Автореферат и диссертация по медицине (14.03.03) на тему:Нарушения энергетического метаболизма митохондрий при интоксикации этанолом и их коррекция гепатопротекторами

На правах рукописи

004615932

Петрова Зоя Викторовна

НАРУШЕНИЯ ЭНЕРГЕТИЧЕСКОГО МЕТАБОЛИЗМА МИТОХОНДРИЙ ПРИ ИНТОКСИКАЦИИ ЭТАНОЛОМ И ИХ КОРРЕКЦИЯ ГЕПАТОПРОТЕКТОРАМИ

14.03.03 - патологическая физиология 14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

- 2 ЛЕН 2010

Томск-2010

004615982

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте фармакологии Сибирского отделения РАМН

Научные руководителя:

доктор медицинских наук

кандидат медицинских наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Удут

Елена Владимировна

Гурто Роман Владимирович

Уразова Ольга Ивановна

доктор медицинских наук

Чернышева Галина Анатольевна

Ведущее учреждение: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт физиологии Сибирского отделения РАМН

Защита диссертации состоится « » Гког:- 2010 года в часов

на заседании диссертационного совета Д 001.031.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук НИИ фармакологии СО РАМН по адресу: 634028, г. Томск, пр. Ленина, 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте фармакологии СО РАМН

Автореферат разослан «

» //¿З^у^-^— 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Амосова Е.Н.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АлАТ - аланинаминотрансфераза АсАТ - аспартатаминотрансфераза АДФ - аденозиндифосфорная кислота АТФ - аденозинтрифосфорная кислота у-ГТП - у-глутамилтранспептидаза МДА - малоновый диальдегид НАД - никотинамидадениндинуклеотид ПОЛ - перекисное окисление липидов СДГ - сукцинатдегидрогеназа ФАД - флавинадениндинуклеотид ЭФЛ - эссенциальные фосфолипиды

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. По данным Российской ассоциации общественного здоровья уровень потребления алкоголя в России является одним из самых высоких в мире. В настоящее время в России насчитывается около 10 млн больных хроническим алкоголизмом [Заиграев Г.Г., 2002; Кошкина Е.А. и соавт., 2004; Таплина B.C., 2005; Bobak М. et al., 2004].

Острые отравления этиловым спиртом занимают ведущее место среди бытовых отравлений и являются причиной более 60% всех смертельных случаев от различных интоксикаций [Литвинов H.H. и соавт., 1997; Немцов A.B. и соавт., 2003; Zaridze D. et al., 2009]. При этом большая часть острых отравлений этанолом с летальным исходом приходятся на лиц, страдающих алкогольной зависимостью [Разводовский Ю.Е., 2004; Ливанов Г.А. и соавт., 2005; Верткин А.Л. и соавт., 200В].

Хроническое употребление этилового спирта является причиной поражения всех органов и систем организма, особенно подвержены его влиянию печень и нервная система [Пауков B.C., 2007]. Многообразные нарушения, развивающиеся в результате алкогольной интоксикации и затрагивающие практически все виды обмена веществ, определяются как прямыми мембранотропными, так и метаболическими эффектами, обусловленными процессами окисления этанола [Буко В.У. и соавт., 2005; Lieber C.S., 2000]. К наиболее важным повреждающим эффектам, формирующимся на этапах катаболизма этилового спирта, относятся: увеличение внутриклеточного содержания НАДН и ацетил-КоА [Lieber C.S., 1994], образование и воздействие токсического метаболита ацетальдегида [Crabb D.W., 1999; Signorini-AHibe N. et al., 2005], интенсификация процессов свободнорадикального окисления липидов биомембран [Aleynik S.I. et al., 1998; Sanchez Perez M.J. et al., 2006]. Смещение соотношения пиридиннуклеотидов в сторону восстановленных форм подавляет аэробное дыхание и синтез макроэргов, ориентирует метаболизм на анаэробные пути с развитием метаболического ацидоза [Hojer J., 1996; Carini R. et al., 2000; Young T.A. et al., 2006]. Этими изменениями в настоящее время объясняется ухудшение процессов энергообеспечения организма. Однако точный механизм действия этанола на энергетический статус митохондриального уровня остается невыясненным [Hoek J.B. et al., 2002]. Практически отсутствуют данные о влиянии этанола на состояние системы энергопродукции митохондрий головного мозга.

Представляет интерес изучить влияние уже зарекомендовавших себя в клинической практике гепатопротекторов (эссенциальных фосфолипидов и адеметионина) на энергетический статус митохондрий на моделях интоксикации этанолом.

Цель работы. Изучение механизмов нарушения функционального состояния митохондрий тканей печени и головного мозга крыс при острой и

длительной интоксикации этанолом с оценкой эффективности их коррекции гепатопротекторами различной природы.

Задачи исследования.

1. Разработать модели острой и длительной интоксикации этанолом.

2. Изучить функциональное состояние митохондрий, процессы липопероксидации в тканях печени и головного мозга крыс, а также активность аминотрансфераз и у-глутамилтранспептидазы в крови на разработанных моделях интоксикации этанолом.

3. Оценить влияние эссенциальных фосфолипидов на функциональное состояние митохондрий, перекисное окисление липидов в тканях печени и головного мозга крыс и активность аминотрансфераз и у-глутамилтранспептидазы в крови при острой и длительной интоксикации этанолом.

4. Исследовать влияние адеметионина на функциональное состояние митохондрий, перекисное окисление липидов в тканях печени и головного мозга крыс и активность аминотрансфераз и у-глутамилтранспептидазы в крови при острой и длительной интоксикации этанолом.

5. Сравнить позитивные эффекты действия изучаемых препаратов на моделях острой и длительной интоксикации этанолом.

Научная новизна. Впервые исследована специфика нарушений энергетического метаболизма митохондрий тканей печени и головного мозга крыс на разработанных моделях острой и длительной интоксикации этанолом. Показано, что этанол, при остром и длительном введении, ингибирует дыхательную цепь митохондрий печени, в большей степени подавляя активность сукцинатдегидрогеназы. В системе митохондриальной энергопродукции тканей печени при острой интоксикации этанолом выявлено истощение компенсаторных механизмов с выраженным нарушением метаболического контроля дыхания митохондрий и разобщением окислительного фосфорилирования. На модели длительной интоксикации этанолом сопряженность процессов окисления и фосфорилирования сохраняется на высоком уровне. В митохондриях тканей головного мозга независимо от модели интоксикации определена активация процессов энергообеспечения по быстрому метаболическому пути с развитием компенсированного низкоэнергетического сдвига и падением сопряженности окислительного фосфорилирования.

