Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Очистка и некоторые физико-химические свойства вируса ящера типа O I A-22

УКРАЇНСЬКА АКАДЕМІЯ АГРАРНИХ НАУК ІНСТИТУТ гКСИЕРЖІГГАЛЬНОІ І КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНО!

МЕДЩЖИ

РГ6 ОА

/ 4 МЮП » * й'иоввдг

БУШГЕДТ ЛАРИСА В1ТАЛЫБНА

ОЧЙЩЕБЯ І ДЕЯКІ ФІЗИКО-ШМІЧЕІ ВЛАСТИВОСТІ ВІРУСУ ЩУРА ТИПУ О І А-22

;5. со. СЗ - зетвринарна мікроб:?лсг:я. з:р/со лсгія, елізсстслсг'.л, мі.-:слсг-.я : : .-.іунслсг: д ?3. СО. С4 - .б:ох:міл

АВТОР

А

Яв ЗЛСС'^ТТЯ Чау-СПЕСТО ЗТУТбЧЯ

5:слог:чких наук

2арк:3 1994

Робота виконана б лабораторії б:сх:мі; Інституту експериментально: : клінічно: ветеринарно: медицини УААН

Наукові керівники :

доктор ветеринарию; наук, академік УААН Красніков Г. А.

кандидат ветеринарию: каук Кленіна Е. Е

Ведучий заклад: Харківський зооветеринарний інститут

годин на зас: ДсіНН І спеціалізовано: ради Д. 02С. 58. Ві.

Інститут: експериментально; і клінічно: ветеринарно: медицині:

адресою:

310023 м. ХаркіЕ, вул. Пужінська 5с

З дисертацією можна ознайомитися г б:5л:отец: ІЕ ІКШ м. Харків-23, вул. Пущкінська 83.

Автореферат розісланий 4— 1994 Р.

Офі ц: йн: опоненти:

доктор біологічних наук Тиштенко О. В.

кандидат біологічних наук Гончарук 0. І.

1994 п

1УУ4 р

Вчений секретар спеціалізованої ради доктор ветеринарних наук

І. Загальна характеристика роботи.

• 1.1. АКТУАЛЬНІСТЬ ПРОБЛЕМИ.

Великі і відповідальні задачі постають перед сучасною наукою з галузі вірусології. Саме тут в останні 35-40 років зроблені відкриття, котрі багато в чому обумовили бурхливий розвиток сучасної 5ілогічноі науки. Одним з найбільш престижних напрямків в розвитку сучасної вірусології залишається вивчення структури віріонів та ідентифікація їх компонентів.

Особливо відчувається необхідність форсованого вивчення вірусних хвороб тварин. Очищення і концентрація вірусів має велике теоретичне і прикладне значення. Віруси е обов’язковими внутрішньоклітинними паразитами і їх розвиток та репродукція здійснюються у живих біологічних системах, у зв’зку з чим, вірусні препарати, одержані від заражених тварин або культур клітин містять велику кількість баластного тканинного і клітинного матеріалу, який створює вигідні умови для збереження вірусу, але дуже ускладнює роботу в умовах лабораторій і біологічних виробництв. Наявність у вірусних суспензіях баластних речовин і других компонентів спричинює необхідность збільшувати кількість хімічних речовин, які використовуються для виготовлення вакцин, ускладнює процес інактивації та сорбції вірусу, викликає сильну імунну реакцію щодо неспецифічних компонентів препаратів, знижує чіткість і специфічність реакцій у діагностичних дослідженнях, особливо при використанні високочутливих сучасних тестів, а у деяких з них такі суспензії зовсім не можуть бути використані.

У зв'язку з цим у сучасних умовах безперервного збільшення вимог до якості біологічних-препаратів, зусилля мусять бути направлені на одержання вакцин та діагностикумів із вірусів, можливо більш якісно очищених від баластних речовин. При цьому мається на увазі, ідо подорожчання технології виробництва біологічних препаратів і часткова втрата вірусу на етапах очищення і концентрації, повністю виправдовуються гарантією їх стабільності, надійності та ефективності.

Розробка методів очищення і концентрації є необхідною умовою вивчення біологічних, хімічних, фізичних властивостей вірусів, особливо дрібних віріонів, відділення котрих від внутрішньоклітинних структур завдає найбільші труднощі. До дрібних вірусів належить і вірус яшура. Захворювання ящуром в недалекому минулому пройшло по всій Україні, завдавши великих збитків тваринництву. Наслідки панзоотії яшура примушують нас і тепер бути обережними

та готовиш до можливого занесення ще* надзвичайно контактної і фекції на територію нашої країни.

У зв’язку з цим вивчення властивостей вірусу яшура, не ди лячись на епізіоотичне благополуччя України щодо цього захворюва ня, продовжує залишатися питанням великої актуальності.

Вірус ящура відрізняють не тільки невеликі розміри, але висока антигенна різноманітність, основою якої, кінець кінцем багатообразність його хімічної структури ї особливо білків.

Незважаючи -на те, що праці з вивчення хімічних та біологі них властивостей вірусу започатковані Bachrach ще у 1952 році 1 продовжені К R Лихачовим, Г. Ф. Шемановою та ін. у 1964 р. parhrach і Wood у 1964 p. , Т. А. Сатиною у 1969 p. „ А. Е Простякі вим у 1970 p. , А. Е Пономарева та ін. у 1978 р. , С. А. Рибаковою ін. у 1978 p., А. Е Пономаревим і ін. у 1991 p., А. В. Чепуркиним ін. у 1991 p. , Pacheco і ін. у 1992 р. , багато аспектів цього наї ряыку досліджень залишаються не повністю вирішеними.

