась характерными для туберкулеза изменениями у убитых животных. Это свойство нативного туберкулина важно по той причине, что отечественный туберкулин РРД-млекопитающих был признан недостаточно эффективным для провоцирования температурных реакций у больных туберкулезом животных (М.К.Юсковец, 1963).

Таким образом, проведенная нами оценка диагностической эффективности нативного синтетического туберкулина во внутри-кожной и внутривенной туберкулинизации, позволила выявить преимущество данного диагностикума перед туберкулином РРД. Эти исследования подтверждены рядом ведущих исследователей нашей страны и стран СНГ и, что очень важно практической ветеринарной службой.

Простая, несравнимо дешевая по себестоимости, экологически безопасная технология получения нативного синтетического (безальбумозного) туберкулина, не уступающему по биологической активности, но превосходящему по специфичности туберкулин РРД, явились основанием для внедрения данного диагностикума в Эстонии и Казахстане, что служит хорошей предпосылкой для решения аналогичного вопроса и в нашей стране.

Теоретические, научные и практические подходы к вопросу получения и применения туберкулезного анатоксина для специфической профилактики туберкулеза в ветеринарной фтизиоиммунологии

Известно, что специфическая профилактика многих инфекционных болезней основана на применении соответствующих фор-молвакцин и формоланатоксинов (Г.Рамон,1964).

Иммунная система организма в ответ на введение антигена способна вырабатывать циркулирующие антитела различных классов, реагировать по типу ГЧЗТ, осуществлять иммунологическое запоминание антигена или стать не отвечающей, толерантной (5.КоЬепД.Шагс1 1983).

В настоящее время практически единственным специфическим препаратом, применяемым в иммунотерапии туберкулеза людей, является туберкулин (М.М.Авербах, 1976; Э.З.Мирзоян,1970).

Используемый для диагностики туберкулеза и специфической терапии туберкулин представляет собой экзо- и эндотоксин микобак-терий туберкулеза. Возможность получения туберкулезного аллер-гоида или анатоксина путем инактивации формалином аллергенных токсических свойств экзо- и эндотоксинов микобактерий туберкулеза не проводилась и не изучалась из-за "классического" представления о не стерильном иммунитете при туберкулезе.

Вышеизложенное обусловило проведение поисковых исследований по изысканию способа получения туберкулезного анатоксина и изучения возможности применения данного препарата для целей активной профилактики туберкулеза.

При получении туберкулезного анатоксина в первоначальных поисковых опытах использовали в отдельности сухой очищенный и безальбумозный туберкулины. Обработку аллергенов формалином проводили при относительно высокой температуре 40-43 С с учетом того, что туберкулин как продукт воднотемпературного гидролиза микобактерий туберкулеза обладает свойствами термостабильного токсиноаллергена, а реакция между формалином и бактерийными протеинами ускоряется и стабилизируется при повышенной температуре (Д.Ф.Горфункель-Кошкина, Н.Д.Воробъева,1977).

В наших исследованиях инактивация аллергенных и токсичных свойств туберкулина, содержащем в 1 мл 50 тыс. Т.Е. обеспечивалась 0,2% концентрацией формальдегида.

В дальнейшем, с учетом положительных результатов по инактивации аллергенных и детоксикации токсичных свойств туберкулина с активностью 50 тыс. Т.Е. в 1 мл 0,2% формальдегидом, было проведено изыскание, а в последствии качественное усовершенствование способа получения туберкулезного анатоксина и испытание его про-тективных свойств на морских свинках, кроликах, а затем на крупном рогатом скоте.

Испытание протективных свойств разных вариантов туберкулезного анатоксина на лабораторных животных

В начальных поисковых опытах испытывали туберкулезный анатоксин, приготовленный в отдельности из сухого очищенного безальбумозного туберкулинов. Однако защитный эффект был незначительный. Морские свинки и кролики имели явные туберкулезные поражения, по большинство из них оставались живыми в течение 2-х месяцев.

Для усиления иммуногенных и протективных свойств следующая серия туберкулезного анатоксина была приготовлена из смеси порошка очищенного туберкулина РРД и безальбумозного с общей аллергенной активностью 100 тыс. Т.Е. в 1 мл.

Заражение кроликов и морских свинок, подвергнутых двукратной иммунизации туберкулезным анатоксином, вызвало единичные туберкулезные поражения величиной с просяное зерно в печени и легких. Контрольные неиммунизированные анатоксином кролики и морские свинки погибли от генерализованного туберкулеза в течение 2-3 месяцев.

Для повышения протективных свойств, следующая серия-туберкулезного анатоксина была изготовлена из удвоенной концентрации порошка РРД-туберкулина (100 тыс. Т.Е.) и культурального фильтрата микобактерий туберкулеза с активностью в 100 тыс. Т.Е. в 1 мл. Таким образам, исходным началом при изготовлении туберкулезного анатоксина являлась смесь, состоящая из 2 г порошка туберкулина РРД и 1 мл культурального фильтрата с общей аллергенной активностью в пределах 190-200 тыс. Т.Е. в 1 мл.