Впервые изучено влияние гепатопротекторов различной природы (эссенциальных фосфолипидов и адеметионина) на функциональное состояние митохондрий печени и головного мозга крыс на моделях острой и длительной интоксикации этанолом. Обеспечивая поддержание структурно-функциональной целостности биологических мембран, эссенциальные фосфолипиды восстанавливают дыхательную активность митохондрий печени и головного мозга в большей степени на модели острой интоксикации этанолом. Адеметионин нормализует процессы митохондриального окисления

в печени и головном мозге крыс преимущественно на модели длительной интоксикации этанолом.

Научно-практическая значимость работы. Полученные данные расширяют существующие представления о механизмах нарушения функциональной активности митохондрий печени и головного мозга при острой и длительной интоксикации этанолом. Экспериментально обоснована целесообразность применения эссенциальных фосфолипидов при острых этаноловых отравлениях, адеметионина - при хронических алкогольных интоксикациях.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Острая интоксикация этанолом сопровождается угнетением активности сукцинатдегидрогеназы митохондрий печени, разобщением окислительного фосфорилирования и активацией перекисного окисления липидов. В головном мозге усиливаются процессы липопероксидации, активируется быстрый метаболический кластер митохондрий, развивается низкоэнергетический сдвиг с разобщением дыхания и фосфорилирования.

2. Длительная интоксикация этанолом, угнетая сукцинатокидазное окисление и подавляя активность НАД-зависимого дыхания митохондрий печени не влияет на сопряженность окислительного фосфорилирования и в меньшей степени изменяет интенсивность образования продуктов перекисного окисления липидов. Выраженность и направленность изменений функциональной активности митохондрий и процессов липопероксидации в головном мозге при длительной интоксикации аналогична таковой при острой.

3. Гепатопротекторы различной природы в равной степени снижают активность процессов перекисного окисления липидов, позитивно сказываясь на митохондриальной биоэнергетике печени и головного мозга: эссенциальные фосфолипиды - на модели острой интоксикации этанолом, адеметионин - на модели длительной интоксикации.

Апробация и публикации. Основные положения диссертационной работы доложены на X конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2009), 64-й Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием (Екатеринбург, 2009), XI конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2010), научной конференции НИИ фармакологии СО РАМН «Фармакологическая регуляция энергетического обмена» (Томск, 2010). Материалы диссертации опубликованы в 6 научных статьях и материалах конференций, в том числе 1 статья опубликована в журнале, рекомендованном ВАК РФ для публикации результатов кандидатских диссертаций.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов экспериментальных исследований, их обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 159 страницах, иллюстрирована 9 таблицами и

26 рисунками. Библиографический указатель включает 262 источника, из них 163 - зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили в осенне-зимний период на 190 белых беспородных крысах-самцах с начальной массой 200-220 г. Животные находились в стандартных условиях вивария при естественном освещении, свободном доступе к воде и пище. Все манипуляции (взвешивание, введение препаратов, декапитация) осуществляли с 9 до 12 часов с целью исключения суточных влияний на метаболизм. Исследования выполняли в соответствии с рекомендациями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических средств» (2005).

Для моделирования острой интоксикации животным вводили 40% этанол в дозе 7 мл/кг внутрижелудочно 2 раза в сутки в течение 7 дней.

Для моделирования длительной интоксикации крысам вводили 40% этанол в дозе 5,2 мл/кг внутрижелудочно однократно в течение 5 недель. Для ускорения процессов формирования алкогольного поражения лабораторным животным предоставлялся доступ к сосудам с растворами этанола в возрастающей концентрации (3-17%). В поилки добавляли 0,02% ментол для коррекции неприятного вкуса этанола [Хабриев Р.У., 2005].

Исследуемые препараты вводили крысам в течение двух недель в эффективных терапевтических дозах. Эссенциале (раствор в ампулах, «Nattermann», Германия) применяли внутрижелудочно в дозе 80 мг/кг в виде суспензии на 1% крахмальной слизи [Саратиков А.С. и соавт., 2004]. Контрольным животным (контрольная группа № 1) по той же схеме в эквивалентном объеме вводили 1% крахмальный раствор. Гептрал (лиофилизат для приготовления раствора для внутривенного и внутримышечного введения, «Hospira», Италия) вводили внутримышечно в дозе 15 мг/кг в растворе L-лизина [Stramentinoli G. et al., 1979; Bailey S.M. et al., 2006]. Контрольной группе № 2 - внутримышечно раствор L-лизина в эквивалентном объеме. Поскольку статистически значимых различий по изучаемым показателям меааду контрольными группами 1 и 2 зарегистрировано не было, эти данные были объединены в одну группу - общий усредненный контроль.

Терапию гепатопротекторами начинали после завершения интоксикации этанолом с 8-х суток и 6-й недели соответственно.

Эссенциале - гепатопротектор, содержащий эссенциальные фосфолипиды, основным действующим веществом является фосфатидилхолин. Эссенциале содержит до 93% фосфатидилхолина с высоким содержанием полиеновых жирных кислот (линолевой, линоленовой, олеиновой).

Гептрал - гепатопротектор с антидепрессивной активностью, активным компонентом которого является адеметионин 1,4-бутандисульфонат.

Через сутки после последнего введения лекарственных препаратов крыс декапитировали под эфирным наркозом. Для исследований использовали сыворотку крови, гомогенаты печени и головного мозга.

Функциональное состояние митохондрий гомогенатов печени и головного мозга крыс оценивали полярографическим методом (полярограф «Эксперт-001», Россия) по скорости потребления кислорода митохондриями в различных метаболических состояниях по В. Chance [Chance В. et al., 1961].

Моделирование метаболических состояний митохондрий сводится к варьированию содержания в среде инкубации субстрата, акцептора фосфата и кислорода. Нас интересовали преимущественно два метаболических состояния - четвертое и третье. Их принято считать, соответственно, состояниями метаболического покоя и активности. Основываясь на разработанной М.Н. Кондрашовой концепции о градациях метаболических состояний [Кондрашова М.Н., 1972], мы рассматривали отдельно состояние 4 до внесения АДФ и после окончания ее фосфорилирования: соответственно состояние 4 покоя (4П) и состояние 4 отдыха (40).

Измерение скорости потребления кислорода митохондриями проводили в термостатируемой (t=26°C) ячейке оригинальной конструкции объемом 1 мл. В качестве субстратов окисления использовали МО'3 M и 5-Ю"3 M сукцинат, 5-Ю"3 M сукцинат с активатором сукцинатдегидрогеназы (СДГ) изоцитратом

I,5-10~3 M, а также глутамат и малат в концентрации по З-Ю"3 M каждый. С целью разделения вклада сукцината и НАД-зависимых субстратов в уровень дыхания органелл использовали ингибитор активного центра СДГ - малонат (2 -10'3 М). В условиях утилизации митохондриями малата и глутамата применение малоната позволяет избирательно выявлять «чистое» НАД-зависимое дыхание. Вклад реакций переаминирования в дыхательную активность митохондрий при окислении НАД-зависимых субстратов оценивали с помощью ингибитора аминотрансфераз - аминооксиацетата (2-Ю-3 М). В качестве функциональной нагрузки использовали АДФ в концентрации

II,7-10"3 М.