фактично не вивчений амінокислотний склад білків різних ті пїв очищеного вірусу, не досліджена залежність хімічного скла} очищених суспензій вірусу ящура від особливостей тих біологічні об’єктів,де здійснювалася його репродукція.

При вивченні фізико-хімічних властивостей вірусу ящура не повній мірі використовувалося визначення співвідношення білка РНК та спектра поглинання в ультрафіолетових променях, не провода лося визначення інфрачервоних спектрів очищеного вірусу,до харау теризують первинну і вторинну структуру білка вірусу ящура

Дослідження ФІЗИКО-ХІМІЧНИХ якостей стосувались окремих Пс раметрів і не мали комплексного характеру. Не проводилося вивчеи ня хімічних та фізичних характеристик суспензій вірусу ящура, як піддавались різному ступеню очищення з використанням хімічних за собів відділення вірусу від баластних речовин, в тому числі і та ких, котрі забезпечували одержання високоочищеннх препаратів.

Всі ці питання вимагали свого рішення, у зв’язку з чим бул проведені власні дослідження.

1.2 Мета і завдання дослідження.

Мета цієї праці: розробити методи очшення вірусу яшура, от риманого із різних джерел і одержати препарати, придатні для про ведення Фізико-хімічних досліджень; визначення хімічного складу фізико-хімічних характеристик очищених препаратів вірусу ящура ти пів О і А-22. На вирішення були винесені такі завдання:

- з -

1. Відпрацювати ефективні комплексні схеми виділення і очищення лапінізованого і культурального вірусу ящура, які забезпечують одержання максимально очищених препаратів без використання ультрацентрифугування;

2. Вивчити деякі фізико-хімічні і хімічні властивості суспензій лапінізованого і культурального вірусу яшура в різній мірі очищеного від баластних речовин.

3. Провести порівняльне вивчення хімічного і амінокислотного складів білка очищеного культурального і лапінізованого вірусу яшура типів 0 і А-22, використовуючи сучасні метода дослідження (гельхроматографію, зазначення ультрафіолетових та інфрачервоних спектрів).

І. 3. Наукова новизна.

Розроблені оригінальні схеми очищення вірусу ящура від тканин заражених кроленят і культури клітин, які забезпечують одержання високоочищених препаратів, придатних для хімічних і фізико--ХІМІЧНИХ досліджень. Розроблені мікрометоди вивчення ХІМІЧНОГО складу вірусу яшура. Вперше проведений порівняльний аналіз амінокислотного складу білка лапінізованого і культурального вірусів ящура типу 0 і А-22, виявлена відмінність між типами вірусу яшура за вмістом кислих і полярних амінокислот. Вперше методом інфрачервоної спектрофотометрії встановлена наявність у білку вірусу ділянки сі-спіралі, включення до бічних ланцюжків білка глутамінової : аспарагінової амінокислот, наявність у препараті дигліцинової

структури. Одержані додаткові дані про хімічний склад вірусу яшура і особливості ультрафіолетових спектрів поглинання.

1.4. фактична цінність.

Запропоновані методи очищення і концентрації дозволяють одержувати препарати вірусу яшура з низьким вмістом неспецифічних білків (очищення по білку на 97-99. 5%) при збільшенні антигенної активності у 20-50 разів. Це дає можливість використовувати їх як антигени у діагностичних реакціях, в тому числі і у тестах, де потрібні компоненти високої специфічності та чистоти, а особливо в 1Ш. Одержані препарати придатні для електронномікроскошч ної ідентифікації вірусу ящура. Дослідні серії протияшурної вакцини, виготовленої із очищеного вірусу зберігали до 90% тварин.

1.5. Основні положення дисертації, ЯКІ виносяться на захист.

1. Розробка схем виділення і очищення вірусу яшура, що дозволяють одержати очищений по білку на 99.5 % лапінізований вірус на 97.2 %. культуральний, і на 93 % афтозний вірус, придатний дл: вивчення його фізико-хімічних властивостей.

2. Вивчення хімічного складу лапінізованого і культурального вірусу ящура'з кількісним визначенням азоту, фосфору, калію натрію, білку і РНК.

3. Вивчення кількісного і якісного складу амінокислот віру-г-; яшура типів О і А-22.

4. Порівняльна характеристика ультрафіолетових спектрів суспензій вірусу яшура на різних стадіях очищення.

5. Вивчення інфрачервоних спектрів вірусу яшурра типів О :

А-22.

6. Розробка мікрометодів визначення хімічного складу очивдШ ного вірусу яшура.

1.6. Апробація роботи.

Матеріали дисертації доповідались на II Всесоюзній ветеринарній конференції ( Москва, 1966); Українській республіканськії конференції з актуальних питань ветеринарії ( Харків, 1969); і: Міжвузівській ветеринарній вірусологічній конференції (Москва, 1970); IV Всесоюзній ветеринарній вірусологічній конференції ( Володимир, 1976); засіданні Вченої Ради ІЕ і КЕМ (Харків, 1994).

1.7. Публікації.

Всього опубліковано 38 робіт, з них- 10 по темі дисертації.

Три статті по темі дисертації друкуються.

1.8. Об'єм і структура дисертації.

Диссергація викладена на стор. друкованого тексту :

складається із вступу ( ^ стор.). огляду літератури (

стор.), власних досліджень ( 3 стор.), обговорення (

стор.), висновків і практичних пропозицій ( ^ стор.).

