Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Антигены Mycobacterium bovis и атипичных микобактерий, изучение и применение для дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота

АКАДЕМИЯ.' АГРАРНЫХ ЯШ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ

РГфОЕУС^Ш ШУЧЮ-ИССЛадСВАГЕЛЬШЙ ИНСТИТУТ эгажааггАльш ВЕТЕРИНАРИИ км. С, Н, ЕЫ1ЕЛЕССК0Г0

На правах дукописн

ЛЫСЕНКО Александр Пазловнч '

УДК 019:616.962.211-07:636.2/043/

АШШЕШ KÏCQ3ACTKRIUM B07I3 и АШ1ИЧНЫХ МИКОБАКТЕРИЙ, ИЗУЧЕНИЕ И . ПРИМЕНЕНИЕ ДЛЯ ДШЕРЕНЦИАЛШОЛ ДИАГНОСТИКИ ТУБ£РШЕЗА КРУГИ ЮГО РОГАТОГО СКОТА

16.00.03— ввтвркиаргзя микробиология, вирусология, опвэоотология, иккология и ихцунология

Ааторафор&т

.писсертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных таук

ukkch 1394

Работа ¡Еыполигиа в лаборатории туберкулеса Белорусского иаучио-ксеявдоаательского институте эксперикоктаньной Ботаринарки ей.С.Н.Еаазлвссйого

Официальные оппоненты: . Доктор ветерикарнах наук,|профосаорР.В.%зо»а Доктор мтеринарних наук, профзссор В.Й.Касый! Доктор ыеднцинскнх наук, профессор Д.П,Титов

Ведущее уьгрежсанка - Витебская академия ветеринарной меда-

■ ЦИНЦ

Защита состоится ". ■ '¿и*. 1994 г. в ^ п.

на заседании специализированного бовета Д.020.47.01 при Белорусской научно-кссяедовательском институте эксперкментаяь ной ветеринара ш.С.Н.Вшелесского (223020 Минский р-н д.Кун-цевчина ЕелШШВ)

С диесертацией ыояно ознакомиться в библиотеке БалНШЭВ ш.С.Н.ВыЕвлесского

Автореферат разослан « 1994 г.;\

Учэкый секретарь

специализированного совета

доктор ветеринарных наук, .

профессор В.и.Лктаж

ОБЦАЯ ХАРАК1ЕН1СТШ РАБОШ

Актуальность теш. Широкомаоатабшв мероприятия, проводница ветеринарной службой, улучшили эпизоотическую обстановку по туберкулезу крупного рогатого скота. Непредвидокным следствием этого явилось услоннение диагностики болезни. Возросло число рзагирукцих на туберкулин коров, но имевших изменений, свойственных туберкулезу. С другой сторона, стали изредка Ввспдакимту-бериулеза в благополучных и рецидивы болезни з оздоровленных стадах. Поэтому важно бкгтро и точно определять в каждом конкретном случае причину реакций на туберкулин для сохранения здоровых животных: я- недопущения распространения заболевания.

Известно, что массовые реакций на туберкулин связаны с инфицированием крупного иогатого скота атипичными иикобактеритак 7A.H.lliapoB,IS69,ISS9; О.В.Мартма, К.К.Тяхнас, 1975,1978; В.Е.%-ревсккй,Н.П.0здиенко,А.М.Кадоч1Ш11,1978; Р.В.Т^зова,1983;Ю.Я.Кас-скч, ВДКочмарский, П. !1. Тихонов Л.С.Дончекко,1387; А. И.

Завгородний, 1987; И.И.Руиачик,1990/. Наряду с этим установлена возможность латентного течения туберкулезной инфекции и пар' систировашш возбудителя туберкулеза в Д-форкс, способного а ' опрздзленньк условиях давать рецидивы болезни /А.И.Кузин,1977; В.П.Урбан,1930; Я.Г.Киршгенхо,1984; А.Д.МусинДЭеб; В.С.йодосэ-зв,И. Н.Рубцова.К,Г.Кириленко, 1965/ Сочетание указанных явлений сучзсггешга Затрудняет прижизненцуэ и поскертнув диагностику туберкуязза, а таказ проведение рациоиальише профилактических . ыэр. ;

По своей сути трудности в диагностика связана с низкой ви-довойспеци^ичностьпдиагиостихумов и значнталмкм антигенным ■ родством микобактерий /А. Н. Шаров, 1982,I989;Dani el 1976; Наг-boe et al., 1979; Closs et al., 1930; Harboe, 1984/.

Прогресс в технике фракционирования макромолекул позволил в последнее время выделить рчд ошацешшх антигенов ii.bovia и Ы, tuberculosis Д. П. Яящонко ,С.А. Бобровпик,С. В. Ксш'ссарэняо, . 1991} Daniel, Anderson 1978;-Hagaí et al., 1931; Wife r et al., IS86; De Brisyn et al. Д€37/.Подуч®на цонокяояальные алтигоха к разим зпитешш ншгабаятзрхаямых аитяголов /И.В.Аццросов.И.А. Владимирский, Г.А.АлэЕС30ва,1939; Е.П. Л/щокко,С. А. Еобровник,Е. В. Горбатоктсо,1993; Coates ut al,, 1ШЗ; Kinàeri et al., Î934; Morris, Thorns, Davis, 1235; и <гр./.0д!£мю она ила но научались

на крупной рогатом скоте или в опытах на лабораторных моделях не показали преимуществ перед градационными диагностикумами.

ЫРВ70 - единственный индивидуальный антиген, испытанный в иммуноферментном анализе /ИйА/ на крупном рогатом скоте и овцах, продемонстрировал высокую специфичность, но сравнительно низкую чувствительность /кагЬов et ai/i99l/. Тем не менее, способ его очистки сложен и малодоступен в наших условиях. Поэтому актуальным остается получение вцсокЬспецифичшх диагностицумов и оптимизация методов их применения с учетом видовых и генетических особенностей иммунного ответа и инфекционного процесса у крупного рогатого скота* В этой связи необходимо знать наиболее важные для иммунной системы этого вида животных индивидуальные антигены м» bovis и атипичных микобактерий, разработать доступные методы их выявления и очистки, определить их диагностические свойства.

Из-за повышенной радиационной нагрузки на население районов, загрязненных радионуклидами, применение флюорографии ограничено. Известно, что И*А мояет использоваться в качестве альтернативного теста для массовой диагностики туберкулезе у чзловека/0ип1е1,0<гЬ-Ъаппе , 1907/. Диагностическая Ценность теста в первую очередь связана с качеством антигенов, поэтому целесообразно испытать полученные нами препараты антигенов и. Ьо vi з и ы.tuberси-loaiu ■ для выявления антител в сыворотках человека с помощью

Цель работы - изучение антигенного состава возбудителя туберкулеза и атипичных микобактерий, исследование свойств отдельных антигенов и иммунного огвета на них, совершенствование на этой основе иммунологической диагностики туберкулеаа, определение влияния генотипа на течение инфегарга у крупного рогатого скота.

Задачи исследований:

1. Разработать референс-системы для выявления, изучения, идентификации неденатурированных антьгенов M.tovis и атипичных микобактерий, значимых для имцунной системы крупного рогатого скота. "... ___■___■ ■ ■

2. Подучить высохоспецнйичнке препараты антигенов й антител, пригодные для диагностики туберкулеза и идентификации микобактерий в РВД и Ш.

3. Приготовить и испытать для аллергической диагностики туберкулеза препарат, превосходящий по специфичности ЛЦД зубарзу-

лин для млекопитающее.

4. Исследовать Иммунный споктр сывороток крови коров, большее туберкулезом и инЧицировашллх атипичными кикобактерияли, бы-яенкть влияние генотипа на некоторые показатели ишугаюго ответа и образование какроскопичесютх туберкулезных изменений.

ШШЛгЗЗ-£КШ!ШЗ_ЕЗ£2ХШ. Впервые разработаны референс-сист'з-ш для выявления в перекрестном гошунозлектрофорезе /ПйЗТ>/ 20-25 антигенсаи, ЪоуХз и атипичных ыикобактерий, значимых для иммунной системы крупного рогатого скота и определены их основные свойства. Изучен антигенной состав, активность и специфичность препаратов из разных • груктур возбудителя туберкулеза, а тагосе ППД туберкулина для млекопитающих, выяснены факторы, влияющие на них.

Впервые вши лена возможность получения из культурадьпого фильтрата препарата, содержащего наиболее специфичные для возбудителя туберкулеза антигены,и показано, что его фракция со средней молекулярной массой 24 кДА обладает высокой ведовой специфичное ьга в К5<».

Доказано, что одной из причин сравнительно низко!! чувствительности и специфичности серологических тостов, особенно с вы-^окоо'пгцетлая антигенами, является преимущественный синтез антител к -'ысок^молекулярным общеродовнм антигена}/ клеточных стенок и образозание иммунных коютлзксов легкосекрекфуотимися ко-лич-ественпо видоспецифичесгаши антигенами возбудителя болезни и синтезирующимися к ним антителами. С учетом этих особенностей сконструирована Тсст-система, позволяющая ди^Ьэрекц!фовать в 1Щ. зара^егаге возбудителен туберкулеза от инфицирования атиппчнжга ьшяобактершми.

Впервые разработан способ и технология получения препарата для аллергической диагностики туберкулеза,существенно пр^осхо-дящего по специфичности ППД туберкулин для млекопитающих.

С помощью Еысокоспецифичных диагностинумов установлена распространенность скрыто протекающей туберкулезной инфекции з стадах, благополучных по туберкулезу.

Доказана связь типа тршейерришв е гйедуеез-з» ответом я старостью образования макросяопических тубередетЕгшк ¡ззггвнешй 7

крупного рогатого скота. „_

По материалам работы подугееэ ажгорезге сгдкзтвзасхвэ "Отф»

соб получении видоспецифического антигена туберкулезных мико-бактериЗ" И372682 и четыре удостоверения на рационализаторские предложения. ' ■

QßäJiI33£S£§3_^Si!SH3l!QSSb_Eä&?ä. Разработанные наборы для IffiA, РЛД, очищенный спе .иЛический аллерген /ОСА/ позволяют с высокой точностью проводить прижизненную диагностику туберкулеза lípyniiorx) рогатого скота, исключать убой коров, инфицированных нетуберкулезными микобактершши и своевременно выявлять животных, зараженшлсы.bovis , дифференцировать микобактерии и их антигены.

