Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка метода получения стерильных вирусосодержащих суспензий для изготовления противоящурных инактивированных вакцин

•'' Для служебного пользования # Г6 сп от 18.05.92р. экз. * £

' УДК 619:615:371:619.988.4

БОРИСОВ ШДЦИМИР..ВЛАДИМИРОВИЧ

РАЗРАБОТКА. МЕТОДА ПОЛУЧЕНИЙ СТЕРЖШЫХ ВШССОДЕВЩИХ 'СУСПЕНЗИЙ ДЛЯ ЮГОТОШШМ.ЛРО-ТИВОЯЩУЩЙ ШЖГИВИРОБАНШ ВАКЦИН

16.00.03 "Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, ■ ' ■-' микология и иммунолог"

С . 1 * ' С - ' - -

' ' i ' ' ! 1 ,. г ' ; . ' : ; . ' '

, А в т о р.е ^ ер ат

диссертации на соискание ученой степени . кандидата. ветеринарных наук •

Владимир - 1992

Работа выполнена зо Всесоюзном научно-исследовательском ящурном институте.

Научные руководители: доктор ветеринарных наук,

ведущий научный сотрудник : H.A. УЛУШВ;

кандидат ветеринарных наук, 'старший научный сотрудник А.Я.ДУДНИКОВ

Официальные оппоненты:

- лР&ШЮЗ Üron Максимович, доктор ветеринарных наук, nnojeccop (6Н/МбЗ:й, г.Локров, Владимирской обл.),

- TOJIOKIiO'i ллексей Сергеевич, кандидат ветеринарных н'г/ч (За.in.!, г.Владимир).

Идущая организация - В1Ы технологический институт биологической промышленности (Щелково, Московской области)

Защита состоится июля 1992 рода -в Ю00 час.

на -заседании специализированного совета К 120.60.01 по защите диссертации на соискание ученой степени кандидата наук при Всесоюзном научно-исследовательском ящурном •институте, по адресу: 600900, г.Владимир» п/о Юрьевец, оНШй. -

С диссертацией моетю ознакомиться в библиотеке всесоюзного научно-исследовательского ядурного института.

Автореферат разослан " " чкня IS92 г.

Ученый секретарь спецкал-:зироранного совета

Соколов Л.Й-

-2 -

Актуальность темы. Для специфической профилактики ящура в кашей стране нешли применение противощурные . и:{активированный вакцины из вируса, культивируемого в организме 2-3-Дневных крольчат, в эксплантатах эпителия языка КРС по Френкелю и в суспензии перевиваемой лиши клеток BHK-2I.

Получение, качественного вирусного сырья занимает важное место в технологии изготовления шактивированных вакцин. Вирусные суспензии, предназначенные для приготовления ПЯВ, наряду с высоким содержанием антигена должны быть стерильными.

Однако, тканевые и куль ту рал ыме вируссодергкашие суспензии нередко конташнированы бактериями и грибами (Макарова Г.А. и Сорвачев Е.А., 1967, 1974; Морев В.Б. и соавт., 1983, 1986; Бодина и ссавт., 1988; и др.). Часть из них выдерживает предусмотренную в" технологии обработку суспензии хлороформом и попадает в готовую вакцину (Шмидт Д., 1984).

Присутствие микробов-контаыинантов в вакцинных препаратах может отразиться на их безвредности, реактоген-ности и иммуногенной активности.

Методы поучения стерильных вируссодеркеаих суспензий при разработке и изготовлении вакцин медицинского и ветеринарного назначения являются актуальными в научнсм и практическом планах."

Так, Хеппле (1968,- 1972) отметил необходимодть предупреждения контаминации на всех этапах изготовления, фасовки и применения вакцинных препаратов, считая такой подход главной гарантией получения качественных вакцин. Аналогичная точка зрения высказана Оверианом (1969) при рассмотрении проблем, связанных с испытанием экспериментальных образцов вакцин на безопасность в национальном институте аллергии и инфекционных болезней (QL'A).

Макарова Г.А. и Сорвачев Е.А. (I9C7, 1974) отстали важность вопросов асептики и антисептики при получении

суспензии лалишэированного вируса ящура, а Шмидт (1984)' - при производстве противоядуриых вакцин из кульаураль-ного вируса ящура.

Для получения стерильных суспензий из тканевого и зсльтурального вируса ящура были предложены (физические и химические методы.

Ряд авторов (Берлизова Л.'S., 1978; Бикыаева Л. 1932; Арюгюнян ЯЛ., 1984) сообщили об успешном применении стерилизупаей :&?льтрзлии для освобождения вирусных суспензий от микробных контаминантов. Однако, применение стерилизувдэЯ Фильтрации в технологии изготовления ПЯЗ усложняет и удлиняет технологический процесс.

