Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Оптимизация метода определения активности туберкулина

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА II ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ДЕПАРТАЛ\ЕНТ ВЕТЕРИНАРИИ

ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ КОНТРОЛЯ, СТАНДАРТИЗАЦИИ И СЕРТИФИКАЦИИ ВЕТЕРИНАРНЫХ ПРЕПАРАТОВ (ВГНКИ)

На правах рукописи

УДК 619 : 616.98: 579.873.21 Т-07

ЕРОШЕНКО Людмила Алексеевна

ОПТИМИЗАЦИЯ МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ТУБЕРКУЛИНА

16.00.03— Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва — 1997

Работа выполнена в лаборатории контроля и стандартизации препаратов против туберкулеза, псевдо- и паратубер-кулеза ВГНКИ ветпрепаратов, на Государственной Курской биофабрике, в Центральном НИИ туберкулеза МЗ РФ, в НИИ физико-химической медицины, в хозяйствах, неблагополучных по туберкулезу крупного рогатого скота.

доктор ветеринарных наук А. Н. Шаров Научный консультант: кандидат биологических наук И. Б. Каргина (НИИФХМ)

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор Р. В. Душук

доктор ветеринарных наук, профессор Н. П. Овдиенко

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных (г. Омск)

Защита диссертации состоится « 1997 г.

в/¿»"часов на заседании диссертационного совета Д.120.85.01 при Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) Министерства сельского хозяйства и продовольствия РФ по адресу:

123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5, ВГНКИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке

Научный руководитель:

(ВГНКИ)

(ВНИИЭВ им. Я. Р. Коваленко)

ВГНКИ.

Автореферат разослан «

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат ветеринарных наук

Ю. А. Козырев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

1.1.Актуальность темы. Успешное развитие животноводства невозможна без ветеринарных мероприятий, обеспечивающих профилактику и ликвидацию ■.нфекционны* болезней животных, в том числе туберкулёза.

Система контроля благополучия хозяйств по туберкулёзу КРС предусматри-1ает поголовное обследование животных два раза в год. В неблагополучных хозяй-ггвах обследование проводят каждые 30 - 45 дней. Эффективность профилактики >аспространения и борьбы с туберкулёзом в значительной мере определяется со-1ершенством средств и методов диагностики болезни ( М.М.Иванов, 1959, 1972, \.И.Кузин, 1987, В.П.Урбан, 1996). В качестве основного метода диагностики тубер-улёза применяют аллергический метод - туберкулиновую пробу. В нашей стране |ля диагностики туберкулеза у млекопитающих используют туберкулин очищенный ППД) для млекопитающих, технология изготовления и качественный состав которо-о отличаются от туберкулинов зарубежного производства.

Туберкулин вводят животным в дозе 10000 МЕ в 0,2 мл растворителя. При том большое значение для эффективности диагностики имеет величина и точность 1огировки вводиь,ого препарата. При увеличении дозы туберкулина возрастает хо-мчество неспецифических реакций, что вызывает необходимость убоя реагирую-цих животных с диагностической целью и проведения дополнительных исследова-1ий в благополучных хозяйствах. При уменьшении дозы часть зараженных животных | неблагополучных хозяйствах не реагирует на туберкулин и остается в стаде, что □еличиваетсроки оздоровления (А.Н.Шаров, 1995).

Использование при многократных исследованиях серий туберкулина с раз-1Ичной активностью не позволяет определить динамику проявления реакций, которая является дополнительным диагностическим признаком.

В соответствии с действующим ГОСТ 16739 - 88 "Туберкулии очищенный ППД) для млекопитающих" активность каждой серии препарата по содержанию юждународных единиц проверяется на сенсибилизированных морских свинках а равнении со стандартным образцом препарата.

Метод определения биологической активности туберкулина рекомендован ямитотом экспертов ВОЗ по стандартизации препаратов (1968). Однако, в силу то-э, что аллергены, изготавливаемые о разных странах, являются оригинальными репаратами, при определении их активности применяют различные варианты этих

методов, обеспечивающие наибольшую достоверность получаемых результатов. Основные различия касаются прежде всего вида сенсибилизирующего антигена, дозировок испытуемого и стандартного туберкулинов, количества свинок в опыте и методов математической обработки результатов туберкулиновых проб (Т.Б.Яблокова, 1969,1984).

Метод определения активности туберкулина на сенсибилизированных морских свинках имеет ряд существенных недостатков, связанных с ошибками при вво дении туберкулина и при учете результатов кожной реакции, а также с разным имд| видуальным ответом у морских свинок. Поэтому разрабатываются новые способы определения активности туберкулина, в частности - реакции иммунокомпетентных клеток сенсибилизированного организма.

1.2. Цель и задачи исследования. Основной целью настоящего исследования является изучение влияния комплекса факторов на точность определения а тивности туберкулина в опытах на сенсибилизированных морских свинках и выявл ние возможности использования с этой же целью реакции торможения миграции макрофагов (РТММ).

Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Изучить уровень аллергии у морских свинок, сенсибилизированных разными видами туберкулёзных антигенов. Подобрать метод сенсибилизации животных, обеспечивающий постоянный высокий уровень аллергии.

2. Определить форму зависимости интенсивности ответных аллергически) реакций у сенсибилизированных морских свинок от дозы туберкулина.

3. Изучить влияние количества используемых разведений и интервалов м< жду ними испытуемой серии и стандартного образца на точность определения аи тивности туберкулина.

