Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка технологии изготовления нактивированной концентрированной вакцины против болезни Ауески

УКРАИНСКАЯ АКАДЕМИЯ АГРАРНЫХ НАУК

УКРАИНСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ

На правах рукописи

Для служебного пользования Экз. № ЮО

КОРНИЕНКО

Леонид Евгеньевич

УДК 619:574.6;615.371 .-587.825.1 ,"570.535,'63$

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ НАКТИВИРОВАННОЙ КОНЦЕНТРИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ АУЕСКИ

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Харьков —'19!)2

Работа выполнена в Украинском ордена Трудового Красного Знаменг научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии и вс Всесоюзном научно-нсследовательском ящурном институте.

Научные руководители — доктор биологических наук, профессор А. Ф. Бондаренко, кандидат ветеринарных наук В. С. Белоконь. Официальные оппоненты:

член корреспондент УААН, доктор биологических наук, профессор ОНУФРИЕВ Владислав Петрович (УСХА); кандидат ветеринарных паук, старший научный сотрудник СГЕЦЕНКО Владимир Иванович (УНИИЭВ).

Ведущее учреждение — Белоцерковский сельскохозяйственный институт им. П. Л. Погребняка.

Защита диссертации состоится «//» ^ 1992 год

в /С? часов на заседании специализированного совет, Д 020.68.81. Украинского научно-исследовательского институт экспериментальной ветеринарии по адресу: 310023, Харьков^ ул. Пушкинская, 83, УНИИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке УНИИЭЕ

Автореферат разослан «// » Ы^О^Ц 1992 г.

Ученый секретарь

специализированного совета Сумцов В. 1

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

\ктуальность проблемы. Вакцинопрофилактика вирусных бег сельскохозяйственных животных, в том числе болезни ски, является обязательным составным звеном противоэпи-гических мероприятий. Хотя вакцинация не приводит к иско-ению вируса болезни Ауески, ее вынуждены проводить в тех тонах, где болезнь широко распространена (Van Oirrchot G. Т., kenr A. L. G., 1984), поскольку это сокращает экономические тки в результате гибели заболевших животных (De Leeuw P. W., l Oirrchot G. Т., 1985), уменьшает способность вирулентного уса перснстировать в организме вакцинированных животных и следствие и число вирусоиосителей (Van Oirrchot G. Т., 1990). Для борьбы с болезнью у нас в стране успешно применяется пифическая профилактика инактивированными (М. С. Чоба-, 1965; В. Т. Айрапетян, 1978; А. М. Цымбал, 1987; Ю. В. Лап, 1990) и живыми вакцинами (П. М. Базылев, Э. М. Прохоро-1972; Г. X. Камалов, 1973, 1975). Недостатком живых вакцин яется то, что они малоэффективны или неэффективны при об-отке поросят с колостральным иммунитетом. Вирус живых цин, репродуцируясь в организме, выделяется в окружающую ду и может, после пассирования на животных, приобретать улентность и вызывать поствакцинальные реакции по типу сме-лшдрома. Вакцинный вирус, используемый для вакцинации ней может быть вирулентным для овец и крупного рогатого та. Пассирование вакцинного вируса на плотоядных животных ле поедания ими боенских отходов приводит к реверсии виру-тных свойств вируса. Вирус аттенуированных вакцин не все-является апатогенным для поросят. Живые вакцины не реко-[дуются к применению в последний период супоросностн, так : они вызывают аборты у свиноматок. Применяемая в отечест-ной практике вирусвакцина ВГНКИ обладает свойствами ат-уированных вакцин. Кроме того, по казана слабая ее эффектив-ть для профилактики болезни Ауески у свиней (Л. П. Гришок этр., 1990; А. А. Коломыцев с сотр., 1991). Исходя из того факта, что инактнвированные вакцины безопас-их предпочитают живым, Вместе с тем, эффективность инак-ированных вакцин зависит от качества цируссодержащего ма-иала, степени очистки и концентрирования антигена, использо-ия различных адъювантов (А. И. Дудников с сотр., 1974—1990; И. Собко с сотр., 1967—1975; А. А. Гусев: с сотр., 1977—1980; К. Муравьев с сотр., 1975—1978). Существенное значение име-технологичность и доступность производства вакцин в биофаб-[ных условиях. Однако используемые в настоящее время спосо-изготовления инактивпрованных вакцин на монослойных куль-ах первичных (В. Г. Айрапетян с сотр., 1978)- или перевивае-х клеток (А. М. Цымбал с сотр., 1987) весьма трудоемки и ма-технологичны. ВИЭВ предложена вакцина ПЛАХ (В. А. Сер-

геев с сотр., 1990) технология изготовления' которой предусматр вает культивирование одного из компонентов вакцины — виру« болезни Ауески в суспензионной культуре перевиваемой лиш клеток ППК/666. Следует отметить, что крупномасштабное пр нзводство этой вакцины не отработано, объемы получаемого сыр] не превышали 5—10 литров.

Для инактивации вируса болезни Ауески во всех перечисле ных выше вакцинах используют формальдегид, который1 не обе печивает получение полностью авирулентных препаратов. Налич: остаточной- инфекционностн и продолжительные сроки инактиващ вируса (3—15 суток) ограничивают его применение.

В связи с вышеизложенным разработка .технологичесю приемов получения вирусосодержащего-материала в биореактора методов очистки и концентрирования, инактивации вируса с уч том оптимизации вакцины по антигену и адъюванту представля1< большой научно-практический интерес.