Оуть химических'Методов получения стерильных вирус-содерн:гших суспензий сводится к применению химиопрепара-. тов (хлороформ, ыетиленхлорид, мертиолат, азид натрия, хинозол) и антибиотиков.

По данным некоторых исследователей (Макарова Г.А., 1974; Олехнотц А., 3973; Шмидт, 1984) использование хлороформа не всегда обеспечивает получение стерильной суспензии. Использование ыертиолата и антибиотиков в производстве вакцин нежелательно, так как эти препараты наряду с вмрагенкыш бактерицидными свойствами имеют существенный недостаток: в комплексе с балластными белкаш они способствуют развитию поствакщшальных осложнений у привитых животных (Рейзин S.H. и сотр., 1987; и др.).'

Таким образом, получение стерильных вируссодерта-ишх суспензий и высококачественных ПЯВ является одной из актуальных проблем.

Дели и задачи исследования ."Основной целью наших исследований было изыскание и научное обоснование эффективного '.¡»технологически простого метода получения стерильных суспензий далиниэкрованного и культурального вируса ящура и ь:алообъе:лннх форм концентратов для изготовления Ецсокоактивимх »«активированных вакцин.

Для вшолкения этой цели исследований бала вадвину-

ты следующие задачи: . .

<- разработать метод получения стерильной суспензии культурального и лапинигнрованного вируса яцура с использованием высокомолекулярного пслигуанздина;

- проверить ищунобиологаческие свойства вируса ящура типов А и 0 после обработки полигуанидином;

- изучить влияние химической стерилизации суспензии на концентрирование вируса ящура адсорбцией на аэро-сил и осаждением полиэтиленгликолем;

- определить сохраняемость противояшурных вакцин из суспензии лапинизированного и'культурального вируса, обработанной высокомолекулярным полигуанидином.

Научная новизна. В работе приведены данные по обоснованию метода получения стерильных виру ссодержащих суспензий для изготовления противояшурных вакцин с использованием высокомолекулярного полигуанидина. Изучены иммунобиологические свойства культурального и лапинизиро-ванного вируса ящура типов А и 0 после микробной декон-ташнации полигуанидином.

Получены стерильные малообъемные форма концентраг тов вируса ящура и изучена сохраняемость прэтивоящуркых вакцин, приготовленных из стерильных суспензий лапинизиро ванного и культурального вируса.

Практическая ценность работы. На основании проведенных исследований разработана "Методика получения стерильной суспензии лапинизированного вируса ящура для изготовления противоящурных вакцин", утвержденная "директором ШИШ I0.I2.9Ir. •

В условиях Суме ко ¡1 биофабрики и завода "Срьевепсет-биопрепарат" воспроизведен метод получения стерильной суспензии лапинизированного вируса ящура при пропыленном изготовлении вакцин.

Результаты разработок пошли в следу:-■гис ьс ко-технические документы:

- 5 -

- "Инструкция по изготовлению и контролю универсальной моно- и поливалентной вакцины против ящура типов А, 0, Си Азил-Х". Утверждена директором ВНИЯИ 28. 02.92г.;

- "Временная инструкция по изготовлению бивалентной эмульсионной вакцины против ящура типов А и 0 (из вируса, выргленногс б клетках BHK-2I)". Утверждена дирс; тором ШИПИ 17.12.91г.

Публикация. По материалам диссертации опубликован« 4 работы.

Апробаццт работы. Материалы диссертационной работ; изложены на:

Всесоюзной конференции молодых ученых, г.Владимир 1990г.;

Международной ■конференции "К новой стратегии борьбы с ящуром", г.Владимир, 1991г.;

Ученом совете БНИЯИ, Х990-1932г.г.

Объем работ». Материалы диссертации изложены на 223 страницах машинописного текста. Работа содержит 26 таблиц, 2 диаграммы, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических.рекомендаций, списка использованной литературы, включавшего 223 наименования, из которых 124 отечественных и 99 иностранных.

Положения, выносимые на защиту.

1. Ыетод получения стерильных вирусс'одержгздх суспензий для изготовления инактивированных противоящурны: вакиин.

2. Получение стерильных малообъемных форм концентратов из лапигазировакного и куяьтурального вируса ящура. • . "

- б -

• СОБСТВЕННЫЕ КССКЕДОВЛНИЯ' Материалы и методы исследований

В работе использовали: лапинизированный Еирус ящура ипов 0jl?I94, ^22^550 и нультуральный вирус ягаура типов г!?194, А£2"550, вырешенный в суспензии клеток BHK-2I. ля контроля иммуногенкой активности вакцин на взрослых елых ншах, морских свинках и сельскохозяйственных откых применяли адаптированные к ним штата вируса Oj 194, А22!5550.