4. Выбрать метод математической обработки результатов туберкулиновы: проб и определить минимальное количество свинок, обеспечивающее получение достоверных результатов исследования.

5 Изучить влияние дозы туберкулина на эффективность диагностики тубе кулбэа у крупного рогатого скота.

» 6. Разработать условия постановки и учета результатов РТММ с использс ааниеы клеток перитомеального экссудата мышей

7 Изучить возможность применения РТММ для определения активности т беркупина

1.3. Научная новизна. Впервые выявлены закономерности влияния комплекса факторов на точность определения по содержанию ME активности туберкулина, изготовленного по технологии, принятой в нашей стране. Установлена форма антигена, обеспечивающая устойчивую сенсибилизацию животных. Установлены диапазон доз препарата и метод математической обработки данных испытания, при которых проявляется и учитывается линейная зависимость lg дозы - эффект.

Оптимальным является использование двух доз - 100и ЮМЕ, при дозах туберкулина менее 5 и более 100 ME нарушается линейная зависимость 1ддозы-зффекг.

Установлено, что регламентированная ГОСТ СЭВ на туберкулин (1967) методика контроля не учитывает закономерности проявления аллергических реакций и не обеспечивает необходимую точность определения активности препарата.

Установлено снижение эффективности аллергического исследования на туберкулёз при уменьшении дозы препарата. При её уменьшении даже о 1,3 раза количество реатрующих животных из числа зараженных достоверно снижается.

Разработаны условия постановки и учет результатов РТММ для определения активности туберкулина.

Установлено, что для получения статистически учитываемых зон миграции макрофагов необходимо использовать мышей линии СБА, массой не менее 20 г, но ранее чем через три недели после подкожной сенсибилизации вакциной БЦЖ на физиологическом растворе, и через трое суток после внутриперитонеапьной стимуляции выхода макрофагов легким минеральным маслом.

Установлено, что в РТММ линейная зависимость логарифм дозы - эффект оптимально проявляется при использовании туберкулина в интервале доз от 12 до 250 мкг/мл.

1.4. Практическая значимость. На основании результатов исследований разработан оптимальный метод определения активности туберкулина, изготавливаемого по технологии, принятой в нашей стране, на морских свинках.

Результаты исследований нашли отражение в изменениях и дополнениях к "Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного (ППД) для млекопитающих" и в проекте Изменений № 1 ГОСТ 16739 - 88 "Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих". Созданы предпосылки для применения РТММ при контроле туберкулина.

S

1.5. Апообаиия работы. Материалы диссертационной работы доложены и получили положительную оценку:

- на Юбилейной конференции лаборатории туберкулёза ВНИИЭВ им. Я.Р.Ко -валенко (1992);

- на межлабораторном совещании научных сотрудников ВГНКИ ветпрепара-тов (1996);

f.fi, ПиНпикаиии. По материалам диссертации опубликовано 7 научных работ.

1.7. Объем работы. Диссертация изложена на 185 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Работа иллюстрирована 19 рисунками и 12 таблицами. Список литературы включает 268 источника, из них 128 на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Работа была проведена в 1991 -1996 гг. по заданию 02.06.08.Д.

В работе были использованы : 1 ) питательные среды: синтетическая питательная среда Курской биофабрики, среда Левенштейна - Иенсена; картофельная среда Павловского; мясо-пептонный бульон (МПБ); среды для культивирования клеток - Na 199 и RPMI -1640; 2) штаммы : М. bovis, штаммы № 8, ANS, БЦЖ ; 3) растворы, реактивы, химические вещества : раствор Хенкса; 0,05 M Трис HCL буфер С pH 7,3 и 0,9% Na CL; 10%-ный раствор крахмала; 10%-ный раствор казеина; 0,1%-ный раствор тршанового синего; вазелин; минеральное масло; полиэтиленсилокса-ноеая жидкость с эмульгатором Т-З; краска Романовского; формальдегид; спирт этиловый; ангарсхое минеральное масло; агар Дифко; агароза; серная кислота; ам-Троновый реактив ; 4) биопрепараты : международный стандарт туберкулина PPD-S; стандартный образец ППД туберкулина для млекопитающих ( серия № 14 ); коммерческие серии туберкулина; поливалентная гидроокисьалюминиевая формолвакцина против пастерелл0за свиней; вакцина БЦЖ; бруцеллопротеин; гепарин; сыворотка крови крупного рогатого скота; фетальная сыворотка крови КРС; сыворотка крови человека четвертой группы; пенициллин; стрептомицин ; 5) животные : морские сеинхи-альбиносы. самки массой 400 г.; беспородные белые мыши массой 20 г и более; мыши линий СБА и C5?Ble; гибриды первого поколения СБА х AKR; крупный рогатый скот.