' Исходя из этого; была поставлена цель; разработать подхо,£ к. созданию промышленной технологии изготовления инактивир ванной. вакцины против болезни Ауески, обладающей выражешк иммуногенностью, на основе суспензионного культивирования ю: ток и вируса.

Для реализации этой цели были поставлены следующ. задачи:

— подобрать оптимальную по чувствительности клеточную ст тему для крупномасштабного культивирования вируса. £ лезни Ауески;

:—отработать надежные- методы инактивации вируса, болезн Ауески;'

— изыскать наиболее технологичные режимы и методы кс центрирования вирусного сырья;

— изготовить лабораторные образцы вакцины с оптимизир ванным: составом по антигену и эффективных адъювантоЕ

— изучить иммуногенные свойства экспериментальных обр.;

... цов . вакцины.

Научная новизна. Отработан полупромышленный метод с] пензионного культивирования вируса, болезни Ауески штаг «УНИИЭВ-18в» в. линиях перевиваемых клеток ВНК-21/2-: ППК-66б/17,-|КЗ-88. Для: инактивации: вируса, болезни. Ауески ] пользован димер; этилевпмлка (АЭЭИ): и. бромэтнлимин гид[ бромид (БЭИ), что позволило сократить время инактивации I руса болезшьАуески в пределах до 24 часов и получать полност.1 авирулентные и иммуногенные препараты,

-Определены: оптимальные условия концентрирования виру болезни Ауески в 60 раз по объему при-помощи адсорбентов и I лиэтиленгликоля.

Впервые при изготовлении инактивированных вакцин прот болезни: Ауески в качестве . аДъюванта использован аэросил. П проведении испытаний экспериментальных образцов сорбиров;

ной и сорбированно-эмульсионной образцов вакцины на Животных получены положительные результаты.

За счет использования концентрированного вирусного антигена и применения в составе вакцины масляного адыованта ВНИЯИ прививная доза, обеспечивающая формирование стойкой защиты привитых животных от заражения вирулентным штаммом вируса, снижена до 1 см3.

Практическая значимость. Разработана и предложена технология полупромышленного изготовления инактивированной концентрированной вакцины против болезни Ауески из культурального вируса, репродуцированных в суспензионных линиях перевиваемых клеток ВНК-21/2-17, ППК.-666/17 и К8-88. Получены и испытаны образцы инактивированной концентрированной сорбированно-эмульсионной и сорбированной вакцины против болезни Ауески. На основе полученных результатов экспериментальных исследований по разработке изготовления вакцины и изучения ее иммуно-генных свойств разработаны: «Технические условия на инактиви-рованную эмульсионную вакцину ВНИЯИ-УНИИЭВ против болезни Ауески из культурального вируса», «Инструкция по изготовлению и контролю инактивированной эмульсионной вакцины ВНИЯИ-УНИИЭВ против болезни Ауески из культурального вируса», «Временное наставление по применению инактивированной эмульсионной вакцины ВНИЯИ-УНИИЭВ из культурального вируса», одобренных Учеными советами УНИИЭВ (протокол № 17 эт 19 августа 1991 г.) и ВНИЯИ (протокол № 14 от 10 октября 1991 г.) и утвержденных ГУВ МСХ Украины.

Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены на научных конференциях УНИИЭВ (Харьков, 1990), ХЗВИ (Харьков, 1991), заседаниях Ученого совета УНИИЭВ (1990— .992).

Публикация. Материалы диссертации изложены в 4 научных »аботах, опубликованных в 1990—1991 годах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 136стра-шцах машинописного текста, состоит из введения, обзора лите-1атуры, собственных исследований, обсуждения результатов, вы-юдов и практических предложений, иллюстрирована 22 таблица-ш и 1 графиком. Список использованной литературы включает 80 наименований, из них 117 отечественных и 163 зарубежных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1 2.1. Материалы и методы

Вирус. В опытах использовали вирулентный вирус болезни Ауес-и штамм «УНИИЭВ-18в», адаптированный в перевиваемой линии леток СПЭВ. Штамм вируса выделен УНИИЭВ в 1962 году от ольного поросенка, используется в производстве инактивирован-ой культуральной вакцины УНИИЭВ против болезни Ауески.

3

Титр инфекционное™ вируса на культуре клеток 71gTUm,50/Mj на кроликах 6,5 lg ТЦД50/мл (паспортные данные).

Животные. В процессе изготовления ,и испытания экслериме! тальных серий инактивированной вакцины против болезни Ауеск использовали лабораторных и естественно восприимчивых живо' ных: мышат-сосунов в возрасте 3—5 суток — 350 гол., морски свинок массой 300—400 г. — 120 гол., кроликов массой 1,8—2, кг — 186 гол., подсвинков массой 40—50 кг — ¡40 гол.

Культура клеток. Основные вирусологические исследования вь полнены на производственной сублинии клеток ВНК-21/2-17; пер< виваемой линии клеток почки сибирского горного козерог .(ПСГК-30); клонированной суспензионно-монослойной культур клеток почки эмбриона свиньи (ППК.-666/17); клонированной су< пензионно-монослойной культуре почки поросенка (RS-88) — с< лекционированных и депонированных во ВНИЯИ. В опытах такж использовали перевиваемую культуру клеток почки поросенк (IB-RS-2) и первнчнотрипсинизированные клетки свиной по1 кн (СП).

Питательные среды. Культуры клеток выращивали на питател1 дых средах, приготовленных на основе сухого ферментативног гидролизата мышц (ФГМ-с), выпускаемого Покровским заводо биопрепаратов (ТУ-46-12-20-80); гидролизата белков крови сухог (ГБК-с) (ТУ 10-09-453-87); гидролизата лактальбумина (ГЛА фирм Дифко, Ферак, Флюка с добавлением сыворотки крови Kpyi ного рогатого скота производства Киевского мясокомбината.