Список літератури включає £43^ джерел, в тому числі зарубіжних/авторів. Робота ілюстрована &0 таблицями і

графіками.

II. ВЛАСНІ ДОСЛІДЖЕННЯ.

II. 1. Матеріали і методи.

?с-5ста проводилася за державним планом у лабср&тср.. :;ох.

. .і : л5М УААН.

Вихідним матеріалом для одержання очишеног: віру:;; яшура були:

Суспензія Еірусвміщуючої мДзової тканини ?-5- добових

кооленят;

Зі С ''"г‘ м7тт'’"- “ЯТ ’ Лг 7'т В С В сгг И V. " ^~ '-г * ‘ ’“";ЛГ:‘'СВ Г Т’-'ніЧІ'Г-Ч'* ПС'~

--ТІ ЗТЕ!’’ *

•І. Суспензія айт плантарно: дзвердн: лапок мсрських свинок;

і. АФтозна лімза морських свинок.

Г дослідах використовували вірус япура типу 0 ггам Галась-КИИ/ . який пройшов на кроленятах 300 пасажів, типу А варіант 22., ттам Новозодолазький), який пройшов 52 паса:® відповідне. Лапіні-зсваний вірус мав інфекційний титр 7-8

Нультурельний Еірус типу А { варіант 22. 2?ам думський) вирощували на культур; клітин СПЕ5, використовуючи серелевине 195 ? додаванням :С ~ інакгивогено: сироватки великої рогато: худоби.

АФти і аФтозну лімфу морських езинок одержали після їх зараження методом тунелювання у длантарну поверхню кінцізск.

На всіх етапах очищення матеріалу, який дослівкували; проводили визначення ультрафіолетового спектру поглинання на 05>-'16, кількості білка пс Лоур: та інФекшйксст:. титраці=ю на новонароджених мишенятах ; морських свинка;':, ‘чиїдений рідкий матеріал : частково зчишен: препарати піддавали ліофільному зисулузаннк.

Всього суло виділено 94 сесії лапіізсваног: вірус". 33 сер., культуральногс і 27 серій аФтсзногс вірусу япура.

Проводячи хімічний аналіз сухого матеріалу, визначали еліду--:ч; показники:

1. Кількість білка за методом Лоурі.

2. Кількість нуклеїнових кислот за А. С. Спіріним.

3. Кількість азоту - колометричким методом після мінергліза-ціі за Кьєльдалем.

4. Кількість фосфору- колорометричним методом з використанням молібдата амокія і аскорбінової кислоти.

3. Кількість калії і натгі:с на полум’яному хтометр:’’цейса", після опалювання досліджуваного матеріалу у муФільній печі при

? 9Г

- . - б.-.. :-;

б. Кількісний і якісний.склад амінокислот- методом хроматографії на папері, вшсористйъуючи'1 "якості'’рухомого розчинника суміші н - бутилового спирту, ЛЬОДЯНОЇ ОЦТОВОЇ кислоти І води В РІЗНИХ співвідношеннях.

. 7. Ультрафіолетовий спектр визначали на СФ - 16 при 230 -

300 нм.

8. Інфрачервоний спектр - на ИКС - 14А, використовуючи призму із ИаСІ.

9. Інфекційність - на новонароджених мишенятах або морських свинках.

10. Антигенні властивості з реакції дифузійної преципітації за Оухтерлоні у модифікації УНІІЕВ з використанням агарози фірми ЗсЬисЬагЬ.

Для визначення показників з 1 по 6 були розроблені мікроме-тоди (кількість -реактивів, температурний і часовий режим). Весь одержаний в процесі роботи цифровий матеріал був оброблений варіаційно-статистичним методом з використанням таблиці Стьвдента і непараметричного критерію И-Вілкоксона, Манна і Уітні.

II- 2. Результати досліджень. \

11.2.1. Виділення 1 характеристика очищених препаратів вірусу яиура.

11. 2.1.1. Розробка схем одержання очщзвих препаратів

лапіаізовавого вірусу ящура.

З метою очищення лапінізованого вірусу яшура були досліджені 4 методи, у кожному з котрих брали тканинну суспензію, яку готували на фосфатному або трис- буфері у відношенні 1:10.

1. До тканинної суспензії додавали різні дози хлороформа (від 10 до 50 %. )■ у гомогенізаторі при 8000 обертах на хвилину. Осад баластних тканинних білків бідділяди центрифугуванням. Надо-садову рідину використовували для подальшого очищення.

2. Тканинну суспензію обробляли 10 % хлороформа і центрифугували. Обробку повторювали 3 рази. Із третього центрифугата вірус осаджували додаванням насиченого розчину гіпсової води. З осаду фосфорнокислого кальцію вірус елювали буфером при шутелюванні протягом 1 години.

а До тканинної суспензії додавали 20 % хлороформу. Вірус осаджували гіпсовою водою і 25 % розчином етилового спирту при’' 5-8 °С.

- 7 -

Елюцію проводили як у другому випадку.

4. Вірус із суспензії осаджували 25 % метанола, потім обробляли сумішшю хлороформа і н-бутанола і 1:1 ) у гомогенізаторі і проводили центрифугування при 80000 g.

У всіх випадках очищення заключним етапом була колонкова хромотографія. У робот: випробували колонки різного розміру-

200 х 10 мм, 500 х 25 мм, різні марки сефадекса ( Г-75, 100, 200) і ДЕАЕ-целюлозу.