Для определения влияния штамма микобактерий туберкулёза и вида антигена на уровень сенсибилизации свинок, приготовили водные и масляные антигены из культур штаммов № 8, АЫ5 и 6ЦЖ. Культуры выращивали в течение 45 суток, затем инактивировали нагреванием при температуре 120°С в течение 30 минут и гомогенизировали отфильтрованную бактериальную массу в масляных и водных адь-ювантах. Пять групп морских свинок, по 20 животных в каждой, сенсибилизировали путем: 1) внутрикожной инъекции 0,1 мл водной суспензии, содержащей 2 мг/мл живой культуры штамма БЦЖ; 2) внутримышечной инъекции 0,1 мл суспензии, содержащей 4 мг инактивированной культуры штамма БЦЖ в 1 мл полиэтиленсилоксано-вой жидкости с эмульгатором Т-3; 3) внутримышечной инъекции 0,1 мл суспензии, содержащей 4 мг инактивированной культуры штамма АЫ5 в 1 мл полиэтиленсилок-сановой жидкости с эмульгатором Т-3; 4) внутримышечной инъекции 0,1 мл суспензии, содержащей 4 мг инактивированной культуры штамма АЫ5 в 1 мл ангарского минерального масла; 5) внутримышечной инъекции 0,1 мл суспензии, содержащей 4 мг инактивированной культуры штамма № 8 в 1 мл полиэтиленсилоксановой жидкости с эмульгатором Т-3.

Уровень сенсибилизации у морских свинок определяли в период от одного до 10 месяцев посте введения антигенов. У морских свинок удаляли с боков волосяной покров выщипыванием, дезинфицировали кожу 70 %-ным спиртом и в депилирован-ные участки кожи вводили 2,5, 5,10,25, 50,100 и 125 МЕ туберкулина внутрикожно по 3-4 инъекции с каждой стороны. Места введения каждого разведения распределяли по принципу латинского квадрата для исключения влияния чувствительности колеи в этих местах на результат испытания. Уровень сенсибилизации определяли по интенсивности (в мм) ответных реакций и углу наклона прямой, отражающей линейную зависимость логарифм дозы -эффект.

Для изучения влияния доз туберкулина и значения кратности разведений ка точность определения активности стандартную серию препарата разделили на двэ части, одна из которых служила стандартным образцом, а другая - испытуемым. Препараты вводили с двукратным - 2,5, 5,10 и 20 МЕ, пятикратным - 5.25 и 125 МЕ и десятикратным -10 и 100 МЕ увеличением. Реакцию учитывали через 24 часа и оценивали по величине среднего диаметра папулы, образующейся о место введения туберкулина, о миллиметрах.

Относительную активность испытуемого образца определяли в соответствии с рекомендациями ГОСТ на туберкулин СЭВ, а также в соответствии с рекомендацией ВОЗ.

Для определения оптимального метода статистической обработки данных внутрикожных туберкулиновых проб проведена сравнительная оценка методов ВОЗ и СЭВ. Проведен пересчет результатов определения активности по содержанию МЕ серий туберкулина млекопитающих, изготовленных Курской биофабрикой за последние 15 лет. Длг, сравнительной оценки этих методов на практике быля взята производственная серия туберкулина № 2, активность которой по содержанию МЕ была определена методом СЭВ равная 44 ООО МЕ, а по методу ВОЗ - 24 ООО МЕ. Приготовили разведения туберкулина, основные растворы которых, с учетом установленной активности тем и другим методом, содержат 50 ООО МЕ в мл. Эти растворы вновь проверили в сравнении со стандартным образцом туберкулина на 17 морских сеинках, разделанных на две группы.

Определяли влияние активности туберкулина по содержанию МЕ на диагностическую эффективность внутрикожных аллергических проб. При этом серии препарата с различной активностью вводили КРС внутрикожно с одной стороны шеи в дозе 0,2 мг в объеме 0,2 мл растворителя, а с другой стороны шеи вводили стандартную серию туберкулина в дозе 10 ООО МЕ в 0,2 мл растЕОритепя.

Реакцию учитывали через 72 часа и оценивали по утолщению кожной складки. Полученные результаты сравнивали, определяли существенность различия в проявлении реакции на испытуемые и стандартную серии туберкулина методом критерия знаков при 95 %-ном уровне достоверности.

В работе также были использованы материалы комиссионной проверки тубер-кулинов в неблагополучных по туберкулезу хозяйствах, проведенной по приказу ГУВ МСХ СССР № 62 от 28.11.1975 г.

Разработка условий постановки РГММ проводилась следующим образом . Мышей иммунизировали подкожным введением указанных выше микобактериаль-ных антигенов в дозе 0,1 мл и использовали в опытах через 1-14 недель после сенсибилизации.

Для приготовления агарозной среды 2 % - ный раствор агарозы, имеющий температуру 47°С, смешивали с фетальной сывороткой или сывороткой крови крупного рогатого схота такой же температуры, средой № 199 в пропорциях, при которых конечный раствор содержит 0,75 % агарозы и 10% сыворотки в мл среды В по-

лученный объем среды добавляли 100 ЕД пенициллина и 100 мкг стрептомицина. Готовую среду разливали в предварительно обезжиренные раствором 70% спирта пластиковые чашки Петри и охлаждали при +6-8°С и 5% С02 в течение двух часов.

Агаровую сред/ готовили следующим образом: 450 мг агара Дифко заливали 15 мл 0,05 М Трис HCL буферного раствора и выдерживали 15 мин при комнатной температуре, затем нагревали на водяной бане до образования светлого прозрачного раствора и после этого выдерживали в кипящей банэ еще 15 мин; готовый трехпроцентный раствор агара, охлажденный до 50-55°С, смешивали с разбавляющим расвором, который содержит 29,5 мл среды 199 или RPMI-1640,0,45 мл сыворотки крови человека IV группы и 0,05 мл раствора пенициллина и стрептомицина; разбавляющий раствор нагревали до температуры 50-55°С. Полученную смесь разливали по 3,5 мл в чашки Петри диаметром 3,3 см, необходимая толщина слоя агара - 4 мм. Чашки накрывали крышками и выдерживали при комнатной температуре до полного застывания агара, затем их хранили вверх дном во влажной камере при 4-6°С и 5%С02. .