Аппаратура. Суспензионное культивирование клеток и вирус осуществляли в ферментерах лабораторного и полупромыщленног объемов отечественного производства: культиваторы стекляннь (КС) с рабочим объемом 5; 40 и 50 литров, а также роллерньз установки с числом оборотов от 8 до 20 р Минуту.

Адаптация и наработка вируса. Вирус 6 рассажа на культур клеток СПЭВ с титром инфекционности 7,5 lg ТЦЛ50/мл инокул] ровали кролику. Из мозга кролика, забитого в агональном coi тоянии с признаками болезни Ауески, готовили вирусную cycnei зию и в течение 8—10 последовательных, а иногда и перемежай щихся пассажей, адаптировали его к монослойным культурам кл< ток ВНК-21/2-17, ППК-666/17, ПСГК-30, IB-RS-2, СП. При кул тивировании вируса болезни Ауески в суспензии клетс ВНК-21/2-17, ППК-666/17, RS-88 в 2-литровых роллерных бутыля и культиваторах с перемешивающими устройствами как лабор; торного, так и полупромышленного типов изучали оптимальнь: параметры культивирования инфицированных клеток с учетом p¡ среды (с корректировкой 7,5 % бикарбонатом натрия) и аэраци) Оптимальную дозу заражения определяли из расчета от 0,01 а

3 ТЦД50 на клетку, а оптимальную концентрацию клеток в су пензии подбирали в параметрах от 1 до 5 млн/мл. Инкубироваш прекращали при наличии в культуре 70—95 % пораженных кл> ток. Вируссодержащую суспензию проверяли на стерильность

)Пределяли титр инфекционности На культуре клеток СП по общепринятой методике. Расчет титра инфекционности проводили по летоду Кербера и выражали в ^ТЦД50/мл.

Методы заражения животных. Кроликов и морских свинок за->ажали внутримышечно культуральным вирусом болезни Ауески ^ дозе 100 ЛДбо/мл (для кроликов) и 106ТЦД5о/мл, соответственно, -виньям вирус инокулировали интрацеребрально в дозе 1 • 103— М03ТЦД5о/0,2 мл. Животных заражали на 28 день после введе-1ия им вакцины.

Реакция нейтрализации. Реакцию нейтрализации вируса стави-ш на первичной культуре клеток СП по общепринятой методике : рабочими двукратными разведениями исследуемых сывороток >т 1:2 до 1:1024 и постоянной дозой вируса. При постановке реак-цш нейтрализации включали контроль на отсутствие токсичности :ывороток, контроль качества культур клеток и вируса.

Инактивация вируса. Для инактивации вируса использовали формальдегид, димер этиленимина и бромэтилимин гидробромид. Рабочие растворы этих препаратов вносили в вируссодержащую »светленную центрифугированием культуральную суспензию до конечных концентраций: формальдегида — 0,035—0,5 %, димер а тиленимина — 0,04—0,16 %, бромэтилимина гидробромида — 1,06—0,15%. Инактивацию проводили в двух температурных режимах при 4-26 °С и +37 °С.

Концентрирование вируса болезни Ауески осуществляли с по-ющыо полиэтиленгликоля и неорганических сорбентов. Конечная юнцентрация полиэтиленгликоля (ПЭГ-115) в вируссодержащей успензии составляла 4—10%, двуокиси кремния и гидроокиси люминия — 0,015—0,6 %. Концентрирование проводили при комнатной температуре и при +4 °С, в течение 4, 24 и 48 часов. Пре-.ипитаты после концентрирования ПЭГ-115 осаждали центрифуги-ованием. При сорбции вируса на гидроокиси алюминия и двуоки-и кремния после отстаивания использовали осадок, предвари-ельно декантировав надосадочную жидкость. В исходной вирус-одержащей культуральной жидкости и надосадочной жидкости пределяли титр инфекционной активности вируса. Процент потери ируса рассчитывали по формуле:

Vn=T2/Tl-100

где: Vn — потери вируса в %, Т2 — титр инфекционности над-осадка, Т1 — титр инфекционности в исходной вируссодержащей суспензии. Титры инфекционности выражали в абсолютных значениях.

Изготовление вакцины. Вакцины готовили из инактивирован-ого и концентрированного вируса болезни Ауески. Одну часть нтигена смешивали с равным объемом стерильного масляного дъюванта (на основе новых синтетических ГОСТ 13004-77,

5

ТУ 384017-64 или минеральных ТУ 381011224-89 масел) до пол чения стабильной эмульсии типа «вода в масле». Эмульсии гот вили на гомогенизаторе МРУУ-302. Получали таким образом со бированно-эмульсионный препарат. Другая часть сорбированно антигена с добавлением 20 % стерильного глицерина представл ла собой сорбированную вакцину.

Контроль стерильности, безвредности и авирулентности. Сл рильность контролировали согласно ГОСТ 28085-89 «Препарат биологические. Метод бактериологического контроля стерильн сти».

Авирулентность и безвредность приготовленных препаратов о ределяли на 5 кроликах массой 1,8—2,0 кг. Среднюю пробу ва цины вводили каждому кролику в области боковой поверхнос бедра в объеме 1,0—2,0 см3. Наблюдение за привитыми животн. ми вели в течении 10 суток. Вакцина считалась авирулентной, ее; кролики оставались клинически здоровыми, и безвредной, еа кролики в течение срока наблюдения были клинически здоровым а при патологоанатомическом исследовании на месте введен! вакцины (через 10 дней) не обнаруживали абсцессов и инфил тратов.