При проведении исследований по получению стерильных успензип лапинизярованного и культурального вируса япу-а, а также изготовлении различных форы противоящурноП нактивированной вакцины использовали: 0,1 ¡Í ацетатный уферный раствор, раствор Хенкса, хлороформ, высокомоле-улярный полигуашдин С HI Г), м.м. 30000-100000 Л, поли-тиленполиамин (ПША) ы.м. 200, аминоэтилэтиленимин АЭЗИ), формалин технический, гель гидрата окиси адши-ия (ГОА), аэросил марки A-S00, сапонин фирмы "Мерк", олизтиленгликоль отечественного производства (ПЭГ-115 !.м. 4000-6000), ыасляный адгдаан? ВНИШ.

Очистку вируссодерккшх суспензий проводили хлеро-юрлом (5%), ПША (0,05-0,13) з сочетании с хлороформом.

При разработке ренина, получения стернльноП суспен-■ии лапинизированного -вируса з вируссодер'Д'ашке -суспензии убавляли высокомолекулярный полигуанидин п разной коечной, концентрации - 0,01; 0,02; 0,03; 0,04; 0,05; 0,06; 1,07; 0,08; 0,09; 0,1; 0,125 и 0,153, очиняли хлоро.^ор-¡OM (Ь%) и выдергивали при температуре S-J0°C 24 часа. !a?e;.¡ контролировали суспензии на наличие гонтанннантоз.

Для получения стерильной суспензии уулмурзлькопо «руса ящура добавляли ШГ в конечной конценграгип ~ (,005; 0.0075; 0,01 и 0,02% и ввдерживапи при те'иерату-чз*8-10°С 24 часа.

Исследование зируссодер>-а-->их суспензий на стериль-

кость проводили согласно "Методу бактериологического контроля стерильности" (ГОСТ 28085-89).

Количество 146 Э компонента вируса ящура определял: по методике С.А.Рыбаковой и С.С.Рыбакова (1978).

Титр инфекционности лапинизированного вируса ящура в суспензиях определяли на 4-С-дневных мышатах-сосунах и выражали в г/мл. Для титрования культурального

вируса использовали монослойные культуры клеток СП, вы-ралснные в пенишллиновых флаконах. Лапинизированный и кульауралжий вирус ящура в очищенных суспензиях инакти-2провали 0,03^ ашноэтилэтиленимином при температуре 27-26°С и рН 7,4-7,8 в течение 24 часов или формальдегиде:.: (0,03-0,053) при температуре 25-26°С, рН 7,8-8,2 в течение 48 часов. Инактивацию вируса в 50-180-кратных контент патах про водили 0,05-0,075% АЭЭИ при температуре 27-2б°С и рН 7,4-7,8 в течение 48 часов. Авирулентность инактивированных препаратов определяли на 4-6-дневньк мшатах-сосунах.

Концентрирование вируса ящура сорбцией проводили следующим образом: к вируссодеркащей суспензии добавляли Ж суспензию стерильного аэросила марки А-300 до конечной концентрации 0,25; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0мг/ш (по сухому веществу). Олесь перемешивали и оставляли для от стоя на 24 часа, надосадочную кидкость титровали. Контролен служила исходная суспензия до концентрирования. По разнице титран судили о степени адсорбции вируса.

Концентрирование вируса преципитацией полиэтилен-гликолем проводили двумя методами:

а) Путем добавления ПЭГ в очищенную вирусную суспензию до концентрации 10%. С:.;есь ввдеруивали 16-20 часов, центрифугировали 20-г25'.,инпри 2500 <3 . Полученный оездек рссуспенднровали в буферных растворах до необходимой концентрации.

б) После выдерх-игания суспензии с ПЭГом смесь филь тровали «ерез ткань Петрянова марки ФШ-15-1,5. Фильтры

ФПП, содержащие концентрат вируса, растзоряли с хлороформе и элшровали раствором Хенкса до необходимой концентрации. После чего центрифугировали пр;: 3000^в течение 30-40 г.

Сорбированные вакцины готовили путеи смешивания очищенной суспензии инактивированного вируса с адсорбентом в соотношении 2:1. После отстаивания сличали надоса-дочную жидкость в количесгве, равном объему добавленного адсорбента. Сапонин сносили до конечной концентрации 0,05%.

Иммуногенную активность вакцин оценивали по их 50%-ной защитной дозе в опытах на взрослых белых кьиа:-: (ИмДзд М) и морских свинках (Hm^q "'С), а так::"э на свиньях (ИцЦзд С).

Результаты опытов обрабатывали в соответствии с руководством по биометрии (Аджарии И.П. и др., IS75; Садовский К.В., Г975).