Регистрировали скорость дыхания митохондрий до (V4n), во время (V3) и после (V40) цикла фосфорилирования добавленной АДФ. Во всех измерениях абсолютные значения скоростей потребления кислорода митохондриями представлены в нанограммах атомарного кислорода в минуту в пересчете на 1 мг белка (нг ат. [0]/мин-мг белка). Для оценки энергетического статуса рассчитывали коэффициенты стимуляции дыхания (Cfl=V/V4n), дыхательного контроля (ДК=Уз/У4о) и сопряженности окислительного фосфорилирования (АДФ/О) [Кондрашова М.Н., 1972; Chance В. et al., 1955].

Активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспартатамино-трансферазы (АсАТ) в сыворотке крови измеряли динитрофенилгидразиновым методом, у-глутамилтранспептидазы (у-ГТП) - L-7-глутамилнитроанилиновым методом [Камышников B.C., 2000].

Активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) в гомогенатах печени и головного мозга исследовали по скорости образования спонтанного и аскорбатзависимого малонового диальдегида (МДА), содержанию диеновых конъюгатов и оснований Шиффа [Владимиров Ю.А. и соавт., 1972].

Результаты обрабатывали непараметрическим методом парных сравнений по критерию Манна-Уитни. Различия считали достоверными при уровне статистической значимости р<0,05 [Хафизьянова Р.Х. и соавт., 2006].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Развитие выраженных метаболических нарушений в гепатоцитах и других клетках организма при интоксикации этанолом обусловлено дезорганизацией липидов клеточных мембран, нарушением окислительно-восстановительного потенциала клеток, накоплением свободных перекисных радикалов, гипоксией и угнетением тканевого дыхания [Ильченко Л.Ю. и соавт., 2002; Буко В.У. и соавт., 2005; Bondy S.C. et al„ 1994; Carini R. et al., 2000; Lieber C.S., 2000; Young T.A. et al., 2006].

Повреждение мембран, индуцированное этанолом и продуктами его метаболизма, как и продуктами ПОЛ, приводит к солюбилизации ферментов цитоплазматических, микросомальных, лизосомальных, митохондриальных и других мембран и их повреждению. Последнее сопряжено с нарушением обмена веществ и энергии, нарушением структуры и функции клеток. В норме ферменты, находящиеся внутри клеток, в плазме крови не выполняют физиологической роли, а служат свидетелями определенной интенсивности цитолиза в тех или иных органах [Зайчик А.Ш. и соавт., 2007; Горюшкин И.И., 2008].

Острая интоксикация этанолом сопровождалась увеличением активности ферментов сыворотки крови: АлАТ - в 1,5; АсАТ - в 1,8; у-ГТП в 2,2 раза соответственно по сравнению с показателями контрольных животных (табл. 1).

Длительный прием этанола приводил к значительному повышению относительно нормальных значений активности у-ГТП (в 4,1 раза), а также АлАТ и АсАТ - в 1,3 и 1,6 раза соответственно (табл. 1).

Обладая выраженным прооксидантным действием, этанол инициировал процессы липопероксидации в печени и головном мозге. При острой этаноловой интоксикации содержание спонтанного МДА в гомогенате печени увеличивалось в 5,4 раза, образование аскорбатзависимого МДА ускорялось в 2,8 раза относительно нормального уровня вторичных продуктов ПОЛ. Количество диеновых конъюгатов становилось больше в 2,1 раза, оснований Шиффа - в 2,5 раза (табл. 1).

Активность ПОЛ при длительной интоксикации этанолом повышалась в меньшей степени, чем при острой. Концентрация спонтанного МДА в гомогенате печени возрастала в 4,7 раза. Содержание аскорбатзависимого МДА, диеновых конъюгатов и оснований Шиффа увеличивалось в 1,3 раза относительно значений у контрольных животных (табл. 1).

Таблица 1

Влияние эесенциальных фосфолипидов и адеметионина на биохимические показатели сыворотки крови и перекисное окисление липидов в печени и головном мозге крыс при острой и длительной интоксикации этанолом (М ± ш, п = 10)

Исследуемые параметры Контроль Острая интоксикация этанолом Длительная интоксикация этанолом Эссенциальные фосфолипиды Адеметионин

Острая интоксикация Длительная интоксикация Острая интоксикация Длительная интоксикация

Сыворотка крови

АлАТ, мккат/л 0,062 ± 0,004 0,093 ± 0,008' 0,082 ± 0,003' 0,065 + 0,003'! 0,064 ± 0,003"' 0,074 ± 0,003й 0,063 ±0,0043

АсАТ, мккат/л 0,061 ±0,005 0,112 + 0,010' 0,098 ± 0,004' 0,070 ± 0,004^ 0,080 + 0,003 м 0,081 +0,005''2 0,062 ±0,0013

7 -ГТП, мккат/л 0,25 ± 0,02 0,55 ± 0,05' 1,03 ±0,04' 0,29 ± 0,012 0,76 ±0,0313 0,35±0,02'-2 0,27 ± 0,033

Гомогенат печени

МДА спонтаный, нмоль/мг белка 0,60 ± 0,02 3,26 ± 0,04' 2,81 ±0,03' 0,68 ± 0,022 2,31+0, Об13 2,51 + 0,06й 0,66 ± 0,043

МДА аскорбатзависимый, нмоль/мг белка-мин 3,80 ±0,08 10,64 ± 1,32' 5,12 ±0,11' 4,11 + 0,122 4,71 ± 0,09й 5,17 + 0,14й 3,95 + 0,133

Диеновые конъюгаты, нмоль/мг липидов 1,02 ±0,03 2,14 + 0,12' 1,30 ±0,08' 1,15 ±0,052 1,41 ±0,07' 1,62 + 0,081-2 1,07 ± 0,043

Основания Шиффа, нмоль/мг липидов 1,18 ±0,05 2,97 ±0,13' 1,50 ±0,07' 1,35 ± 0,042 1,62 ±0,10' 2,03 ±0,12'2 1,24 + 0, Об3

Гомогенат головного мозга

МДА спонтаный, нмоль/мг белка 0,38 ±0,06 1,65 ±0,03' 1,73 ±0,06' 0,41 ±0,042 1,23 ± 0,04й 1,14±0,03'2 0,45 + 0,023

МДА аскорбатзависимый, нмоль/мг белка-мин 1,30 ±0,05 2,10 ± 0,111 2,03 ± 0,09' 1,31 ±0,042 1,53 ±0,061,3 2,21 ±0,06' 1,35 ± 0,033

Диеновые конъюгаты, нмоль/мг липидов 0,25 ±0,02 0,71 ±0,04' 0,85 ±0,03' 0,27 ± 0,022 0,65 ± 0,04й 0,73 ±0,02' 0,30 ± 0,043

Основания Шиффа, нмоль/мг липидов 0,50 ± 0,03 0,91 ±0,05' 1,11+0,04' 0,53 ± 0,032 0,71 ± 0,04й 1,05 + 0,04' 0,55 ± 0,053

Примечание: Статистически значимые отличия при р<0,05:1 - по сравнению с контролем,2 -по сравнению с острой интоксикацией

этанолом, 3 -по сравнению с длительной интоксикацией этанолом.