. Предложенный набор для определен»! в И5А антител человека к антигенам гккоблктерий человеческого вида позволяет проводить быструю диагностику болезни, не прибегая к массовой йлюорографии,

Рейеренс-системы и ре.зеренс-прелараты могут служить для быстрой и объективной оценки штаммов што бактерий, диагностику-мов и изучения иммунного ответа.

Предложения для практики прошли комиссионные проверки и апробации в БелНИИЗВ им.С.Н.Вишелесского, Республиканской ветеринарной лаборатории» хозяйствах республики, в Институте пульмонологии Министерства здравоохранения Республики Беларусь.

Главгел! управлением ветеринарии и КТС Минсельхозпрода Республики Беларусь /протоколы ÍÍ4 от 21.11.90г., ÍÍ2 от 7.04.92г./ утверааены:

- Технические условия, временная инструкция по изготовлению и контролю, Браненное наставление по применению "Тест-системы /набора/ для дифференциальной диагностики туберкулеза крупного рогатого скота в ИМ";

- Лабораторный регламент получения и временное наставление по применению очищенного специфического аллергена /ОСА/ из ШД туберкулина для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота;

- Временная . инструкция по изготовлению и контролю положительной контрольной сыворотки и гамма-глобулина к антигенам ш-кобактерий 1-1У группы по Раиьоку для очистки специфических антигенов /аллергенов/, контроля специфичности антигенов возбудителей туберкулеза в тест-системах для Й5А и ЩЦ; '

- Временная инструкция по изготовлению и контролю положительной контрольной сыворотки к антигенам возбудителей туберкулеза для контроля их активности в РЭД и Ж>А.

- Технические услозия, временная инструкция по изготозлени» и контролю, временноз наставление по применению "Набора для дифференциации гикобактерий в ¡^Д". • ■ '

Рекомендации по применению ЩЦ с набором антигенов микобак-терий для дифференциации реакций на туберкулин у крупного рогатого скота одобрены Западным региональным отделением ВЛСХШЛ.

-¿ПРЗ^ИШЯЛ^ЗГ^ Основные результаты исследований доложены; на Ученом совете БэлНИИЭЗ /1984-1993/, на Всесоюзных координацл-' онных совещаниях /1987-1990/, на подсекции ветеринарии НТС Минсельхозпрода Республики Беларусь, на Ш Республиканской научно-практической ко&оеренцки "Современные проблег.и профилактики зоо-нозных болезней и пути их решения" /Гродно, 1987/, на Всесоюзной научной конференция "Совершенствование методов государственного контроля ветеринарных препаратов" /Москва, 1991/, на Всесоюзном сешшаре "Совершенствование туберкулиновых препаратов" /Курская биофабрика, 1937/, на П Пленуме Белорусского научного общества иммунологов и аллергологов /Могилев, 1993/.

изГ&ШШШИ* По теме диссертации опубликовано 26 наунЯых" статей.

С^1^туса_и_дбъем_ди££§2££ШЗИ1. Диссертация изложена на 379 страницах машинописного текста, включает 33 таблицы и 72 рисунка.

Список литературы состоит из 342 источников, в том числе 172 иностранных.

На зал?:ту выносятся следугацнэ основой jjojQxgmjg:

1. Характеристика антигенного состава и наиболее значимых для икмушой система крупного рогатого скота антигенов п. bovin и атипичных кикобактерий. Рзференс-препараты для изучения антигенного состава и стандартизации диагностикумоб.

2. Иммуиохимические и диагностические свойства основных структур,про.цуктов лизиса и очищенных антигеновь:,bovis, u.tuber-ouioais , методу фракционирования антигенов.

3. Е1Д и ША дла дифференциальной диагностики туберкулеза и 'дифференциации культур микобактерий.

Технолог:и приготовления, специ фичность и диагностические свойства ОСА.

4. Особенности гуморального иммунного ответа при туберкулезе и инфицировании атипичными микэбактзрикмя. Проявление туберкулезной инфекции у т^лок с разными типами трансФерринов.

S '

Материалы и методы чсследовачкй

Основные исследования выполнены в лаборатории туберкулеза Белорусского НИИ экспериментальной ветеринарии им.С.Н.Выпэлесско-го и хозяйствах республики в 1983-1493 гг.

Ц^ЬУУРЫ__В работе использовали 25 эталонных

и производственных штаммов микобактерий 14 основных вцгов /ВГШИ, 1ЩШТ/, 60 культур, вццвлеиго'х от реагироьавших на туберкулин живо тшх и объектов внесшей среды.

Ш2ИК22М§Ше_ацтисенов_и2_ма£обактер1}24- Бакмассу микобак-терий инактивировали <т>енолом /0,5-3^/ или на гамма-установке с Со /0»4У./рад/. Культуральше жидкости стерилизовали фильтрацией через "05" пластины фи.;ьтрь'3ейтца,

¡.'лкобактерии разрушали ультразвуком /на УЗДН-I при 15-35 кгц/, механически /на дезинтеграторе JI.I7.0C0.0ITC/. Лнтигеш из клеток и клеточных стенок экстрагировали ЗМ KCl, и,25% водным раствором фенола и 0,1-0,5% растворами тэина РО или тритона XI00.

Антигены концентрировали диализом в целофаковых мешках против полиэтиленгликоля /ПЭГ-П5/ и с помощью лиофшмзацж на установке Пиша IA МРГ/.

Содержание белка определяли по биуретовой реакции, по связывали» кумасси голубого ü -250 и по Лоури /1955/.

В исследозкниях использовали разные серии ЛПД туберкулина для шекч-литамси-:, для птиц, комплексного аллергбаа из атипичных микобактерий /КАЙ/ Курской биоЪабрики, ППД туберкулины изы. tuberculosis; T-3~4ü и :.:.'fcovi_ /ЛйнйИКВ"./, туберкулина фирмы iiif-fa Г.лгхйих К ii-U-jv/akia Zaklaäy przeayalu Bi о we ternary jne-go.

n^fSSffilg ■■ Wf ЩЗЗДЙШЙК» Оптимальную схему тюриммунизацив отрабатывали на 103 кроликах и б баранах. Референе-сыворотки получали на 6 головах молодняка крупного рогатого скота живой массой 150-200 иг, которых гнперишудазировали смесями дезинтвгра-тпб негретой бакмассы и концентрированных кульа„ралькцх жидкостей ы,bovis Valloe /п*3/ и атн.ичных микобактерий 'ii.kaasa-ii Ü4/74, K.scrofulaceum 52ё, U.avlun 1бОЗ, К.intrazellulare 5868, K.fortuituai 342, М.phi ei 1i:J9, B.fortuitttiiiHffllT/, диейергиро-. .вашшми ультрэзвунбы в неполном вдьюЕаще фре?.еда/1:3/.

Ахтгжл вводили в дозе 200-250 мг?/кг, с интервала!® 7-15 . дней.Сыворотки*крови получали в сроки, определяете целями исследований.

Рзакцша иммунодиффузии /РУ1/ ставили в агаре Difoo на стеклянных пластинках 9x12 см, добавлял в буферный раствор З/ШГ и, используя штамп с центральной лункой диаметром 5 мм к гпэстью периферическими лунками в 5 мм от нее. После 48-S6 ч.инкубации пластинки от ивали раствором хлористого натрия, преципитата усиливали 0,07^ сульфатом кадмия.

Перекрестный ншуноэлектрофорез ДПШ^ проводили в DS агаро-зе sigma type ина веронал-мединаловом бу'ере /0,02/ piï 8,6 согласно рекомендаций Axeloen /1974/. Электрфореэ антигенов /50100 мкл/ в первом направлении вели при 10 в/см, а во втором -при 2-3 в/см в агарозе с антисывороткой /50 мкл на 1мл агарозы/. Гели после отжимания, отмывания и высушивания окрашивали 0,2'А ну-масси бриллиантовым синим r-250 / Plut а /.

. Для анализа индивидуальных антигенов и антител применяли.ва-•. риант ШЕЯ» с промежуточным гелем Л1Г/ в который вносили 100-200 - - ':Мкл исследуемого препарата. Результаты 1ШЭ5 ПГ интерпретировали

• ПО Aícel¡!tín /1974/. ■ > .

Антигенную нагрузку некощентрированнЕС элюатов, получелшх ' \ после гель-гиль трации или ионообменной хроматографии, о ri род s ля л л в слитном ракетном кмиуноэлектрофорезе ¿E025¿, которЛ! проводили "■'si* агарозе с референс-сывороткой lí.bovis /50 мкл/мд/. Для исследуемых элюатов з слое агарози без антиснворотки вырезали ряды лу-нок'/ГООмкл/. Электрофорез вели 16-18 ч.при 1-2 в/см.

Заставили на иммунологических панелях Dynatech . Для сорб- ,

• цни антигены и антитела растворяли в 0,1М карбонат-бикарбонатнсм

. буфера /КББ/ и инкубиробзли в лунках 10-12 ч при +б,..+8°С. Панели блокировали 0,5% сывороткой крови кур или бычьим сывороточном альбумином /ША/.

После каждого этапа внесениякомпонентов панели отмывали 0,ЗМ раствором хлористого натрет рН 8,3-8,6 с 0,2?» твжа 20 /?еггак /.

Для визуализации реакции использовали антквидовке перокси-дазные кокьюгаты /НТО "Инициатива"/, субстратом служил ортофевя-лендигшин /0,4 мг/мл/ и перекись водорода. Реакцию останавливала IH серной кислотой и оценивали в единицах ептич. еской плотности /Ш/ таспсктро^ото!.:егро Я--580 Dynatech при 492 ям.

1ШЕ22$В§3-ХВ2К312СВ§ФВ8» Исследования выполняли па набора хроматографического оборудования фяр.т LIS /Швеция/,

rsSsriMbSBâîffiRJ проводили на коленках 2,6x65 сц и 2,6x25 см,

на ультрогеяях АсА 54, 44, 34, 22 , 202 согласно рекомендаций, фирмы изготовителя /LKB/. , V .

Для определения молекулярной массы колонки калибровали по плкцли декстрана голубого /2000/, Хс° кролика, меченного ФЩЦ /190 «Да/, гемоглобина лошади /77 кДа/, ША /57 кДа/, овальбуш-на /43 кДа/, пероксидазы хрена /40 кДа/, трипсина /24 кДа/, цито-хрома С /13,8 иДа/. • .

Иммуноглобулины'ввделяли бесколоночный . методом на ДЕАЕ-сеЪадексе или на колонке с ыолселек-toíí А-25 и ДВДЕ-целлвдозойХ.$римель, 1979/.

При фракционировании антигенов мнкобактерий применяли ступенчатую элюцил 0,005-IM растворами хлористого натрия или К-фосфат-ного буфера рН 7,5.