При испытании данного анатоксина на морских свинках выяснилось, что подкожное введение препарата вызывало у части животных местные воспалительные реакции, они теряли в весе и их приходилось выбраковывать из опытов при заражении культурой М. бо-вис.

Тем не менее, двукратная иммунизация данным вариантом туберкулезного анатоксина 43 морских свинок и 27 кроликов в трех опытах предохраняла от заражения тех животных у которых отсутствовала отрицательная реакция на введение препарата. Таким образом, туберкулезный анатоксин обеспечивал устойчивость лабораторных животных к заражению не случайно, а вполне достоверно. В то же время причиной появления местной воспалительной реакции могла быть слишком высокая доза 0,8-1% концентрация формалина в препарате.

Данное предложение легко подтвердилось при параллельном введении морским свинкам концентрированного и разведенного 1:1 физиологическим раствором туберкулезного анатоксина. Тем самым создалась проблема усовершенствования способа изготовления туберкулезного анатоксина с целью исключения или максимально возможного снижения отрицательного действия прививочной дозы препарата на организм животных.

Снизить активность начального препарата и за счет этого уменьшить концентрацию формалина в конечном продукте не представлялось поначалу оптимальным вариантом по той причине, что тогда для усиления защитных свойств туберкулезного анатоксина потребовалось бы увеличить кратность или объем вводного антигена. Требовал решения вопрос исключения добавления в качестве токсина порошка туберкулина РРД в культуральную жидкость. Это обусловливалось тем обстоятельством, что с одной стороны технология изготовления туберкулина РРД связана с использованием химических средств воздействия на нативный туберкулопротеин, это существенно снижало его активность, а с другой стороны исходная, в 200 тыс. Т.Е. в 1 мл, аллергенная активность токсина требовала увеличения до 0,8-1% формалина для инактивации аллергенных и токсичных свойств конечного продукта. Решение проблемы было найдено за счет оптимизации способа изготовления туберкулезного анатоксина. В качестве исходного токсина использовали нативную культуральную жидкость микобактерий бовис с начальной, максимально возможной аллергенной активностью 100 тыс.Т.Е. в 1 мл. С учетом того, что 0,3% концентрация формалина обеспечивала инактивацию аллергенных свойств культуральной жидкости с начальной аллергенной активностью в 100 тыс. Т.Е. в 1 мл, перед нами стояла задача о доведении требуемой активности конечного продукта в 200 тыс. Т.Е. Решение этой задачи было достигнуто путем сорбции туберкулопро-теина культуральной жидкости на адъюванте и последующим декантировании 50-55% неактивной надосадочной жидкости. Таким образом, мы получали туберкулезный анатоксин с не меньшей, что и в предыдущем варианте его получения антигенной активностью, но концентрация формалина в нем не превышала 0,3%. Данная концентрация формалина в препарате не вызывала воспалительных реакций на месте подкожного его введения в дозе 1-2 мл морским свинкам и 5 мл. крупному рогатому скоту. Для наглядности мы проводим схему получения туберкулезного анатоксина.

Схема 2

Получение туберкулезного анатоксина

1. В культуральный фильтрат М. бовис с исходной аллергенной активностью 90-100 тыс. Т.Е. в 1 мл добавляют формалин до 0,3% концентрации и проводят инактивацию аллергенных и токсичных свойств при 45 С в течение 7 дней.

2. Сорбция анатоксина на 3% геле гидроокиси алюминия, добавляемой из расчета 25-30% к общему объему и декантировании 5055% неактивной надосадочной жидкости.

3. Расфасовка препарата по флаконам, стерилизация при 0,8 атм. в течение 30 минут.

Технологические преимущества изготовления последнего варианта туберкулезного анатоксина послужили основанием для проведения специального испытания на морских свинках.

Порядок экспериментального испытания предусматривал одну-и двукратную иммунизацию морских свинок ранее разработанным прототипом и последним его вариантом с последующим инфицированием опытных и контрольных животных культурой возбудителя туберкулеза шт. Балле в дозе 0,00001 мг. Для наглядности результаты эксперимента отображены в таблицах 7 и 8.

Проведенные клинические наблюдения за состоянием иммунизированных морских свинок подтвердило нашей предположения о том, что причиной местной постпрививочной воспалительной реакции у животных является слишком высокая, до 1%, концентрация формалина в туберкулезном анатоксине, полученном по предыдущему варианту его изготовления.

Таблица 7

Порядок применения разных вариантов туберкулезного анатоксина и влияние иммунизации на клиническое состояние морских

Группа Вариант туберкулезного кол-во Средняя масса морских свинок в гр.