На модели острой интоксикации этанолом концентрация спонтанного МДА повышалась в 4,3 раза, образование аскорбатзависимого МДА ускорялось в 1,6 раза, содержание в гомогенатах мозга крыс оснований Шиффа и диеновых конъюгатов возрастало по сравнению с контролем в 1,8 и 2,8 раза соответственно (табл. 1).

Длительное введение этанола сопровождалось увеличением продукции в головном мозге спонтанного и аскорбатзависимого МДА соответственно в 4,6 и 1,6 раза. Количество диеновых конъюгатов и оснований Шиффа повышалось в 3,4 и 2,2 раза относительно значений, наблюдаемых в норме (табл. 1).

На фоне острой интоксикации этанолом эссенциальные фосфолипиды (ЭФЛ) восстанавливали до нормальных значений активность исследуемых ферментов сыворотки крови (табл. I).

Применение ЭФЛ для коррекции нарушений, вызванных длительным введением этанола, снижало активность АлАТ и АсАТ соответственно в 1,3 и 1,2 раза относительно показателей цитолиза гепатоцитов в группе животных с интоксикацией. Активность у-ГТП уменьшалась в 1,4 раза (табл. 1).

На модели острой интоксикации этанолом ЭФЛ нормализовали содержание спонтанного и аскорбатзависимого МДА, диеновых конъюгатов и оснований Шиффа в гомогенатах печени и головного мозга крыс (табл. 1).

При терапии ЭФЛ длительной интоксикации снижалась активность процессов ПОЛ в печени. Концентрация спонтанного МДА снижалась в 1,2 раза, образование аскорбатзависимого МДА замедлялось в 1,1 раза. Количество диеновых конъюгатов и оснований Шиффа статистически значимо не отличалось от значений незащищенных препаратом животных (табл. 1).

В головном мозге под влиянием ЭФЛ на фоне длительной этаноловой интоксикации содержание спонтанного и аскорбатзависимого МДА снижалось соответственно в 1,4 и 1,3 раза. Концентрация диеновых конъюгатов уменьшалась в 1,3 раза, оснований Шиффа - в 1,6 раза относительно значений группы животных, оставленных без лечения (табл. 1).

Коррекция адеметионином острой интоксикации этанолом обеспечивала снижение в сыворотке крови активности АлАТ, АсАТ и у-ГТП - в 1,3; 1,4 и 1,6 раза соответственно по сравнению с показателями нелеченных животных (табл. 1).

Под влиянием адеметионина на модели длительной этаноловой интоксикации активность трансаминаз и у-ГТП в сыворотке крови нормализовалась (табл. 1).

На фоне острой интоксикации этанолом адеметионин снижал интенсивность процессов ПОЛ в печени: концентрация спонтанного МДА уменьшалась в 1,3 раза, образование аскорбатзависимого МДА - в 2,1 раза. Содержание диеновых конъюгатов и оснований Шиффа становилось меньше, чем у животных с интоксикацией, в 1,3 и 1,5 раза соответственно (табл. I).

Введение адеметионина животным с острой интоксикацией сопровождалось снижением продукции спонтанного МДА в гомогенате мозга в 1,4 раза. Уровни остальных продуктов липопероксидации оставались такими же, как в группе животных, не получавших препарат (табл. 1).

При терапии адеметионином на фоне длительной интоксикации этанолом содержание в гомогенатах печени и головного мозга спонтанного и аскорбатзависимого МДА, диеновых конъюгатов и оснований Шиффа нормализовалось (табл. 1).

При острой интоксикации этанолом в печени крыс наблюдалось ингибирование сукцинатзависимой энергопродукции, выраженное нарушение метаболического контроля дыхания митохондрий и разобщение окислительного фосфорилирования по сравнению с параметрами биоэнергетики группы контрольных животных.

В тесте с добавлением в среду инкубации экзогенного сукцината в концентрации, близкой к физиологической (1 мМ), снижалась скорость фосфорилирующего дыхания митохондрий (Уз) на 13%. Скорости контролируемого дыхания (У4п, У4о) статистически значимо не отличались от контрольных значений (рис. 1). Коэффициент АДФ/О уменьшался на 16% (рис. 2).

При повышении субстратной нагрузки добавлением 5 мМ сукцината наблюдалось возрастание скоростей поглощения кислорода митохондриями в состоянии покоя и отдыха на 21 и 26%, скорость активного фосфорилирования АДФ снижалась на 8% (р<0,05) (рис. 1). Коэффициент АДФ/О становился меньше, чем у контрольных животных на 11% (р<0,05) (рис. 2).

При утилизации смеси НАД-зависимых субстратов (малата и глутамата) в митохондриях печени крыс, получавших этанол, регистрировалось увеличение скоростей У4п и У4о на 18 и 33% соответственно, У3 статистически значимо не изменялась (рис. 1). Отмечалось снижение величины АДФ/О на 20% (рис. 2).

Скорости дыхания при внесении ингибитора СДГ малоната в среду инкубации митохондрий печени с НАД-зависимыми субстратами превышали скорости в норме в состояниях покоя и отдыха в среднем на 39%, в состоянии активного фосфорилирования - на 9% (р<0,05) (рис. 1). Коэффициент АДФ/О уменьшался на 12% (р<0,05) (рис. 2). Ингибиторный анализ дыхания митохондрий с применением малоната при окислении НАД-зависимых субстратов на фоне острой интоксикации этанолом показал увеличение вклада окисления эндогенного сукцината в продукцию АТФ.

Функциональное состояние митохондрий печени крыс при длительной интоксикации этанолом характеризовалось существенным ингибированием процессов как НАД-, так и ФАД-зависимой энергопродукции с преобладанием НАД-зависимого дыхания и сохранностью сопряженности окислительного фосфорилирования относительно нормальных значений.