¿•Й'УЗ-Ш-ХК'-'а-ЗЗГВаХ'ИЗ• Для очистки наиболее специфичных антигенов возбудителя'туберкулеза из гамма-глобулиновых фракций ан-тиснеопоток к антигенам атипичных ыикобактерий получали иммуно-сорбенты с no'-oqbn глотарового альдегвда по Avrameas, Terninelc, /1374/. •

Антитела к u.bovie , в том числе к ввдоспецифическим антигенам очищали с помощью иммуносорбентов на основе активированной сефарози /phairancia /, к которой присоединяли антигены u.bovie или смесь антчгенов шкобактср;:!' 1-1У группы по Раньону /антиген I-DV. "

■.2aSESB2Í¿BS2 проводили в стандартных трубках, в 7-1550 поли-акрил'содздноы геле /НААГ/ по Oavic/1%4/; в трубки; и в блоке 12,5У» ПААГ с ДСН по LaerJ-i IS74.

■ Антигенную нагрузку фракция определяли, инкубируя гелевые колошей в агара с антисывороткааи; • '

: рркус^тхуугцс^ • осуществляли по Yfrisht /1969/ в

стандартных трубках с ТО'ПААГ и аы*олкнами рН 3-10 7 LKB/.

¿¿Ш-Щ^^-В-аИЗЗА^й^-ИШЛШ^^С^ТЗЛг^аВ 1К осажда-, ли из сывороток ПЭГ-П5 /3,2S£/, дис;ошп:ропали в 0,1Н уксусной кислоте и фракционировали на уяьтрогеле Л-2. Антигенную и антительную активность эЛюатов анедизироваяк в ЖА.

Цодопмгше.тавотще. Опыты по разработке F/Щ, Ж? А, ОСА в заполнены:

на 36 головах крупного рогатого скота экспериментально зараженного 'или гипер1ш:.:ушзироБанного кмкобактеряшли разшх

ьвдов; . .."

-на 493 здоровых коровах, не реагирующих на ППД туберкулин; . -на 9395 коровах о реакциями на туберкулин из 139 неблагополучных и благополучных по туберкулезу хозяйств 28 районов республики.

5!Л22К2Ы5_Ее2ВИ_ггаЗ£Йх При разработке тест-системы для диагностики туберкулеза у человека использовали 23 сыворотки крови лздей с известными (формами туберкулеза, а также 69 сызорогок крови клинически здоровых доноров, которые лобезво предоставили кандидаты медицинских наук Л.К.Суркова и Л.<5.Яковлева.

Влияние генотипа на течение туберкулезной инфекции определяли на 15 тзлках с типам* трансферринов АЛ, ДЯ, АД, которых содержать в контакте с животными, зараженными К.Ьо-^ю. СП^.

Определение типов трансферринов в!"полнено сотрудниками Белорусского 1Ш1 яивотноводстла И.С.Плешкевич и В.И.Леткевич.

Телок исследовали аллергически ППД туберкулином и КАМ, а также серологически а ЩЦ с видоспецифическии антигеном ц.ъо-. /ШАБ/. '

Степень распространения макроскоптоеских изменений учитывали на вскрытии животных. Обсемененность лимфатических узлов и легких возбудителем туберкулеза определяли посевом патматериала .на-среду Лепеютойна-Иеисена.

Б2Б22Ш2'Л2ГЦЗ§2222_1!2£Л2Д222Ш!§ патматериала и определение вцдовой принадлежности культур выполняли согласно "Наставления по диагностике туберкулеза кивотных" !■'. 19С6.

Л-форс.ы ггикобактеркй выявляли, согласно рекомендаций й.В.Ко-заленко /1984/. Зэдоврэ принадлежность ввделенных Л-$орм определял!} в иммунофлюоресцентной микроскопии и в реакции ко-агглютина-ции со з^арН.аигеио , нагрузенккм очищенными антителам! кролика к Евдоспецирическим антигенам возбудителя туберкулеза бычьего вида.

Статистические данные, обрабатывали по Е.В.Моицевичюте-Эрин-гепе /1964/.

СОЕСТВШЙЫЕ ИССЖЩОВАНЙЯ

I. Получение антисивороток для 'изучения антигенного состава шкобактеряй.

Получение активных антисывороток о антителами к максимальному числу неденатурированных антигенов иикобактерий разных видов

;. . ' - ": э

необходимое условие для изучения антигенного состава микобакте-риЯ. 3 опытах на 108 кроликах, 6 Саранах и 6 головах крупного рогатого скота было установлено, что иммунны!: ответ к наиболее широкому споктру антигенов дает гипериммунизация инактквированными О,5-ЗИ фенолом или гамма-лучами, дезинтегрированными микобактерия-ми, смотанными с. культуральшми жидкостями. При 7-II-кратных инъекциях: таких препаратов с неполным адьювантом фра Лада /1:3/ и с 7-14-даовшад интервалами были получены активные специфичные кроличьи аитисыворотки к 14 видам микобакторий, бараньи - к 5 видам и бычьи - к li.bovis Vallée , а также к смеси антигенов 7 основных видов атипичныхмикобактерий /антисыворотка 1-1У/..„;■

В ВЩ и ПИ35 с гомологичными антигенами аитисыворотки образовывали соотпетственно по 10-12 и Z0-25 преципитатов. Сопоставле-Ш1в антисывороток в ГОШ показало, что иммунная система каядого вида животных неодинаково различает и дает антительный ответ на антигены микобактерий. Наряду с различиями в концентрации л аф-фшшости в бараньих и кроличьих антисыворотках отсутствовали антитела .к 2-4 разновидностям антигенов, на которые крупный рогатый скот давал выраяенный ответ. Это подтвэридает мнение Chase, Kaplan /I960/ о необходимости использования антисывороток того веда кивотных, для которого разрабатывается иммунологическая диагностика и даагностнкумы. Поэтому основные исследования были выполнены на бычьих рефвренс-сыворотках, состоявших из равных объемов сывороток разных особей н сроков взятия крови. Замороженные или лиофилизированные референс-сылоротки в течение б лет давали в ГОШ повторявшуюся картину преципитатов и демонстриро-гали стабильную активность в л5Д.

2, Реферэис-системы антигенов возбудителя туберкулеза и атипичных микобзктераЯ, ебцеродовьм, видо- и группоспецифические антигена

Б качестве референс-антигенов применяли препараты, использовавшиеся при гипериммунизации, но после удаления из них нерастворимых частиц клеточных стенок. В ПИЗБ с референс-сыворотками они давали хорошо воспроизводите спектры преципитатов, кадцый .■■ из .которых получил свой номер. Свойства антигенов, представлен- , пых отдельны;® преципитата!« изучали по влиянию на mr* антигенов v. антител разной специфичности, включаемых в промежуточный гель, В частности, для выявления перекрестно резгирущих зпитопов и

антигенов в ПГ включали антисыворотку или антиген 1-1У. Видоспе-цифические эпитопи м.'ьоуш обнирукичали с помоцьа а^шшо очищенных 1 в к видоспецн^ическии зпитопам.

На рисунке I представлен референс-споктр Ц.1оу1е УгЛЛео из 25 антигенов /преципитатов/. Установлено, что проципит&тн I к 1к образованы фрагментами клеточных стенок и содержат общеродовыэ антигены. П рентная 2, также кал I и 1н, был сильнее выражен в де-зинтегратах бакмассы и почти незаметен в культуральннх жедкостях. Он обладал ярко'выраженной перекрестной активностью и, судя по характерной форме и свойствам, являлся аналогом БЦЯ СО /О1ооа с г а!,, 1980/.

Актигеш 3 и 5 иногда образовывали обирй преципитат. Первый был явно обгцзродсвым, а антиген 5 содержал обц-эродовкэ и небольшое число видоспецифических эпитэпов.

Преципитаты 4,6,7 имели характерную форму и положение в голе первого направлегия. Онн активно реагировали с аитишвороткой 1-1У, хотя в антигене 6 были обнаружены ввдоспециЛическке п.'Штопы. Отличительной чертой антигенов 4,6,7, а тагом I и 2 бнла высокая иммунореактшшость. Имешго ка них начинался иммунный ответ при инфицировании и гиперикмуяизации микобактерияни. Пзп>стра~' ция начата иммуногенеза в И5А подтвердило низкую специфгагосгь этих антигенов.

Антигены, леаавшие е геле второго направления з той или пней степени обладали общородовыми эпитопаыи. Их концентрация была высока в антигенах 8,9,10,11,12,13,14, 18,19,20,21,22,РА. Антитела антисыворотки 1-1У, вклтаепшо в ПГ также влияли на антигены 15, 16-17 и 23, но в гораздо меньшей степени, чем ¡га предыдущие, Антигены 15, 16-17 выражение реагировали с бычьими 1е к ввдоспеци-фичвекш эпитопам ы.Ьот±з , и могли рассматриваться как количественна ввд0специ|)ичзскиэ антигены.

Анализ в рефрене-системе других штаммов М.Ьоу1аи м.4аЬег-оиХое1з показал, что антигенное родстю внутри айда составляет 92-95,а с близкородственным м.гиЬегса1оа1э - 87,Патогенные отаммн.отличались от ЕЦЗ по наличии и концентрации антигенов 16-17, 20, 22. У основного производственного атачма Р8 отсутствовал антиген 21 и отмечалась меньшая способность минорных компокдагаов образовывать ввдимыэ преципитаты с реферзнс-сыворот-

кой ы.ъоуаз г'а11в0.

Рис. 2 Роферонс-спектр антигенов атипичных микобактеряй /совместные исследования с аспирантом Т.Н.Агеевой/

Серологическая гомогенность возбудителя туберкулеза по ви-доспоцзфгаеским компонентам, регистрируемым э ИЩ с кроличьей . моноспециф.ической антисыворогкой м. bovis была подтверждена в опыте на 12 штаммах bovis и 3 штаммах к,tuberculosis . В исследован]шх культурах обнаружено по 4 идентичных компонента, два из которыз были термолабильны и теряли способность дреиипити-роваться антителами после автойлавирования. Видо специфически;? компоненты, примерно, в одинаковых концентрациях были представлены в основных разновидностях препаратов, приготовленных из указанных культур.

На рисунке 2 приставлен референс-спектр 20 основных антигенов атипичных г.;кобактерий. При введении з ПГ антигенов или антисшзоротки М. bovin установлено, что основная масса антигенов имзет иммунологическое родство с антигенами возбудителя туберкулеза. Лишь антигены AHI, AI08 и предположительно,AII0 и AI03 нэ стречались у M.bovla • .