Результаты собственных исследваиий

.Уикробная деконтаминация суспензии лшшглзирогаклс-го вируса ящура с применением полигуанидина

Для получения стерильной суспензии лапиы'.олрованкс-го вируса испольоовачи образцы высокомолекулярного поли-гуанидина, синтезированного в ИКСХ Ali СССР.

S ходе исследований установили, что эффективность антимикробного действия полигуанидина в отношении конта-«■инзнтов лапинизированного вируса зависела от его концентрации в суспензии, количества 'мк?спессв, температуры и последующей обработки суспензии хлороформе»:. Так, при увеличении концентрации ЕПР с 0,01 до 0,07? в суспензии, 'приготовленной из разделанных крольчат, количество стерильных суспензий увеличивалось с £0,0 до ICGv. Аналогичная зависимость отменена и при обработке полкгуаки нем вируссодеркащеИ суспензии из целых крольчат. .¿:«;:-мальная концентрация Д1Г, эффективная в оанеиекия г.слу-

чения 1С0£ стерильных суспензий, зависала также от уровня обсемененности их бактериями и' грибами и составляла .для суспензии, содеркааей 2,5x10^-4, ОхЮЬ и 6,3x10^-5,Зх хЮ'кол./ыл, 0,06 и 0,123^, соответственно.

Сочетайте применение ШГ и хлороформа для деконта-1.'.*нации и получения стерильной суспензии лапиниэировен-ного вируса позволило в 1,5-1,6 раза снизить концентрации подкгуанидина.

Так, обработка суспензии из разделанных крольчат 0,С4Г? Х:Г позволила получить 71,4* стерильных суспензий, в то ьпемл как применение той «:е концентрации полигуани-чина в сочетании с хлороформом в 100$ случаев обеспечи-2аю получение стерильных суспензий. Для суспензи из целы/. крольчат обработка хлороформом приводила к снижению антимикробной концентрации ШГ с 0,125 до 0,075%.

Гюьыпенне температуры суспензии, обработанной ШГ и хлорофэрлсы, с 10-12°С до 27-28°С приводило к повыиению бактерицидной эффективности полигуанидина на 7,1-16,7$.

Влияние обработки суспензии полигуашдином на иммунобиологические саойства лапинизи-рованного вируса ящура

При микробной деконтаминации лаяинизированного вируса лцура вакно не только добиться получения стерильной суспензии, ко и избегать потерь основного•иммунизирующего компонента вируса.

Для ото г о в суспензиях, обработанных ШГ и хлороформом, определяли титр инфекшонкости и количество 146Б частиц, а такке приводили оценку иымуногенной активное- .■' ти вируса в составе адсорбатвакцикы.

Про&еденше исследования показали, что обработка суспензии ШГ и хлороформом не приводила к снижению титра ин-фекционности, то есть не умен^лала количества инфекционных вирусных частиц.

Так, инфсхционность лапинизированного вируса ящура

-20-

0|?Я94 до-обработки ШГ и хлороформом была равна 7,63+ "0,03 ^ ЛДс^Ли, а после обработки полигуанидином в . концентрации 0,03-0,083 составила от 7,63?0,07 до 7,76+ +0,08 JI^q/мл.

Концентрация 146 S компонента в суспензии вируса Я1аура типа 0j, обработанной хлороформом и ШГ в концентрации 0,05; 0,015 и 0,1%, находилась в пределах 0,34+ +0,01мкг/ыл - 0,36+0,ОЗмкг/мл и не отличалась от концентрации частиц в контрольной суспензии - 0,37+0,04укг/мл (суспензия, обработанная ПША и хлороформом).

Обработка суспензии лапинизированного вигзуеа ящура типа Agg п о ли гу анид и но м в сочетании с хлороформом так^е не приводила к суиесчъентг.у снижению количества 146 S компонента вируса. Концентрация 146 S частиц вируса кгу-ра Agg в суспензии, обработанной ШГ и хлороформом, была равна 0,80+0,+-0,82+0,11мкг/ьш, а в суспензии, счищенной ПША и хлороформом - 0,84+0,Шмкг/мл.

Отсутствие потерь иммунизирующего компонента при получении стерильной суспензии лапинизированного вируса с помшью полигуакидина и хлороформа было доказано при определении имадуногенности адссрбатвакцин типов А и 0 в опытах на взрослых белых икиах. Контролем служила Еак-цина из лглинизированного вируса ящура, очинённого ПЗНА в сочетании с хлороформом»

1ЗД5О Н моновалвнтных адсорбатвакцин, изгЬтовлен-ных из стерильных суспензий дапинизированного вируса яцура типа 0, составляла 0,20+0,02мл, а в контроле была равна 0,18+0,02мл.

