Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ НАРУШЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ ЭТАНОЛОМ, БАРБАМИЛОМ И ИХ ФИТОТЕРАПИЯ

¿Г0

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ НАРУШЕНИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ ЭТАНОЛОМ, БАРБАМИЛОМ

И ИХ ФИТОТЕРАПИЯ

16.00.02 - патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Улан-Удэ, 2003

На правах рукописи

РАЗУВАЕВА ЯНИНА ГЕННАДЬЕВНА

Работа выполнена в Институте общей и экспериментальной биологии Си бирского отделения Российской академии наук.

Научный руководитель:

доктор биологических наук

Официальные оппоненты;

доктор биологических наук, профессор

кандидат биологических наук

Лоншакова Клара Сергеевна

Хибхенов Лопсондоржо Владимирович

Абидуева Лыгжима Ранжуровна

Ведущая организация: Восточно-Сибирский государственный технологический университет.

Защита состоится « 05 »декабря 2003 года в

Л

часов на заседании диссертационного совета Д-220.006.01 в Бурятской сельскохозяйственной академии им. профессора В.Р. Филиппова (670024, г. Улан-Удэ, ул. Пушкина, 8).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Бурятской сельскохозяйственной академии им. профессора В,Р. Филиппова.

Автореферат разослан « Л» роября 2003 года.

Ученый секретарь >

диссертационного совета / /

кандидат ветеринарных наук, доцент У Г. А. Игумнов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В последние десятилетия проблема употребления веществ,- вызывающих при систематическом приеме психическую и физическую зависимость, среди населения России стала чрезвычайно актуальной. Так, по данным наркологических диспансеров с 1991 по 2000 гг, число больных с алкогольной зависимостью увеличилось в 4 раза, а больных с наркотической зависимостью - в 9 раз (Г.Г. Заиграев, 2002; В.В. Киржанова, 2002; ЕА. Кошкина, 2002), При этом, психоактивные вещества, применяемые как постоянно, так и эпизодически, вызывают широкий спектр патологических изменений со стороны всех внутренних органов, а основными точками их приложения являются сердечно-сосудистая, гепатобшшарная и нервная системы (B.C. Пауков, 2001).

Формирование алкогольной и наркотической зависимости обусловлено нарушением функционирования различных биохимических и физиологических процессов, протекающих в организме, многие из которых можно рассматривать в качестве первичных патогенетических факторов. К таким факторам можно отнести дезорганизующее действие психоактивных веществ на клеточные мембраны (М.А. Константинопольский, 1992, Л,Ф, Панченко, 1994; С. Lif 1994; J. Salonen, 1997; S-Y. Chen, 2000),,торможение синтеза РНК и белков (П.Б. Казакова, 1990; В.И. Сергненко, 1993; П.Д. Шабанов, 1998; В.Н. Ярыгин, 1994), изменение функциональной активности нейромедиаторных систем мозга (И.П. Анохина, 2000; С.Ю. Калшневич, 1994; J.T. Coull, 1994) и другие метаболические последствия введения в организм ПАВ, которые приводят к морфологическим изменениям в большинстве мозговых структур и негативно сказываются на познавательных функциях мозга (JI.E., Бородкина, 2002; Г.В. Ковалев, 1990; П.И. Сидоров, 2000; П,Д. Шабанов, 2000).

На сегодняшний день в клинике алкоголизма и наркомании применяется широкий набор лекарственных средств: ноотропьг, знткдепрессанты, адапто-гены,; витамины и др. (А.Г. Гофман, 1999;.П.Д. Шабанов, 1998). Несмотря на то, что все эти средства принадлежат к различным фармакологическим группам,- их влияние направлено на нормализацию структурно-функционального состояния головного мозга и высших интегративных процессов - памяти, внимания, мышления. Однако, эти средства не всегда могут обеспечить достаточный терапевтический аффект при симптоматическом лечении нарушений высших функций мозга, и при этом их применение нередко приводит к нежелательным, часто токсическим проявлениям, что резко снижает качество лечения (А.Г, Гофман, 1999; А.Я. Гриненко, 1993; В. Gabryel, 1994).

Изложенное выше обосновывает необходимость поиска новых лекарственных средств, безвредных для организма и L обладающих нейропротектор-ным действием. Особого внимания, заслуживают лекарственные средства растительного происхождения, издавна применявшиеся в народной и традиционных медицинах при заболеваниях нервной системыjjmjjи^к^из^ающиеся

3 . ц,-

\ * .^-ЗШ?О

в последнее время при различных функциональных нарушениях центральной нервной системы, вызванных интоксикацией, травмой мозга, гипоксией, алкоголизмом и другими патологическими состояниями (Г.Х. Дамдинова, 2001; И.Л. Зеленская, 2000; Й.В. Шилова, 2001).

В соответствии с вышесказанным, нами разработано новое растительное средство, условно названное «Ноофит», в состав которого входят; шлемник байкальский, левзея сафлоровиднаЯ, валериана лекарственная, мята перечная, горец птичий, крапива двудомная; тысячелистник обыкновенный.

Цель исследования. Целью настоящей работы явилось определение особенностей морфофункциональных нарушений головного мозга при действии этанола и барбамила и оценка фармакотерапевтической эффективности фи-тосредства «Ноофит» при интоксикациях ими.

Исходя из указанной цели исследования, были сформулированы следующие задачи:

1) изучить особенности влияния этанола и барбамила на структурные изменения головного мозга крыс и связанные с ними нарушения когнитивных процессов в условиях эксперимента;

2) исследовать фармакотерапевтическую эффективность «Ноофита» при алкогольном и барбамиловом повреждениях головного мозга;

3) изучить влияние «Ноофита» на процессы обучения и памяти у интактных животных и при действии факторов, вызывающих амнезию: гипоксия, электросудорожный шок;

4) выявить основные механизмы нейропротекторного действия «Ноофита». Научная новизна. В данной работе впервые изучено нейропротекторное

действие нового средства «Ноофнто при алкогольном и барбамиловом повреждениях головного мозга. В работе впервые установлена ноотропная активность «Ноофита», которая выражается в улучшении процессов обучения и памяти у интактных животных, и при действии факторов, вызывающих амнезию.