3. Получение, фракционирование и о "-метка антигенов возбудителя туберкулеза млокопитажри:

Аитигеш получали из 3 штаммов ц.bovis / v-iiee , ¡83» CJIg/ и и.tuberculosis H^Uv; . После-выращивания на среде Сото-

на и ин: етив^ции фенолом tZ'A! бакмассу отделяли от культуральной жидкости и дезинтегрировали на УЗДН-1 при 22 кгц /УЗД/. Францию .клеточных стенок выделяли центрифугированием и подвергали дополнительной обработке ультразвуком /КС/. Из культуральных .фильтратов' ДЭ/получали преципитаты, осалдешше 4J» 'ГХУ к 5055 сульфатом амыспга. Кроме того, провели исследование фракции, выпадавшей в осадок при внетаивании культурального фильтрата с фенолом /ШШ/.

Полученные препараты, а также ПОД туберкулин, фракционировали на ультрогелях АсА54 и 44, получение фракции анализировали н Ш5 и ISA.

3.1 Оценка неочищенных и частично очищенных антигенов íá.bovia В ИЬА

Исследование препаратов проводили в IÍ5A с референс-сыворотками ы. bovis и I-C, а такие с - отрицательной контрольной сывороткой для РСК. Суммарную активность определяли по способности и-'явлэть антитела б максимальных¡ разведениях сывороток, пере-

крестную активность оценивали по интенсивности реакций с антисывороткой 1-1У, расчитывая нвдекс перекрестной активности /ША/Х Специфическую активность выявляли по отношению интенсивности реакция с антесыворотяоЯц.1,0т1и к интенсивности реакций с ан-ткскяороткой 1-1У /ИСА/Р

Установлено, что самая высокая суммарная активность была характерна для УЗД, но с не ГС коррелировала и наибольшая перекрестная активность, которая также была выражена у препаратов клеточных сяенок /КС/.

Продукта секреции а лизисе мшгобактерий, представленные в культуральяых фильтратах и ПГЦ|. туберкулине оказались специфичнее УЗД и КС. Дополнительное фракционирование Кг? ТХУ и сульфатом ам-кот-л достоверно на повышаю КСА преципитатов, но неояидашнм оказалось обнаружение достоверно большей специфической активности у преципитатов /ИТ5/, спонтанно выпадавших в осадок при выстаивании культ/ре яыагс I" штьтратоь штаыаоя ЛГаНое, У.^Кчй фенолом.

Анализ б ГИГА показал, что основу ®3 составляют высокоспеци-фичкке антигены 14,15,16-17, в то время как другие продукты КЪ одев? белее широкий спектр перекрестнореагируюцнх компонентов.

Выделение наиболее спешйичнвх препаратов ШЗ обеспечивает использование 6-8 недельных культуральных фильтратов И.Ьо\1а Уз1-

1вО

Простота получения делает ФШ> перспективным источников спе-цифичалС' ангкгенов, мингшалыю хонталнашрованных обя>ерсдовыми компонентами. •

3.2 фракционирование антигенов возбудителя туберкулеза по размерам молекул

При ^ракциоиировзиии ярелнратэз из возбудителя туберкулеза на уяьгрогело АсА54 :: 44 установлено, что их профили злюции были примерно одинаковы. На рисунке 3 представлен характерный профиль К& в сопоставлении с анализом эллатов в ВГФ и ИРА. Как видно, основная масса активных антигенов ассоциировалась с участком 6820 кДА» а эффективность их разделения была не. высокой. Индекс

и-. ИСА = ОПбов галар (ЯКУ

х „ щд - Ш1-1У , ШАар " Шконтр £

¡о гз го

г!

2 <1

30

номещ даммтоз

Рк.З. Рсгчлегагы гель-<?миг-аации Млгоу/з „з ультрогс,«

^ьЖ/Л

Рис.г/. Ргзулуеты зеаь-фнлет-

рации 9ТО7м.£оу15 Гл»» «а 7/ь?-рагеле АсА$ч и а/'аля?л закатов о II ИФД

л 15

га

•г-х-'ь-гг-Рие-& ИФА с ЯЛД таегр/сули-

ЛЗЛ ном О; ФПУ- %• гячитзм Щэ 1РГГ9

——норнальнз.я сыаояггкя

—— Яеугрзь'г-сыворот;« 1-(]/ --—"—ц

специфической активности влюатов, как правило, возрастал до фракции S2I, но достоверно не превышал показатель исходного препарата. Только при гель-фильтрации ¡015 штаммов Vaileo, SB,H37Rv удалось подучить активные высоноспецифичныз фракции. Как ввдно на рисунке 4 в высокомолекулярных злштах била сосредоточена основная масса перекрестно реагируюдих компонентов. С элюата №15 начинался рост специфической активности и снижение перекрестной, элюаты IPI7-2I /средняя м.м. 24 цДа/ практически не давали реакций в ISA с антисыворотками к антигена].: атипичных ыико-бактерий /Рис.5/. Испытание элзоатов И8-20 в ПИЗШГ показали, что содержащийся в них антиген образовывал базовую линию с антигеном 15, не влияя на другие преципитаты. Таким образом,высокая видовая специфичность алтигена 15,косвенно установленная в ШЭЗ^ была подтверждена в Й5А., а сам антиген выделен в иммунохшотче-ски одетом виде.

3.2 Очистка антигенов u.bovis на им-чуносорбентах •'•■■. с антителами к обцеродовыы антигенам

Работу проводили на ш.1муносорбентах, содержащих гамма-гло- ; булиновую фракцию антисыворотки 1-ЕГ. Фиксированные антитела связывали до 9054 бэлка комплекса исходных антигенов U.bovie , не затрагивая только антигены 15 и 16-17. С помоцьо гель-фильтрации очищенного препарата удалось разделить эти антигены и изучить их свойства. Установлено, что в РВД они не давали перекрестных реакций, а №А у антигена 15 они отмечены при разведении антисыворотки 1-1У 1:40, а у антигенов 16-17 прослеживались до разведения 1:400. IJo этому показателю они уступали антигену 15 очищенному из

Кроме того после инкубации на иммуносорбенте антигены конта-, минировались смывавшимися иш!уногдобул:шаш и их фрагментами. Это затрудняло использование очищенных антигенов /ВСАЕ/ в ША, но не препятствовало применения в К!£. - ,

4. Разработка и совершенствование средств и методов ,'■■■-., дифференциальной диагностики ту о еркулеза .;'.'■„-■

4.1 Изучение диагностических свойств антигенов шкобак-терий в Й1Д и опткщзациа параметров ее постанов!®

В опыте на крупном рогатой скоте, зараженном vi.bovi3/n=I8/, M,aviua /п=3/ li»lntracellulare /п=3/И.зсго£и1ьсаша /п=3/ установлено, что дезинтеграты и культуральные фильтраты при обычной постановке ЩЦ выявляли антитела в 40-10056 сывороток, но ве-16

рояткость определения вида мжобактзрий по числу линий преципитации была не высокой. ВСАБ, в отличие от неочиценкьэс антигенов, не реагировал с сыворотками крови животных, зараженных атшггчщ-ки «дясобактершши, но в 12,5-100% случаев выявлял животных, зара-жонных ¿1.bovis . Чувствительность И!Д с снворэткам; крови коров . из неблагополучных стад била ниже. Кодифицировав методику поста- . ковки реакции путем чередовали в агаре лунок исследуемых и силь-' :ок. положительных сывороток, удалось супрстээнш повысить ее чувствительность. В.опыте на 59 сыворотках крови коров неблагополучного стада и 2д сыворотках етвотнызс с парааллергическими peaic.-^wwi на туберкулин по оптимизированной методике была достигнута чувствительность £0,3.-3 при сьецифичности 77,в то врешг как показатели традиционного способа были соотвзтстаенш 9,4?6 и S4,b:!. При расчете показателя, исходя из данных вскрытия, чувствительность оптишзнроваиного способа достигала 85,7%.

4.2.1 Оценка эпизоотического состояния стад с помощью набора антигенов из микобакторий разных видов в

В период с I9S3 по 1990 г. с помощью набора антигенов /ВСАБ, U.£30r0fulnceum .là.aviuia , U.fortuitus! / В РДД ИССЛЗДОВШГО 5440 проб сывороток реагируварсс на туберкулин коров из 133 хозяйств/250 ферм/ 25 районов республики. Из числа исследовакачх, 477 сывороток реагировало с ВСАБ. 3 74Я сывороток были об-

наружены антитела к антигенам микобактеркй П-Df группы по Раньо-

Число проб pearapy»2pv;; п ЕСАБ коррелировало с ситуацией а стаде. В неблагополучных стадах этот показатель был.34,6% от числа реагирующих на туберкулин, в "сигнальных" хозяйствах - 22-26,(ТА, в благополучных стадах с достоверными результатами симультанной пробы не пракгаал

В большинстге случаев норовы благополучных стад, ензоротки которых реагирозали с ШАБ не имели на убое изыененлй, характерных для туберкулеза и при обычном бактериологическом исследовании из паткатериала не ввделяли возбудителя болезни. Тем не менее, при фазово-контрасткой микроскопии мазков с яичных сред и полужедкой модифицированной Среды Школьгаковой удалось обнаружить протс- и créponласты, которые по данным шшунофлкоресцен-цил и реакции ко-алутоткнации принадлежали вЛ-^формам возбудителя туберкулеза.

4.3 Разработка ®А для дифферент*,алькой диагностики ■ . туберкулеза* •

: . Постановка USA с неочищенными антигенами по общепринятому . способу, в принципе, позволяет отличи ь сыворотки крови интактшх животных от инфицированных микобактерияш, но дифференцировать заражение lä.bovis от инфицирования атипичными шкобактерияш из-за сильных перекрестных реакций практически невозможно. ' Для повышения специфичности показаний ©А был разработан способ связывания перекрестно реагирующих антител смесью антигенов' атипичных мккобактерий, добавлениях в буфер для разведения сывороток. Такой прием снижал на 40-50?» показания СП антисыворотки 1-1У, достоверно не влияя на активность;антисыворотки ы.bovis . На полевых сыворотках, из-за низкого содержания антител к ведоспеци-фическим компонентам, применекио приема было успешным при разведениях I:I0-I;50.

При работе с низкими разведениями сывороток было необходимо учитывать индивидуальную неспецифическую адсорбцию путем дополнительного исследования сывороток в лунках, блокированных инертным белком. В этом случае разница ыааду ОП а лужах обеспечивалась за счет антител, соединявшихся с антигеном.