Контроль иммуногенности. Иммуногенность экспериментальнь образцов вакцины изучали двумя способами. При проверке имм ногенности качественным способом вакцину вводили внутримыше но в дозе 1,0 см3 морским свинкам, кроликам и подсвинкам. Чер 28 суток после иммунизации привитых и контрольных животнь заражали вирулентным вирусом. Для проверки иммуногеннос вакцины количественным способом ее вводили в цельном и в ра веденном (1:10, 1:100) виде. Разведения вакцины готовили I «Плацебо». Для эмульсионной вакцины использовалась эмульа «вода в масле» приготовленная на гомогенизаторе путем смеш вания равных объемов адъюванта ВНИЯИ и дистиллирование воды. Для «Плацебо» сорбированных вакцин использовали 2 раствор двуокиси кремния. По окончании эксперимента высчит] вали величину ИмДб0 по методу Федида для морских свинок, кр ликов и свиней.

Статистическая обработка результатов исследований. Для о

работки результатов исследований использовали общепринятые биологии статистические методы. Изучая иммуногенную акти ность вакцин на животных, обработку полученных данных пров дили по методу Кербера в модификации И. П. Ашмарина.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Репродукции вируса болезни Ауески в различных культурах клеток и на лабораторных животных

С целью выбора более совершенной культуральной систем были проведены сравнительные исследования по культивировани

яруса болезни Ауески в монослойных и суспензионных линиях леток. Исследуя чувствительность линий суспензионных культур леток ВНК-21/2-17. ППК-666/17 и ,1*5-88 к вирусу болезни Ауес-¡1 штамм «УНИИЭВ-18в», отрабатывали технологические приемы элупромышленного культивирования. При этом обращали вни-апие на концентрацию клеток в заражаемой суспензии, множест-знность заражения (ТЦД50 на клетку), скорость вращения ме-алки, рН среды, продолжительность культивирования, содержание поддерживающей среде сыворотки крови крупного рогатого ско-I. Была изучена также репродуктивная способность вируса тит-эванием его на различных культурах клеток и лабораторных жи-зтных.

Вирус адаптировали к монослою клеток ВНК-21/2-17, ППК-666/ 1, ПСГК-30, 1В-Н5-2 и СП в течение 8—10 последовательных эссажей до стабилизации титров инфекционной активности виру-1. Опыты показали, что вирус болезни Ауески очень быстро адап-фовался ко всем взятым нами культурам клеток. К 8—10 пас-1жу биотитр вируса достигал максимальных значений и дальней-ее его пассирование лишь незначительно повышало его актив-)сть. Так, для культуры клеток ПСГК-30 биотитр составил 26 ±0,03 ТЦДро/мл, ППК-666/17 — 8,00±0,00 ТЦД50/мл, НК-21/2-17 — 8,77±0,06 ^ТЦД50/мл. №-1^-2 — 7,50±0,00^ 'ДД50/мл, для СП — 8,47±0,08ТЦД50/мл. Время проявления ПД сокращалось на 6—12 часов и зависело от плотности клеток монослое и количества вируса предыдущего пассажа, вносимого >и заражении клеток. Различия по времени проявления ЦПД ш испытанных культур оказались незначительными и составили -4 часа. При многократном пассировании вируса на культурах теток была снижена заражающая доза вируса на матрас. Если 1чальная объемная доза заражения составляла исходя пз соот-•шения 1:15 то есть 10 мл вируса на 150 мл поддерживающей еды для всех линий клеток, то к 8—10 пассажу ее удалось снн-:ть для культуры клеток ПСГК-30 до 1:50, ВНК-21/2-17, ППК-'6/17, 1В-К5-2 и СП до 1:30. После адаптации вируса болезни уески в монослойных культурах изучали условия накопления его гомологичных клетках суспензии на быстровращающемся рол-;ре (8—20 об/мин) в 2-литровых бутылях. При этом особое вни-ание было уделено определению оптимальной дозы заражения и шцентрации клеток в 1 мл заражаемой клеточной суспензии, олученные данные свидетельствуют о том, что к 4—7 пассажу ютнтры вируса в этих культурах достигают максимальных знаний на культуре клеток ВНК-21/2-17 — 8,751к ТЦД50/мл, ПК-666/17 — 8,75 ТЦДм/мл, 1^-88 — 8,001ё ТЦД5(/мл. Вре-1 проявления ЦПД для всех культур после адаптации вируса ставило 48—50 часов. Концентрация клеток 1,8—2,2 млн/мл бы-1 наиболее оптимальной, а доза вируса 0,5—2 ТЦД50 на клетку 1еспечивала проявление ЦПД в кратчайшие сроки (48—50 ча-в).

Результаты, полученные при наработке вируса в культивато рах полупромышленного типа (КС-6, КС-40, КС-50), были сход ными с результатами, определенными на "роллерной установке Установлено, что наиболее оптимальная скорость вращения ме шалки — 50—60 об/мин, рН среды 7,0—7,2, аэрация воздухо? 0,2—1,0 л/час из расчета на литр суспензии клеток и вируса. Пр] появлении 20—30 % пораженных вирусом клеток в суспензии кс личество подаваемого воздуха постоянно уменьшали и доводил: до минимальных значений (0,1—0,2 л/час). При 'таких условия культивирования титры инфекционной активности вируса состг вили для культур клеток ВНК-21/2-17 и ППК>66б/17 — 8.751: ТЦДбо/мл, для клеток £5-88 — 8,0 ^ ТЦД5п/мл, между тем ЦП,] вируса в этой культуре проявлялось на 4—6 часов раньше. Врем культивирования составляло в пределах 46—64 часов, в некотс рых случаях ЦПД вируса на клетки (75—90 %) наблюдали з 24—36 часов, однако стабильности получения результатов в таки минимальные сроки добиться не удалось.