Животны анатоксина и порядок животных До Через

его применения с местной прививки 30 дней ±

1. 2. 3. ТА инактивированный 1% формалином, доза 1 мл. подкожно, однократно Т.А. тот же, прививка двукратная с интервалом в 10 дней, в дозе 1+1 мл. ТА изготовленный по новому варианту, инактивирован 0,3% формалином, доза 1 мл подкожно, однократно Т.А. тот же, прививка двукратная с интервалом в 10 дней. 3 3+2 380±4 389±6 378±4 369±3 372±5 379±4 -11 -17 1

4. • 369±3 369±4 0

Применение в иммунизации морских свинок последнего варианта туберкулезного анатоксина не оказало отрицательного действия на организм привитых животных.

Полученные данные отражены в таблице 8 и вполне закономерно свидетельствуют о неоднозначном протективном эффекте наблюдаемом нами за иммунизированными животными после их заражения.

Таблица 8

Протективная активность туберкулезного анатоксина в зависимости от метода его изготовления, дозы и порядка иммунизации при испытании на морских свинках

Группа Пало с патологией туберкулеза Убито с пато- Характер

животных в период логией тубер- туб. Поражений

45-50 50-55 55-60 кулеза спустя при убое

дней дней дней 2 месяца животных

1 опытная 2 2 единичные туб.

Поражения в

печени

2 опытная - - - 2 то же

3 опытная - - - 2 то же

4 опытная - - - - -

5 контроль 4 3 2 2 множественные

в количест- туб. Поражения

ве 11 интакт- в печени и лег-

ных морс- ких

ких свинок

В первой опытной группе, однократно иммунизированный первым вариантом туберкулезного анатоксина, смертельный исход от инфицирования наблюдался у 2 морских свинок и еще 2 были убиты с патологией туберкулеза. Таким образом степень поражения туберкулезом животных этой группы составила 36,3%.

Во второй опытной группе, дважды иммунизированной туберкулезным анатоксином, изготовленным по первому варианту, падежа животных не наблюдали. Однако при убое морских свинок этой группы у 2-х из них обнаружены явные туберкулезные поражения в печени. Таким образом, степень поражения туберкулезом по этой группе животных составила 19%.

В третьей опытной группе морских свинок, однократно иммунизированных туберкулезным анатоксином, изготовленному по но-

вому варианту, случаев падежа животных не наблюдалось. Однако при убое 11 животных этой группы у 2-х из них обнаружены единичные туберкулезные поражения в печени.

В четвертой опытной группе морских свинок случаев падежа животных не наблюдали как и не обнаружено поражений и при убое этих животных спустя 2 месяца после заражения.

В контрольной группе морских свинок, спустя 40 дней после заражения начался падеж животных. При вскрытии 9 павших и 2-х убитых морских свинок этой группы во всех случаях подтверждалась патология туберкулеза.

При проведении бактериологических исследований возбудитель туберкулеза в бактериальной форме у животных 1-й опытной группы был выделен от 4-х морских свинок с клинической картиной туберкулеза и еще у 3-х животных этой группы в Ь-форме.

От животных 2-й и 3-й опытных групп возбудитель туберкулеза в бактериальной форме был выделен от 2-х морских свинок в каждой группе имевших туберкулезные поражения в печени и еще от 2-х в Ь-форме.

В четвертой опытной группе выделить культуру возбудителя туберкулеза ни в бактериальной, ни в Ь-формах не удалось.

Полученные нами результаты исследований позволяет сделать заключение, что различия в технологии сравниваемых препаратов, при равной их биологической активности, оказали значительное влияние на их протективные свойства при испытании на морских свинках. Эти результаты представляют практическую ценность по той причине, что при проведении испытаний в производственных условиях во все не безразлично какой ва-риант туберкулезного анатоксина будет использоваться для массовой иммунизации животных. Согласно наших данных для таких испытаний целесообразнее использовать последний вариант туберкулезного анатоксина. Иммунизация им не оказывает отрицательного действия на организм животных.

Результаты проведенного эксперимента послужили основанием для оформления заявки на изобретение "Способ изготовления туберкулезного анатоксина" N 96115761.

Полученные нами положительные результаты экспериментальных испытаний туберкулезного анатоксина на лабораторных животных послужило основанием проведения исследований по изучению иммуногенных и превентивных свойств данного препарата непосредственно на крупном рогатом скоте, для которого он собственно и предназначался в первую очередь.

Испытание туберкулезного анатоксина на крупном

рогатом скоте

В условиях эксперимента нами была проведена двукратная последовательная иммунизация 33 телят в благополучном по туберкулезу хозяйств, а для последующего наблюдения иммунизированных животных разместили на неблагополучной ферме вперемешку с больными активной формой туберкулеза бычками.