□ У4п контроль В У4п этанол О У4п ЭФЛ ■ У4п адеметионин

О У4о контроль 0У4о этанол Ш У4о ЭФЛ ■ У4о адеметионин

□ УЗ контроль а УЗ этанол ШУЗ ЭФЛ ■ УЗ адеметионин

Рис. 1. Влияние эссенциальных фосфолипидов и адеметионина на скорости дыхания митохондрий печени крыс в метаболических состояниях покоя (У4п), активного фосфорилирования (Уз) и отдыха (У4о) при острой интоксикации этанолом. Субстраты окисления: а - сукцинат 1 мМ; б - сукцинат 5 мМ; в - манат и глутамат; г -малат и глутамат с добавлением мапоната; ЭФЛ - эссенциальные фосфолипиды; статистически значимые отличия при р<0,05: * - по сравнению с контролем, # - по сравнению с острой интоксикацией этанолом

а б

□ контроль □этанол

в г

I ЭФЛ ■ адеметионин

Рис. 2. Влияние эссенциальных фосфолипидов и адеметионина на сопряженность окислительного фосфорилирования (АДФ/О) в митохондриях печени крыс при острой интоксикации этанолом.

Субстраты окисления: а - сукцинат 1 мМ; б - сукцинат 5 мМ; в - малат и глутамат: г -малат и глутамат с добавлением малоната: ЭФЛ - эссенциальные фосфолипиды: статистически значимые отличия при р<0,05: * - по сравнению с контролем, # - по сравнению с острой интоксикацией этанолом.

При окислении митохондриями печени крыс 1 мМ сукцината наблюдалось снижение скоростей поглощения кислорода в состоянии покоя, активного фосфорилирования добавленной АДФ и отдыха на 13, 23 и 25% соответственно (рис. 3).

В тесте с применением сукцината в концентрации, превышающей физиологическую, скорости дыхания У3 и У^ уменьшались на 20%, У4[1 статистически значимо не отличалась от контрольного значения (рис. 3).

При использовании в качестве субстратов окисления малата и глутамата скорости дыхания митохондрий печени У3 и У4о снижались на 18 и 25% соответственно. Скорость дыхания в состоянии покоя не изменялась (рис. 3).

Ингибиторный анализ дыхания митохондрий с применением конкурентного ингибитора СДГ малоната не выявил под влиянием длительной интоксикации этанолом значимого вклада окисления эндогенного сукцината в дыхательную активность митохондрий печени при окислении НАД-зависимых субстратов. Действительно, если в контрольной группе малонат обусловливал снижение скорости У3 на 16% и увеличение коэффициента АДФ/О на 8% при окислении НАД-зависимых субстратов, то в исследуемой группе (при добавлении малоната к митохондриям, окисляющим малат и глутамат) скорость фосфорилирующего дыхания и коэффициент сопряженности окислительного фосфорилирования оставались на прежнем уровне (рис. 3,4).

Коэффициент сопряженности окислительного фосфорилирования АДФ/О при окислении митохондриями печени как НАД-, так и ФАД-зависимых субстратов статистически значимо не отличался от такового в контроле (рис. 4).

В системе энергопродукции митохондрий головного мозга крыс, подвергнутых острой интоксикации этанолом, наблюдалось возрастание скоростей дыхания митохондрий во всех исследуемых метаболических состояниях при окислении как НАД-, так и ФАД-зависимых субстратов, разобщение окислительного фосфорилирования и нарушение метаболического контроля дыхания митохондрий по сравнению с параметрами биоэнергетики контрольной группы животных.

Утилизация митохондриями мозга 1 мМ сукцината приводила к повышению скоростей поглощения кислорода в среднем на 23% относительно нормальных значений (рис. 5). Коэффициент АДФ/О статистически значимо не изменялся (рис. 6).

При увеличении концентрации сукцината до 5 мМ скорости дыхания митохондрий в состоянии покоя и отдыха возрастали на 46%, в состоянии активного фосфорилирования - на 18% (рис. 5). Коэффициент АДФ/О снижался на 20% (рис. 6).

При внесении в среду инкубации малата и глутамата скорости поглощения кислорода митохондриями головного мозга повышались: У4п - на 69%, У3 - на 20% и У4о - на 40% (рис. 5). Коэффициент АДФ/О уменьшался на 8% (р<0,05) (рис. 6).

а

□ У4п контроль

□ У4п этанол ®У4л ЭФЛ ■У4п адеметионин

□ У4о контроль

□ У4о этанол шУ4оЭФЛ

■ У4о адеметионин

б в

О УЗ контроль ВУЗ этанол ВУЗЭФЛ ■ УЗ адеметионин

Рис. 3. Влияние эссенциапьных фосфолипидов и адеметионина на скорости дыхания митохондрий печени крыс в метаболических состояниях покоя (У4п), активного фосфорилирования (Уз) и отдыха (У^) при длительной интоксикации этанолом. Субстраты окисления: а - сукцинат 1 мМ; б - сукцинат 5 мМ: в - малат и глутамат; г -малат и глутамат с добавлением малоната; ЭФЛ - эссенциальные фосфолипиды; статистически значимые отличия при р<0,05: * - по сравнению с контролем, # - по сравнению с длительной интоксикацией этанолом.

а б в г

□ контроль 0 этанол 0 ЭФЛ ■ адеметионин

Рис. 4. Влияние эссенциальных фосфолипидов и адеметионина на сопряженность окислительного фосфорилирования (АДФ/О) в митохондриях печени крыс при длительной интоксикации этанолом.

Субстраты окисления: а - сукцинат 1 мМ; б - сукцинат 5 мМ: в - малат и глутамат: г -малат и глутамат с добавлением малоната: ЭФЛ - эссенциальные фосфолипиды: статистически значимые отличия при р<0.05: * - по сравнению с контролем, # - по сравнению с длительной интоксикацией этанолом.

а

б

□ У4п контроль ЕЗУ4п этанол ®У4п ЭФЛ ■ У4п адеметионин

О У4о контроль РУ4о этанол И У4о ЭФЛ ■ У4о адеметионин

□ УЗ контроль

□ УЗ этанол аУЗЭФЛ ■ УЗ адеметионин

Рис. 5. Влияние эссенциальных фосфолипидов и адеметионина на скорости дыхания митохондрий головного мозга крыс в метаболических состояниях покоя (У4п), активного фосфорилирования (Уз) и отдыха (У10) при острой интоксикации этанолом. Субстраты окисления: а - сукцинат I мМ; б - сукцинат 5 мМ; е - мапат и глутамат; г -манат и глутамат с добавлением малоната; ЭФЛ - эссенциальные фосфолипиды; статистически значимые отличия при р<0,05: * - по сравнению с контролем, # - по сравнению с острой интоксикацией этанолом.

а б в г

□ контроль Р этанол ШЭФЛ ■ адеметионин

Рис. 6. Влияние эссенциальных фосфолипидов и адеметионина на сопряженность окислительного фосфорилирования (АДФ/О) в митохондриях головного мозга крыс при острой интоксикации этанолом.