Через трое суток поело стимуляции выхода клеток мышам стерильным шприцем вводили в перитонеальиую полость 3-5 мл раствора Хенкса, содержащего 100 ЕД пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 0,5 ЕД/мл гепарина. Проводили легкий массаж брюшной стенки в течение трех Минут, а затем отсасывали шприцем пери-тонзальный экссудат. ..■'>■...

Также за 2-6 суток до проведения опыта мышам сводили внутрибрюшинно для стимуляции выхода перитонеальных макрофагов МПБ, вакцину против пасте. реллбза свиней, растворы казеина и крахмала, бруцеллопротеин, вакцину БЦЖ, легкое минеральное масло. В день постановки реакции у убитых и вскрьпгых мышей промывали брюшную полость раствором среды № 199 или RPM1-1640 с содержанием 1,5 или 10 % сыворотки крови ICPC или фатальной или сыворотки кропи человека IV группы, охлажденным до +4°С. Полученныэ клетки осаждали центрифугированием и дважды ресуспендировапи культуральной средой с сывороткой крови. Клетки центрифугировали в течение 5 мин при 1000 -1200 оборотах в минуту. Количество клеток в 1 мл суспензии определяли подсчетом в камера Горяева, определяли жизнеспособность макрофагов по отсутствию окрашивания 0,1 %- ным раствором трипансвого синего.

Для постановки РТММ использовали клеточную суспензию, содержащую в 10 • мкл от 0,5 до 3,5 млн клеток. В каждую лунку геля вносили по 10 мкл суспензии кпэ-

ток, в контрольные лунки добавляли такое же количество культуральной среды, а в опытные - разведения туберкулина в диапазоне доз от 6 до 1000 мкг в мл. Чашки инкубировали 18-20 часов при 37°С , 5% СОг с избытком водяных паров Для фиксации результатов реакции в чашки вносили 10% - ный раствор формальдегида и выдерживали один час. После удаления формальдегида чашки высушивали под тягой до исчезновения влаги в лунках, удаляли агар, промывали дистиллированной водой и вновь высушивали. Зоны миграции макрофагов учитывали под бинокулярной лупой в условных единицах по средней ширине кольца зоны миграции. Откссителькую активность туберкулина в реакции торможения миграции макрофагов вычисляли по методу, рекомендованному Комитетом экспертов ВОЗ по стандартизации биологических препаратов.

Определяли уровень двигательной активности макрофагов по показателю расхода глюкозы из культуральной среды и по показателю активности на поверхности клеток 5' нуклеотидазы. Суспензию клеток культивировали в пробирках в течение 18-20 часов, затем пробы культуральной среды разводили в 20 раз и обрабатывали антроновым реактивом, а в прилипших ко дну макрофагах - определяли активность 5' нуклеотидазы по накоплению неорганического фосфата. Результаты реакций учитывали на спектрофотометре при длинах волн 620 и 750 нм, соответственно, для глюкозы и 5'нуклэотидазы.

Экспериментальные данные подвергнуты статистической обработке по V.l. Weir (1960), И.П.Ашмарину, ААВоробьеву (1962), И.Т.Шевченхо(1970), иАЛГ. Усович с соавторами (1970) с применэнием вычислительной техники (МК-51).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Определенно активности туберкулина на сенсибилизированных морских

свинках.

3.1.1. Определение формы зависимости интенсивности реакции у сенсибилизированных морских свинок от дозы туберкулина.

Средняя интенсивность реакции на туберкулин в дозах 2,5, 5, 10, 25, 50, 100 и 125 МЕ составила, соатвэтственно,10,7+08,12,4+0,7, 13,9+0,6, 16.0+0,6, 17,8+ +.0.4, 18,7+0,4 и 19,2+0,6 мм. Графическоз изображение зависимости Ig дозы -эффект и адвисимости доза - эффект представлено на рисунке 1.

го <»

а 14

2.5 по г? во ноо а* о --1. , .. |—. |-»—--«—»-*-- »

о.ч 0,7 1,0 14 О I.* Ь О

Рис. 1. Графики зависимости доза (1д дозы)-эффект у сенсибилизированных морских свинок. Логарифм дозы - эффект имеет линейную зависимость, а доза-эффект образует параболу. Метод определения активности туберкулина, основанный на зависимости 1д дозы - эффект, учитывает закономерность проявления биологического процесса при внутрикожных аллергических пробах, в соответствии с которой любая доза туберкулина в интервале 0,4...2,1 логарифма МЕ вызывает реакцию, цифровое выражение интенсивности которой находится на полученной прямой. При определении активности препарата по методу СЭВ линейная зависимость отсутствует.

3.1.2. Сравнительная оценка разных истодов статистической обработки данных аллергических проб при определении активности туберкулина. Определение активности по содержанию МЕ 127 серий туберкулина для млекопитающих, изготовленных Курской биофабрикой за последние 15 лет, по методам расчета, рекомендованным ВОЗ и СЭВ, показало совпадение этого показателя только в 32,3% случаев. При этом в случае активности туберкулина по методу СЗВ, раеной 50000 МЕ/мл, такой же результат установлен и по методу ВОЗ. При большем или меньшем показателе ашвноети по методу СЭВ расхождение результатов опро-. деления по методу ВОЗ значительно возрастает.