Иммунизация туберкулезным анатоксином вызвала существенную перестройку иммунного статуса организма животных. Так, уровень общего белка повысился с 7,5±0,42 г% до 8,95±0,40 г.%, уровень иммуноглобулина класса М увеличился с 2,5+0,4 мг/мл до 4,3+0,2. Наиболее показательным был рост синтеза иммуноглобулинов класса й, как показателя выработки специфических антител. Достоверное повышение наступило уже после первой прививки. Повторное введение анатоксина дальнейшее увеличение синтеза .^С до 34,5+0,6 мг/мл, против фоновых 19,2±0,5.

При исследовании животных внутрикожной туберкулиновой пробой аллергической настроенности не было и комплементсвязы-вающие антитела не обнаруживались. Полученные результаты согласуются с выводами Касьянова А.Н. (1987) при изучении влияния парентерального введения больших доз бруцеллина на аллергическую и серологическую перестройку организма здоровых животных.

После размещения иммунизированных телят на неблагополучной по туберкулезу ферме для сопоставления показателей иммунологического статуса мы принимали в расчет изменения в организме животных реагирующих и не реагирующих на туберкулин.

Характерным, на протяжении всего периода наблюдения, было стабильно высокое содержание в сыворотке крови реагирующих и не реагирующих на туберкулин опытных животных иммуноглобулина класса в , что свидетельствовало о длительном иммуногенном влиянии туберкулезного анатоксина на иммунную систему организма.

Уровень иммуноглобулинов класса у не реагирующих на туберкулин опытных бычков имел достоверно выраженный количественный показатель до 9 месяцев. В последующем прослеживалась тенденция к снижению уровня иммуноглобулинов этого класса. В сыворотке крови реагирующих на туберкулин животных уровень .^М был значительно выше чем у ареактивных. Установленные различия можно объяснить персистированием в организме животных в качестве антигена микобактсрий туберкулеза.

Следует отметить, что состояние ПЧЗТ к туберкулину было выявлено у 7 из 32 бычков спустя 8,5 месяцев содержания их в заразном изоляторе и не отмечалось стабильностью и продолжительностью. При переисследовании через каждые 2 месяца опытных животных, у 40-50%., ранее реагировавших на туберкулин, состояние ПЧЗТ на туберкулин не выявлялось. В то же время показатель интенсивности кожных реакций у 5 постоянно реагировавших на туберкулин опытных бычков имел хорошо выраженную тенденцию к снижению с 9,8+1,9 мм в 8,5 месяцев, до 8,0 мм в 10 месяцев и до 4,2+1,6 в 12 месяцев. Если принять во внимание, что состояние ПЧЗТ на туберкулин, спустя 12 месяцев, было выявлено у 9 из 30 оставшихся опытных бычков, на фоне всех реагирующих контрольных животных, то можно утверждать, что протективный эффект иммунизации составил не менее 70%, что в свою очередь соответствует требованиям предъявляемым к "убитым" вакцинам.

Следующий опыт нами был проведен на 8 головах молодняка крупного рогатого скота в специально построенном изоляторе.

После двукратной иммунизации животных туберкулезным анатоксином их подвергли искусственному заражению культурой М. бовис, штамм N 8 в дозе 10 мг. Одновременно подвергли заражению и контрольного бычка. Наблюдение за зараженными животными осуществлялось в течение 3 месяцев. За этот период было проведено 2 диагностических исследования.

При первой туберкулинизации, проведенной спустя 1,5 месяца после заражения, состояние ПЧЗТ на туберкулин было выявлено у всех 8 опытных бычков со средней интенсивностью кожной реакции в пределах 7,3+2,1 мм утолщения кожной складки против 22 мм у контрольного бычка. Туберкулинизацией, проведенной спустя 3 месяца после заражения, состояние ПЧЗТ на туберкулин было выявлено лишь у 3 из 8 опытных бычков. При этом интенсивность кожных реакций у них составила 2-3 мм. У контрольного бычка реакция на туберкулин сохранилась практически на прежнем уровне.

При диагностическом убое опытных бычков характерных для туберкулеза патологоанатомических изменений выявлено не было. У контрольного бычка был обнаружен начинающийся туберкулезный процесс в бронхиальном лимфатическом узле.

При проведении лабораторного исследования биоматериала в Курской ОВЛ ни у одного опытного бычка заболевание туберкулезом подтверждено не было (экспертиза N 3439-3447).

Полевые испытания иммуноэпизоотологической эффективности туберкулезного анатоксина нами были проведены в период с 1989 по 1995 годы в одном хозяйстве Курской и 8 хозяйствах Ростовской области с охватом более 6 тысяч голов крупного рогатого ско-та.Следует отметить, что накануне иммунизации в большинстве этих хозяйств, при выделении относительно небольшого количества реагирующих на туберкулин животных, тем не менее заболевание туберкулезом постоянно подтверждалось при диагностическом убое. Это несомненно свидетельствовало о неполном выявлении инфицированных и больных туберкулезом животных и об угнетенном иммунобиологическом состоянии у большинства из них, связанное в основном с неудовлетворительными условиями содержания и кормления.