Субстраты окисления: а - сукцинат 1 мМ; б - сукцинат 5 мМ; в - малат и глутамат: г -малат и глутамат с добавлением малоната; ЭФЛ - эссенциальные фосфолипиды; статистически значимые отличия при р<0,05: * - по сравнению с контролем, # - по сравнению с острой интоксикацией этанолом.

Совместное окисление НАД-зависимых субстратов с малонатом увеличивало скорости дыхания в состояниях покоя, активного фосфорилирования и отдыха соответственно на 69, 19 и 50% относительно скоростей у контрольных животных (рис. 5). Коэффициент АДФ/О снижался на 17% (рис. 6). Ингибиторный анализ дыхания митохондрий с применением малоната не выявил при острой интоксикации этанолом вклада окисления эндогенного сукцината в продукцию АТФ при окислении НАД-зависимых субстратов.

Сравнительный анализ скоростей контролируемого дыхания митохондрий указывает на наличие компенсируемого экзогенными субстратами и АДФ низкоэнергетического сдвига в митохондриях головного мозга крыс на модели острой интоксикации этанолом.

Исследование функционального состояния митохондрий головного мозга крыс при длительной интоксикации этиловым спиртом выявило сходные нарушения в системе энергопродукции.

При окислении митохондриями мозга крыс 1 мМ сукцината скорости дыхания У4п, У3, У4о повышались на 39, 24, 34% соответственно (рис. 7). Коэффициент АДФ/О снижался на 22% (рис. 8).

После добавления в среду инкубации сукцината в концентрации 5 мМ скорость дыхания в состояниях покоя увеличивалась на 56%, активного фосфорилирования - на 18% и отдыха - на 32% (рис. 7). Коэффициент АДФ/О уменьшался на 10% (р<0,05) (рис. 8).

При окислении НАД-зависимых субстратов наблюдалось значительное увеличение по сравнению с нормальными значениями скоростей контролируемого дыхания - на 63 и 51%. Скорость фосфорилирующего дыхания повышалась на 28% (рис. 7). Коэффициент сопряженности окислительного фосфорилирования снижался на 8% (р<0,05) (рис. 8).

Внесение малоната к митохондриям мозга крыс, окисляющим смесь НАД-зависимых субстратов, увеличивало У4„ в 2,1 раза, У3 - на 39%, У4о - на 46% (рис. 7). Коэффициент АДФ/О статистически значимо не отличался от контрольного значения (рис. 8). Ингибиторный анализ дыхания митохондрий головного мозга крыс при длительной интоксикации этанолом с применением малоната при окислении НАД-зависимых субстратов показал увеличение вклада окисления эндогенного сукцината в дыхательную активность митохондрий.

Оценка скоростей контролируемого дыхания митохондрий указывает на наличие компенсируемого экзогенными субстратами и АДФ низкоэнергетического сдвига в митохондриях головного мозга крыс, получавших этанол при длительном введении.

Введение ЭФЛ на фоне острой интоксикации этанолом нормализовало НАД-зависимое дыхание, устраняло ингибирование СДГ, восстанавливало до нормальных значений сопряженность окисления и фосфорилирования в митохондриях печени крыс.

□ У4п контроль

□ У4п этанол ШУ4пЭФЛ

■ У4п адеметионин

О УЗ контроль ВУЗ этанол ШУЗ ЭФЛ ■ УЗ адеметионин

□ У4о контроль 0 У4о этанол В У4о ЭФЛ ■ У4о адеметионин

Рис. 7. Влияние эссенциальных фосфолипидов и адеметионина на скорости дыхания митохондрий головного мозга крыс в метаболических состояниях покоя (Ут), активного фосфорилирования (У3) и отдыха (У^) при длительной интоксикации этанолом. Субстраты окисления: а - сукцинат 1 мМ; б - сукщинат 5 мМ; в - малат и глутамат; г -малат и глутамат с добавлением малоната; ЭФЛ - эссенциальные фосфолипиды; статистически значимые отличия при р<0,05: * - по сравнению с контролем, # - по сравнению с длительной интоксикацией этанолом.

а б в г

□ контроль □ этанол ШЭФЛ ■ адеметионин

Рис. 8. Влияние эссенциальных фосфолипидов и адеметионина на сопряженность окислительного фосфорилирования (АДФ/О) в митохондриях головного мозга крыс при длительной интоксикации этанолом.

Субстраты окисления: а - сукцинат 1 мМ; б - сукцинат 5 мМ; в - малат и глутамат; г -малат и глутамат с добавлением малоната; ЭФЛ - эссенциальные фосфолипиды: статистически значимые отличия при р<0,05: * - по сравнению с контролем, # - по сравнению с длительной интоксикацией этанолом.

После добавления в среду инкубации сукцината в концентрации 1 мМ наблюдалось увеличение скоростей У3 и Удо на 19 и 13% (рис. 1). Коэффициент АДФ/О возрастал на 9% (р<0,05) (рис. 2).

При повышении субстратной нагрузки добавлением 5 мМ сукцината отмечали увеличение скорости фосфорилирующего дыхания на 7% (р<0,05), коэффициента АДФ/О - на 23% (рис. 1,2). Скорости контролируемого дыхания митохондрий печени крыс, получавших ЭФЛ, статистически значимо не отличались от скоростей в группе животных, подвергнутых острой интоксикации этанолом (рис. 1).

Внесение в среду инкубации малата и глутамата нормализовало параметры биоэнергетики печени. Скорости поглощения кислорода митохондриями в состояниях покоя и отдыха снижались соответственно на 20 и 25% (рис. 1). Коэффициент АДФ/О увеличивался на 19% (рис. 2).

Оценка изменений функциональной активности митохондрий печени при окислении НАД-зависимых субстратов с применением малоната указывает на незначительный вклад в продукцию АТФ окисления эндогенного сукцината под влиянием ЭФЛ.

В системе митохондриальной энергопродукции головного мозга под действием ЭФЛ на модели острой интоксикации этанолом наблюдалось восстановление сопряженности окислительного фосфорилирования и тенденция к снижению кинетических параметров дыхания.

Утилизация митохондриями мозга 1 мМ сукцината приводила к уменьшению скорости У3 на 9% (р<0,05) (рис. 5).

После добавления в среду инкубации 5 мМ сукцината скорости поглощения кислорода митохондриями мозга снижались на 10-15% (р<0,05) относительно скоростей у незащищенных препаратом животных (рис. 5). Коэффициент АДФ/О увеличивался на 19% (рис. б).

При окислении НАД-зависимых субстратов митохондриями головного мозга статистически значимо снижалась только скорость фосфорилирующего дыхания (на 9%) (рис. 5).