Найбільш ефективним методом попереднього очишення виявився II метод. А в цілому схема очишення лапінізованого вірусу ящура приведена нє наступи:етсрінії:.

II. 2.1.2. Характеристика препаратів лапі візованого вірусу ящура на різних стадіях очищення.

На всіх етапах очищення лапінізованого вірусу ящура ми визначали у- рідких препаратах вірусної і здорової тканини кроленят (контроль) кількість розчинного білка і процент очищення препарата по біжу по відношенню до вихідного гомогенату, зміст азота і інфекційний титр.

З гомогенаті лапінізованого вірусу яшура вміст білка становив 0,535 ті, а в гомогенаті здорової тканини - 0,531 г Z. Титр вихідного вірусного гомогенату дорівнював 7-8 ig*..

Після першого очишення хлороформом зіруений матеріал зиявив-ся очищеним по білку на 50,5 Z, а здорова тканина на 51,8 %.

Друга обробка хлороформом приводить до очищення вірусного матеріалу по білку на 66,7 Z, а здорової тканини - на 71,7 Z.

Процент очищення після третьої обробки хлороформом складав

для вірусного матеріалу 7S,5 а для здорової тканини - 80,6.

Після адсорбції на фосфорнокислому кальції зірусвміщуючий препарат ” до колонки " був очищений на 94,5 Z, а здорова тканина-на 95,4 Z.

Відповідно зміні вмісту білка зменшується і кількість азоту в препарат: з 7,7 мг ( у вихідному гомогенаті ) до 1,7 мг з 1 мл

у препараті "до колонки”. Цей препарат мав титр 5-7 igj,.

Очищення на колонці з сефадексом Г-75 дозволило одержати 2-і сумарні фракції (піки), перша з яких вмішувала 0,0027 г % білка ( 99,5 % очищення ) при інфекційному титрі 5-6 lg2 , друга

0,0065 г Z білка ( 98,8 % очищення), інфекційний титр- 3-4 lg* .

- 8 -

СХЕМА ОЧИЩЕННЯ ЛАПІНІЗОВАНОГО ВІРУСУ ЯЩУРА.

! Нанесення вірусного матеріалу + ) і фосфатно-сольов. буфер, рН-7,б і

Гомогенізування 10 хв. при 8000 об. за хв.

| Ліофільне висушування |

1 1 Сухий вірус , .. - . Сухий вірус

1 очищення 99%. 1 очищення 97%

- g -

II. 2.1. 3. Виділення і характеристика препаратів афтозного вірусу.

Для одержання афтозного вірусу : лімфи, морських свинок за ражали внутрішньошкірно вірусом яшура у плантарну поверхню задні, лапок. Стінки утворених афт розтирали із скляним піском, суспен зію центрифугували при 6000 об. за хв. , центрифугат пропускали через колонку з сефадексом Г-75, Г-100, Г-200 і ДЕАЕ- целюлозою. 3-вихідному вірусі вмішалося 0,350 г Z білка.

Очищення афтозного вірусу в даному випадку становило на се-фадексі Г-75 -92,3 Z, Г-100 -90,2 Z; Г-200 -92.2 %; ДЕАЕ- целюлозі- 97,3 Z. Найбільший процент очищення досягався на ДЕАЕ-целюло-зі, однак, процес був дуже розтягнутий у часі. Тому використовували для цієї мети сефадекс Г-75.

Очищення афтозної лімфи до колонки складалося з одноразової обробки подвійною кількістю хлороформа. Якщо у ВИХІДНІЙ лімфі МІСТИЛОСЯ 5 г %. білка, то після обробки хлороформом залишалося 3,5 г %, а після гельфільтрації - 0,085 г Z.

II. 2.1. 4. Одержання і характеристика препаратів культурального вірусу ящура.

Культуральний вірус ящура заморожували і після відтадазаняя центрифугували при 3000 об. за.хв. Центрифугат зміщували у різних кількостях з охолодженою гіпсовою водою і додавали 25 Z етилового спирту при температурі 7 °С. Осад зідділяли у рефрижераторній центрифузі при 3000 об. за хв., суспендували у 1/20 початкового об’єму трис-буфера і шутелювали 1 год. Потім вірус пропускали через колонку з сефадексом Г-75.

У вихідному культуральному вірусі містилося 0,145 г % білка, при титрі інфекційності 5-6 lgi • У препараті "до колонки”, після обробки гіпсовою водою і спиртом, було 0,0239 г %, білка. Препарат, пропущений через сефадекс Г-75 був очищений по білку на 97.2 %, при інфекційному титрі 4-5 lgt.

11.2.2. Імунохімічна характеристика вірусу ящура.

Із досвіду роботи з різними вірусами відомо, що дія на вірус хімічних і фізико-хімічних факторів, часто негативно впливає на вірус, приводячи до денатурації його білка і зрештою інактивації вірусу.” У зв'зку з цим, очищаючи вірус яшура різними метода-

ми, паралельно проводили вивчення його імунохімічних властивосте на різних стадіях процесу. Вірус після очищення хлороформом і ад сорбції на фосфорнокислому кальції, мав титр на один порядок ниж че вихідної тканинної суспензії (6-7 ). Очищений таким чино

вірус мав хороші антигенні і імуногенні властивості. Антиген, при готовлений пс методиці УНІІЕВ їв очищеного і концентрованого віру су, був активним і тилослецифічним у РДП з використанням гіпері мунних сироваток з- титром 1:50 для тилу О і 1:30 для типу А.