Иммунизация туберкулезным анатоксином способствовала активации иммуноаллергического состояния у инфицированных возбудителем туберкулеза животных. В то же время, что на наш взгляд очень важно, как с эпизоотологической, так и с патогенетической точек зрения, при увеличении в первые 2-3 месяца после прививки количества реагирующих на туберкулин животных, тем не менее мы ни в одном случае не наблюдали обострение туберкулезного процесса у инфицированных животных, а наоборот, состояние инфицирован-ности сменялось полной элиминацией микобактерий из их организма. Об этом свидетельствует то, что состояние ЧПЗТ к туберкулину у таких животных носило непродолжительный период и, спустя 1,5-2 месяца, аллергия на туберкулин у них не выявлялась, за исключением больных туберкулезом, зараженных задолго до их иммунизации туберкулезным анатоксином.

При анализе иммунологических изменений в отдаленные периоды после иммунизации установлено, что у реагирующих на туберкулин животных показатель Т-супрессоров оставался практически неизменным, а Т-хелперов уменьшался последнее, по всей видимости наблюдалось за счет увеличения Т-эффекторов, ответственных за перенос ПЧЗТ.

Четко прослеживалась тенденция к снижению уровня иммуноглобулина у не реагирующих на туберкулин животных, при высоком его показателе у реагирующих, что объясняется персистиро-ванием в их организме микобактерий туберкулеза.

Результаты проведенных нами иммунологических исследований и эпизоотологического наблюдения за иммунизированными животными находившихся в условиях постоянного инфицирования их

организма микобактериями туберкулеза из окружающей среды свидетельствуют, что однократная иммунизация туберкулезным анатоксином индуцировала состояние иммунитета продолжительностью до 6-8 месяцев. Повторная реиммунизация этих животных, проведенная спустя 6 месяцев, сопровождалась более продолжительной, до года невосприимчивостью организма к туберкулину. Двух - и трехкратная иммунизация предохраняла животных от заражения и заболевания туберкулезом не менее 18 месяцев.

Исходя из результатов проведенных нами полевых испытаний туберкулезного анатоксина можно утверждать, что данный препарат обладает достаточно высокой эпизоотологической и иммунологической эффективностью, что открывает новые подходы к решению вопроса специфической иммунопрофилактики туберкулеза.

На основании проведенных исследований и полученных результатов и их обсуждения предлагаем следующие выводы и практические предложения.

ВЫВОДЫ

1. Разработан метод повышения выхода аллергеноактивных веществ туберкулина из определенного объема исходной культу-ральной жидкости, включающий добавление в биобутыли с биомассой микобактерий туберкулеза 1/4-1/5 части деминерализованной воды и повторном водно-температурном гидролизе при 1 атмосфере в течение 1,5-2 часов, что позволяет увеличить выход активного, повышенной специфичноси нативного туберкулина, с уменьшенным содержанием солей до 10 тысяч диагностических доз с 1 литра питательной среды.

2. Применяемые основные методы концентрации и очистки аллергеноактивных веществ очищенного туберкулина РРД-млекопитающих с помощью трихлоруксусной кислоты, сульфата аммония приводят к потере исходного препарата на 78-80%, при снижении его активности на 20-30%.

3. Нативный синтетический туберкулин, приготовленный без химического воздействия на аллергеноактивные вещества препарата по биологической активности, видовой специфичности равноценен производственным сериям туберкулина РРД-млекопитающих.

4. Доказана возможность повышения эффективности аллергической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота с помощью нативного синтетического туберкулина. В стадах с парааллергиче-

ским фоном сенсибилизации атипичными микобактериями или ми-кобактериями авиум использование во внутрикожной пробе нативно-го туберкулина обеспечивает, по сравнению с туберкулином РРД-млекопитающих, снижение на 30-60% и более количество реагирующих животных. Внутривенная туберкулинизация нативным туберкулином в дозе 200 тыс. Т.Е., обеспечивает в 90-100% случаев выявление больных туберкулезом животных и не вызывает десенсибилизацию чувствительности кожи.

5. В зависимости от эпизоотической обстановки аллергическая диагностика туберкулеза обеспечивается туберкулином с аллергенной активностью в 10 тыс. и 5 тыс. Т.Е. Внутрикожная проба туберкулином в тест-дозе 5 тыс. Т.Е. целесообразно для исследований в благополучных по туберкулезу стадах и в хозяйствах с парааллерги-ческим фоном сенсибилизации животных атипичными микобактериями или птичьим видом микобактерий туберкулеза. В то же время в неблагополучных по туберкулезу стадах однократная туберкулиновая проба в тест-дозе 5 тыс. Т.Е. является недостаточно информативной, в связи с чем необходима повторная, на 72 часу, туберкулинизация не реагирующих животных. Оптимальным вариантом, при исследовании неблагополучных по туберкулезу стад, следует считать однократную туберкулинизацию туберкулином в тест-дозе 10 тыс. Т.Е.