Установлено, что данное средство обладает антигипоксической, спазмолитической и противосудорожной активностью. Базисным молекулярно-клеточным механизмом нейропротекторного действия «Ноофита» является его способность ингибировать свободнорадикальное окисление и стабилизировать биологические мембраны.

Практическая значимость работы. Экспериментально обоснована возможность коррекции фитосредством «Ноофит» морфофункциональных повреждений головного мозга этанолом и барбамилом и связанных с ними нарушений процессов обучения н памяти, что позволяет рекомендовать данное средство для клинических исследований.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на курсах патанатомии, патофизиологии, фармакологии и клинической фармакологии медицинского факультета Бурятского государственного университета МОРФ.

Положения, выносимые на защиту:

алкоголь и барбамил, вызывают значительные морфофункциональные

нарушения головного мозга в условиях эксперимента;

новое растительное средство «Ноофит» обладает выраженной фармако-

терапевтической эффективностью при алкогольном и барбамиловом

повреждениях головного мозга;

«Ноофит» обладает ноотропным типом действия;

основными механизмами, определяющими нейропротекторное действие

«Ноофита», следует считать его антиоксидантное, мембрано стаб илиз и-

рующее, антигипоксическое, противосудорожное, спазмолитическое

действия, ,

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на: -, научно-практической конференции «Биологически активные добавки и перспективы их применения в здравоохранении» (Улан-Удэ, 2001); Южно-Сибирской международной конференции студентов и молодых ученых (Абакан, 2001);

Международной научно-практической конференции «Устойчивое развитие сельского хозяйства в бассейне озера Байкал» (Улан-Удэ, 2002); Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы адекватного питания в эндемичных регионах» (Улан-Удэ, 2002); IX, X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002,2003);

- , научно-практической конференции, посвященной 70-летию службы контроля качества лекарственных средств в Бурятии (Улан-Удэ, 2003); международной научной конференции «Возрастная физиология и патология сельскохозяйственных животных», посвященной 90-летию В.Р. Филиппова (Улан-Удэ, 2003);

научно-практической конференции «Биологически активные добавки в профилактической и клинической медицине» (Улан-Удэ, 2003). Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ. Структура н объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 135 страницах компьютерного текста и состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы, включающего 233 источника, из которых 80 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 14 таблицами, 9 рисунками и 21 микрофотографиями.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены на 640 белых крысах линии Вистар обоего пола с исходной массой 160-180 г.

«Ноофит» исследовали в форме отвара, приготовленного по ГФ СССР XI издания (1990), Отвар «Ноофита» вводили внутрижелудочно животным в

объеме 1,0 мл/100 г массы. В отдельных бпытах исследовали «Ноофят» в объемах 0,3 и 0,5 мл/100 г массы животного. В качестве препарата сравнения во всех экспериментах использовали синтетический ноотропный препарат - пир-ацетам, в доз^ 200 мг/кг массы (Т.А. Воронина, 2000; Г.В. Ковалев, 1990).

Алкогольную интоксикацию у лабораторных животных вызывали внут-рижелудочным введением крысам 40 % этанола в объеме 9 мл/кг массы животного в течение 45 дней'(А.И. Майский, 2000): Барбамил вводили белым крысам внутрибрюшинно' в дозе 25 мг/кг массы животного ежедневно в течение 4 недель (МД. Гаевый, 1980): Выбор барбамила связан с тем, что введение этого вещества вызывает привыкание'с «классическим^'Проявлениями физической зависимости подобно морфину и этанолу (И.П. Анохина, 1990). «Но-офит» и пирацетам вводили внутрижелудочно ежедневно* Через 6-8 Часов после каждого введения этанола или барбамила. Животйь£м' контрольной группы вводили в эквивалентном объеме дистиллированную Böiiy по аналогичной схеме. Через сутки после последнего введения психоактивного вещества животных умерщвляли мгновенной декалитацией.

Для оценки морфофункционального состояния головного мозга подопытных животных использовали ряд гистологических, гистохимических и гисто-энзимологических методов. Для проведения гистологических методов материал фиксировали в 10 % нейтральном формалине и 96° этаноле, Обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, заливали в парафин-целлоидин. Помимо общепризнанного метода - окраски гематоксилин-эозином, применяли специфические методы окраски нервной ткани: крезилвиолетом по Писано для выявления хроматоф ильного вещества и ядер нервных йлеток, по Дубранскому и Миягава-Александровской - на олигодевдроглию, по Шпильмейру - на мие-линовые волокна (Ё.Г. Елисеева, 1967; Г.А. Меркулов, 1969).

Кроме качественного анализа микропрепаратов, окрашенных по методу Ниссля, на микроскопе МБЙ-10 при увеличении 7x40 проводили морфомет-рическое исследование клеточного состава в разных областях головного мозга. Так, в Ш, V слоях коры головного мозга в 20 полях зрения и мозжечке в 100 клетках подсчитывали количество разных по структуре нейронов. НорМохром-ных, умеренно и резко гиперхромных, умерено и резко гипохромных, «клеток-теней», Также был проведен морфометрический анализ клеток гиппокампй но степени окраски крезилвиолетом. Клетки были разделены-на-2 группы: тёмный с резкой степенью гнперхромии и светлые, имеющие светлое ядро и разной содержание тигроидного вещества в цитоплазме. Определялось количество (в %) темных и светлых клеток по отношению к общей сумме клеток.