Сравнительная оценка растворов туберкулина серии № 2, приготовленных из расчета содержания в 1 мл 44000 МЕ по методу СЭВ и 24000 МЕ по методу ВОЗ, по-

казала, что активность серии, установленная по методу СЭВ, не соответствует действительности.

Так если считать исходную активность серии по методу СЭВ, разной 44000 МЕ/мл, то при обработке результатов испытания приготовленного разведения 60000 МЕ/мл этим же способом, активность туберкулина равна 46000 МЕ/мл, а по методу ВОЗ - 34000 МЕ/мл, что указывает на явное завышение результата первичного испытания активности этой серии.

При проверке разведения серии из расчета активности 24 000 МЕ/мл, активность ее по методу СЭВ равна 51500 МЕ/мл, а по методу ВОЗ - 56500 МЕ/мл, что соответствует ожидаемому результату (50000+10000).

Метод определения аетианости туберкулина, принятый в нашей стране, отличается низкой чувствительностью и не позволяет регистрировать значительные отклонения этого показателя качества препарата от требуемого. Метод ВОЗ - высокочувствителен и учитывает закономерности проявления кожной аллергической реакции.

Результаты определения активности туберкулина на сенсибилизированных морских свинках были подтверждены испытаниями на КРС хозяйств Саратовской области, неблагополучных по туберкулезу. Использованы серии туберкулина Na 1 и № 2 с активностью, определенной по методу СЭВ - 47 300 МЕ/мл и 44 000 МЕ/мл, по методу ВОЗ - 38 000 МЕ/мл и 23 500 МЕ/мл, соответственно.

Из 39 голов первой группы на стандартный образец с активностью 50000 МЕ/мл реагировали 33 животных со средней интенсивностью реакции 8,1 мм и на серию № 1 реагировали 32 короаы с интенсивностью реакции 5,9 мм.

Из 47 коров второй группы на стандартный образец реагировали 38 животных со средней интенсивностью реакции 8,9 мм и на серию № 2 - 35 голов со средним утолщением кожной складки на 8,0 мм.

Несмотря на кажущуюся незначительность разницы в количестве реагирующих животных и в показателях интенсивности реакции на стандартный образец и серии туберкулина Na 1 и № 2, различие это, определяемоэ методом критерия знахов при уровно значимости S5 %, статистически достоверно (р < 0,05).

3.1.3. Влнямио количества развэдений туберкулина и интервалов ножду ними на результаты испытания.

Использован стандартный образец туберкулина, который разделили на две части: одну часть считали референтной, а другую - испытуемой серией туберкулина.

Туберкулин вводили морским свинкам, сенсибилизированным живой культурой штамма БЦЖ, в дозах 2,5, 5 и 10 МЕ; 5, 25 и 125 МЕ; 25, 50 и 100 МЕ; 10 и 100 МЕ; 10, 35 и 100 МЕ; 12,5,25, 50 и 100 МЕ. Результаты испытания показали, что в 61% случаев наблюдались близкие к ожидаемым результаты (50000 + 10000) при использовании 2,5, 5 и 10; 2,5 и 10; 5.25 и 125; 5 и 25; 25 и 125; 5 и 125; 10 и 100; 12,5, 25, 50 и 100; 12,5 и 25; 12,5 и 50; 25 и 50; 25 и 100; 50 и 100; 12,5, 25 и 50; 12,5, 5, 50 и 1С0 МЕ, независимо от количества взятых доз - 2, 3 или 4, и интервала между ними -2, 4, 5, 6,10 или 25. В то же время в 39% случаев получены результаты в тех жэ диапазонах доз и интервалов мажду ними, выходящие за пределы допустимого, что можно объяснить только техническими ошибками при проведении исследований.

При использовании туберкулина в двух дозах ожидаемый результат получен о 55% случаев, в трех дозах - в 60%. Наибольшая ошибка определения наблюдается при использовании 2,5 и 125 МЕ. В зонах реакции на туберкулин в дозах до 2,5 и свыше 125 МЕ при имеющемся уровне сенсибилизации евин ох закономерность зависимости !д дозы - эффект нарушается: на нижнем уровне- за сччт приближения к зона неспецифических реахций (до 5...8 мм), на верхнем уровне - за счет применения запредельной дозы туберкулина, на которую организм но способен отвечать адекватно. Учитывая, что !д дозы - эффект имеет линейную зависимость, применение двух доз испытуемой и двух доз референтной серий можно считать вполне достаточным, однако, различие а интенсивности реакции на меньшую и большую дозы при использовании двух доз туберкулина долясно быть статистически достоверным. Оптимальным является применение доз от 5 до 100 МЕ с шагом увеличения не менее четырех. '

3.1.4. Определение миндального количества свинок, обеспечивающего достоверность полученного результата.

Метод определении активности туберкулина на морских соинках характеризуется значительным разбросом получаемых результатов из-за возможных ошибок при введении препарата (глубины ого инъекции в кожу, дозировки) и учета реакции при неясной выраженности границ папул, а также вследствие различной реактивности мест введения.

При случайном подборе морских свинок в двух опытах для получения достоверного результата исследования достаточно четырех свинок. Однако, величина ошибки метода в этих случаях равна 20,7% и 109,9%. Значение ошибки определения уменьшается с увеличением количества свинок в опыте. По десяти свинкам эта ошибка составляет 9,9% в первом случае и 23,7% во втором.