Внесение ингибитора СДГ малоната к митохондриям, окисляющим малат и глутамат, приводило к уменьшению скоростей дыхания У4п и У4<> на 20 и 26% соответственно (рис. 5). Коэффициент АДФ/О возрастал на 16% (рис. 6). Ингибиторный анализ с применением малоната не выявил под влиянием ЭФЛ вклада окисления эндогенного сукцината в дыхательную активность митохондрий головного мозга при окислении НАД-зависимых субстратов.

В группе животных, получавших ЭФЛ при длительной интоксикации этанолом, отмечалось повышение скоростей поглощения кислорода митохондриями печени во всех исследуемых метаболических состояниях при НАД- и ФАД-зависимом дыхании. Однако на фоне положительных сдвигов в кинетике митохондриальной активности развивалось разобщение процессов окислительного фосфорилирования по сравнению с незащищенными препаратом животными.

В тесте с добавлением в среду инкубации к митохондриям печени 1 мМ сукцината скорость дыхания в состоянии покоя повышалась на 27%, в состоянии активного фосфорилирования - на 30%, в состоянии отдыха - на 72% по сравнению с показателями крыс в группе длительной интоксикации (рис. 3). Коэффициент АДФ/О уменьшался на 15% (рис. 4).

Увеличение концентрации сукцината до 5 мМ приводило к возрастанию скоростей У4п и Уло на 46 и 73%, У3 - на 22% (рис. 3). Коэффициент АДФ/О снижался на 21% (рис. 4).

При использовании НАД-зависимых субстратов регистрировалась высокая активность системы энергопродукции митохондрий печени крыс, получавших ЭФЛ. Скорости дыхания органелл в метаболических состояниях до, во время и после цикла фосфорилирования АДФ увеличивались на 48, 36 и 90% соответственно (рис. 3). Коэффициент АДФ/О становился меньше на 29% (рис. 4).

При совместном окислении смеси НАД-зависимых субстратов с малонатом наблюдалось повышение скоростей поглощения кислорода в состоянии покоя на 55%, активного фосфорилирования добавленной АДФ - на 42% и отдыха - на 70% по сравнению со значениями группы животных, подвергнутых длительной интоксикации этанолом (рис. 3). Коэффициент АДФ/О снижался на 14% (рис. 4). Применение ингибитора СДГ выявило вклад эндогенного сукцината в продукцию АТФ при окислении НАД-зависимых субстратов, что указывает на активацию быстрого метаболического кластера митохондрий печени.

Повышение кинетических параметров дыхания митохондрий печени на фоне разобщения окислительного фосфорилирования под влиянием ЭФЛ свидетельствует о включении компенсаторных механизмов, обеспечивающих быструю наработку макроэргических соединений в условиях длительной интоксикации этанолом.

Введение ЭФЛ животным после моделирования длительной этаноловой интоксикации не оказало протективного действия на биоэнергетику головного мозга - скорости дыхания митохондрий оставались повышенными во всех исследуемых метаболических состояниях, сопряженность окислительного фосфорилирования не восстанавливалась.

Добавление в среду инкубации 1 мМ сукцината сопровождалось увеличением коэффициента АДФ/О на 14% (рис. 8).

При повышении субстратной нагрузки внесением 5 мМ сукцината к митохондриям головного мозга коэффициент АДФ/О снижался на 11% (р<0,05) (рис. 8). Остальные показатели дыхания митохондрий статистически значимо не изменялись по сравнению со значениями, регистрируемыми у животных, незащищенных ЭФЛ (рис. 7).

При утилизации смеси НАД-зависимых субстратов митохондриями головного мозга крыс статистически значимо снижался только коэффициент АДФ/О (на 13%) (рис. 8).

При внесении малоната в среду инкубации митохондрий головного мозга с НАД-зависимыми субстратами окисления скорость дыхания У4„ уменьшалась на 14%, У4о повышалась на 10% (р<0,05) относительно скоростей при интоксикации этанолом (рис. 7). Коэффициент АДФ/О снижался на 12% (р<0,05) (рис. 8). Анализ изменений функциональной активности митохондрий при окислении НАД-зависимых субстратов с применением малоната указывает на увеличение вклада окисления эндогенного сукцината в продукцию АТФ под влиянием ЭФЛ.

Адеметионин при острой интоксикации этанолом оказывал умеренное улучшение биоэнергетики печени, поскольку при восстановлении кинетических характеристик функционального состояния митохондрий сохранялось разобщение процессов окисления и фосфорилирования.

Скорость фосфорилирующего дыхания митохондрий печени крыс при окислении сукцината в физиологической концентрации повышалась на 18%. Скорости контролируемого дыхания и коэффициент АДФ/О статистически значимо не отличались от значений в группе животных с острой интоксикацией (рис. 1,2).

При увеличении концентрации сукцината до 5 мМ скорость дыхания У3 возрастала на 16%. Коэффициент АДФ/О и скорости У4п и У4о статистически значимо не изменялись (рис. 1, 2).

При окислении НАД-зависимых субстратов поглощение кислорода митохондриями печени в состояниях покоя и активного фосфорилирования увеличивалось на 12% (р<0,05) (рис. 1).

Ингибигорный анализ дыхания митохондрий печени с применением малоната при терапии адеметионином показал увеличение вклада окисления эндогенного сукцината в продукцию АТФ при окислении НАД-зависимых субстратов. Скорость фосфорилирующего дыхания повышалась на 8% (р<0,05). Скорости контролируемого дыхания митохондрий оставались без изменений (рис. 1). Коэффициент АДФ/О снижался на 12% (р<0,05) (рис. 2).

Введение адеметионина на фоне острой интоксикации этанолом не улучшало в значительной степени энергопродукцию в митохондриях головного мозга крыс. Кинетические параметры дыхания и сопряженность окислительного фосфорилирования оставались такими же, как в группе животных с интоксикацией.

При утилизации митохондриями мозга 1 мМ сукцината статистически значимо повышалась только скорость У4п (на 10%) (рис. 5).

В тесте с использованием 5 мМ сукцината значимых отличий от показателей нарушения биоэнергетики головного мозга, вызванного введением этанола, зарегистрировано не было (рис. 5, 6).

После добавления в среду инкубации маната и глутамата коэффициент АДФ/О снижался на 20% (рис. 6). Скорости поглощения кислорода митохондриями мозга статистически значимо не изменялись относительно показателей в группе крыс, получавших этанол (рис. 5).

При совместном окислении смеси НАД-зависимых субстратов с малонатом происходило уменьшение коэффициента АДФ/О на 14% (рис. 6). Ингибиторный анализ с применением малоната не выявил под влиянием адеметионина вклада окисления эндогенного сукцината в дыхательную активность митохондрий головного мозга при окислении НАД-зависимых субстратов.