Для гистохимических и гистоэнзимол^опиеекнХ методов исследования готовили свежезамороженные срезы на криостате МК-2Э! Свежезамороженные срезы окрашивали на содержание липидов Суданом черным «В» поБеренбау-му, активность сукцинатдегидрогеиазы (СДГ) выявляли по Нахласу (Э. Пирс,

1962). ^парафиновых срезах определяли содержание РНК по Браше (Г.А.

Для оц^ к ^ состояния процессов перекисного окисления липШов в'ftimo-роло'вного мозгта определяли содержание малонового днальдеги-Владимиров, 1972), уровень активности каталазы (МА. Королю^ 1988),,

.■■,. Ocipyjp, токсичность ^Ноофита» проводили по методу Кербера (Е.В. Арзамасцев, 2000). Класс токсичности определяли по классификации К.К. Сидорова (1973).

Мембраностабшшзирующую активность «Ноофита» определяли in vitro по степени торможения перекисного и осмотического гемолиза отмытых эритроцитов человека (И.Е. Ковалев, 1986).

Влияние «Ноофита» на спонтанную двигательную активность, ориентировочно-исследовательскую реакцию и эмоциональность животных изучали с помощью теста «открытое поле» (Г.В. Ковалев, 1990; J.Buxes, 1963).

Влияние на процессы обучения и памяти у интактных крыс исследовали при выработке условной реакции пассивного избегания (УРПЙ), условного рефлекса с положительным подкреплением в Т- образном лабиринте условной реакции зрительной дифференцировки (УРЗД) (Т.А. Воронина, 2000).

Нарушения обучения и памяти у крыс вызывали введением 40% этанола в объеме 9 мл/кг в течение 45 дней, введением барбамнла в дозе 25 мг/кг в течение 4 недель, воздействием электросудорожного шока {70-100 мА, 0,2-0,5 с), гипоксической гипоксией и гиперкапнией, непосредственно после выработки условного рефлекса (ТА, Воронина, 2000).

Антигипоксическое действие «Ноофига» исследовали на 4 моделях: нор-мобарической гипоксии с гиперкапнией (Л.Д. Лукьянова, 1989), острых гипо-барической (В.А. Березовский, 19S5), гемической (Ю.Ф. Костюченко,1982), гистотоксической (А.П. Караев, 1989) гипоксий. Антигипоксическое действие «Ноофита» и пирацетама оценивали по продолжительности жизни животных,

Противосудорожную активность «Ноофита» исследовали на моделях камфорных и стрихниновых судорог (ТА. Воронина, 2000), При этом оценивали латентный период развития судорог, выраженность клонической и тонической фаз, общую продолжительность судорожного периода и выживаемость животных.

По величине реакции тонкой кишки белых крыс на введение карбахолина и адреналина изучали спазмолитическую активность «Ноофита» (R.F. Furchott, 1967).

Статистическую обработку данных проводили с помощью параметрического критерия Стьюдента и непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитнн. Различия считались достоверными при Р< 0,05 {В.И. Серженко,

2001). 1(.':';;Т",г

■ , ... ..л л.-.. г"

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Морфофункцнональные изменения головного мозга при алкогольной

интоксикации и их коррекция фитосбором «Ноофит» При микроскопическом исследовании коры головного мозга животных, потреблявших в течение 45 дней этанол, обнаруживаются значительные¡изменения в структуре нейронов III и V слоев. При этом в III слое изменения, направлены в сторону увеличения гиперхромных клеток, а в V - в сторону увеличения гипохромных клеток (табл.1).

При количественном анализе нейронов П1 слоя коры мозга установлено, что у животных, потреблявших этанол, количество нормохромных клеток"снижается на 65,7 %, умеренно гиперхромных клеток - на 23,4 %, при этом увеличивается количество резко гиперхромных клеток (на 68,1 %) по сравнению с таковыми у животных интактной группы (табл. 1). Гиперхромные клетки образуют скопления, их тела атрофируются; истонченные дендриты прослеживаются на значительном протяжении. Незначительно увеличиваются количество гипохромных клеток, находящихся в состоянии периферического и тотального хроматолиза с мелкоячеистой вакуолизацией цитоплазмы, число «клеток-теней», явления сателлитоза и нейроиофагии.

По мнению некоторых авторов (Д.Д. Орловская, 1986), гиперхромофилия является эквивалентом заторможенного состояния и характеризуется как ги-поксическое повреждение головного мозга (Гипоксия, 2000). Вакуольная дистрофия нейронов отражает нарушение их липопротеинового каркаса, что свидетельствует о тяжелых необратимых изменениях, увеличение числа резко гипохромных нейронов, «клеток-теней» и замещение погибших нейронов гли-ей указывает на истощение резервных возможностей нейронов головного мозга. Наличие большого количества измененных нейронов является еще одним из признаков выраженной гипоксии мозга (H.H. Боголепов, 2001).

При морфометричеСком исследовании нейронов V слоя коры мозга крыс, потреблявших этанол* наблюдается снижение количества нормохромных (на 64,6 %) и умеренно гиперхромных клеток (на 42,9 %) по сравнению с таковыми у животных интактной;1руппы!(таб1лЛ). При этом резко увеличивается количество резко гипохромных клеток, находящихся в состоянии набухания с вакуолизацией цитоплазмы. При алкогольной интоксикации в этом слое незначительно увеличивается количество резко гиперхромных, сморщенных нейронов. На микропрепаратах они встречаются по 2-3 в поле зрения.

Степень гююксических изменений головного мозга и других органов определяется также по снижению активности митохондриальных ферментов (B.C. Пауков, 1991), Так, в наших исследованиях при просмотре микропрепа-рагов, окрашенных по Нахласу, выявлено снижение активности СДГ во всех слоях коры головного мозга.