Оптимизация параметров и приемов постановки Ш>А позволило разработать тест-систему, где калздая сыворотка исследовалась с диагностикумом, выявлявшем весь спектр антител, с эиш se препаратом, но в буфере с антигеном 1-1У и в обычном буфере с очищенным антигеном 15, Положительной считали реакцию, если превышение ОП, в сравнении с контролем в лукке с неочищенным антигеном былого?' и более, в лунке с буфером I-X.V /А/ - 1,4 и более и с очищавши антигеном''1,4 и более, В зависимости от активности коныогата и разведения сывороток абсолютные- значения могли быть другаш, но соотношение оставалось прежним.

Сконструированная тест-система в комиссионной опыте на 37 сыворотках крови коров с макроскопическими туберкулезными изменениями /19 сывороток любезно предоставлены кацд.биол.наук JI.M. Ходуном ВШИБШ/, 48 сыворотками коров о парааллергическими реакциями на туберкулин, 33 контрольныш и сывороткшм крови иитакт-кых животных показала чувствительность 835» /по очищенному антигену 15 - 3255/ и специфичность 90',£ /по антигену 15 -'36%/.

х - в выполнении исследований принимала участие аспирант Т.Н.Агеева

.Применение тест-системы в 21 хозяйстве республики показало, что в благополучных стадах число реагирующее в И&А колебалось от О до 2054 / в" среднем-И, 758/. В большинстве случаев /Р-СЬ'М роаяцни в ISA совпадали с реакцией в симультанной пробе з оценкой 'Ч" и В хозяйствах с угрояащеи ситуацией /единичные "сигналы", неопределенные результаты симультанной пробн/ число реагируя:;;;« в ША в среднем достигало 26,©а. В неблагополучных стадах в ИМ было выявлено 50/i коров от числа рзагкровавитх на туберкулин. У 9Z% таких животных на вскрытии бил обнаружен туберкулез.

По наблюдениям, ведулдемся с 1991 года езоевремз/шеа вцявлегше яквотных, реагировавших в Шгк и удаление их из стада способствовало поддэряанию устойчивого благополучия и во многих случаях коррелировало со снижением числа реагирукцих. яа туберкулин коров.

4,4. Эффективность антигенов при выявлении антител к возбудителю туберкулеза а сыворотках крови у человека

В IEA с сывороткой крови больного очаговым туберкулезом в -фазе уплотнения и пулом сывороток клинически здоровых доноров исследовали ППД туберкулина ы„tuberculosis - т-3840 и Балле -/ЛенШИБС/ ультразвуковые дезинтегратк, культуральные фильтраты 5ПЗ il.bovio и is. tuberculosis H^Rv , а также наиболее специфичный антиген с м.м. 35кДа, выделенный из 5П5 H^Rv .

Наиболее активными антигенами оказались $1® я УЗД U.tubcr-culosiaHjyRv / Ш 2,6-2,8/. В расширенном опыте на сыворотках людей явно больных туберкулезом УЗД показал чувствительность 10056, а ЦЩ только 5W, но при более высокой специфичности. Учитывая, что тест-система нужна для выявления опасного контингента, предпочтение было отдано более чувствительному ультразвуковому дезин-теграту.

При испытании разработанной тест-системы с 69 сыворотками клинически здоровых доноров была достигнута специфичность 8I& Из 23 сывороток людей с разными формами туберкулеза 20 давали положитель-ше результаты/чувствительность 86,9^/

Необходимо отметить, что 3 сыворотки больных, давшие отрицательный результат э IE?А реагировали з НЩ по оптимаэировагагому варианту. Вероятно в таких сыворотках антитела находи; сь в имиун-ннх комплексах и не выявлялись в ША, но могли участвовать в образовании прецшштата под влиянием антигена и антител положительной

сыворткн.

4.5 Особенности гуморального кыыуигаго ответа . пра туберкулезе и инфицировании коров ати-пячньавй микобактеривии

Моделирование дифференциальной диагностики в Й64 иа рефе-

ревс-сызоротках нэ представляет особь» трудностей, но при спонтанной туберкулезе,даже при оптимизации условий постановки реакции, очищенные вксокоспецнфкчкые антигзш дакт сравнительно низкий уровень чувствительности. Для изучения этого явления в ША и ШЭФПГ исследовали 43 сывороток крови коров с разным сгатусоы по туберкулезу. Антигена¿¡и для ИшА служили: >ЗД КС /клеточных стенок/, Кй, высокомолекулярная фракция /более 90 кДа/ выделенная из 1& при гель-фильтрации /БМа? Ш/, и очзгщенный антиген 15. В ПИЭй исследуемые сыворотки добавляли з ПГ и определяли по их влишяш иа преципитаты референс-спактраМ.'ЬогЗ.а наличие в них соответствуй:;)®: разновидностей антител, кымушш: кошяексов или свободных антигенов.

Ери характеристике» сухарного кыуукного ответа в ИМ установлено, что з скеоротках крова как больнкх туберкулезом, так и коров, шфадирсвкошх атипичными мякобоктераши превалирую? сити-тела к обв>еродовш, преимущественно," гыеокомолекуляриьй!, евдзаи-кш с шшточкшя стенкш«? антигенам, Тонка антитела выявлялась ^ КС с чувствительностью спеикф'дчностьо 0>£. ВШ КЗ -

соотсетствзшо 100> и 20%. У более специфичных К5 в антигена 15 показатели чувствительности были и 42^ при специфичности 70% и 100£. ■

Результаты Ш3£ ПГ сушировавд в таблше I. Из нее еидко , что сыворотки крови здоровых, не раагкрущ12с иа. туберкулкя животных окаэдааяи влияние преципитаты референс-спектра, указывающие на присутствие в шзс антител к рдау антигенов, особенно 1,3,5,6,7,21. 60£ сывороток сийаали высоту преципитата 15, но не вызывали продолжение его линий в ВТ. По-видимому о тот аффект не евлзак о антителами, так как в о антигеном 15 ати сыворотки на реагаровала.

Экспериментальное зараяонне части здоровых животных сопровождалось расширением спектра за счет антител к антигенам 8,14, 16,17. У хивотк с параадиергическими реакциями иа тубархулин

Таба.1 Частота встречаемости (%) з сыворотках крови коров антател, шыуншас комплексов» свободна антигенов, ркаэкващих гшюи на. преикпвтаты рефереис-слзктра возбудителя туберкулеза в Шс« ДГ

Группа , аиаэ тныг

Номера антигенов (преииштатов) раференс-спектра

Т7Г

.!„! - » „ } 12|13 116 к_ГГГ

М I г I 3 4 5 { б I 7 [ 8 } 12123 114 1X5 »18-119 120 {21 122 123 I К I I ! 11 I Г { I I I I I17 I I_I_)__1_I I;_¡,

Здоровые животнш (п»10) Ант:*.тела(%) ТО 60 80 30 60 80 70 Анедгени и

кммутшо 40 • :

комплекс» . • ■

20 ео?

58

Антктала

Антигоны и кннуннао |комплексы

33

17 33 17 34

17 17

20 20

%ф|ЩйроБа«1Ш атйяичнкми ыикобактерилми (п-12)

Актатвла 53 92 58 100 180 83 33 50 589 66? 33

Антигены и ' . „„ „ хшуюте 42 17 8 8 комплексы . -_____. _

25 8

Язрорааьно кнфииироЕаннко возбудителем туберкулеза 67 63 63 33 67 100 50 17 50 17 83

33

Спонтанно больные туберкулезом (д=12) Антитела 75 67 58 875 4233 8 8 8332550 25 8 Антигены и „ ■ иммушыз 17 67 17 50 33 33 33 8 75 67 50 8 8 го комплексы _____ ■_______

50

25 25 17 8 49

X - шндентнфиикрованшгв антигены

означалась больтзд частота встречаемости антител к антигенам

фи заражении к.Ъоу1о наибольший ответ танаэ иабладался на антигены 1-7, Кроме того, у части коров отаачалось достоверное появление антител к антигену 15. Другие изменения в рефзренс-спектре были характерны для присутствия в сыворотках свободных антигенов 4,7,13,14,15,16-17,20,21,23.и их комплексов с антителами.

фа спонтанном туберкулезе самой отличительной чертой была высокая встречаемость свободных антигенов, особенно, 4,6,14, 15,16-17 или их комплексов с антителами. Это проявлялось образованием характерных базовых линий, связанных с прешшитатада реферейс-спектра и иэ встречавшееся ври инфицировании коров атипичными кикобактериямн.

Таким образом,синтез антител при инфицировании атипичными шткобактериями и при туберкулезе вел почти га одинаковый спектр антигенов. Антитела к наиболее специфичным антиген возбудителя быстро включались в имыуташо комплексы в, поэтому,, вносили незначительный вклад в суммарную аятктельну» активность сшороток. Исходя из этого,для повышения эффективности диагностики целесообразно определять вэ.только'антитела, но и соответствующие антигены и их комплексы о антителами. В известной стеши»; это удавалось при постановка РЗД с применением сильных положительных сывороток, гдо позитивны» результаты бцяи получаны у 65,75« »изатшх с какроскоиическ'дии туберкулезными изиекзнай»5:.'

Присутствие спвшфиесхих антител и антигенов в шшуивде комплексах бшо доказано при их непосредственном выделении из сизороток больных животных, диссоциации, фргцгциояароЬашя» и анализе в ИЙА.

4,6 Выявление и дифференциация антигенов ыикобактераЯ: . в И&А, '

Согласно дашшм научной литературы /Д.Н.Гюрдаи-огяы, 1935/ а полученных нами рваультатов в щрова больньрс коров могут присутствовать свободные антигены возбудителя болезни. Дян ¡к опро-двлония в 'Ш. бшш исшаганы!

- способ учета изменения активности в ИйА рзфаронс-сшзорот-

кя H.^ovia псд действием субстрата содержащего аитаген?

- сзи.ъьич-четодо с чсподьэовашим очнщешзгс аффмной хромают рафией антител крол»:ка или быка к антигенам К. со vi о .

Установлено, что первый вариант бш более чувствительным я позволяя с удовлетворительной стогенью достоверности определять до 19 иг антигенов и.bovis . Сзцдви-Мйлоды показали чувствитель» кость в пределах 600-700 нг ;»-эа перекрестных реакций ксшер-чзскчх кокьлгатэв с антителами других видов животных.