6. Детоксикация токсических и инактивация аллергенных свойств экзо- и эндотоксинов микобактерий туберкулеза положена в основу разработки способа получения принципиально нового вакцинного типа препарата, под названием туберкулезный анатоксин, не индуцирующего состояние ПЧЗТ к туберкулину у здоровых животных и не имеющего по этой причине противопоказаний к использованию в ветеринарной фтизиоиммунологии.

7. Подкожное введение туберкулезного анатоксина в дозе 5 мл. здоровому крупному рогатому скоту обеспечивает синтез иммуноглобулинов класса М и G на 10-15 день и сохранение высоких, достоверно выраженных показателей у вакцинированных животных при однократной иммунизации до б месяцев, а при двух- и трехкратной до 12 месяцев.

8. Продолжительность и уровень иммунитета в оздоравливае-мых стадах с использованием туберкулезного анатоксина может определяться сопоставлением количественных показателей сывороточных иммуноглобулинов М и G у реагирующих и не реагирующих

на туберкулин животных и при достоверно выраженной их разнице показана реиммуиизация поголовья оздоравливаемого стада.

9. Установлено, что при инфицировании микобактериями туберкулеза иммунизированных животных у последних проявляется непродолжительное, в течение 1-2 месяцев, состояние ПЧЗТ на внут-рикожное введение туберкулина, без перехода состояния инфицирования в развитие патологического процесса.

10. Экспериментальные опыты и результаты полевых испытаний туберкулезного анатоксина, проведенные в достаточно сложных условиях стационарно неблагополучных по туберкулезу хозяйств свидетельствуют о том, что данный впервые разработанный и апробированный препарат обладает хорошо выраженной превентивной и протективной эффективностью, что открывает новые подходы практического решения вопроса специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В целях повышения эффективности аллергической диагностики туберкулеза для внедрения в ветеринарную практику предлагается нативный синтетический туберкулин, полученный без химического воздействия на аллергеноактивные вещества биомассы мико-бактерий туберкулеза, позволяющий в нынешних условиях добиться на 30-60% снижения количества неспецифических реакций на туберкулин в условно-благополучных по туберкулезу стадах при полном выявлении больных туберкулезом или инфицированных микобакте-риями туберкулеза животных.

2. Полученные положительные результаты полевых испытаний нативного синтетического туберкулина и независимой экспертизы, проведенной Государственной ветеринарной лабораторией Норвегии, послужили основанием для внедрения в диагностику туберкулеза данного диагностикума в Эстонии.

3. Для первичной диагностики туберкулеза и дифференциации параллергических реакций на туберкулин в условно-благополучных по туберкулезу стадах предлагается внутривенная туберкулинизация нативным туберкулином в дозе 200 тыс. Т.Е., позволяющая в 90100% случаев надежно выявлять больных туберкулезом животных при абсолютном исключении неспецифических реакций.

4. С целью специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота предлагается впервые разработанный новый тип вакцинного препарата - туберкулезный анатоксин, не индуцирующий состояние ПЧЗТ к туберкулину у иммунизированных животных и не имеющий противопоказаний для применения в ветеринарной фтизио-иммунологии.

Однократная иммунизация туберкулезным анатоксином здоровых животных предохраняет их от заражения при инфицировании микобактериями туберкулеза в условиях неблагополучных по туберкулезу стад не менее 6 месяцев. Реиммунизация животных спустя 6 месяцев или первоначальная двукратная их иммунизация обеспечивает невосприимчивость к туберкулезу не менее 12 месяцев.

5.В целях обеспечения скорого оздоровления неблагополучных по туберкулезу стад рекомендуется проводить активную иммунизацию животных туберкулезным анатоксином на фоне ветеринарно-санитарных мероприятий, направленных на уничтожение возбудителя туберкулеза в окружающей животных внешней среды, тем самым свести к минимуму последующее инфицирование микобактериями туберкулеза иммунизированных животных и появление у них состояния ПЧЗТ к туберкулину.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Евглевский Ан.А., Евглевский Ал.А. Десенсибилизирующие свойства к туберкулезу биопрепаратов, содержащих формалин и фенол // Курский ЦНТИ, N220-86.

2. Буткин Е.И., Евглевский Ан.А., Евглевский Ал.А. Иммуноаллерги-ческие модели при туберкулезе в учебном процессе и эксперименте // Курский ЦНТИ, N225-86.