При другом подборе морских свинок получаются подобные результаты, следовательно, можно увеличить количество животных в опыте, однако, это делает контроль активности туберкулина дорогостоящим. Поэтому следует признать минимально допустимым использование в опыте 10 свинок.

3.1.'».Влияние вида и формы антигена на уровень сенсибилизации морских свинок к туберкулину.

Сравнительную оценку уровня сенсибилизации определяли в среднем по группам сенсибилизированных разными антигенами свинок установлением достоверности различия в интенсивности реакций, на введение туберкулина в дозе 50 МЕ/0,1 мл (х+и) при 95%-ном уровне значимости, а также по углу наклона прямой зависимости !д дозы-эффект на введение туберкулина в дозах 2,5, 5, 10, 25, 50,100 и 125 МЕ в 0,1 мл. При оценке уровня сенсибилизации морских свинок стзтистачески значимого различия в интенсивности реакции на введение туберкулина в дозе 50 МЕ ни при одном исследовании не установлено. Средняя интенсивность реакции через1 месяц составила соответственно по вышеуказанным антигенам 17,8 +.0,97, 18,4+1,32,18,8+1,67,17,9+1,00, 18,4+1,85 мм. Но обнаружено также разницы в величине углов нахлона прямых зависимости 1д дозы -эффект. Через шесть месяцев после иньекции антигенов интенсивность реакции нз 2,5, 5,10, 25, 50, 100 и 125 МЕ у свинок, сенсибилизированных убитой культурой штамма БЦЖ на ПЗС, составила соответственно 8,5+0.9,10,1+0,9,12,9+1,5, 15,0+1,1, 16,4+0,9, 17,8+0,2, 18,5 +.0,9 мм, а у сенсибилизированных культурой штамма АЫ5 на АММ-8,3+1,3,10,5+ 1,5,12,6+1,8, 15,8+1,5, 17,5+1,5, 18,1+1,3, 19,1+1,Змм.

При определении продолжительности сохранения уровня сенсибилизации ус тановлено, что интенсивность реакции у свинок с течением времени практически н! уменьшается и углы наклонов прямых зависимости 1д дозы - эффект не изменяются

Так, у сенсибилизированных живой культурой БЦЖ, убитыми культурами штам-ыоа БЦЖ, АМ5, № 8 на ПЭС и штамма АНЪ на АММ интенсивность реакции на дозу

50 ME за период наблюдения снизилась соответственно лишь на 1,0; 1,2; 2,6; 1,9 и 0,5 мм

Результаты исследований показывают, что все испытанные антигены - из живых и убитых культур, из разных штаммов микобактерий туберкулеза бычьего вида обладают практически равноценной сенсибилизирующей способностью, обеспечивающей высокий стабильный уровень сенсибилизации в течение 10 месяцев (срок наблюдения).

З.Ч.в.Влиянио дозы туберкулина на эффективность аллергической диагностики туборкулэза у крупного рогатого скота.

Испытания проводились на группах схота с. высокой, средней и низкой степенью распространения туберкулеза, общей численностью 262 головы. Животным исследуемых фупл стандартная серия туберкулина вводилась з дозах 10 ООО МЕ/0,2 . мл и 7 700 МЕ/0,2 мл, а также 10 000 МЕЮ,2 мл и 5 G00 МЕ/0,2 мл. Результаты исследований показывают, что в группе со средней степенью распространения туберкулеза на дозу 7 700 МЕ/0,2 мл на реагировало семь ronca зараженных животных, что составляет 13,2 % от числа больных. В группе с низкой степенью распространения болезни на дозу 5 000 ME п 0,2 мл не реагировали в головы, что составляет 30,7 % от числа зараженных. В группе животных с высокой степенью распространения туберкулеза, туберкулин о дозе 5 000 МЕ/0,2 мл нэ выявил восемь зараженных животных, что составляет 5,8 % от числа больных. Во осох случаях исследования средняя интенсивность ответной реакции была достоверно менее выражена на уменьшенную дозу а сравнении С реакцией на 10 000 МЕ/0,2 мл ( р < 0,05 ). Уменьшение диагностической дозы препарата, особенно в группах скота со средним я низким уровнем распространения туберкулеза, приводит к снижению эффективности туберкулииэвой пробы.

3.2. Роакция торможения миграции макрофагов для определения активности

туберкулина.

3.2.1. Разработка условий пос- зновкм и учета РТММ.

Первоначально для постановки реакци-- была использована агароэная среда, содержащая 0,75 % агарозы иЮ % сыворотки крови крупного рогатого скота. Из-за

отсутствия миграции макрофагов и дефицита агарозы в дальнейшем применялась ргзроаая среда. Постановка РТММ на агаровых блоках, содержащих сроду № 199 или, ЯРМ1-1640,1, 5 или 10 % сыворотки крови крупнота рогатого скота, фатальной сыворотки КРС и сыворотки крови человека четвертой группы, показала, что использование среды № 199 и 1 % фетальиой сыворотки КРС и сыворотки крови человека является оптимальным для получения хороших зон миграций и количественной оцонки теста. Обязательным условием использования огароаых блоков является насыщение среды углекислотой. Сроду мсжкз использовать в период от трех часов до семи суток после изготовления и хранения при + 4°С, 5 % СОг и избытке водяных пароа. ;

получение от лабораторных животных максимального количества функционально активных макрофагов перитонеальнэго экссудата необходимо предварительно за трое суток проводить внутриперитонеальную стимуляцию легким минеральным маслом:

Для получения статистически учитываемых зон миграции и проявления линейной зависимости 1д дозы - эффект в РТММ надо а лунки вносить равные объемы суспензии, содержащей 2,5x10е клеток, и туберкулин в концентрациях от 12 до 250 мкг/мл ' •

3.2.2. РТММ с поритонеальньши макрофагами беспородных мышой.