Кгялуногенная 'активность вакцины из обработанных ШГ'и хлороформом суспензий вируса ящура типов А и 0, в которых сырье« служили целые крольчата, составила 0,045+ +0,007 и 0,23+0,03мл (ИмД^ М), соответственно. И

ва.кшны в контроле для типа А была равна - 0,04370, ООЗ.мл, а для типа 0 - 0,22+0,035мл.

- II -

Хт-iu'.eii'.tc ацсирСатаакш'Н, приготовленных из стерильных суспензий лалинизированного вируса ящура типов А и О, в течение 12-24 месяцев при температура 4-8°С существенно не снизил.- специфическую активность препаратов. ИмДзд Л г.а:-:ц.ины из латинизированного вируса ящура Agg, обработанного Sir и хлороформом, сразу после изготовления сос-0,03в10,С04:лл, а после хранения в течение 32 це-c:«z9.b f'.-jr.<\ Г'сьпа - 0,044+0,004:.«!.

;-!>.Ул0 с-,е:.чтгриготовленной адсорбатвакшсы из сто-р:::-.»г.го лз.ш'низированного вируса япура типа 0 рсснялась С,£,С70,03гл, а через 24 месяца хранения при температуре 4-?' С составила 0,23;0,04кл.

Тгхип обрас-ом, проведена® исследования показали, т.'. пглн-енснле в концентрации 0,03-0,15^ для подучен.'." стр.рилып;;/. суспензий лппинизирогаииого вируса ячура А и 0 не зызивбло потерь иимунизируклего кокпонен-и не оказнгало влияния на анткген « процессе хранения ракцинч ьр/. температуре 4-8°С в течение 12-24 месяцев.

Применение высокомолекулярного полигуанидина для микробной декснтамингции суспензии кулътураиьногс вируса я?;ура

Для определения эффективности высокомолекулярного

полпгуанидлна з отношении микробных контаминантов куль-туральпсго вирусе ящура в суспензии добавляли- 5-<Ю£ пастаорн Н1Г дс конечной концентрации 0,005-0,03%.

пр;г этом устаниклене, что обработка суспензии куль-турального вируса яи^ра полкгуанидшюм в концентрации 0,00о£ обеспечивала получение стерильной суспензия в случаев, а при использовании ШГ ъ концентрации от 0,0075 дз О,Ж достигала ГС0 эффективности. Хлорофорх в ка;пекурац.'!! 21 бия о&яктоьш лишь в 30/" случаен,

й да-.ьнеГг.-пх стопах суспень- л ьтурального вируса

1Г.Г' Б "пкцетран/и 0,0075-0.02^. а оуспснппах К/ ^ ь туральнло гшруса ид-ура, со^ерча-

е

ших ШГ, определяли титр инфекционнссти и количество Мб 9 компонента. Контроле?-! служила суспензия вируса очищенная хлороформом.

Титр инфекционкости вируса щура е суспензиях, очи-шенных хлороформом, по типу А был ровен 7,54*0,17 ИЦ^п/мл и по типу 0 - 7,30+0,19 Ц иу^^Алл, а в суспензиях, обработанных ШГ в концентрации 0,005-0,02?, находился я следуоиих пределах для типа А 7,5670.22-7,68+ +0,23 Ц И1а50 мл и для типа 0 - 7,20+0,1-7,5470,26 Ц

'11Ц.О —

Определение гогачестяа 74С$ компонента вируса я:-у-ра типе в А (I 0 спектрофотсиетрическип методом показало отсутствие потерь 146 5 частиц в суспензиях после их обработки полигуанидином.

Так, п суп пенэяи гируса ящура А-р 2» ОЧ11иенной 2% хлороформа, концентрация 1463 компонента составила 1,49+0,58п<г/мл, а п суспензиях, обработанных ШГ в концентрации 0,0075-0,025", находилась в пределах 1,4370,56-~1,6070,6&«.кг/шг.

Обработка суспензии культурального вируса .щура полигуанидином в концентрации 0,0075-0,03м тага/е не приводила к существенному снижению количества 146 3 компонента вируса. Концентрация 146 5 частиц вщгуса. ;-зура типа 0 в суспензиях, обработанных ШГ, составила 1,06+ +0,29-1,2670,ОбмкгЛ/л, а в суспензии, очищенной хлороформом, била равна 1,15+0,17мкг/ш.

вакцин из кулмурального вируса яг^ура типа А, обработанного полигуанидином, была в пределах 0,03^--0,046мл и не имела существеннчхразличий с Еакцинаги иг> вируса, очищенного хюроформом. Ич'^ф Л вакцины из вируса .ятиура типа 0, обработанного ШГ э кониентр"".ип 0.0075» -0,05Й, состявила 0,19+0,03-0,22+0,ОЗул, а ,из «•»-руса,,очинённого 2% хлороформа, была рпь;-з т9~0.а;?;л.