Динамику накопления вируса болезни Ауески изучали в кул! туре клеток ВНК-21/2-17 при суспензионном культивировании культиваторах КС-40 с рабочим объемом 40,0 литров. В отобрат ных в разные промежутки времени от начала культивировани пробах определяли процент живых и «мертвых» клеток, а такж титр инсЬекпионной активности вируса. Через 48±4.0 часов кул1 тивирования биотитр вируса достигал 8,37ТЦДяп/мл. При это количество погибших клеток в вирусной суспензии составлял около 70%. Дяльнейшее культиви^вание клеток и вируса в проявления ЦПД на 92—94 % инфицированных клеток лии незначительно повышало биотито вируса (на 0,24—0,34 ТЦД* мл). Вместе с тем, при 90—95 % гибели клеток удлинялись ср ки культивирования до 54—60 часов против 48 часов. Культив ро^ание клеток и вируса в течении 54—60 часов способствует ув лишению ттроттента «мептвътх» клеток за счет неспецифической г бели культупьт ня 25—30%. что наблюдали в контроле неинФиц ронянных виоусом клеток. В связи с этим цикл культивирован; вируса болезни Ауески в суспензии клеток в дальнейшем прекр шали пои наличии 70—80 % дегенерировавших клеток.

Изучая влияние сыворотки крови крупного рогатого скота в по держиваюшей среде, установлено, что при одинаковой дозе зар жения вирусом клеточной культуры (суспензии клеток и виоуся согтепжашей сыворотку крови, изменялись сроки проявления ЦП. Для моноелойных культур они удлинялись до 24—36 часов по тив 90—24 часов и в суспензии — до 64 часов против 52 часс Присутствие 10 % сыворотки крови крупного рогатого скота сн жало титр инфекционной активности вируса, который и монослс ной культуре клеток составлял 7,83 с сывороткой и 8.8 1ег ТЦД мл без нее и для суспензии 8,08 1£ против 8,71 ^ ТЦДяп/мл. С: дует отметить, что такое ингибирующее действие сыворотки кр ви повышается с нарастанием ее процентного содержания. 8

Параллельно с опытами по изучению чувствительности клеточных систем для культивирования вируса выполнены исследования по подбору модели и тестобъекта для титрования вируса и полуфабрикатов при изготовлении вакцины. Данные сравнительного титрования вируса болезни Ауески в различных культурах клеток и на лабораторных животных представлены в табл. 1.

Таблица I

Биотитр вируса в клеточных культурах и на лабораторных животных

№ т

1ест система

Биотито вируса

Ой)

1. Культура клеток ВНК-21/2-17 8,23±0,08 (ТЦД5о/мл)

2. —»— СП 8,50±0,00 —»—

3. —ПСГК-30 8,25 ±0.00 —»—

4. —»— ППК-666/17 8,17 ±0,06 —»—

5. Животные Мышата сосуны 4,25±0,11 (ЛД5о/мл)

6. —»— Морские свинки 3,25 — »—

7. —»— Кролики 9,00 — »—

2.2.2. Концентрирование и инактивация вируса болезни Ауески

Выбор оптимальных условий концентрирования и инактивации культурального вируса осуществляли с использованием вируса болезни Ауески, выращенного в суспензии клеток ВНК-21/2-17. Предварительно вирусную суспензию очищали от клеточного детрита на центрифуге.

Сравнительные результаты концентрирования вируса с помощью двуокиси кремния и гидроокиси алюминия показали, что двуокись кремния по своим сорбционным свойствам значительно превосходит гидроокись алюминия. В минимальной концентрации 0,03 % на ней сорбируется до 89,29 %' вируса, тогда как гидроокись алюминия сорбирует только 32,4 %. Дальнейшее увеличение концентрации двуокиси кремния в вирусной суспензии способствует более высокому выходу вируса в полуфабрикате. Хотя с увеличением концентрации гидроокиси алюминия также повышается выход вируса, он все же значительно уступает двуокиси кремния. Объясняется это скорее всего химической структурой двуокиси кремния и большим запасом сорбционной поверхности.

После определения эффективности сорбции вируса болезни Ауески аэросилом (двуокись кремния) в сравнении с гидроокисью алюминия изучали сорбцнонные свойства его в более высоких концентрациях (0,3—0,6 %). С увеличением концентрации аэросила в вирусной суспензии повышался выход вируса в полуфабрикате. Если в концентрации 0,03 %' он сорбирует 87,12—89,29 % вируса, то с увеличением концентрации в Ю раз, то есть до 0,3 % его, сорбционная активность повышается до 97,43 %'. В концентрации 0,6 % аэросил сорбирует уже 99,68 % от исходного вируса. Однако, при увеличении процентного содержания аэросила в вирусной

суспензии, концентрирование удается осуществить лишь в 8—10 раз по объему. Немаловажным является и тот факт, что при повышении концентрации аэросила в суспензии, а в конечном итоге в вакцине, увеличивается реактогенность таких препаратов.