3. Евглевский A.A. Регламентация аллергической диагностики туберкулеза у сельскохозяйственных животных //Курский ЦНТИ, N355-87.

4. Вишняков С.И., Евглевский Ан.А., Левантовский С.А., Евглевский Ал.А. Аллергическая арреактивность к туберкулину при скармливании белково-минеральных добавок //Курский ЦНТИ, N260-87.

5. Евглевский Ан.А., Евглевский Ал.А., Киптилый Ю.П., Выдрин В.Н., Дубинин А.Н., Лебедев А.Ф. Противотуберкулезный анатоксин и его защитные свойства для животных //Курский ЦНТИ, N80-89.

6. Евглевский A.A. Диагностика специфически и неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота //Курский ЦНТИ, N152-90.

7. Евглевский Ал.А., Евглевский Ан.А., Дубинин А.Н. Изготовление и испытание безальбумозного. туберкулина для диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота //Курский ЦНТИ, N216-90.

8. Евглевский A.A., Дубинин А.Н. Результаты испытания противотуберкулезного анатоксина на крупном рогатом скоте //Курский ЦНТИ, N1-91.

9. Урбан В.П., Евглевский Ан.А., Евглевский Ал.А. Изготовление и испытание туберкулезного анатоксина //Курский ЦНТИ, N21-91.

10. Евглевский A.A., Дубинин А.Н., Холодов H.A. Результаты испытания туберкулезного анатоксина на крупном рогатом скоте //Курский ЦНТИ, N1-91.

11. Евглевский A.A., Дубинин А.Н. Протективная эффективность туберкулезного анатоксина при испытании на молодняке крупного рогатого скота //Курский ЦНТИ, N175-93.

12. Евглевский A.A., Дубинин А.Н. Применение безальбумозного туберкулина для аллергической диагностики туберкулеза //Курский ЦНТИ, N174-93.

13. Карелия С.Т., Евглевский A.A. Проявления неспецифических туберкулиновых реакций у крупного рогатого скота //Курский ЦНТИ, N107-94.

14. Евглевский A.A., Урбан В.П. Экспериментальное обоснование применения безальбумозного туберкулина для диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота //Мат.НПК., КГСХА, 1994. С. 31-33

15. Евглевский Ал.А., Евглевский Ан.А. К вопросу совершенствования технологии изготовления туберкулина //Мат.НПК., КГСХА, 1994. С. 50-53

16. Евглевский A.A., Пахоменко А.И., Епифанов A.B. Материалы экспериментального и производственного испытания туберкулезного анатоксина на крупном рогатом скоте //Мат. НПК., КГСХА,

1994. С. 47-50

17. Евглевский A.A., Киптилый Ю.П., Епифанов A.B., Ермакова Е.В. Достоинства и перспективы использования безальбумозного туберкулина во внутривенной туберкулиновой пробе при диагностике туберкулеза //Мат. НПК., КГСХА, 1994. С. 61-63

18. Евглевский A.A., Коваленко А.М., Стебловская С.Ю., Воробьева Н.В. Иммуногенные и протективные свойства вакцины БЦЖ и туберкулезного анатоксина при туберкулезе крупного рогатого скота //Курский ЦНТИ, N13-95.

19. Карелин С.Т., Евглевский A.A. К вопросу причин проявления неспецифических туберкулиновых реакций //Мат. НПК., КГСХА,

1995.

20. Евглевский A.A., Мотин В.В. Микобактериальные токсикоаалер-гены в основе получения анатоксина //Мат. НПК., КГСХА, 1995.

21. Евглевский A.A., Керимжанова Б.Ф. Диагностическая ценность, технологическая и экологическая безопасность изготовления безальбумозного туберкулина//Мат.НПК., КГСХА, 1995.

22. Евглевский Ан.А., Урбан В.П., Евглевский Ал.А., Мотан В.В. Экологический и иммунологические подходы к специфической диагностике и профилактике туберкулеза //В сборнике Современные экол. проблемы провинции, Курск, 1995. С. 90-91.

23. Евглевский Ал.А., Евглевский A.A. Протективные свойства туберкулезного анатоксина при испытании на крупном рогатом скоте //Тез.докл. НПК., Новосибирск, 1995. С.30-32.

24. Евглевский Ан.А., Евглевский Ал.А. Достоинства и перспективы использования безальбумозного туберкулина в аллергической диагностике туберкулеза //Тез. докл. НГ1К., Новосибирск, 1995. С. 6768.

25. Евглевский Ал.А. Оценка эпизоотологической эффективности полевых испытаний туберкулезного анатоксина в стационарно неблагополучных по туберкулезу стадах //Тез. докл. НПК посвящ. 100 летая Курской биофабрики, Курск, 1996. С. 108-109.

26. Евглевский A.A. Протективная активность разных вариантов туберкулезного анатоксина при испытании на морских свинках //Тез. докл. НПК посвящ. 100 летия Курской б-ки, Курск, 1996. С. 109-111.