Хранение адсорбатвакцин яз вируса г-иуча :, ..• риботонного ШГ, б течение 12 меся::с-" при »ч^герел* *•..•»

- 13 -

4-8°С суиественно не снизило специфическую активность препарата. Иь'Д-д М с векепри по то вл енко й вакцины была равна 0,026+0,01мл, а после хранения 0,034+0,02мл. Хранение б течение 12 'мзсяцсв при температуре 4-8°С адсорбатвак- . цины из вируса ящура типа 0, обработанного полигуанидином в'концентрации 0,01-0,02$», приводило к снижению кщуно-гекносг/ препарата с С,21+0,04мл до 0,29+0,01мл, но уровень вероятности разности был низким (Р=94л).

Результаты проверки качества вируссодержащей суспензии и иммуногенной активности вакцин кз вируса ящура типов А и 0, обработанных полигуанидином, позволяют заключить об отсутствии потерь иммунизирующего компонента в процессе обработки суспензии культурального вируса ящура.

Концентрирование'вируса ящура, обработанного полигуанидином, и изготовление вакцин

Анализ литературных данных показывает, что для получения высокоактивных противояшурных вага'пн, как правило, применяют концентрирование вируса ящура различными методами: адсорбцией на минеральных сорбентах, осаждением полизтаггенглшеолем и ультрофильтрацией.

Шили были проведены исследования по изучении влияния обработки вирусных суспензий полигуанидином на качество препаратов, изготовленных из вируса ящура, кон- • центрированного адсорбцией азросилом и преципитацией ПУГом.

Дле этого использовали суспензию лапинизированного и культурального вируса-ящура типов. А и. 0, обработанные . . полигуанидином и хлороформом.'Контролем сдукила суспензия вируса, очкаенная ПЗЛА в сочетали с хлороформом.

Концентрирование вируса методом сорбции на аэросил

В предварительных опытах установлено, что о'бработка вирусной суспензии Ы1Г и хлороформом йе влияет на сорбцию • вируса ящура аэросилоы-300. Так, для сорбции 94% вируса

- 14 -

в суспензии, обработанной ШГ, требуется 2мг/мл аэросила, такое-же количество сорбента требуется и для адсорбции . 90% Еируса в суспензии, очииенной ПША и хлороформом.

Кроме того отмечено, что адсорбция вируса яшура аэросилом находится в прямой зависимости ит количества сорбента.- При концентрировании вируса ящура 0]; в суспензиях, обработанных ВПГ и хлороформом, аоросилом-300 й концентрации 0,25; 0,5; I; 2; Змг/мл процент адсорбированного вируса составил 19; 32; 65; 94; 983, соответственно.

Методом сорбции концентрировали вирус ящура без су-пествснных потерь в 5-15 раз. При этом имцукогенная активность противояшурной вакцины, приготовленной из стерильной суспензии ладинизированного вируса ящура типа составляла 0,20+0,02мл, а контрольной - 0,16+0,02мл №%) М)'

Концентрирование вируса методом преципитации пели этиленгликолеи

3 ходе исследований установлено, что концентраты лаликизированного и культурального вируса ящура, приготовленные из суспензии, обработанной полигуанидином, были стерильнши, а концентраты из суспензии, очищенной хлороформом были, как правило, контаминироваш бактериями и грибками.

Концентрирование стерильного лапинизированногс вируса ящура типа От добавлением Х03~ов полизтиленгликоля было эффективным, и потери вируса при этом составили -1,8/ь, а при( концентрировании вируса в суспензии, считанной .ПЗПА'"и хлороформом^ потери были равны - 1,6%,

Аналогичные результаты были- подучены при концентрировании культурального вируса яшура типа А.^ обработанного полигуаш-дином в концентрации 0,013. Яс -эри аируса яиура при концентрировании ПЭГом в 100 ¿аз :•>%} объему я суспензии, очищенной хлороформом и обработанной ШГ, составили 0,43 и 0,63, соответственно.

- 15 -

Приготовленные 100-кратные концентраты вируса ящура типа А ннактивировали АЭЭй и готовили из ни;; ацсорбатвак-цины с двухкратней концентрацией антигена в вакцине.

ИмД,.^ и вакцин из антигенов, обработанных полигуани-. дкяок, была равна 0,038+0,02мл, а из. вируса, очищенного 2% хлороформа, составила 0,03+0,01мл.

В следущей•серии опытов провели испытания препаратов из вируса ящура, концентрированного методом преципитации-фильтрации .

Для атого в вируссодеркащую суспензию лапинизированного культуралького вируса ящура добавляли Х0/о ПЭГ, после чего фильтровали через ткань Петрянова (чШ-Х5-1,5). Ткань Петрянова после фильтрации растворяли в хлороформе, а вирус злюировали буферными растворами.