Полиэтиленгликоль хорошо концентрирует вирус болезни Ауески. При концентрации 4 % полиэтиленгликоля не адсорбируется всего 17,78 %' вируса. С увеличением концентрации полиэтиленгликоля до 6, 8 и 10 % количество неадсорбировавшегося вируса уменьшается соответственно до 10,0; 2,69 и 1,95 %'. Кратность концентрирования составляет 100. Следует отметить, что время, достаточное для осаждения преципитатов, может составлять всего 4 часа.

Изучено влияние полиэтиленгликоля на сорбционную активность аэросила при концентрировании вируса болезни Ауески. Так, при постоянной концентрации полиэтиленгликоля в вирусной суспензии (10 %)и увеличивающейся концентрации аэросила (0,015; 0,03; 0,06; 0,075 %) уменьшается количество неадсорбировавшегося вируса с 54,54 до 15,5 %, fc 45,5 до 1,04 %, с 4,5 до 0,4 %, с 2,57 до 0,15% соответственно. Применение такой малой концентрации аэросила как 0,03 %' в присутствии полиэтиленгликоля позволяет сорбировать около 99 % вируса. Очевидно, что аэросил является сам по себе хорошим сорбентом. Совместное применение аэросила и полиэтиленгликоля значительно усиливает эффективность концентрирования.

Результаты сравнительных опытов по инактивации вируса болезни Ауески с помощью формальдегида и производных азириди-нов показали, что бромэтилимин гидробромид и димер этилени-мина инактивируют его за 6—14 часов. С увеличением концентрации азиридинов и повышением температуры инактивации усили валось их инактивирующее действие. Характерно, что при таких же концентрациях формальдегида полной инактивации удавалоа достичь лишь через 5—6 суток. Производные азиридинов инакти вируют вирус болезни Ауески с одинаковой скоростью, по реакции первого порядка в линейной зависимости. Кривая инактивацш вируса с помощью формальдегида значительно отклоняется от реакции первого порядка, спад инфекционности более медленны* и продолжительный.

2.2.3. Испытание иммунобиологических свойств экспериментальных образцов инактивированной вакцины

2.2.3.1. Подбор компонентов вакцины

С учетом отработанных в предшествующих опытов техноло гических приемов культивирования клеток и вируса, очистки концентрирования и инактивации готовили экспериментальные об разцы вакцины. В состав препарата вошли концентрированный нг аэросиле в присутствии полиэтиленгликоля антиген вируса болез

ни Ауески. Биотитр вирусных суспензий используемых для приготовления препаратов был примерно одинаковым (7,9—8,2 ^ТЦДбо/ мл), содержание вирусного белка составляло — 0,3—0,41 мкг/мл.

Приготовленная сорбированно-эмульсионная вакцина представляла собой эмульсию типа «вода в масле» белого цвета, слегка вязкой консистенции. Сорбированный препарат представлял собой жидкость белого цвета.

2.2.3.2. Испытание экспериментальных образцов вакцины

на стерильность, безвредность и авирулентность

При контроле по показателям качества вакцин из вируса, выращенного в культуре клеток ВНК-21/2-17, ППК-666/17 и 1^-88 они оказались стерильными. Проростов бактериологических сред, проявляющихся помутнением, изменением цвета и газообразованием не наблюдали.

При контрольном испытании образцы сорбированной и сорби-рованно-эмульсионной вакцины оказались безвредными и авиру-лентными. Через 10 дней после инокуляции вакцин все животные остались клинически здоровыми. У некоторых животных при па-тологоанатомическом вскрытии были обнаружены олеогрануле^ы (местная реакция на масло), которые представляли собой шарики со сформировавшейся соединительнотканной оболочкой размером 0,6—0,9 мм в диаметре, с однородным содержимым в виде белой густой массы.

2.2.3.3. Проверка иммуногенности инактивированных вакцин

против болезни Ауески

На кроликах испытывали 6 образцов вакцины. Для исследования одного образца вакцины использовали 15 кроликов (по 5 животных на одно разведение вакцины, 4 головы оставались контрольными). Вакцина вводилась в цельном, 1:10, 1:100 разведениях В дозе 1 см3. Препараты с масляными адъювантами имели более высокую нммуногенность, чем сорбированные вакцины. ИмД50 для вакцин с масляным адъювантом составила — 0,01 (100 иммунизирующих доз в 1 см3 вакцины) н сорбированных вакцин — 0,03 (до 33 иммунизирующих доз в 1 см3 вакцины). Результаты испытания экспериментальных образцов вакцины на кроликах представлены в табл. 2.

2.2.3.4. Проверка иммуногенности инактивнрованных вакцин против болезни Ауески на морских свинках

На морских свинках испытывали 6 образцов вакцины. Для исследования одного образца вакцины использовали 15 животных (по 5 морских свинок на одно разведение вакцины, 4 головы оставались контрольными). Вакцина вводилась в цельном, 1:10 и 1:100 разведениях в дозе 1 см3. Испытанные образцы вакцины обладали

11

Таблица 2

Иммуногениая активность экспериментальных образцов сорбированной и эмульсионной инактивированной вакцины против болезни Ауески из культурального вируса на кроликах

Результа-

№ Система ты конт- Кол-во

культи- Основа рольного ИмДбо/мл ИмДбо в

п/п вирования вируса адъюванта заражения жив-х (гол.) прививн. дозе

1. ВНК-21/2-17 аэросил+

масло 1,14 0,01 100

аэросил 3/12 0,03 33

2. ППК-666/17 аэросил+

масло 2/13 0,01 100

аэросил 4/11 0,03 33

3. 1*5-88 аэросил+

масло 2/13 0,01 100

аэросил 4/11 0,03 33

4. Контроль 4/0 — —

Примечание: числитель — число погибших животных после заражения, знаменатель — число выживших.