По мнению некоторых авторов (В.И. Сергиенко, 1993), гистотоксические изменения, вызванные введением ПАВ, в первую очередь связаны с наруше-

нием водногообмена. В наших исследованиях при введении этанола наблюдаются выраженные гидропические изменения, которые выражаются в появлении перицеллюлярного и периваскулярного отеков и дренажных форм оли-годендропшоцитов. Последние, по мнению некоторых авторов (Э.Н. Попова, 1984), являются компенсаторно-приспособительной реакцией, направленной на поддержание функции нейронов в ранние сроки алкогольной интоксикация.

Таблица 1

Влияние «Ноофита» и пирацетама на количество разных типов нейронов в III, V слоях коры мозга и клеток Пуркинье в мозжечке у белых крыс при алко-_гольноЙ интоксикации (М±ш)_

Тип клеток1 • Группы животных

Иитакгная №0) Контрольны (этанол + НгО) Опытная (этанол+ «Ноофкх», 1,0 мл/100 г) Опытная (этанол+ лнрацетам, 200 мг/кг)

Щ слой

Нормохромные 7,6+0,75 2,б±0,57** 4,8±0,56* 4,9±0,78*

Умеренно гиперхромные 4,7±0,31 3,6+0,59 2,0±0,41* 2,9±0,17

Резко гиперхромные 2,2+0,14 б,9±1,18** 4,7±0,81 4,7±0,43

Умеренно гипохромные 2,6±0,37 3,5±0,29 4,7±0,20* 3,8±0,55

Резко гипохромные . 1,3±0,52 1,8±0,45 1,б±0,46 1,5±0,20

«Клетки-тени» - 1,4±0,16 0,1±0,05* 0,4+0,08*

V слой

Нормохромные 7,9±0,95 2,8±0,61** 4,9±0,73* 3,3±0,15*

Умеренно гиперхромные 2,8+0,26 1,6±0,44** 2,2±0,41 2,3±0,32

Резко гиперхромные 2,3±0,12 2,7±0,23 2,5±0,20 2,7±0,28

Умеренно Гипохромные 4,4±0,32 5,3±1,25 4,7±0,55 4,8±0,73

Резко* гипохромные 1,3±0,17 2,3±0,20** 1,8+0,06 2,2±0,32

«Клетки-тени» - 2,7±0,19** . 2,2±0,20 2,6±0,40

Мозжечок

Нормохромные 33,3±3,00 20л5±5(2** 29,712,30 24,1 ±2,40

Умеренно гиперхромные 23,4±1,20 4,1 ±0,53** 19,2±1,97* 20,5± 1,69*

Резко гиперхромные 24,8±4,29 37,8±8,31** 2б,8±2,19* 3б,0±3,18

Умеренно гипохромные 6,2±1,26 4,3±0,30 1б,б±1,72* 9,2+0,76*

Резко гипохромные 0,9±0,29 7,5±0,82** 2,5±0,19* 0,5±0,22*

«Клетки-тени» 4,8 ±0,91 25,8±3,23** ¡б,9±0,94* 8,1 ±0,81*

Примечание. Здесь и далее: * - значения достоверны по сравнению с данными у животных контрольной группы при Р<0,05;** - значения достоверны по сравнению с данными у животных интахтной группы при Р< 0,05.

Введение белым крысам «Ноофита» вызывает снижение количества резко гиперхромных нейронов в III слое на 68,1 % и резко гипохромных в V слое -на 21,7 %, а такЖе уменьшение количества «клеток-теней» в этих слоях коры мозга по сравненное с контролем (табл. 1). Введение пирацетама вызывает достоверное снижение количества резко гиперхромных клеток в III, но йе влияет на число резко гипохромных клеток в V слое коры головного мозга. На фоне введения этих средств происходит увеличение количества нормохромных, умеренно гипо- и гиперхромных клеток, активности СДГ в коре головного мозга, что свидетельствует о повышении функциональной активности йейро* нов (Орловская ДД„ 1986).

При морфометрическом исследований микропрепаратов коры мозжечка (табл,1) установлено, что при алкогольной интоксикации наибольшим изменениям подвергаются клетки Пуркинье (табл.1). Так, суммарное количество регрессивных форм клеток Пуркинье при введении этанола составляет 71,1 % от общего числа нейронов, что в 2 раза больше, чем у животных икгактной группы. Эти изменения в основном направлены в сторону увеличения количества гиперхромных, пикнотическЙх нейронов и «клеток-теней». Зернистый и молекулярный слои мозжечка при алкогольной интоксикации не подвергаются изменениям, ;

При незначительном повышении нормохромных клеток на фоне введения «Ноофита» и пирацетама {табл. 1) происходит существенное увеличение количества умеренно гипер- (на 78,6и 80,0 % соответственно) и гипохромных (на 74,1 и 53,2 % соответственно) клеток Пуркинье и снижение регрессивных клеточных форм по сравнению с контролем. Эти морфометрические данные позволяют судить о повышении функциональной активности клеток Пуркинье при введении «Ноофита» и пирацетама. ,'v' r ' v

Высказывается предположение, что в проявлений феномена предпочтения значительную роль играет гиппокамп как центральная структура лимби-ческой системы (А.Ф. Савоненко, 1997; M.D. De Bellis, 2000). Намк: ¡проведен морфометрический анализ клеток гиппокампа по степени окраски1 тфезилвио-летом. Нервные клетки гиппокампа у интактных животных являются светльь ми и однородными по форме, содержат большое округлое ядро и узкий ободок цитоплазмы. Согласно усредненным количественным данный. (Н И 1 /Артюхина, 2002), такие светлые клетки являются доминирующими, ß > лшпокампе и i составляют в среднем 95% от общего числа нейронов. Остальные 5% клеток в данных структурах составляют темные, гиперхромных клетки. Так, при введении этанола происходит повышение количества гиперхромных клеток на 72,8% по сравнению с данными в ингактной группе (рис. 1). j

При введении животным «Ноофита» на микропрепаратах гиппокампа были обнаружены отдельные гиперхромные клетки, которйе 'не образовывали очаговых скоплений, и их количество (рис.1) было снижено на 43,8 % по сравнению с таковым у животных контрольной группы.