Для оцінки імуногенних властивостей:', очищеного вірусу буї приготовлені 23 серії дослідних протиящурних вакцин, котрі випре їувалися на поросятах і морських свинках. У наших дослідженнях те кі вакцини зберігали до 90% вакцинованих тварин при зараженні ві русом яшура.

Проводили також вивчення б ?ДП очищеного хлороформом: і фільтрацією через сефадекс, ліофільно висушеного вірусу ящура,5 кий;' зберігався більше 2 років при теемпературі +15 °С. Чіткі л: ні5 преципітації утворювались між матеріалом з високим стулене очищення (І пик) лапінізованого вірусу типу 0 і А, варіант 22 : гомологічними сироватками. Чітку лінію преципітації також утворі вав миатеріал II піку вірусу типу А варіант 22. Неочищеш і чаї тково очищені препарати до концентрації на колонці у всіх випа, ках не утворювали ліній преципітації з гомологічними сироваткам: Реакція була специфічною,про що свідчила відсутнітсть ліній прец пітації між гетеролопчним антигеном і сировоткою.

11.2.3. Ультрафіолетовий спектр вірусу ящура.

На поглинання ультрафіолетових променів суспензіями вірус впливає хімічний склад і структура білків капсида, більша або ме ша здатність цих білків поглинати ультрафіолетові промені у пе них зонах спектру і величина відношення білка до нуклеїнової ки лоти, котра більш інтенсивно поглинає ультрафіолетові промен ніж білки.

~?оцес: роботи ми визначали УФ - спектр препаратів на рі них стадіях очищення, а також сухих очищених препаратів. Бри ви ченні УФ - спектру вихідних гомогенатів ми спостерігали два пі яяття криво: при 240 і 280 нм. Це свідчить про те, що в препарг знаходилась досить велика кількість полісахаридів і простих б і ків, з перевагою в них таких амінокислот, як цистеїн, триптофг Коефіцієнт 260/280 препаратів дорівнював 0,84. Максимум поглинг ня припадав на 275 нм. У афтозного вірусу у цій зоні УФспектру

ворювався мінімум.

Після очищення хлороформом, у процес: якого виводиться значна частина забруднюючих тканинних компонентів, на кривій лапінізо-заного вірусу утворювався мінімум з області 230 нм. Коефіцієнт 2Є0/280 такого препарату дорівнює -1,55. Подібний препарат афтозного вірусу мав коефіцієнт рівний- і,50. Таким чином після хлороформного очищення р:зк:х матеріалів їх характеристики зближували-

л с

Препарати очищеного вірусу І і II піків мали максимум поглинання при 260 : мінімум при 240 нм. Коефіцієнт 260/280 у препаратів І піку дорівнює- 1.26, у II піку- 1.55.

Ультрафіолетові спектри сухих лапінізованих гомогенатів характеризувалися "зглажуванням" піків у облает: 270-280 нм, що характерне для рідких препаратів теля хлороформного очищення. Ле наводить на думку, ідо в процес: висушення неочищених препарат:' частина баластних речовин зазнає денатурації.

Сухі очищені препарати І і JJ піків дають крив: поглинання аналогічні з рідкими препаратами. Коефіцієнт 260/280 для лапіНізс-заного вірусу типу А, варіант 22 дорівює- 1,25; для типу 0- 1,15; культурального вірусу типу А, варіант 22- 1,26.

II. 2.4. Інфрачервоний спектр вірусу ящура.

Методи інфрачервоної епректрофстометр:і почали застосовувати у дослідженнях білків і пол:пептид:в у 40 - 50 роках. При дослідженні вірусів зони використовуються ще дуже рідко.

Виміри поглинання інфрачервоних смуг у білкових препаратах ззичайно проводять при довжин: хвилі 2-15 j* ( 500 - 5000 см }.

Смуги поглинання, як: зиникають у цій області, обумовлені

збудженням молекулярних коливань, частоти яких визначаються розміщенням атомів у молекулі і величиною міжатомних сил, а їх інтенсивність- зміною розподілу зарядів, що виникає при коливанні атомів.

Зовні ліній зигляд інфрачервоних спектрів поліпептидів : білків визначають так зван: ам:дн: смуги I, II, ПІЛ, : смуга зален-тних коливань NK - групи.

У досл:джених препаратах з:русу дшура спостерігалося поглинання в області 1680-1650, 1580-1540, 1470-1450, 1250, 1040-1015, 900 і 790 см'1.

Поглинання в області 1650 і 1540 см спостерігав Fraser R.

( 1952, 1953 ) п;ш вивчені інфрачервоних спектрів вірусу тютюно-

во і мозаїки. На основі цих і більш ранніх досліджень названого а тора і Ргасе ( 1952 ) було встановлено, що коливання в облас

1650 см виникають в результаті розтягнення зв'язку 00 і поворо і і в напрямку C=N. Зміни цих зв’язків асоцийовані з резонанс аміногруп. Поглинання в області 1650 см-1 передбачав Pauling та і ші. ( 1951 ) для білків, які мають структуру d-спіралі, коли З

останка амінокислот утворюють один її виток.

Смугу поглинання в області 1570 см-1 можно пояснити симетри ними і асиметричними коливаннями С00 групи глутамінової і аспар гіновоі кислот бічних ланцюжків білкової молекули. Смуга поглина ня в області 1540 см 1 є результатом коливань зв’язку N-H. Сму

поглинання в області нижче 1400 см зв’язані з коливаннями, в к

трих приймає участь весь поліпептидний скелет молекули. Поглина

н

ня в області 1040 см моде виникнути за рахунок валентних колива

SO3 - групи цисте і нової кислоти.