При постановке реакции определяли условия, обеспечивающие адекватный иммуный ответ и проявление линейной зависимости процента торможения миграции макрофагов от ма дозы препарата. Специфическое торможение миграции макрофагов перигонэальнсго экссудата наблюдается через три недели после иммунизации мышей вакциной БЦЖ, суспензиями микобаетерий бычьего вида штаммов № 8,AN51 БЦЖ на полиэтиленсилоксановой жидкости с эмульгатором Т - 3, проявляется в течение всего периода исследования (14 недель) и процент торможения миграции макрофагов составляет 5-47%.

Установить степень влияния вида сенсибилизирующего антигена на результа ты РТММ нэ удалось из-за значительного разброса данных в единичных опытах.

При использовании клеток перитонеального экссудата животных, сенсибшъ зированных вакциной БЦЖ и стимулированных гидроокись алюминиевой формол-вахциной против пастереллеза свиней .торможение миграции на дозы туберкулин* 12,25,50,100 и 200 мкг/мл составило, соответственно, 11,9+2,8; 9,8+2,0; 9,5+1,9;

8,4+1,5 и 4,9+1,2%. В данной группе наблюдалась обратная зависимость эффекта торможения миграции от дозы туберкулина.

При предварительной стимуляции выхода клеток БЦЖ установлено торможение миграции макрофагов на дозы туберкулина 12, 25, 50 и 100 мкг/мл, составляющее соответственно 2,2+2,2; 3,9+2,7; 12,8+3,2; 19,9+3,2 %. В данной группе наблюдается прямая зависимость 1д дозы - эффект только в 50 % случаев постановки реакции. В связи с нестабильностью получаемых результатов беспородные мыши для постановки РТММ непригодны.

Определение дпигательной активности макрофагоп беспородных мьпивй био-■ химически»» методами.

Методы определения двигательной активности макрофагов по расходу глюкозы из культурзльной среды, применительно к клеткам мышей, и активности 5' нук-пеотидазы на клеточной мембране находятся на стадии отработки условий постановки и учета результатов рэекций. В большинстве случаев наблюдается общая тенденция в иммунологическом ответе махрофагоа сенсибилизированных мышей на действие специфического антигена - туберкулина. Так, при торможении миграции в 3, 12 и 23% процент индекса неорганического фосфата составляет 73 , 28 и 10 %, соответственно. Таким образом, развитие методов объективной оценки динамической активности макрофагов является перспективным направлением и требует дополнительных исследований.

3.2.3. РТММ с клетками гибридных и линейных мышей.

>Кивотные были использованы через четыре недели посла сенсибилизации эакциной БЦЖ. Для стимуляции выхода макрофагов в перитонеальную полость использовали легкое минеральное масло, при постановке реакции туберкулин для млекопитающих референтной серии № 14 применяли а концентрациях от 12 до 1000 икг/мл.

В РТММ на мышах линий СБА, Сот/816 и гибридах СБА х АКЯ также получено этецифичоское угнетение миграции клеток. Процент торможения миграции у мышей пинии СБА на дозы туберкулина 12: 25,100 и 200 мкг/мл составил 5,0+1,2 ;11,5 +2,9, 18,5+3.1.21,6+3,3 %. а у мышей линии С57/В1внз дозы 25, 50, 100 и 200 мкг/мл -3.4+1,5, 17.5+7.4; 19,3+4.1, 23.3+4.7 %

У мышей гибридов СВА х АК1Ч процент торможения миграции на дозы туберкулина 30, 60,125 и 250, 600 и 1000 мкг/мл составил 8,2+3,8,12,9+0,3; 13,7+7,9; 20,1+8,2; 25,2±8,8 и 27,0+8,6 %.

У всех групп мышей проявляется линейная зависимость 1д дозы-эффект , но отмечается значительный разброс значений в группе. Более высокий уровень ответных реакций, получение большего количества клеток перитонеального экссудата от мышей линий СВА позволяет считать эту популяцию как наиболее пригодную для определения, активности туберкулина в РТММ.

3.2.4. Определение активности туберкулина в РТММ с использованием порито-наальных макрофагов мышей линии СВА.

При определении активности туберкулина взята стандартная серия туберкулина для млекопитающих № 14 в концентрациях 50,100 и 200 мкг/мл, а в качестве испытуемого образца - эта же серия в равных концентрациях и уменьшенных в два раза.

При равных концентрациях испытуемого и стандартного препаратов результаты определения активности туберкулина по трем точкам соответствуют ожидаемому значению. Но при вычислении активности по двум точкам наблюдаются значительные отклонения от истинного значения активности туберкулина! Значения этого показателя колеблются в пределах от 38 448 МЕ/мг до 69 711 МЕ/мг. Такой разброс значений активности препарата объясняется тем, что в РТММ процент торможения миграции на одну и ту же концентрацию стандартной серии различается в значительной степени.