Определение содержания антигенов показало, что при туберкулезе оно достигает 200-600 нг/мл. Однако сыворотки крови животшх, тестированные атиьичными никобактерлями гахх;е нередко давали высокие показателя Ой. Вероятно ото связано с наличием в них труднодеградируемых антигенов апяличных микобактерий или близкородственных микроорганизмов. На это указывают и результаты ШЭ5 ДГ, где подобные антигены были обнаружены у 20-401 исследованных особей (Табл.и. Следовательно и при поиске антигенов возбудителя болезни надо решать проблему перекрестных реакций.

Наиболее аффективно укаэаннуп проблему удалось решить при Идентификации иикобакгерий. Установлено, что используя в качество антигена для ИМ прогретые взвеси микобактерии в КВВ ыогно с помощь» очищенных аффинной хроматографией is к в идо спеи ифиче ск:а компонентам ¡л.bovis, и группоспепифяческоЛ сыворотки 1-1У со 100& специфичностью дифференцировать в И$А возбудитель туберкулеза от атипичных Микобактернй. Для осуществления реакции надо, по меньшей мере, 63 нг растворимых антигенов на I лунку или 100300 нкг бакиассы мякобактеркЯ.

Опыт на 51 культура* показал, что откокенке ОД с м.bovis к ОИ с группоспецкфическоЛ сывороткой 1-1У у культур возбудителя туберкулеза всо^яа больио 1,0 Д ,3-3,0/, а у «vnunwraac иккобактерай кэтвз 1,0 /0,2-0,6/.

Разработаншй набор для вденти^икздпи мадобакторкЯ в 1Ш успешно апробирован в Республиканской ваторанарвоЯ лаборауоряи п рекомендован к внедрения. Он позволяет сократить срок вденти-фикашш с 1-3 шсшеЕ до 2-3 дней, педлячкть бкепробу, сопрязсен-нув с опасностьп рассеивания инфекция «о вныгчеЯ ерздз.

" - исследования яшолнены совместно с аажрздтои Т.Я.АгвевоЙ

23

4.7 Разработка способов получения высокоспепифич-нызс аллергенов для дифференциальной дкагнос. >зси туберкулеза

Практика применения ЩЦ туберкулина для млекопитающих свидетельствует о его перекрестной активности. Б ШЭй установлено, что в его составе преобладают антигены 1,1н,2,3,6^11,13,14,15, 16-17, с также присутствуют, другие компоненты рефоренс-сяектра, потерявшие из-за тепловой деструкции способность преындитировать-ся антителами. Концентрация и набор антигенов варьировал от серии к серии, но в РВД с моноспеиифичесной акгасывороткойк.^о^е в образцах ЩЦ туберкулин Курской биофаорики всегда выявлялись 3 водоспецифических компонента аналогичные таковым зарубежных образцов препарата.

> При фракционировании ПВД туберкулин- в ШАГ, &ЖиАГ-ДСН, на ультро^ле Аса34,44,54, методом кзоэлектрофзкусирования установлено, что он представляет собой смесь сильно денатурированных молекул массой 200-5 кДа, из которое наибольшая часть сосредоточена » зоне 10-12 кДа. Изоэлектрические точки /р1/ белковых фракций 1Щ туберкулина были в пределах 2,8-4,6, поли-сахарвдныя 6,8-8,1.

Ори фракционирования ПЦД туберкулина с юмогцьп физико-хими-ческ!сс катодов в отличш от бноспетфтческих лз удалось получить фракций, достоверно прзвосходяирк по специфичности исходный препарат. Очистка ПЩ туберкулина иа кьшуиосорбеите с антителам»: к антигахаы атипичных ыикойактериЯ вола к связывания 70белка препарата, уыэиыпевкв числа вшшяозыыг с ПИЭ2 преципитатов с II до 2-3 и существенному повышена» н гомогегаюсти препарата. Если да очкетки белковый спектр ПОД туберкулина бия представлен дкффузгааз фракциями, распологаыжы..ся по всей голевой г мойке, то в очщениои аллергена /ОСА/ он состою; из одиой основной и 2-3 мелких фракций. Соответственно различались я профили а ледка исходного и очщашого препарата при гель-фкдьтрации гд удьтро-геде АсА54. Причем основная аллергическая активность ОСА сосредоточивалась в зона 30-20 «Да. Назкоиодекудяргай пик /менее 13,8 кДа/ бш практически кнортеи.

Вцсокая специфичность ОСА, получошюго очисткой из, иммуно-сорбеите, продемонстрирована в опыто на крупном рогатом скоте подкожно варахенноы какобактериямя разных в'^дов /Табл.2/.

1аблша 2

Группы зарахоных 1 Утолщения кожной складки в им

ЖЯВОТКЫХ {ЩД туберкулин . 10СА сер.32/2 1 10000Т.Е. 1200ккг в0.2 мл

I Интервал после заражения

1 бОлн. 1 90 дн ! 60 ли ! 90 ян

Ы.ЬОУ1В 11,3+1,0 6,3*0,4 8,3+1,5 5+1,2

iI.lntreoellul.are 11,2+1,2 3,6+0,4 1,7+0,4 0,2+0,2

ii.av1.um 5,3+2,1 3,5+0,4 0,340,2 0,3г0,2

На 1ЩЦ туберкулин реагировал» гшэотные, зараженные и атипичными ыикобактериями. ОСА выявляя только животных инфицированных возбудителем туберкулеза. Следовательно, очистка на км-муносорбенте позволяет подучить фактически строго спеиифкчный препарат для аллергической диагностики. Тем да менее,применение кммуносорбентов сопряжено с рядом технических трудностей, связанные с очисткой антител, подготовкой и регенерацией иммуно-сорбомов, контроля связывавдей активности. Дзэтому были проведены исследования во разработке методов имыунопрециттшии обща родовых антигенов ШЩ тубэряудиа свободиныи аятатаяами гам-иа-гдобулиновкс фракшФ бараиьик аитисыворотогс к.капзаоН , м, аого1о1аоеиш \M.aviua , ввделагакс Из них 1ц, еитасыворот-кя 1-1У и 1« 1-1У. Иммунопрешгапта* п растворсай иымунвнй комплекс осаадгли ПЭГ/4%/. В ряде случаев после амауногрзцапитаини препарата фршщпош.оваля на ультрогеле АсА54, Контролем, слузага ЩЦ туберкулин, в том числе обработанной гю|хлвькой енвороткой , крупного рогатого скота а ШГ, Исходи® доза препаратов после гмнуиопревипитЕики увеличивали ка. 25-35;?, учгэтзая связывание аляергсноаякш^нх веществ.

В опытах I» крупном рогатой сяотэ пжерял!указяровашоы V ы.ьот1а и антигеном 1-1У установлено, что сскодшЯ ■% обработай^ нормальной сывороткой а ПЗГ инзля пртггзряо одкнакосув активность.

Обработка 1ОД туборяуягса'аитагазани дастоЕЭрдо та пошва-

'.V: 25 ' г

жа. ero спеияфкчиости. &ффект наблюдался только посла удаления кммунопреишштата и растворимого иммунного комплекса, который при введении животным вызывал одинаковые ксдавга рзакиии как в группе животных» гиавриммукизированных íi.bovi» , так и антигеном 1-1У,

Степень очистки антител или удаление их избытка путем гель-фильтраики существенно не влияло на специфичность препарата, поэтому для имыунопрзиипитацкн полно было использовать или непосредственно аняюыворотки или их гамма-глобулиновув фракции о об®ательшш осаадекиеа нимунного комплекса ШТ. Вместе с тем, бета обнаружена, разиша в активности препарате.®, очищенных раз-шага способами. Из таблицы 3 вядна, что ОСА, полученный иммуко-прещиштацизй антисывороткой 1-1У» в условиях опыта был досто-вэрно активнее (К5Й) препаратов, очищенных та кыыуиосорбеита а кдаун&прецяпитадоеЯ le с последующей гель-фильтрацией. Это коррелировало и с данными полевых опытов (раздел 4.7.1).

Таблкаа 3

Группа кивот— I Утолщения кожной оюшдки в ш .,,... }¡KX IШЩ ту- 1 OCA I ОСА клгу- I ОСА маыу-I беркулин! юздносор-! норрешшита-I нопрзцилк-I !Сент 1рия Ig 1таыия а/с I 1 !+гель-фиьт.11-1У _-.1---1-;-1-ZJL-!-;---

1>лоримму:п!эи- ■

рованныо «?. ¿о-

и болыалз 7,3+1,3 3,^-0,5 3,5Ю,8 4,6+0,7

Туберкулезом ^ ~ ________**___.

Гиперимотдаш-рованяке 1-1У

и инфицирован. „

атипичными 3,5+0,6 1,3*0,5 0,840,3 0,4*0,2 адкобактериши

Активность разных серий ОСА, несмотря на коррекцию дозы, в условиях эксперимента и в неблагополучны« стадах составляла 38~46$5 от ДООООТ.Е. исходного препарата. Увеличение дозы ОСА по белку на 30-50$ не влекло заметного увеличения активности адларгичаезевх реакций. Вероятно это бшо связано с меньшей попуяшвей клонов клеток, учавствующих в кожной аллергической реакция. Исходя из ото го, стандартизировать ОСА надо не по об-'в]®Я актиБностЕ, а по критерии шдичия положительной реакции

(Змм и более) у животных, зараженных м.Ъоу1э и отсутствию их да эту ае дозу у особей, инфшированкл нэтуберкулезны!,я» кинобактериями.

В целом, несмотря «а то, что ОСА вшивал меньшие по интенсивности колотое рзакшш, в опыте по контактному заражения телок он прдемонстрировял большую эффективность в начальных стадиях инфекционного процесса (табл.4)

Таблша 4

J Время исследования после начала опыта

Препараты | £ндалено реагирующих на 3 мм и более в % от > числа исследованных__

! 7 I 16 1 31 ) ЕВ ! 94 I 207

1ЩЦ туберкулин 8,3 8,3 .8.3 16,6 16,6 83,3

ОСА 16,6 41,7 25 66,7 33,3 66,7

4.7.1 Испытание ОСА в стадах о разной эпизоотической ситуацией по туберкулезу

В благополучные стадах при введении ЛЦД туберкулина и ОСА 364 коровам были получены отрииательше реакции.

В неблагополучных по туберкулезу стадах из 428 коров на ШД туберкулин реагировало С9, При повторном исследования с применением ОСА рэахсии была выявлены у 40 коров (45$), но число реагироЕавдих на разные серии препарата было различида. Серия 146, очгецвиная иикунопреаягштаиией выявляла 1000 коров из числа обнаруженных 1Щ туберкулином. У 57 таких «ивояшк на у боа был найден туберкулез.

Йа сории 39/2, 13/1-3, очкцащшэ на имауносорбенте, реагировало 39£ коров. & них у 63,6$ на убое (5ши выявлены харадторныэ изменения или вццелека культура возбудителя туберкулеза.