Группы животных

■ Икгактная (днст. вода)

□ Контрольная (этанол + диет вода)

■ Опытам (этанол + Ноофот, 1,0 мл/100 г) _□ Опытная (этанол н- мрацетам, 200 мг/кг)_

' Рис. 14. Влияние «Ноофитали Пирацетама на количество гиперхромных клеток в гиппокампе при алкогольноЙ,интокеикации у белых крыс.

Исследование глиальных элементов (олигодендроглии и микрогдии) не выявило никаких значимых изменений, лищь отмечены появление дренажных олигодендроглмоцитрв и пролиферация их около погибших нейронов, что носит компенсаторный характер (Э.Н. Попова, 1984).

При доступном нам световом ^увеличении видимых изменений мнелино-вых волокон не öbino обнаружено, эти данные подтверждались гистохимической реакцией на жир по Бер^нбауму.

! - .

Морфофункииональные изменения головного мозга при барбамн-ловой интоксикации н их коррекция фитосбором «Ноофит»

Результаты < гистологических исследований позволили установить, что структурные изменения головного мозга при введении барбамила сходны с таковыми прй'; алкогольной интоксикации. Так, в коре мозга увеличивается количество гйперхромных клеток и клеток в состоянии набухания и хроматолиза, но в разных^соотношениях, в разных областях коры. Во II - III слоях коры мозга отмечается выраженное увеличение количества гйперхромных клеток, в среднем оно увеличивается в 4 раза по сравнению с таковым у интакт-ных животных (табл. 2). Тела таких клеток несколько уменьшены в размерах, выявляются истонченные базальные дендриты и более толстый апикальный дендрит.

! При гистохимическом исследовании этих структур было обнаружено понижение содержания РНК в цитоплазме клеток и активности СДГ. Преобладающие в коре мозга явления гилерхромного окрашивания нейронов, умень-

Л1

шение в них РНК и активности СДГ свидетельствуют о выраженном понижении функциональной активности клеток коры (Э.Н. Попова, 1984).

Таблица 2

Влияние «Ноофита» Ц пирацетама на количество разных типов нейронов в Ш, V слоях коры мозга и клеток Пуркинье в мозжечке у белых крыс при бар-

Тип клеток Группы животных

Интактная (Н,0) Контрольная (барбамил + Н30) Опытная (барбамил + «Но-офиг», 1,0 мл/100 г) Опытная (барбамил +пирацетш, 200 мг/кг)

III СЛОЙ

Нормохромные 7,б±0,75, ! 2,2±0,28** 3,5±0,33* 3,5±0,26*

Умеренно пшерхромные 4,7+0,31 ■ ;2,1±0,27** : 1,6±0,16 2,1+0,32

Резко гиперхромные 2,2±0,14 &,6±0,22** 3,9±0Д5* 4,4+0,72*

Умеренно гипохромные 2,6±0,37 2,5±0,57 5,1±0,26* 3,7±0,23

Резко гипохромные 1,3+0,52 2,4±0,73 2,5±0,26 2,6±0,58

«Клетки-тени» . - 1,4±0,26** 1,6±0,32 2,5±0,46*

У слой

Нормохромные 7,9±0,95 2,2±0,32** 3,6±0,4б* 3,9±0,58*

Умеренно гиперхромные 2,8+0,26 1,4+0,18** 2,2±0,29* , 2,4±0,41*

Резко гиперхромные 2,3±0,12 5,1 ±0,49** 4,3 ±0,44 3,8±0,38

Умеренно гипохромные 4,4±0,32 4,3±0,45 4,0±0,б4 - 4,0±0,35

Резко гипохромные - 1,3+0,17 3,б±0,58** 2,9±0,33 3,1±0,3б

«Клетки-тени» - 2,2±0,32** 1,6±0,32 1,8±0,39

Мозжечох

Нормохромные 38,3 ±3,00 9,5±0,76** 24,2±2,26* 22,0±2,34*

Умеренно гиперхромные 23,4±1,20 7,610,91** 17,3±1Д7* 16,5±1,50*

Резко гиперхромные 24,8±4,29 39,5+2,38** 29^±2,55* 30,3 ±2,89

Умеренно гипохромные б,2±1,26 ! ,8,1 ±0,72 4,1*0,51* б,4±0,50

Резко гипохромные 0,9±0,29 Ю,2±1,01** 6,3 ±0,43* 7,1±0,78*

«Клетки-тени» 4,8±0,91 24,4±2,01** 19ДЫ.58* 17,9±2,55*

Наиболее выраженные изменения наблюдаются в V слое (табл.3), они выражаются в значительном снижении числа нормохромных (на 72,2%), умеренно гиперхромных клеток (на 50 %) и увеличении числа резко гипо-(63,0 %), гиперхромных (на 54,9 %) клеток и «клеток-теней» (в 2,2 раза) по сравнению с

интактным контролем. Исчезновение тифоидного вещества сопровождается развитием набухания различной степени. Большинство из этих клеток подвержены гидропическим изменениям, содержат вакуоли средних и гигантских размеров.

В отличие от алкогольной при барбамиловой интоксикации в V слое на фоне резкого увеличения количества гипохромных клеток увеличивается количество резко гиперхромных клеток, которые образуют скопления. При этом отдельные клетки сморщиваются, их апикальные дендриты, штопорообразно извиваясь, прослеживаются на длительном расстоянии. Все вместе образуют мозаичную картину с явлениями выпадения нейронов, нейронофагии и сател-литоза.