Установлено, что концентрат из суспензии лапинизированного вируса ящура, обработанной ИГ и хлороформом, не содержал микробных контаминантов, ь то время как концентрат из контрольной суспензии был нестерилен.

Потери стерильного лапинизированного вируса ящура типа 0 при концентрировании полиэтиленгликолем в 50 раз по объему составили 5,5%, а вируса, очищенного ПША и хлоро формом,- 4,3%.

Полученные 50-тк-кратные концентраты вируса икакти-вирсвали АЭЭИ и готовили из них сорбированные вакцины, разоавляя концентрат до трехкратного по объему 2% раствором азросила-300.

Иммукогенность вакцины из стерильных антигенов была равна 0,£0+0,04мл Р'мДзо И и существенно -не отличалась от активности хакцинк из контрольных концентратов (0,22+ +0.03мл4',

Аналогичные результаты получены при концентрировании лолиотнленглкколем культурального вируса ящура, обработанного полигуанидином.

На заключительном этапе исследований из лапинизированного вируса ящура типа А, обработанного РЛГ и хлоро- .

- 16 -

формам, была изготовлена эмульсионная вакцина.

Для этого приготовили'180-кратный по объему концентрат вируса ящура, который получали путем осаздения вируса, преципитированного ПЭГ, на ткани Пегрлнова.

Вакцину готовили, смешивая равные части концентрированного антигена с масляным адъювантом ВНИЯИ, и контролировали на подсвинках массой 35-40нг.

Вакцину вводили внутримышечно в дозе 1мл за 10 дней до контрольного заражения.

ИмДзд для свиней вакцины из стерильного концентрата вируса ягаура Ло¡> составила < 0,003мл, то есть в 1мл вакцины содержится более 333 пягидесягипроцентнш иммунизирующих доз.

Таким образом, применение полипу&нидина для получения стерильных суспензий лапинизированного и культураль-ногс вируса ящура типов А и 0 не влияет на дальнейшее концентрирование вируса аэросилом-300 и полиотиленгли-колем и позволяет получать высокоактивные концентрированные антигены для производства вакцин.

Изготовление и контроль опытно-промышленных серий

вакцин

Отработав в лабораторных условиях реким получения стерильной суспензии лапинизированного вируса ящура, на Сумской биофабрики изготовили одну серию бивалентной мкцины против ящура типов А и 0 и одну'серию моновалентной вакцины против вируса ящура типа А на заводе "Юрьевецветбиопрепарат". Объем суспензии каждой, серии был равен 1500-3800л. ' . .

На Сумской биофабрике в качестве вирусного сырья использовали целых крольчат, содержащих вирус ящура типов А и О,

Для получения стерильной вируссодержащей суспензии использовали, полигуанидин з концентрации 0,09% и хлороформ 5% (объемных).

- 17 -

Вирусные суспензу-v: опытно-промышленной серии после обработки ШГ б сочетании с хлороформом были стерильными, тогда кпк суспензии плановых серий, выпущенные на биофабрике бйли контаминированы микрофлорой.

Титр инфекционноети вируса ящура в суспензиях опытной серии, составил по типу А - 7,5 ^ J^qA'-i и по тнцу О - 8,4 ¿д Щ^дА.'Л, а в суспензиях плановых серий находился в пределах 7,5-7,6 fy ЛД^^/мл для вируса типа А к 7,5-8,3 Ц ЛД^Аш (тип 0).

Вирус якура А и 0 типов после обработки ШГ и хлороформом инактивировали формальдегидом, затем концентрировали в 4 раза адсорбцией на ГОА и объединили в бивалентную вакцину.

Иммуногенную активность вакцины контролировали на морских свинках и получили, что ИмД^ .'¿С против вируса ящура типа А и вируса типа 0 была равна 0,21мл. Следовательно, 20 №.$50 Ж против типа А содержится в 4,2мл вакцины, а 23 ИмД^д Ж против типа 0 содержится в 4-, 8мл, что позволило выпустить вакцину для практического применения в прививном объеме для КРС равном 5мл.

На заводе "Юрьовецветбиопрепарат" изготовили вакцины против вируса ящура типа А, б которой использовали обработанную полипуаквдином (0,075$) и хлороформом виру асодержйцую суспензию из целых крольчат.

Суспензия после обработки ШГ в сочетании с хлоро-.формой.не содержала микробных конташнантов. Титр икфэк-.циснности вируса ящура типа А до и после внесения пели-гуанидина составил 6,047-0,4 и 8,00+0,5 JJJJ^q/мл, coot--ветстьекно.

Полученную стерильную суспензию концентрировали ПЭГ, осаэдая преципитат'при 15000 на протечной цент- ■ рифуге 02P-ICI-KI. Осадок вирусного преципитата-ресусг пендиро ьалк в забуференном физрастворе до ХШгк'ратной концентрации по объему к инактивировали*АЭЭИ.