Поглинання в області 1015 см свідчить про наявність у cm білка дігліцинової структури. Ця смуга у культурального віру ящура трохи зрушена у короткохвильовий бік, що може бути результ том присутності більшої кількості міжмолекулярних водневих зв'я

КІВ.

II. 2.5. Хімічний склад очищеного, лашнізованого і культурального вірусу ящура.

В результаті проведеного хімічного аналіза очищеного сухс вірусу яшура виявлено, шо кількість загального азоту в препарат вірусу яшура знаходиться в межах 7,5-10,1 г %, причому найбілі його кількість містить лапінізований вірус ящура типу 0.

Найбільша кількість загального фосфору встановлена у пре; раті культурального вірусу типу А, варіант 22 - 0,434 г Z. 1 містив також більше калію і нагрію ніж лапінізований вірус.

При дослідженні кількості білка і РНК знайдено, що білкг вірусі ящура - 1,96-3,4 г Z, РНК- 0,81-1,56 г Z.

Найбільша кількість білка і нуклеїнової кислоти знаходив ся в лапінізованому вірусі яшура типу 0.

Незважаючи на неоднакову абсолютну кількість білка і нук:

І новоі кислоти, співвідношення ЇХ виявляється дуже близьким у 5 русі ящура різних типів. В середньому співвідношення білка і ! становить: 2,2:1 ( 70,0:30,0; 70,8:29,2; 66,5:33,5 % у лапінізої ному вірусі типу О, вірусі типу А, варіант 22 та культуральному і русі типу А - відповідно).

11.2.6. Хімічний склад сухих вихідних і частково очищених препаратів вірусу ягаура.

Поряд z вивченням хімічного складу очишнсгс вірусу ящура. доел:джували за тими же показниками вихідні : частково очииен

У склад, вихідного зірусвмішуючого лапінізованого гомогенату виявлено: 5,25 г % азоту, *,24 r Z фосфору, 1,25?' мг Z натрію, :,4~С мг % калію, 24,0 г Z білка та 5,0 г Z нуклеїнових кислот.

Вихідний препарат культурального вірусу лшура вмішував: •" ~ “ одг.гт'у ~ ~ ”. 2'Р у,- “ і - 0 З1 9 vr /

натр;к. 11,5 г Z білка. 5,18 г Z нуклеїнових кислот.

Частково очищений "до колонки" препарат лапінізованого вірусу ящура типу А, варіант 22 вмішував 5,0 г " загального азоту,

1.22 г % фосфору, 0,311 мг Z калію, 1,402 мг Z натрію; 8,3 г / білка та 4,0 г % нуклеїнових кислот.

Подібний препарат лапінізованого вірусу ящура типу 0 вмішував 3,0 г % загального .азоту, 1,32 г Z фосфору, 0.^25 мг Z калио,

2.970 мг % натрію. 3.1 г Z білка, 5,39 г % нуклеїнові*.* кислот.

Препарат "до колонки” культурального вірусу ;.тура вміщував:

7,3 г % азоту, 3,92 г Z фосфору, 0,195 мг % кал.ю та 0,444 мг 5

натрис; 11,2 г % білка та 6,18 г % нуклеїнових кислот.

Препарати II піка лапінізованого вірусу лггу'г т_дпу А, варіант 22 та 0 вміщували: 6,0 та 4,0 г % загальне. :у; 1,49 т;

1,81 г Z загального фосфору; 0,569 та 0,327 мг ...ю; 1,205 т;

С.70С мг Z натрію; 4,0 та 5,5 г Z білка; 3,0 та S, ■" . Z нуклеїно-

вих КИСЛОТ ВІДПОВІДНО.

З подібному препараті культурального зі русу лшура виявлено: £.~= г о азоту, 3. :і г * фосфору. 0,073 мг Z калій. 0.208 мг .'

натрію, ~,5 7 % білка, 2,39 г Z нуклеїнових кислот.

II. 2. 7. Особливості амінокислотного складу вірусу ящура.

II. 2. 7.1. Амінокислотний склад очищеного лапінізованого вірусу ящура типу А, варіант 22 та О.

З результат: хроматографічного .аналізу лапінізованого віру :у дгура виявлено 17 амінокислот: аланін, аргінін, аспарагіноз. кислота, гістидин, глютамінова кислота, лізин, лейцин, метионін пролін, оерин, треонін, триптофан, тирезін. иистін, іенілаланін аспарагін, глютамін.

5с і амінокислоти, за виключенням проліну, були визначе

КІЛЬКІСНО.

По кількісному складу амінокислот зіруси типу А, заріант

та 0 відрізняються один від одного. Так, у вірус: типу А вшшуеа

ся більше гістидину, глютамінової кислоти, треоніна, аланіна, к тиокін-валіна, фенилалакін-лейцика. Зума гідрофобних амінокисд в обох типах вірусу майже однакова >, 32,8 - А, 31,9 - 0),а су кислих амінокислот - різна. У вірусі А значно більше кислих амін кислот ( 22,0 - А; 15,8 - 0 ). Співвідношення гідрофобних та ки лих амінокислот у вірусі типу А-22 дорівнює - 1,49; у вірусі ти

г*' _ /~\

Для того щоб краще уявити амінокислотний склад вірусу взаємозалежність амінокислот в ньому складена амінокислотна ка та. При її складанні вміст кожної амінокислоти вважався за 100 а склад всіх останніх амінокислот даного вірусу перераховував відносно цієї амінокислоти.