выраженными иммуногенными свойствами для морских свинок. Высокая степень концентрирования антигена не позволила выявить существенных различий в иммуногенности вакцин даже при рас-титровке. ИмД50 всех испытанных на морских свинках вакцин составила — 0,01, что равнялось 100 иммунизирующих доз в 1 см3 вакцины.

2.2.3.5. Проверка иммуногенности инактивированных вакцин против болезни Ауески на свиньях

На свиньях испытывали 3 образца вакцины. Для исследования одного образца вакцины использовали 12 свиней (по 4 животных на одно разведение вакцины, при двух контрольных). Вакцина вводилась в цельном, 1:10 и 1:100 разведениях в ;дозе 1 см3. Результаты испытания экспериментальных образцов вакцины приведены в таблице 3.

Как видно из представленных в таблице 3 результатов, более высокую иммуногенную активность показала вакцина, полученная из вируса, выращенного в культуре клеток ВНК-21/2-17. ИмД50 для сорбированно-эмульсионной вакцины, составила 0,01 мл (100 иммунизирующих доз в 1 см3 вакцины), для сорбированной — ИмДбо составила 0,03 мл (33 иммунизирующих дозы в 1 см3 вакцины). Ниже оказалась иммуногенность у сорбированно-эмульсионной вакцины, полученной из вируса, культивируемого в клетках ППК-666/17 — 0,08 мл (12 иммунизирующих доз в 1 см3 вакцины). 12

К 14 дню после вакцинации вируснейтрализующие антитела появлялись у всех привитых животных. Наиболее высокие титры вырабатывались у животных на эмульсионную вакцину, приготовленную из вируса, полученного в культуре клеток ППК-666/17 (6,53 лог2). Титры антител на введение вакцины, приготовленной из вируса, полученного в культуре клеток ВНК-21/2-17, оказались несколько ниже, и составили для сорбированной вакцины — 4,83 лог2 и для сорбированно-эмульсионной — 5,62 лог2. Как следует из результатов опыта (таблица 4), уровень титров вируснейтрализующих антител не коррелирует с защитой животных от инфекции.

Таблица 3

Иммуногенная активность экспериментальных образцов сорбированной и эмульсионной инактивированной вакцины против болезни Ауески из культурального вируса на свиньях

п/п Система культи- Основа Результаты контрольного ИмДго/мл Кол-во ИмДго в

№ вирования вируса адъюванта заражения жив-х (гол.) прививн. дозе

1. ВНК-21/2-17 аэросил+ масло аэросил 3/9 4/8 0,01 0,03 100 33

2. ППК-666/17 аэросил+ м.асло 5/7 0,08 12

3. Контроль — 2/0 — —

Примечание: числитель — число погибших животных после заражения,

знаменатель — число выживших.

Таблица 4

Уровни титров вируснейтрализующих антител после вакцинации свиней инактивированными препаратами против болезни Ауески

Система Основа Титры вируснейтрализующих антител, дни (лог2)

культ, вируса адъюванта (7) (14) (21)

ИМДБО/МЛ

ВНК-21/2-17 аэросил+

масло 1,14±0,14 4,18±1,03 5,62 ±1,89 0,01 аэросил 1,01 ±0,27 3,90 ±1,20 4,83±1,61 0,03

ППК-666/17 аэросил +

масло 1,74±0,26 4,87±0,71 6,35±1,37 0.08

Через 30 дней после контрольного заражения свиньи были подвергнуты исследованиям на наличие вируса в паренхиматозных органах, головном и спинном мозге. Суспензией из этих органов

заражали кроликов и культуру клеток СП. Результаты проведенных исследований (таблица 5) свидетельствуют о том, что от свиней, привитых инактивнрованной вакциной и зараженных на 28 день интрацеребрально вирулентным вирусом, выделить его из исследованных проб не удалось. В то же время у животных контрольной группы вирус выделяли из паренхиматозных органов, головного и спинного мозга. По-видимому, высокая концентрация вирусного антигена в прививной дозе вакцины способствует не только выработке активного иммунитета, но и препятствует приживлению вируса в организме привитых животных.

Таблица 5

Данные по вирусовыделению у свиней, привитых инактивированнымн вакцинами против болезни Ауески

№ п/п

3.

Характеристика животных

Свиньи, привитые сорбированной вакциной ц зараженные иптрацеребралыго Свиньи, привитые эмульсионной вакциной и зараженные интрацеребрально Контроль: свиньи зараженные интрацеребрально

Количество животных (гол.)

16

2

Данные вирусовыделения

на кроликах

0/8

па культуре клеток СП

0/8

Примечание: числитель

количество животных рус болезни Ауескн; знаменатель — количество животных в опыте.

0/16 0/16 2/2 2/2 от которых выделен ви-

Результаты проведенных испытаний экспериментальных образцов вакцины на естественно восприимчивых и лабораторных животных показали следующее:

— количественный метод контроля на лабораторных живот-пых дает надежную и объективную оценку нммуногенности инак-тивированпых вакцин против болезни Ауески. При этом наблюдается четкая закономерность «доза—эффект»;

— эмульсионные вакцины обеспечивают образование более напряженного иммунитета. ИмД50 для кроликов составила 0,01, для морских-свинок — 0,01 и для свиней — от 0,01 до 0,08 мл, то есть в прививном объеме содержится пятидесятипроцентных доз для кроликов — 100, морских свинок более 100 и для свиней — 12—100;

— вируснейтрализующие антитела и сыворотке крови свиней появляются на 7 день после вакцинации в титрах 1,01—1,74 лог2, повышаясь и 14 дшо до 3,9—4,87 лог2 и к 21 дню до 4,83—6,53 лог2;

— как показали результаты контрольного заражения, титры ви-руенейтрализующих антител не коррелировали с невосприимчивостью животных к инфекции.