Концентрат после инактивации содержал П0,6ыкгДу1 .

- 18 -

146 S компонента вируса ящура и был свободен от посторонней микрофлоры.

Вакцину готовили, смешивая равные части концентрированного антигена с Масляным адъювантом ЗНШИ, и контролировали на подсвинках массой 30-40кг.

Результаты контроля иммуногенности показали высокую активность вакцины. ИмД^ для свиней составила - 0,01мл, то есть в прививном объеме 1мл содержится 100 пятидесяти-процентних иммунизирующих доз.

Таким образом, результаты изготовления опытно-промышленных серий противояаурной вакцины на Суыской биофабрике и заводе "Юрьевецветбиопрепарат" показывают, что разработанный в лабораторных условиях метод получения стерильной суспензии лапинизированного вируса ;з:ура с применением высокомолекулярного полигуанидина и хлороформа .воспроизводим в производственных условиях.

¿ПЛОДЫ

Í. Разработан метод получения стерильной суспензии лапинизированного вируса ящура с помощью отечественного препарата - высокомолекулярного полинуанидина, который в концентрации 0,03-0,12сй в сочетании с хлороформом обеспечивает стерильность вируссодержав;еЯ суспензии.

2. Микробная стерильность культурального гир.уса ящура также получена путем" добавления н. суспензию 0,0070-^0,02/5 полинуанидина.

3. Стерильная суспензия лапинизированного и культурального. вируса- я ¡дура типов Л и 0, полученная обработкой ш1Г, полностью- сохраняет титр инфекционности и концентрацию 146 S компонента. Шмуногенность инактивиро^анннх вакцин,. приготовленных на их оено?е, как правило, еоот-петстгорала. активности контрольных препаратор из вирус?, очищенного Ü3ÍÍA и хлороформом.

4,. J опытах на лабораторных жятютных установлено, что ацеорбатпакцина из стерильного лашназирогтшого и культурального вируса ящура га по в А и 0, хранит; ляся при

- i9 -

температуре 4-8 °C, не снижала, иммуно'генную активность в течение i-2-х лет. ■ ■

о. Метод получения стерильной суспензии лапинизиро-ранного и культурального вируса ящура типа А и 0 с помощью ¿íiT обеспечивает возможность изготовления стерильных и)-1Ь0-кратных концентратов вируса путем адсорбции на аэрэсил или осади,ением полиэтиленгликолем.

0. Предложенный метод получения стерильной суспензии лаплнизированного и культурального вируса ящура не трабует перестройки существующих технологических линий и обеспечивает возможность противоящурных инактивированных вакцин первого и второго поколения.

практический пидашш

1. "Методика получения стерильной суспензии лапини-зирогзинного сируса ящура для изготовления противоящурных ракцин", утверждена директором ВНИЙИ 10.12.91 г.

2. Метод получения стерильной суспензии вируса ящура с применением ¿ЗПГ.и хлороформа включен в следующую нормативно-техническую документацию:

а) "¡Зременная инструкция по изготовлению бивалент- • ной вакцины против ящура типов а и 0 (из вируса выращенного е клетках ШК-21)",' утвервден!а директором ^НИЯИ 17.12.91 г.; _ *

б) "Инструкция по изготовлению и контролю универсальной' шно- и поливалентной вакцины против- ящура типов >i,ü,С и язия-т1",' утверждена директором ¿НйЯИ 28.02.92 г.

CiIilCOrl ОЛУШКОлйШХ PiiBOT '

i. Борисов и.о., Лезова Т.Н'. Действие некоторых анткбак- • терпальннх препаратов на микрофлору суспензий лапинп-зированного вируса ящура // -Акт. вопр. вет.пирусол.Тез. докл.научно-техн.конф.молодых ученых,Владимир,1990, с. ¿i-ó2.

2. Леэова Т.Н., Улупов H.A., Борисов Стерилизующая очистка суспензии культурального вируса ящура // Акт. вопр.вет.вирусол.Тез.докл.научно-техн.конф. молодых ученых,-Владимир, 1990, с. 54-53.

3. Улупов H.a., Лезова Т.Н., Борисов ¿3.^., Дудников А.И., Михалишин 3.J. Технология получения стерильных концентратов вируса ящура для изготовления вакцин // К но«ой стратегии борьбы с ящуром. Тез. мечсдунар.конф., Владимир, 1991, с. 42-43.

4. Лезова Т.Н., Улупов H.A., Борисов J.J., Михалишин i.j., Дудников A.il. Иммуногенная активность концентратор антигена и протигоящурных вакцин при хранении //

К новой стратегии борьбы с ящуром. Тез. междунар. конф., Владимир, 1991, с. 68.