При порівнянні амінокислотних карт лалінізованого вірусу т

ну 0 та типу А-22 виявляється, що в вірусі типу А-22 в 2 ра

більше таких амінокислот, як цистин,лізин,аргиній,серин-гліцин,ф кілаланін-лейцин у перерахунку на глютамінову кислоту та треонін.

Амінокислотний склад очищеного вірусу ящура ( відносні % ).

Амінокислоти А22 культур. А22 лапініз. 0 лапініз.

М-ш М - т М + т

Цистин+цистеін 3. 3+0. 12 5. 4+0. 54 6,5+0,33

Лізін о. 4+и. ос 11. 4+р. 86 13.0+1.05

Гістидин 17. 0+0. би 12.1+0. 95 7.4+1.30

Аргінін 9. 3+0. 77 11.5+1.22

Аспарагинова кислота 9. 1+1. 22 13. 4+1. 14 11. 4+0. 81

Серин + гліцин 11. 6+0. 26 9.3+1.09 9. 7+1. 75

Глютамінова кислота 13. 4+0. 54 6. 5+0. 63 4. 4+0. 81

Треонін 7. 9+р. 5С 5. 9+0. 44 2. 7+0. 25

Аланін 10. 4+С. 31 10. 5+1. 22 5. 9+1. 06

Тирозін 3. 9+р. 53 4. 2+0. 63 3. 5+0. 26

Триптофан — 2. 5+0. 26 2. 3+0. 20

Метионин+валин 5. 2+0. 54 7. 6+0.54 4. 7+_0. 90

Фенілаланін+лейцин 4. 9+0. 92 9. 9+0. 70 14. 1+1.20

II. 2. 7. 2. Амінокислотний склад очищеного культурального

вірусу яшура типу А, варіант 22.

¥

У даному типі вірусу виявлені ті ж амінокислоти, що і в ла-пінізованого вірусу, за виключенням триптофана Він або відсутній у складі даного вірусу, або його кількість знаходиться за межами, визначення даного метода

У культуральному вірусі цистин, лізін, аспарагінова кислота, фенілаланін-лейцин міститься з меншій кількості ніж у лапіні-зованому вірусі яшура того ж типу. Якщо сума кислих амінокислот у них однакова ( 22,0 і 22,5 % відповідно), то сума гідрофобних амінокислот дещо більша у лапінізованого.

II. 2. 7.3. Амінокислотний склад частково очищених препаратів лапінізованого вірусу яшура.

При вивченні гомогенатів лапінізованого вірусу яшура типа А, варіант 22 і типу 0 виявлені ті ж .амінокислоти ,що і у очищеного вірусу, але в інших кількостях. У вихідному препараті лапінізо-заного зіруеу Емітується 23,9% гідрофобних амінокислот і 20,3% кислих.

При порівнянні препаратів " до колонки " з і русі з типу 0 та

А, варіант 22 виявлено, аю у препараті типу 0 змішується більше

фен і ладан і я-лейдана ; серин-глшина ' 1С.? ; із.г проти 5.2 і 3,9

відповідно'; менше тирсзина : метиси:н-гал:на 2.4 ; 4,5 проти

4,0 і 5,2 відповідно.,. .

Препарат ”ло колонки лапін-.гснансго =:русу типу А. варіант 22 містить 51.: ^ Гідрофобних ; 22,3 ” числи:* амінокислот. препарат вірусу типу 0-25.5 і 21,1." зідпсвідно.

У препараті II піку вірусу типу 0 змідується менше цистину, лізину, гістидину, аргініну, триптофану, тирсзіну і більше треоні-ну, ні;х у зі русі типу А, варіант 22 2.3: 9.?; 5,04: 5,5; 3,1;

2,0; 3,3 проти 5,3; 12, і; 12,4; 3,5; 4,~; 2,3; 4,4-3: дповідно).

У препараті її пику вірусу типу А, варіант 22 міститься 34,2% гідрофобних і 19,3% кислих амінокиоглст, у вірусі типу 0 -21,2% гідрофобних і 19,3% кислих амінокислот.

III. жсвожи.

1. Розроблена технологія очищення лапінізованого., культурального : афтозного вірусу яшура, яка дозволяє одержати у достатній кількості високоочищений. 51 слог ічноактивний препарат, придатний для вивчення його хімічного складу і фізико-хімічних властивостей, використовування його як антигена : для виготовлення вакцин.

Згідно з технологією необхідне:

а) Очищення лапінізованого вірусу яшура, який вмішує великз кількість тканинних білків, здійснювати = використанням 3-разово: обробки хлороформом, адсорбції та гельхроматографії на сефадекс: Г-75.

б) Для виділення та очищення культурального вірусу яшура використовувати осадження етиловим спиртом і гельхроматографію.

в) Дяя виділення та очищення афтозного вірусу ящура застосовувати одноразову обробку подвійним об’ємом хлороформу та гельхроматографію.

2. Ультрафіолетові спектри поглинання вірусу яшура характеризуються наявністю одного піку із максимумом при 260 і мінімумої при 240 нм. Коефіцієнт 260/280 становить: для лапінізованого ві-руссу ящура типу А, варіант22 -1,25; для типу 0 -1,15 для культурального в:руса типу А-1,26. Після ліофільного висушення ультрафіолетові спектри очищенного вірусу не ЗМІНИТЬСЯ.