При введении «Ноофита» и пирацетама (табл.2) наблюдается более сглаженная гистологическая картина. Увеличивается количество нормохромных, умеренно гипо- и гиперхромных клеток, повышается активность фермента СДГ во всех слоях коры, уменьшается количество гиперхромных сморщенных нейронов в III и V слоях коры. Гиперхромные нейроны встречаются в поле зрения единично, не образуя скоплений. Гипохромия представлена в основном периферическим хроматолизом, часть клеток содержит мелкие и среднего размера вакуоли. «Клетки-тени» и нейронофагия обнаруживаются местами.

Как известно, кора мозжечка очень чувствительна к действию психоактивных веществ (В.И. Сергиенко, 1993; K G. Ва Кег, 1999; J.J. Walker, 1997; J.D. Thomas, 1998). Так, в наших исследованиях введение барбамнла вызывает токсикогипоксические изменения в клетках Пуркинье, сходные с изменениями при алкогольной интоксикации. При этом введение барбамила по сравнению с этанолом вызывает более значимые изменения: увеличивается количество «клеток-теней», резко гипохромных клеток с наличием в цитоплазме вакуолей средних и гигантских размеров.

Введение «Ноофита» (табл. 2) вызывает повышение количества нормохромных клеток на 60,7 %, умеренно гиперхромных - на 56,1 %, снижение числа резко гипер- и гипохромных клеток на 25,3 и 37, 6 % соответственно, «клеток-теней» - на 22,1 % по сравнению с таковыми у животных интактной группы.

Изменения в гиппокампе при барбамиловой интоксикации соответствовали таковым при введении этанола. Под действием барбамила (рис. 2) происходит увеличение количества гиперхромных пикнотических клеток на 74,9 % по сравнению с таковым у животных интактной группы. По сравнению с контролем введение «Ноофита» и пирацетама вызывает снижение числа таких клеток на 34,5 и 36,6 % соответственно.

30

Количество 20 гиперхромных клеток (%) 10

' ' 0

Группы животных

■ Интастная (диет, вода) □Контрольная (барбамил + диет вода)

■ Опытная'(ёарбамкд + "Неофит", 1,0 млЛОО г) _; ЕЮггытнаб(барбаммд+пирацетам, 200 мг\кг)

Рнс.2. Влияние «Ноофита» и пирацетама на количество гиперхромных клеток в гиппокамае при б^рбамиловой интоксикации у белыхкрмс.

Механизмы действия «Ноофита»

По классификации К.К. Сидорова (1973) исследуемое нами'растительное средство «Ноофит» можно отнести к группе относительно безвредных лекарственных средств.

По мнению некоторых авторов (Гипоксия, 2000; Н.В. Гуляева, 1994; И.А. Завалишин, 1996), ключевом звеном в гибели нейронов является активация перекисного окисления липид(№. Так, в наших исследованиях введение этанола и барбамила вызывает повышение содержания МДА (на 67,1 и 70,8 % соответственно) и снижение активности аншоксидантного фермента - катал азы (на 70,8 и 61,5 % соответственно) в гомогенатах головного мозга по сравнению с данными в интактной группе. Наши данные позволяют предположить, что улучшение гистологической картины головного мозга крыс, получавших исследуемое средство, вероятно, обусловлено мембранозащитным и ангиокси-дантным действиями «Ноофита». Так, введение «Ноофита» на фоне алкогольной н барбамнловой интоксикации вызывает снижение МДА (на 46,6 и 50 % соогтветственно) и повышение активности каталазы (на 37,7 и 47,7 % соответственно) в гомогенатах головного мозга по сравнению с контролем.

Установлено, что «Ноофит» оказывает тормозяшее влияние на гемолиз эритроцитов, вызванный реактивом Фентона. Так, введение отвара в инкубационную среду снижает гемолиз эритроцитов на 66,8 %, а в разведениях 1:5, 1:10, 1:50 и 1:100 - на 52,6; 51,3; 44,4 и 42,7 % соответственно по отношению к контролю. Данные, полученные при исследовании «Ноофита» на осмотический гемолиз, свидетельствуют о том, что максимальный мембраностабилизи-рующий эффект достигается при введении отвара и составляет 70% относительно контроля.

Наличие антиоксидантной и мембраностабилширующей активностей у исследуемого фитосбора связано с наличием в нем.растений, содержащих, главным образом, фенольные соединение (В;А»Хазанов, 1999). Известно, что растительные полифенолы. являются ловушкэми свободных радикалов, защищают организм от оксидантного : стресса^ блокируют процессы ПОЛ, меняют структурные характеристики биологических ^мбран (N.C. Cook, 1996; L. .Packer, 1999). К природным анти0ксидэкгам:0ти9сят также витамины Е, (L, Packer, 1999), A (D.V. Crabtree, 1997; Н. Tsuchihashi, 1995), K(N.C. Cook, 1996; L. Packer, 1999), содержащиеся в большом, количестве в крапиве двудомной, горце птичьем, левзее сафяоровидноНг, тысячелистнике обыкновенном (Н.В. Казаринова, 1991; В.В.Тедятьев^1991),■ - . ü

При изучении ноотропных свойств: фитосбора, было выявлено, что курсовое введение ' его интактным животным вызывает снижение пассивно-( оборонительной реакции как в тесте открытое поле, так и в Т-образном лабиринте, и, как следствие, повышает поисково—исследовательскую активность и скорость выработки рефлекса с .положительным,,пищевым подкреплением; ; стимулирует когнитивные функции у крыс, что выражается в ускорении выработки условных рефлексов и сохранности памятного ¡следа в отдаленные после обучения сроки в тестах УРЗД и УРПИ. Наиболее выраженный эффект, сопоставимый с эффектом пирацетама,. наблюдается при введении «Ноофита» в объемах 0,5 и 1,0 мл/1 ООг массы животного.