Прижюткал- .о отличающийся результат был получек в 16 благополучных и оздоровленных стадах при исследовании 3&2 коров, реагйровавкос на ЩЦ туберкулин. При повторном виеденчи препарата коашыз "реакнии сохранились у 145 жяволвяс (42,4$). Кз их ягсяа на ОСА с утолщением конной скяадкн m 3 км и бол<з$

рзагароведо только 16 коров íll%) или 4,7% всего обследованного контингента. Суммарная интенсивность реакций на GCA составила 12,ВЙ от интенсивности реакций на ПЦЦ туберкулин.

* ' Шагопэлучиз стад бцло подтверждено при длительном наблщда-ши (2—10 лет), по данньм симультанной пробы, при^ослеубойной и блктер;млогшес:ю!5 диагностике.

, В стадах о неясной и угрожающей ситуацией по туберкулезу исследована 2171 корова, Б некоторых из шве впоследствии бш зарегистрирован туберкулез. В частности, в одном из стад реакции на ЛЦД туберкулин были выявлены у 37 животных, 12 из которых (32,4$) одновременно реагировали на ОСА. При диагностическом убое корови с утолщением к окно Г, складки на ЛЗД туберкулин ~ 7мм и на ОСА ~ 6ш в средостбнкоы лк^&тическсм узле была обдаружеца туберкулсзододобиая гранулема. Кз патматериала выделены условно стабильные 1-формн ы. bovis , зызнваватз аллергию к туберкулину л остаточные туберкулезные измзиения при пассаке на морских сшгках. Чороо 9 месяцев в стаде бш обнаружен классический вариант возбудителя.

Высокий урогень реагирования гд, ССА, как правило, коррелирует с iюблагоприятней! показателями симультанной пробы. Так, при очередном исследовании в стаде (400 гол.), где ранее отмечались мдссовыэ реакции на туберкулин,было ввделено 32 коровы, кз которых'- И реагировало на ОСА (56$). Результат скмультошюЯ пробы достоверно 'указывал на туберкудезнуа кн&кикя в стаде ("+и-25,- 7 голов). IIa убоэ у реагировавших обнаружена гиперплазия лимфоузлов к мелкие туберкулез оподобньга гранулемы, в которых били выявлены Л-формьг ы, bovis . ¿loела удаления опасного'контингента и дезпкйокили через 63 дня в стадо реагировало на ПЦЦ туберкулин Í2 коров и только I - ш ОСА (реакция совпала с оценкой "+"). При последующих проверках вкяелядиоь единичные кввотныэ с реакциями на ПЦЦ туберкулин и ОСА,

Подобные результаты получены и в друпк стадах, где симультанная проба достоверно указывала ка туберкулезную инфекции. Весьма характерным для стад с угрояаетцей ситуацией по туберкуле-sy бша высокая интенсивность реакций на ОСА, которая составляй! 62$ от такого показателя ШЩ туберкулина.

0 принципиальной разнице характера реагирования на ОСА в стадах с разным статусом по туберкулезу свидетельствуют рззудь-

2о ' , -

таты приведению в таблше 5, в которой сопоставлены даишо испытания оддах и тех же серий ОСА.

Таблица 5

Серия I Неблагополучные и угро- 1 шагополучнкв стада

I жаемкэ стада______I_

\% реагируй- !Средняя jmtsh-!$ реагирующих!Средняя интон-¡щих на ОСА !сивность peáK-hia ССА от чи-Гсивностьтааи-1от числа вы-1ций на ОСА т !сла выявлен. IииЯ на ОСА им _1 явлен. 1ЩЦ t _____ШД_ ) _

146 100Й 4,8 0 0

13/0-7 50, ■5,5 0,7

1-2/92 44$ 1,65 26.35S 0,7

3/92 65.7S6 2.7 0 0

65,IS 8,2^ 0,35*

' Во всех случаях число реагирующих и интенсивность реакыий в неблагополучные и угрожаемых стадам было достоверно вше* чем в благополучных. 3 целом резултаты испытания ОСА показали, что реакпия ка препарат, по меньлеЯ мере, в 89-95,3% случаев связаш. с икфкикроваипем животного возбудителем туберкулеза. Высокую видовую слепифэтность ШЩ туберкулина адсорбированного антисызороткой к.avium подтвердили и единственные в таком роде исследования, выполненные ка крупном рогатом скоте наа-аао : t rfL. (Г989).

Разработанный нами аллерген полезен, в дервуп очередь, для оперативной диагностики туберкулеза, особенно, в стадах с неясной обстановкой, где его применение позволяет ео стабилизировать при сохранении контингента животных, ^фазированных атапачными ыикобактеридаи.

ОСА мокко применять при "расшифровке" парадоксальных реакций в благополучных стадах. Лри исследовании таких янвотных реакиня с оценкой более, чем в половине случаев совпадала с реакцией на ОСА. По нашему мнении, как и в серологических тестах, это отлгйтся'подтверждением персистевдня возо'уди'гзля туберкулеза у животных благополучные стад.

С помощыа ССА можко получать объективную ^формацию о ходе и качестве оздоровления стад от туберкулеза.

&. Особенности проявления туберкулезной адвекции у ' коров с разными типами траксферринов

При изучении некоторых генетических факторов крови у крупного рогатого скота были установлены различия в генных концентрациях по аллелям трансферрикового локуса Т£А, Тг Д у больных и здоровых'животных (Б.А.Дкумков, И.С.Шешкевич, М.М.Григорьев, А.П.Лысенко, 1978). Для экспериментального подтверждения а то го нами проведен опыт по воспроизведению туберкулезной инфекции у телок с указанными тиаами трансфзрршов.

Из стада черно-пестрого скота благополучного по туберкулезу бшо отобрано по 5 телок с АА, ДД, АД. Но две толки с и г и!) , а также телку сгш заразили кшратрохеально №.. Остальных кивотных содержали совместно с зараженными.

В хода опыта на 16,31, Ш, 94,124 и 207 дань животных исследовали сшультанно ДЦЦ туберкулином и НАМ, в сыворотках крови с помощью КД определяли ентитеяа к ВСАБ.

Установлено, что у телок стив. аллергические реакции - встречались примерно в 2 раза чаще и с большей интенсивностью, чем у гшвоткда с ггдд и, наоборот, в группе с ггм в ходе опыта в 10 случаях были подучены лолоаигельню результаты РЗД, в то время как у телок с ата» их было только 5.

На вскрытии установлено, что проявлеиио туберкулезной ин~ факшзи также было различным. Если изменения, свойственные туберкулезу бкгш обнаружены ь загаоточгах, бронхиальных, средостениях и мэзентериаяьгак лимфатических уздах у телок с ход. , то жявотнш с шш изменения характерных дня болезни нз имели.

При бактериологическом исследовании возбудитель туберкулеза выявлен у животных всех групп. Наибольшая обсемененность отаачена у телок с Т£М.

В целом опыт подтвердил, что крупный рогатый скот с итбог-дев устойчив к кнфекпии. 8то коррелирует и с более вырадеша»и кодами реакциями, характерными генетически устойчивым животным (А.Ы.Мороз,А»С.Аат,Б.В.Иикоиэнао,1ШЗ), Вероятно, что обнаруженная устойчивость связана с активностью 1г-генов, сыешениш: с главной системой гистосовместимости, к которой относят гака, кодирующие тип тронсф-эррина. С другой стороны, резистентность мажет определяться шпосредствзшо функииокальндаи особенностями трансфферинов, с которыми вирулентные микобакгерки способны конкурировать за свободное аелезо, необходимое для кх размно 30

аения (Л.Л.Лазовская, Л. ¡.1. feray ¡t,.!533).

6. Выводы

1. При подкожной гапериммунизалии крупного рогатого окота нзгретнм■деэкнтегратами бакмассы и культуральнсЯ жидкости ми-кобактерй иммунная система крупного рогатого скота распознает и дает шт«нсквкьй1 гуморальный иммунный ответ на 20-25 основных антягонов.

-Днтисквороткк с указанным спектром антител пртодш s качестве реферзнс-препаратов для 1ЫЭФ к /Ш. при характеристике и стандартизация диагностикумсв, предназначенных для крутого рогатого скота.

2. С помощью ры{еренс-претратов в ШЗЗ идентаиро еajю 25 антигенов Miovia в разной степени обладавших иммунологическим родством с антигенами атипичных микобахтерай. В антигенах 15,16-17 преобладали вцдоспенифичвскиа эпигоны, определявшие кс высокую специфичность в иммунологических реакции.

Из 20 выявленное антигенов атипичных мккобактерий, по меньшей 1'зрз два (А1СВ, АШ), не встречались у возбудителей туберкулеза млекопитающих.

3. ¡Иммунологическое родство птаммов возбудителя туберкулеза бггчьего пида находятся в пределах Ш-95,8$, а с К.tuberculosis оно составляет не менее 37,^4.

Шкболее специфичны1 антигены присутствуют у всех изучен-.-пвс и- .ммов возбудителей туберкулеза бычьего и человеческого вида, но пх кониентргшия мокь-г бить различной.

4. Ультразвуков!» дез гн те граты я препараты га клеточках стенок отличаются .ксокой активностью пря выявлении анткмкко-бакториальнкх антител, ио содержат значительна нонвенгтраиии обцеродовкх антигенов.

Продукты^ секрепий и лизиса возбудителя туберкулеза более специфичны.: лаетиивание культуральтщх фильтратов штаммов Valles и Кб с 0,5-ЗЙ ^екола дает осадок, содерзсащйй активные еисоко-спеаифячшзз антигены, из которых при .вль-фильтрашш и отборе элюатов в диапазоне 30-2СкДа *ожно вцаелить антиген i5, : идентичный антигену полученному при хроматографии.

" Очищенный антйгея 15 отличается высокой «»эиифичноетыо и здтиеностьэ в И&1.

5. Гуморальный иммунный отве? у крупного рогатого скота как на il.bovia , так и на атипичные микобактериа характеризуется преимущественным синтезом и циркуляцией антител к низкой специфичным высокомолекулярным антигенам (1,2,3,4,6,7). Антитела к наиболее специфичным антигенам ¡¿.bovis , в 33-67% случаев циркулируют в составе иммунных комплексов или обнаруживаются в низких титрах только у 32-43JS животных.