Результаты определения активности препарата, при концентрациях испытуемого туберкулина в два раза ниже стандартного образца показывают, что актианост испытуемого туберкулина, определяемая по различному количеству доз, колеблете: в пределах от 100 до 59 500 МЕ/мг. Из 35 определений активность препарата соответствует ожидаемому значению (25 ООО ± 20 %) только в девяти случаях, что составляет 24 %.

Использование клеток генетически однородных животных, так же как и бе сто родных, не позволяет получить стабильные результаты исследований. Реакция тор можения миграции макрофагов по точности определения активности туберкулина ^ превосходит метод внутрикожных аллергических проб на сенсибилизированных мо

ских свинках, и при существующем техническом уровне ее постановки не может ' применяться на практике из-за нестабильности получаемых результатов.

ВЫВОДЫ.

1. Реакции на вкутрикожное введение разных доз туберкулина у сенсибилизированных морских свинок имеют линейную зависимость логарифм дозы - эффект.

2. Метод определения активности туберкулина, применяемый а еетеринзриой практике нашей страны, не позволяет регистрировать значительные отклонения этого показателя качества препарата. Метод, рекомендованный ВОЗ, учитывает закономерности проявления аллергических реакций и обеспечивает большую точность исследования.

3.Линейная зависимость 1д дозы - эффектна введение туберкулина, изготет-ливаемого по технологии, принятой в России, проявляется в диапазоне доз от 5 до 100 МЕ.

4. Использование двух доз туберкулина в интервала от 5 до ТОО МЕ и шагом разведения не менее четырех позволяет определить ветивность аллергена с ©5% уровнем вероятности. Применение 10 и 100 МЕ является оптимальным.

5. Достоверный результат определения активности туберкулина •обеспечивается при использовании в опыте не менее 10 сенсибилизированных морских свинок.

6. Высокий и устойчивый уровень сенсибилиззции морских свинок к туберкулину достигается при использовании живой культуры штамма БЦЖ и масляных суспензий убитых культур различных штаммов микобактерий 'бычьего вида.

7. Снижение содержания МЕ в туберкулине (даже а 1,3 раза) достоверно уменьшает эффективность внутрикожнмх аллергических проб при диагностике туберкулеза у крупного рогатого скота.

8. Использоаание при постановке РТММ среды Кг 199 с 1% фетапьной сыворотки КРС или сыворотки крови человека IV группы для выделения, отмывки макрофагов и пркготозлония 1% - ного агарового геля обеспечивает получение количественно оцениваемых зон миграции. Обязательным условием постановки реакции является стимулирование за трое суток выхода макрофагов в перитоноальную полость, получение и обработка клеток на холоду и их концентрация до 2 х 10° кл/мл.

9. Беспородные мыши не могут быть использованы для постановки РТММ в связи с невозможностью использования пула клеток нескольких мышей и большим разбросом данных единичных определений.

10. При использовании в РТММ клеток мышей линий СБА, C57/BI3 и гибридов первого поколения СБА х АКР получена прямая зависимость lg дозы - эффект, однако, в пределах групп отмечается значительный разброс значений, отрицательно влияющий на точность определения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1. На основании полученных результатов исследований разработана методика определения активности туберкулина на сенсибилизированных морских свинках, обеспечивающая высокую точность исследования.

Методика вошла в изменения и дополнения к "Инструкции по изготовлению и контролю туберкулина очищенного для млекопитающих", а также в проект Изменения №1 ГОСТ16739-88 "Туберкулин очищенный (ППД) для млекопитающих".

2. Разработана методика сенсибилизации мышей, стимуляции и получения макрофагов, установлены дозы туберкулина для реакции торможения миграции макрофагов с целью определения активности туберкулина. Необходимо продолжение этих исследований для разработки технических условий постановки реакции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Ерошенко Л А., Шаров АН. Определение активности туберкулина. II Сборник научных трудов ВГНКИ. -1994. -т.55. - С. 147 - 154.

2. Ерошенко Л А., Каргина И.Б. Отработка реакции торможения миграции макрофагов мышей для определения активности туберкулина. II Сборник научных трудов ВГНКИ -1995.-т. 57.-С. 107-114.

3. Ерошенко Л.А., Шаров АН., Каргина И.Б. Усовершенствовать метод контроля активности туберкулина для млекопитающих. II Заключительный отчет. -1995. - ИН8 № 02950003753. - № гос. регистрации 01930006127. - 57 С.

4. Ерошенко Л А. Анализ разных методов определения активности туберкулина. II Сборник научных трудов ВГНКИ. -1995. - т. 57. - С. 115 -119.

5. Ulapoo А И., Ероша ¡ко Л А, Косяхин А.Н. Влиянкэ дозы туберкулина на эффективность аллергической диагностики туберкулеза. // Тезисы докладов ксмфэретучн 'Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных Сиоггагм-чзских препаратов". - 193в. - С. 170.

6. Ерошемко ЛА, Каргмна И.Б. Использование линейных и беспородных мышей для РТММ при определении еетизносги туберкулина. И Тезисы докладов южфэренцки "Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препгротоз". -1599. - С. 172-173.

7. Ш."роо АН , Тырима О С., Ерошенко ЛА и др. Препараты для дишюстики ryöcfv кулбза у »:коотн!;>и. // Q книга "Курская биофзбрмка - 1СО лет*. - 1SS6. - С. 374 - 402.