В экспериментах на животных установлена способность ноотропов ослаблять нарушения процессов обучения и памяти, вызванные приемйМ. этано-гла, наркотических анальгетиков, терапией, транквилизаторами, нейролептиками и других депрессантами ЦНС (А.Г. Гофман А.Г., 1999; Г.В. Ковалев, 1999; ! Н.Г. Чобанов, 1994), Способность влиять на условно-рефлекторную деятельность крыс, нарушенную алкогольной интоксикацией, характерна и для растительных средств с ноотропным типом действия (Е.Д. Гольдберг Е.Д., 1994; Г.Х Дамдинова, 2000).

Результаты исследований показали, что введение этанола в течение 45 дней не влияет на выработку условного рефлекса у белых крыс, однако, приводит к стойким нарушениям инестических функций. Эти данные согласуются с результатами исследований других авторов (Ю.В. Буров, 1985; П.Д. Шабанов, 1998), показавших; что этанол нарушает выработку условного рефлекса только после 4 месяцев введения. Однако, даже однократное введение этанола, по мнению этих же ¡авторов, приводит; к нарушениям процессов памяти, что согласуется с результатами наших исследований. Введение барбамнпа в дозе ■25 мг/кг вызывает стойкие нарушения процессов обучения и памяти в тесте ;УРПИ. Так, у животных, получавших барбамил, латентный период захода в наемный отсек снижается по сравнению с; интактным контролем во все сроки исследований на 13,2; 57,8; 59,3 %. -

Установлено, что «Ноофит» в объеме 1,0 мл/100 г обладает акгиамнести-

ческим эффектом на фоне алкогольной и барбам иловой интоксикации. Так, латентный период у животных, получавших «Ноофит», значительно превышает таковой у животных контрольных групп во все сроки исследований.

Также установлено, что «Ноофит» в исследуемых объемах улучшает процессы обучения и памяти на фоке амнезии, вызванной максимальным электросудорожным шоком и гипоксией. При этом антиамнестическое действие исследуемого средства наиболее выражено при введении его животным в объеме 1,0 мл/100гмассы.

Высокой антиамнестической активностью ноотропы обладают в условиях амнезии, вызванной гипоксией (Т.А. Вороника, 2001; В.А. Xазанов, 2000; Г.С.БогтеЫ, 1999). Наши исследования показали, что «Ноофит» в условиях нормобарической гипоксии с гнперкапнией обладает антиамнестическим эффектом, повышая когнитивные функции у крыс, что проявляется в выработке условного рефлекса и сохранности памятного следа на протяжении всех сроков эксперимента по сравнению с контролем.

Известно, что ноотропные препараты обладают довольно высокой активностью в условиях различного вида гипоксий (Т.А. Воронина, 2001; А.Д. Лукьянова, 2001). Противогипоксические эффекты, присущие химическим соединениям, в полной мере выявляются и у флавоноидсодержащих растительных препаратов (И.Л. Зелинская, 2000; Л.Д. Лукьянова, 2000; В.А. Хаза-нов, 1999).

Результаты наших исследований показали, что «Ноофит» оказывает анти-гипоксическое действие при нормобарической гипоксии с гнперкапнией, острых гипобарической, гемической и гастотоксической гипоксиях, увеличивая среднюю продолжительность жизни животных. Наиболее выраженный эффект наблюдается при курсовом введении животным «Ноофита» в объеме 1,0 мл/100 г.

На моделях камфорных и стрихниновых судорог установлено, что «Ноофит» обладает противосудорожной активностью. Он удлиняет латентный период и укорачивает время судорог. Данный эффект обусловлен тем, что в состав компонентов сбора входят растения, биологически активные вещества которых обладают противосудорожным действием: флавоноиды байкалин и скутеллярин, входящие в состав шлемника байкальского, эфирное масло валерианы лекарственной (Г.В. Крылов, 1992; В.В, Телятьев, 1991; А.Д. Турова, 1984).

Установлено, что введение «(Ноофита» достоверно снижает величину спазма, вызванного харбохалином, уменьшает реакцию гладкой мускулатуры на адреналин. В основе спазмолитического действия «Ноофита» лежит способность биологически активных веществ, содержащихся в данном сборе (эфирные масла, флавоноиды, алкалоиды, дубильные вещества, органические кислоты и др.), ослаблять спазмы гладкомышечных органов (Г.В. Крылов, 1992; В.В. Телятьев, 1991; А Д. Турова, 1984).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом; полученные данные свидетельствуют о том, что введение этанола и барбамила вызывает нарушения морфофункционального состояния центральной нервной системы, что выражается в изменении структур головного мозга Животных, активации ПОЛ и нарушении высших интегративиых функций мозга. Введение барбамила вызывает брлее значимые структурные изменения во всех исследуемых отделах головного мозга по сравнению с таковыми при введении этанола.

^Исследование фармакотерапевтической эффективности нового растительного средства «Ноофит» показало, что его курсовое введение на фоне алкогольной н барбамиловой интоксикаций оказывает выраженное нейроирогек-торное действие, которое характеризуется нормализацией морфофункционального состояния головного мозга. Так, на фоне введения «Ноофита» снижается количество регрессивных нейронов (резко гкпо- и гиперхромных, «клеток-теней»), увеличиваются количество функционально активных нейронов (умеренно гипо- и гиперхромных) и активность мшохондриальиого фермента - СДГ.

Установлено, что «Ноофит» обладает ноотровдым типом действия. Так, курсовое введение «Ноофита» улучшает организацию исследовательских движений, активирует выработку условных рефлексов с положительным и отрицательным подкреплением, замедляет угашение памятного следа при краткосрочном и долгосрочном запоминании. Исследуемое средство устраняет амне-зируюшее влияние этанола, барбамила, электрошока и гипоксия.

Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что реализации ней-ропротекторного действия «Ноофита» способствует антигипоксическая, про-тивосудорожная, спазмолитическая активность изучаемого средства, обусловленная широким спектром биологически активных веществ, содержащихся в указанном средстве: флавоноидов, алкалоидов, эфирных масел, комплекса витаминов, органических кислот, макро- и микроэлементов, полисахаридов и других веществ (Г.В. Крылову 1992; В.В. Телятьев, Í991; А.Д. Турова., 1984).

Установлено, что одним из базисных механизмов нейропротекторного действия «Ноофита» является его мембраностабилизирующая и ангиокси-дантная активность, обусловленная, главным образом, комплексом фенольных соединений (В. А. Хазанов, 1999).

вывода

1. Введение этанола и барбамила вызывает значительные структурные изменения преимущественно в коре головного мозга, коре мозжечка и гиппо-кампе и связанные с ними нарушения процессов обучения и памяти у лабораторных животных.

2. Основными механизмами повреждающего действия этанола и барбамила являются активация свободнорадикального окисления лигоздов и сниже-

ние активности системы антиохсидкнтной защиты.

Применение «Ноофита» вызывает* нормализацию морфофункционального состояния головного мозга у животных на фоне алкогольной и барбамиловой интоксикаций. ..........| -

«Ноофит» улучшает процессы обучения и памяти у- интактных животных и у крыс, подвергнутых влиянию различных факторов, вызывающих амнезию: этанол^ барбамила, гапоксйи, электросудорожного шока. Механизмами нейропротекторного действия «Ноофита» являются его антиоксидантное, мембрйос'тйбилизирующее, ангнгипоксическое, проти-восудорожное и с пазмблитичес кое действия.

Практические рекомендации

1. Результаты проведенных' иссле^Вва^йй «НбЬфита»1 позволяют рекомендовать его для исследований в нархолбгачеёяАй' кл Шкс.

2. Данные, изложенные в настоящей работе, мог^т быть использованы в учебном процессе в к>'рсе лекций по морфологии и фармакология.

Список опубликованных работ' ■

1. Разуваева Я.Г., Убашеев И.О., Прокопьев В.Н. Противовоспалительная активность многокомпонентного растительного средства!// БйоЛогиче-ски активные добавки и перспективы их применения в ЗАравоЬХранении. - Улан-Удэ, 2601. - С.63-64.

2. Разуваева Противосудорожное действие многокомпонентного рас-тогельногч средства//Тез. докл. Южно-Сибирской международной кон* ференцчи ^^ещов и молодых ученых.-Абакан, 2001. С.155.

3. Разуваещ^&Г^, Убашеев И.О., Прокопьев В.Н. Влияние многокомпо-/ нентного. расрггельного сбора на поведенческие показатели крыс в тесте «открыто^ прлр> у крыс II Мат. межд. научно-Практ. конф. «Устойчивое развитие сельского хозяйства в бассейне оз. Байкал». - Улан-Удэ, 2002. -С. 126-123; : ,

4. Разуваева ^.Г!,,^Убашеев И.О., Прокопьев В.Н, Использование многокомпонентного растительного средства в качестве мембраностабилизи-рующей биоактивной добавки // Тез. докл. Всероссийской науч. конференции «Актуальные проблемы адекватного питания в эндемичных регионах». - Улан-Удэ,. 2002. - С. 47-48.

5. Разуваева Я.Г., Уёашеев И.О., Леднева И,П., ЕТобаева И.Г., Прокопьев В.Н. Изучение влияния многокомпонентного растительного средства на холинергическую и адренергическую реакции гладкой мускулатуры // Тез. докл. IX, Российского национального конгресса «Человек и лекарство». - Москва, 2002. - С. 684. '

6. Разуваева Я.Г., Убашеев И.О., Прокопьев В.Н., Багинова Е.П. Влияние многокомпонентного растительного средства на течение экспериментальной гипоксической гипоксии // Мат. науч.-практ. конф,, посвященной 70-летию службы контроля качества лекарственных средств в Бурятии. - Улан-Удэ, 2003. - С. 98-99.

7. Разуваева Я.Г., Убащеев И.О., Прокопьев В.Н, Влияние многокомпонентного растительного средства на течение гемичесхой гипоксии у белых крыс // Тез. докл. X. Российского национального конгресса «Человек н лекарство». - Москва, 2003.- С. 651-652.

8. Разуваева Я.Г., Убашеев И.О., Прокопьев В.Н. Влияние многокомпонентного растительного средства на функциональное состояние нервной системы / // Практическая фитотерапия. - Москва, 2002. - № 4. - С. 4-9.

9. Убашеев И.О., Разуваева Я.Г., Прокопьев В.Н. Влияние фитосбора «Но-офит» на течение экспериментальной гипобарической гипоксии И Мат. международ. Науч. конф. «Возрастная физиология и патология сельскохозяйственных животных», посвященной 90-летию В.Р. Филиппова. -Улан-Удэ, 2003. - С. 83-84.

10. Разуваева Я.Г., Убашеев И.О., Прокопьев В Н., Бартанов А.И. Влияние фитосбора «Ноофнт» на экспериментальные нарушения когнитивных функций, вызванные электросудорожным шоком // Мат научно-практ. конференции «Биологически активные добавки в профилактической и клинической медицине». - Улан-Уда, 2003. - С. 65-66.

Подписано в печать 03.11.2003 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Объем 1,2 печ. л. Тираж 100. Заказ № 150.

Отпечатано в типографии Изд-ва ЕНЦ СО РАН, 670047 г. Улан-Удэ, ул. Сахьяноаой, 6.

$18514