6. Дифференцировать гуморальный им^кный ответ на зарвяе-наеii.bovia от инфицирования атипичными микобактерикмк с чувствительностью 8955 и специфичность» Ю%> позволяет тест-система для Шк, в которой сыворотки крови исследуются с антигеном, выяелящим весь спектр антител, в обычном буфере и в растворе с антигенами атипичных микобактерий, а тагске с высокоспецифичным антигеном 15 (24 кДа).

7. Применение очищенных антител к видоспецифкческим эпи-xonai: u.hovic и антисыворотки к груплоспецифическим антигенам атипичных микобактерий позволяет с чувствительностью 63125 иг и со специфичностью 1002$ дифференцировать антигены и культуры микобактерий.

8. В ПОД туберкулине для мдекодитанцкх присутствуют основные антигены культуральной кидкости ц. bovis , ио набор и концентрация отдельных компонентов у разных серий препарата может варьировать.

Бидоспецкфичзские компоненты отечественных образцов ППД туберкулина идентичны таковым, обнаруженным в туберкулинах зарубежного производства. ■

9. Связывание общеродових антигенов ПДЦ туберкулина свободными или фиксированными на иымуносорбенте антителами позволяет в 8-9 раз повысить его специфичность. При использовании свободных антител обязательны:,! условием является удаление им-мунопрсципитета и растворимого иммунного комплекса.

10. Специфическая активность ОСА связана с фракцией имеющей размеры молекул «в* 24 »Да. Молекулы меныгего размера ' активны в кожной аллергической пробе и серологических тестах.

11. Алдзргическая реакция па внутрикоаное введение ОСА

в 89-95,3$ случаев свидетельствует о связи иммунного ответа с инфицированием возбудителем туберкулеза. Особенно эффективен ОСА для ранней диагностики болезни, где его чувствительность

достовэрно превосходи? показатель стандартного ППД туберкулина.

12. Результаты применения высокоспецифявных препаратов э РИД, У&Ау во внутрккожной аллергической пробе показывакт, что во многих благополучных стадах на фоне широкой сенсибилизеции атипичными микобактериями туберкулиновые реакция в 8-12$ могут быть связана с латентной туберкулезной инфекцией. Основпй поддержания устойчивого благополучия з таких стадах должно быть своевременное выявление и удаление особей с неблагоприятными иммунологическими показателями.

13. ггео у крупного рогатого скота коррелирует с более высокой устойчивости к туберкулезу. У уязвимых яиэотных с мал в два раза чаче регистрируются положительные результаты в РВД.

Предложения для практики

_ Главным управлением ветеринарии и НТО Министерства сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь (протоколы }?4 от 21.11.90г., ¡К от 7.04.92г.) утмрадены НТЦ и временные наставления по применению на:

1. Тест-систему (набор) для дифференциальной диагностика туберкулеза крупного рогатого скота а ИЛА;

2. Очиаенчый специфический аллерген (ССА) для диагностики туберкулеза у крупного рогатого скота.

3. Набор для дифференциации культур микобактерий в ИВА.

- Рекомендации по применению РИД с набором антигенов микобактерий для дифференциации реакций на туберкулин у [фупного рогатого скота одобрены Западным региональным отделением ЕАСХНИЛ (1989г.)

-"Способ получения видоспецифического антигена туберкулезных микобактерий'Ч авторское свидетельство №1372582, 1987 г.)

-"Набор для определения антител человека и антигенам возбудителя туберкулеза в ШАГ Апробирован в институте пульмонологии. Минздрава РЗ.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1.Джумков З.А.,Плепгкевич И.О., Григорьев М.М..Лысенко А.Г1

. 0 некоторых биохимических изменениях крови у крупного рогатого скота при туберкулезе// Таз.докл.ьр«сп. конфгрзнции по туберкулезу. - 1977. - с.54-56.

2. Ятмхов В.А.,Пжете:се8кч ИХ..Григорьев М.М., Лысенко А.П.

33

Распределение некоторых генетических факторов крови " круп- ' кого рогатого скота при заболевании тубер:улэзом// Достижений ветеринаркой науки и передового опита - животноводству. Мег-.¿од.сб., jijn.4, Минск. -1378, - с. 4-6.

3. Даумков В.А., Зотова B.C., Плешкевич И.р., Никончик Л. И., Григорьев И. Ii., Лысенко А. П. Результаты изучения белкового обмена и активности некоторых ферментов у коров,' больных туберкулозо.4//Езтериаарная наука - производству: Сб.научн.тр. БелНШВ. - 1980. - Т.ХУШ. - с.17-19.

4. Чепик Г. L. Реоультатн испыта!! я видоспещгфического антигена Ы.бовис в иммунологических реаяциях// Современные пг -

блеш зоонозных инфекций: Тезисы докладов Всесоюзной меявзд. коиф. - Симферополь, 1981. - с.161-162.

5. Объедков Г.А., Лисенко А.П. Еыявлекне гиперчуЕ'.твп-талькости замедленного типа и специфических антител при туберкулезе крупного рогатого скота с помощью очищенных антигешалс компонентов У.бовис// Инфекционкно болезни 1срупного рогатого

i скота и мери борьбы с ними: Сб.научи.трудов. - Минск, 1982,-с. 27-33.

6. Попова Г.Г., Поповцев В.В., Лысенко А.П. Апробация методики диффереш-ргации никобактерий бычьего вида от атилкч-кых ми"оСактеоий// Сб. научн. трудов ВГНКИ ветпрепаратов. - М. IS85. - с.25-28.

7. Лысенко А.П., 0*ьздков Г.А. Туберкулез сельскохозяйственных аивокшх// Справочник по болезням с-х аивотных. -Минск, Уралкай, IS85..- с.-т38-189.

8. Лысенко А.П., Глинниксва 3.А., Руыачик И.И., Журавлз-ва Т.Н., Лзткевич I.A. Патологоанатомическиа изменения у телах с разными генотипами При экспериментальном заражении бовис// Научные основы развития животноводства в БССР. - Минск, Урад-май, IS86. - вып. 16. - с.143-145.

9. Объедков Г.А., Карпова Г.А., Сосвкин В.А., Куравлева Т.Н., Лысенко А.П, Иммунный отвсг- у телок с разными генотипами при экспериментальном заражении М.бовис//Ветеринер1Шя

наука - производству: Меявед. гб. - Минск, 1900. - ? ХХ1У. -с.24-28.

10, Лысенко А.П., Обьеднов Г. А., Гяинкикова З.А., Григорьев И.М., Карпова Г,А., 1^мачик И.И. Изучите очищенных спе-фических антигенов ПОД туберкулина// Весц1 АкадэмП наэук 34

1987. - Г'й.а с.92-99.

11. Лысенко А.П. Специфические антигены различных штаммов й.бовис// Зетврянария. - 1987, - J?5. - с.34-56

12. Лысенко А.П,, Объедков Г;А., Григорьев М.Ы., Карпова Г.А. Некоторый особенности эпизоотической ситуации по туберкулезу в Белоруссии// Тезисы докл. Ш республ. научно-прокт. ков$. - Гродно, 198?. - 0.72.

13. Лысенко А.П., Чепик Г.В. Способ получения вядоспецп-фачвского антигена туберкулезных микобактериЯ №1372662, 8.10. 1987.

14. Лысенко А.П. Антигенный состаа и дифференииашл втаммов М.бовкс от атипичнчх микобактеряй// Вопросы эпизоотологии, двагаостнки и мероприятия по ликвидации туберкулеза и бруцеллеза животных! Сб.ваучн. трудов ВАСШШ. - Новосибирск, [967. - с.50-58.

15. Лысенко А.П. ИамунохЕмичзский анализ хроыатографи-вдских фракций Н.бордо п Ц.ту<5еркулеэве// Еатеранария. -[S37. * J?I2. - с.32-36.

IÔ. Лысенко А.П. Антигенный состав ЩД туберкулина для мекош1тащих//Ве®5рЗйарзя» - I9S9. -1*5. - с.32-34.

17. Лысенко А.П» Ишунохшическая характеристика я пути :овершенствовяняя препаратов для диагностики туберкулеза// Гезисы докл. Всесоюан. съезда фтизиатров. « Някск, 1Й39. -

s. I23-K4.

18. Лысенко А.П., Карлова Г.А., Глгяшпкоза З.А., Шеи-

:о li.ll. Связь некоторых типов транс^орриов о развитием макро-«одических изменений при заражения крупнот рогатого скота 1.бовкс// Ветеринарная наука— производзтау. Мзашвд. сборник.-шок, 1990. - Т.ШШ. - с.40-42.

19. Лысенко А.П., Обьодкоз Г.А. Тубзрхулзэ сельскохозяйственных shsoтаю// Справочник по болозняа сельскохозяйствен-' ых яивоша. - Иинск, IS9I.

20. акаю"" А.П. Выявлена антигенов Нгжобактеряуи боетс// етеришрия. - 1991. - Й. - с.26-29.

¿1. Лысенко А.П., Карпова Г.А., Агеева Т.Н. 1йг«увсхиыи~ зсккй метод опенки специфичности препаратов даядкаггастяхи убаркулеза// Совересзнствоваиио ьгатодов государственного кон-родя вэтпрдшратоз: Тезвси доил.' Bcecoisii. кзу*т,ксн$орен-

ива. -М.,1991. - с.Ш.

22» Üyaiwiai С.И., Лысенко A.A., Шимко В.В. Излучение ко-воспзиифической гшиюшоротки к сокрзторювд инауко глобулину класса А крупного рогатого скота// Ветеринарная наука - производству. - Минск, 1991, - ТДХ1Х. - с.37-40,

23. Лысенко А.П., Карпова Г.А., Агеева Т.Н.«Специфичность актагенов М.бовис при диагностике «уберкулеза крупного рогатого скота в №SA// Ветеринария. - I9S2. - Jf3. - с.22-24.

24. Лысенко A.IL, Карпова Г.А, Изучение эпизоотического состояния стад с потщыо набора антигенов 1>шкобакгер;гй разных вцдов// Вэтеринараая наука - производству. - Минсж, 1992. -

- с.27-32.

25. Лысвгшо А.П., Карпова Г.А., Агеева Т.Н., Гдйшяхова З.А., Кузнецов H.A. Оцеша алла^гкчзских проб для диагностика ' туберкулеза крупного рогатого скота// Взюриирная тука -производству. - Минск, 1093. - XXXI. - с.78-87,

26. Лысашо А.И., Агеева Т.Н., Карпова Г.А. Особенности гуморального ииушого отЕэта у крупного рогатого скота при шфшвроваши Мизсобавтариуы бовис и атипгошавз мккобакЕериягш// Ахтуадышз вопросы Еммунодогка и аллергология. - Минск, 1994.~

■ с.97-98. '

" 7/

л/""'