3. У складі вірусу яшура міститься 7,5 - 10.1 г % загального азоту; 0.252-С.434 г X загального фосфору, 1.96-3.4 г % білк; і 0.81-1.56 г % РНК. Відношення білка до РНК у вірусі ящура різних типів близьке (2.2:1) : становить в середньому у процентном; відношенні 70 % білку і ЗО % РНК.

4. При інфрачервоній спектрофотометрії вірус яшура дає ему ги поглинання, які свідчать про наявність участку сЬ спіралі : білку, включення у бокові ланцюжки білка глутамінової та аспарагі нової амінокислот, а також диглівднової структури у полипепті дня ланцюгах.

5. До складу білка вірусу ящура входить 17 амінокислот, культуральному вірусі типу А , варіант 22 у порівнянні з лапі нізо заним вірусом того ж типу відсутній триптофан.

6. Лапінізованний і культуральний Вірус типу А, варіант 2 вмішує однакову кількість негативно заряджених (кислих) і неполяр них (гідрофобних) амінокислот. У порівнянні з ними лапіяізований

Вірус типу О вмішує меншу КІЛЬКІСТЬ кислих і більше гідрофобних кислот. У склад: лапінізованого вірусу обох типів значно більше гідрофобних амінокислот ніж у культуральному зірусі.

7. Білок вірусу яшура можна віднести до групи простих білків, що підтверджується пдрофобніетью, амінокислотним складом і співвідношенням амінокислот.

8. Очищений вірус ящура виявляє зисоку антигенну активність, яка зберігається у сухому препараті протягом 2 років

9. Дослідні серії вакцини із очищеного вірусу зберігали

90 % тварин у дослідах прямого зараження. .

IV. ПРАКТИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ.

1. Для вивчення ХІМІЧНИХ 1 ФІЗИКО-ХІМІЧНИХ особливостей Вірусу ящура доцільно використовувати вірус, очищений по запропонованій схемі, яка включає обробку хлороформом, адсорбцію : гель-фільтрашю через сефадекс Г-75,що дає 93-99,5 % очищення.

2. Розроблена технологія виділення і очищення зі русу яшуру з наступним ліофільним висушеяням моле бути використана при виготовленні активних преципітуючих антигенів і у виробництві проти-яшурних вакцин.

3. Виявлені особливості хімічного складу вірусу яшура можуть бути використані безпосередньо при розробці ефективних засобів специфічної профілактики ящурної інфекції, конструюванні про-тиящурних вакцин.

Список опублікованих робіт до темі дисертації.

1. Кленина Н. 3. , Цымбал В. И. , Зунггедт Л. В. Антонов В. С. 51м-мунохимическое изучение очищенного вируса ящура // Акт. вопр. зет. вирусологии: Матер / 11 Всосоюз. конф. по вопр. вет. вирусологии 24-27 янв. 1966. -М. -1965. -Ч. І. -С. 36-87.

2. Кленина Н. В. , Вуштедт Л 3. Применение геля "Сафадекс" для очистки вируса ящура // Акт. зопр. зет. вирусологии: Матер. /III Всесоюз. вирусологической конф. 23-25 янв. 1967. -М. . 1967. -Ч. І. -С. 108-109.

3. Кленина Н. Е , Тертьшшик В. Л , Антонов В. С. , Цымбал В. И. , Вупггедт Л. В. , Белан А. Д. Превентивные свойства специфического гамма-глобулина при яшуре свиней, вызванном вирусом типа ”А-Ц" // Во-

лезни свиней: Тез. докл.. /Науч. -произвол, конф. , К , 1967. -С.

27-28.

4. Кленіна ЕЕ , Буштедт Л В. , Тертишник Е I. , Очистка віру-

су яшура :з застосуванням колонкової хроматографії на сафадекс:. // Ветеринара: Респ. міжвід. тематич. наук. зб. -К., 1969. -Е 24.

-С. 42-47.

5. Кленина Е Е , Буштедт Л. В., Тертьшшик Е И. . Очистка виру-

са яшура хроматографией на сафадексе // Яшур: Темат. сб. работ по пробл. ящура. Владимир, 1970. -С. 315-320.

6. Кленіна НЕ, Лебедева О- П, Буштедт Л В., Сучасні метода очистки вірусу та перспектива їх використання для біохімічного аналізу вірусу яшура і його РНК. // Ветеринарія: Респ. міжвід. тема-тич. наук. зб. -К., 1970. -Е 26. -С. 9-20.

7. Кленина Е В., Лебедева £ П. , Буштедт Л Е , 0 химическом

составе вируса яшура и его РНК // Вирусные болезни сельскохозяйственных животных: ііатер. /I межвуз. вет. вирусологическая конф.

26-28 ноября 1970. -М. , 1970. -Ч. I. -С. 165-166.

8. Кленіна ЕЕ, Лебедева 0. Е , Буштедт ЛЕ, Чорная Л Д.

Хроматографічний профіль : спектр поглинання в УФ- променях вірусу ящура та його РНК// Ветеринарія: Респ. м:жвід. тематич. наук.' зб.

-К , 1973. -Е 34. -С. 23-27.

9. Буштедт ЛЕ Хімічн: особливості лапінізованого і культурального вірусу яшура //Ветеринарія: Респ. мі жв ід. тематич. наук. Зб. -К , 1973. -Е 36. -С. 59-64.

10. Буштедт ЛЕ .Кленина ЕЕ Изучение инфракрасного спектра вируса ящура //Акт. вопр. вет. вирусологии; Матер, докл. / IV Всесоюз. вирусологической конф. 17-19 ноября 1976. -Владимир, 1976. -Ч. І. -С. 33-34.