Таким образом, предложена новая более совершенная технология изготовления пнактивированной концентрированной вакцины против болезни Ауески. Вакцины обеспечивают формирование стойкого иммунитета и препятствуют приживлению вирулентного вируса в организме привитых животных.

ВЫВОДЫ

1. Разработана новая технология изготовления и контроля пнактивированной вакцины против болезни Ауески из культураль-ного вируса, выращенного в суспензии перевиваемых клеток.

2. Использование в работе суспензии перевиваемых линий клеток ВНК-21/2-17, ППК-666/17, ^3-88 и монослоя клеток СП и 1В-НЭ-2 обеспечивает репродукцию вируса болезни Ауески штамма «УНИИЭВ-18в» с высоким титром ннфекционности в пределах 7,20—8,77 ТЦД50/мл для культур клеток, 9,0 ^ТЦДбо/мл для жроликов, 3,25 ЛД50/мл для морских свинок и 4,25 ^ЛД50/мл для новорожденных мышат при внутримозговом способе заражения. С целью изготовления вакцины рекомендуется использовать перевиваемую линию клеток ВНК-21/2-17.

3. Установлено, что производные азиридинов: димер этилени-мина и бромэтилимин гидробромид в отличие от формальдегида инактивируют вирус болезни Ауески в течение 24 часов при +26 °С против 120—144 часов.

4. Отработан метод концентрирования вируса болезни Ауески на неорганических сорбентах (двуокись кремния) в присутствии полиэтиленгликоля, обеспечивающий 60-кратное по объему концентрирование вируса болезни Ауески.

5. Разработаны количественные методы контроля иммуноген-ной активности инактивированной вакцины против болезни Ауески па свиньях и лабораторных животных (кролики и морские свинки) путем определения пятидесятипроцентных иммунизирующих доз (ИмД50), обеспечивающих возможность стандартизировать вакцину по нммуногенности и повысить надежность ее контроля.

6. Сорбированные н сорбированно-эмульсионные инактивиро-ванные вакцины против болезни Ауески из культурального вируса авирулентны, безвредны и обладают высокой антигенной и имму-погенной активностью на свиньях и лабораторных животных. При сравнительном изучении вакцин установлена более высокая активность у эмульсионных препаратов — ИмДэо составляет для свиней — 0,01—0,08 мл, для кроликов — 0,01 мл и для морских свинок — 0,01 мл, ,то есть в прививном объеме 1 см3 содержится от 12 до 100 пятидесятнпроцентных защитных доз.

7. Высокая антигенная и иммуногённая активность эмульсионной инактивированной вакцины против болезни Ауески препятствует приживлению вирулентного вируса в организме привитых свиней и последующему вирусоносигельству, при их заражении или совместном содержании с больными животными.

8. Результаты проведенных исследований послужили экспериментальным обоснованием для разработки нормативно-технической документации на инактивированную вакцину ВНИЯИ-УНИИЭВ против болезни Ауески из культурального вируса, утвержденной Главным управлением ветеринарии Украины.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Предложена технология изготовления инактивированной вакцины против болезни Ауески на основе крупномасштабного суспензионного культивирования клеток и вируса.

По результатам экспериментальных исследований составлена научно-техническая документация на инактивированную концентрированную вакцину против болезни Ауески (ТУ, Инструкция по изготовлению и контролю и временное наставление по применению инактивированной эмульсионной вакцины против болезни Ауески), одобренная Учеными советами УНИИЭВ (протокол № 17 от 9 августа 1991 года) и ВНИЯИ (протокол № 14 от 10 октября 1991 года), утвержденная ГУВ МСХ Украины (28 января 1992 года) и рекомендованная для испытания в производственных условиях.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Корниенко Л. Е. Адаптация вируса болезни Ауески к суспензионному клону ВНК-21 // Методические рекомендации по актуальным вопросам ветеринарии (молодые ученые производству). Украинский НИИ экспериментальной ветеринарии, Харьков, 1990.—с. 13.

2. Корниенко Л. Е., Белоконь В. С., Бондаренко А. Ф., Беляев Н. Е., Лнтен-кова И. Ю., Костюченко В. Г. Экономическая эффективность крупномасштабного культивирования вируса болезни Ауески // Ветеринарная медицина: экономические, социальные и экологические проблемы: Тезисы докладов республиканской конференции. Харьков, 1990.-е. 300.

3. Корниенко Л. Е., Белоконь В. С., Бондаренко А. Ф., Беляев Н. Е., Литвинова И. Ю., Костюченко В. Г., Прохоров В. В., Берус П. Т. Изучение репродуктивной способности вируса болезни Ауески при суспензионном культивировании // Тезисы докладов Всесоюзной конференции посвященной 140-летию ХЗВИ. Харьков, 1991.-е. 123.

4. Корниенко Л. Е., Белоконь В. С., Бондаренко А. Ф., Главацкий В. П., Дудников Л. А., Берус П. (Т., Беляев Н. Е. Инактивация вируса болезни Ауески веществами азнридинового ряда // Тезисы докладов Всесоюзной конференции посвященной 140-летию ХЗВИ. Харьков, 1991.-е. 124.