27. Евглевский Ал.А., Дубинин А.Н. Оценка специфичности туберку-линов в зависимости от их дозы в неблагополучном по туберкулезу стаде //Мат. НПК посвящ 25 летию ф-та вет. мед. КГСХА, 1996. С. 19-22.

28. Евглевский Ал.А., Коваленко A.M. Оценка иммуноморфологиче-ских изменений в организме морских свинок при иммунизации туберкулезным анатоксином и БЦЖ //Мат. НПК посвящ. 25 летию ф-та вет. мед. КГСХА. 1996. С. 15-16.

29.Евглевский Ал.А., Дубинин А.Н. Иммунологическое состояние организма животных и вопросы интерпретации кожных реакций на туберкулин в благополучных по туберкулезу стадах //Мат. НПК посвящ. 25 летию ф-та вет. мед. КГСХА. 1996. С. 17-18.

30. Евглевский Ал.А, К вопросу изменения активности нативного синтетического туберкулина при длительном хранении //Мат. НПК посвящ. 25 летию ф-та вет. мед. КГСХА. 1996. С. 22-25.

31. Евглевский Ал.А., Дубини А.Н. Эпизоотологическая оценка полевых испытаний туберкулезного анатоксина в стационарно неблагополучных по туберкулезу стадах // Мат. НПК посвящ. 25 - летию ф-та вет. мед. КГСХА. 1996. С. 10-11.

32. Евглевский Ал.А., Коваленко A.M., Стебловская С.Ю. Оценка протективной активности разных вариантов туберкулезного анатоксина при испытании на морских свинках //Мат. НПК посвящ. 25 летию ф-та. вет. мед. КГСХА. 1996. С. 25-26.

33. Стебловская С.Ю., Евглевский Ал. А. Динамика изменений сывороточных иммуноглобулинов у крупного рогатого скота при иммунизации туберкулезным анатоксином //Мат.НПК посвящ. 25 летию ф-та. вет. мед. КГСХА. 1996. С. 35-36.

34. Стебловская С.Ю., Евглевский Ал. А. Активность Т-и В-системы иммунитета у здорового крупного рогатого скота при иммунизации туберкулезным анатоксином //Мат. научн. практ. конф., КГСХА. 1996. С. 39-42

35. Евглевский Ал.А. Исследование активности синтетического туберкулина на различных моделях сенсибилизации морских свинок //Мат. научн. практ. конф. КГСХА. 1996. С. 22-24

36. Евглевский Ал.А. Биохимическая характеристика и диагностическая ценность нативного синтетического туберкулина //Мат. научн. практ. конф. КГСХА. 1996. С. 14-15

37. Евглевский A.A. Оценка иммуноэпизоотологической эффективности туберкулезного анатоксина в условиях стационарно неблагополучных по туберкулезу хозяйств//Курский ЦНТИ. N150-96.

38. Евглевский Ал. А., Евглевский Ан. А., Стебловская С.Ю. Оценка протективных свойств туберкулезного анатоксина и динамика изменений иммунологического статуса молодняка крупного рогатого скота при содержании в условиях туберкулезного изолятора //Труды КГСХА, 1997 г.

39. Стебловская С.Ю., Евглевский А. А., Изучение протективных и иммунных свойств туберкулезного анатоксина при испытании на морских свинках // Мат. 9-й межгосударственной НПК. С-Петербург, 1997, 164 с.

40. Евглевский А. А., Стебловская С.Ю. Оценка протективных и им-муногенных свойств туберкулезного анатоксина на молодняке крупного рогатого скота // Мат. 9-й межгосударственной НПК. С-Петербург, 1997, 156 с

41. Евглевский А. А., Керимжанова Б.Ф., Судаков М.П., Коваленко A.M. Биохимическая характеристика и диагностические свойства ту-беркулинов, полученных различными методами// Мат. 9-й межгосударственной НПК.С-Петербург, 1997, 154 с.

42. Евглевский А. А., Коваленко A.M. Иммунноэпизоотологическая оценка эффективности испытания туберкулезного анатоксина в условиях стационарно неблагополучных по туберкулезу хозяйств // Мат. 9-й межгосударственной НПК.С-Петербург, 1997,110 с.

Методические рекомендации

1. Евглевский Ан. А., Буткин Е. И., Евглевский Ал. А. Методические рекомендации по диагностике туберкулеза животных // Курск - 1988.

2. Евглевский Ал. А., Дубинин А. Н. Практические аспекты первичной диагностики туберкулеза и дифференциации неспецифических реакций на туберкулин у крупного рогатого скота // Курск -1991,

1. Способ получения туберкулезного анатоксина. Положительное решение на изобретение № 96115761, 1996.

" " Положительное решение на изо-

Изобретения