Применение адеметионина на фоне длительной интоксикации этанолом не только снимало ингибирование СДГ, но и приводило к активации системы энергопродукции митохондрий печени. Функционирование дыхательной цепи происходило при этом с высоким сопряжением процессов окисления и фосфорилирования.

Добавление в среду инкубации экзогенного сукцината (1 мМ) приводило к увеличению скоростей контролируемого дыхания в среднем на 24%, фосфорилирующего дыхания - на 44% (рис. 3).

При повышении субстратной нагрузки внесением 5 мМ сукцината скорости У4п и Уз возрастали в среднем на 32%, скорость Удо не изменялась по сравнению с показателями в группе длительной интоксикации этанолом (рис. 3).

При окислении ФАД-зависимых субстратов сопряженность процессов окисления и фосфорилирования сохранялась на уровне нормальных значений (табл. 4).

При утилизации НАД-зависимых субстратов повышались скорости дыхания митохондрий печени: У4п - на 29%, Уз - на 40% и У4о - на 54% по отношению к скоростям, регистрируемым у нелеченных животных (рис. 3). Коэффициент АДФ/О снижался на 14% (рис. 4).

Внесение малоната в среду инкубации к митохондриям головного мозга, окисляющим манат и глутамат, способствовало увеличению скоростей контролируемого дыхания в среднем на 24%, фосфорилирующего дыхания - на 31% (рис. 3). Коэффициент АДФ/О статистически значимо не изменялся (рис. 4). Тест с применением малоната показал восстановление активности СДГ при окислении НАД-зависимых субстратов до уровня, наблюдаемого в норме.

В головном мозге под влиянием адеметионина на фоне длительной интоксикации этанолом наблюдалось снижение скоростей контролируемого дыхания митохондрий относительно значений, регистрируемых у незащищенных препаратом животных. Сопряженность окислительного фосфорилирования нормализовалась.

Скорости окисления митохондриями мозга 1 мМ сукцината в состоянии и Удо становились на 8 и 25% (р<0,05) меньше скоростей дыхания у нелеченных животных (рис. 7). Коэффициент АДФ/О увеличивался на 50% (рис. 8).

В тесте с использованием 5 мМ сукцината наблюдалось снижение скоростей контролируемого дыхания митохондрий головного мозга на 18-24%. Скорость фосфорилирующего дыхания и коэффициент АДФ/О статистически

значимо не отличались от показателей животных, подвергнутых длительной интоксикации этанолом (рис. 7,8).

При окислении малата и глутамата происходило уменьшение скоростей поглощения кислорода митохондриями головного мозга в состоянии отдыха на 21% (рис. 7). Коэффициент АДФ/О повышался на 15% (рис. 8). Скорости дыхания митохондрий в состоянии покоя и активного фосфорилирования оставались такими же, как при длительной интоксикации этанолом (рис. 7).

Добавление ингибитора СДГ малоната в среду инкубации к митохондриям мозга с НАД-зависимыми субстратами приводило к снижению скоростей У411, У3 и У<|<, - на 39, 17 и 22% соответственно (рис. 7). Коэффициент АДФ/О увеличивался на 8% (р<0,05) (рис. 8). Оценка изменений функциональной активности митохондрий головного мозга при окислении НАД-зависимых субстратов с применением малоната указывает на увеличение вклада окисления эндогенного сукцината в продукцию АТФ под влиянием адеметионина.

Проведенное исследование выявило разнонапранленный характер изменений энергетического метаболизма митохондрий в основных органах, поражаемых при интоксикации этанолом, - в печени и головном мозге. В системе митохондриальной энергопродукции печени при острой интоксикации реализуется мембранотропное действие этанола и ацетальдегида, проявляющееся активацией процессов липопероксидации, разобщением окислительного фосфорилирования и признаками выраженной деэнергизацией митохондрий с ингибированием ключевого фермента быстрого метаболического кластера - СДГ. Длительная интоксикация этанолом характеризуется наряду с угнетением сукцинатокидазного окисления, подавлением активности НАД-зависимого дыхания митохондрий печени с сохранностью сопряженности окислительного фосфорилирования. Напротив, в головном мозге система окисления сукцината принимает активное участие в реализации на уровне митохондрий адаптивного процесса при интоксикации этанолом. При этом выраженность и направленность изменений функциональной активности митохондрий и процессов ПОЛ в головном мозге была сходной при различных моделях.

Оценка исследуемых показателей свидетельствует о том, что терапевтический эффект гепатопротекторов в условиях экспериментальной интоксикации этанолом оказался неодинаковым. Протективный эффект ЭФЛ на систему энергопродукции митохондрий печени и головного мозга реализуется главным образом при острой интоксикации, предположительно за счет восстановления структурно-функциональной целостности митохондриальных мембран, поврежденных высокими дозами этанола. Адеметионин улучшает биоэнергетику печени и головного мозга в большей степени на модели длительной интоксикации этанолом.

выводы

1. Разработанные модели острой (7 мл/кг 40% этанола 2 раза в сутки в течение 7 дней) и длительной (5,2 мл/кг 40% этанола в течение 5 недель) интоксикации этанолом позволяют получить достаточный уровень гиперферментемии, сохраняющийся в течение 2-3 недель, при выраженном нарушении митохондриальной энергопродукции печени и головного мозга.

2. На модели острой интоксикации этанол приводит к деэнергизации митохондрий печени и ингибированию сукцинатдегидрогеназы. Длительное введение этанола сопровождается угнетением как сукцинат-, так и НАД-зависимого дыхания митохондрий печени без разобщения процессов окисления и фосфорилирования. На обеих моделях развивалась гиперферментемия и активировались процессы липопероксидации.

3. В системе энергопродукции митохондрий головного мозга, независимо от модели интоксикации этанолом, происходят аналогичные изменения биоэнергетических процессов: активация процессов энергообеспечения по быстрому метаболическому пути с развитием компенсированного низкоэнергетического сдвига и снижением сопряженности окислительного фосфорилирования, усиливалось перекисное окисление липидов.

4. Эссенциальные фосфолипиды на фоне острой интоксикации этанолом снижают активность аминотрансфераз и у-глутамилтгранспептидазы в крови, нормализуют НАД-зависимое дыхание и устраняют ингибирование сукцинатзависимой энергопродукции митохондрий печени, оказывая умеренное снижение кинетических параметров функциональной активности митохондрий головного мозга. Сопряженность процессов окисления и фосфорилирования, а также уровень первичных и вторичных продуктов липопероксидации в печени и головном мозге крыс нормализовались при терапии эссенциальными фосфолипидами.

5. На модели длительной интоксикации этанолом коррекция эссенциальными фосфолипидами проявляется улучшением как НАД-, так и сукцинатзависимой энергопродукции печени крыс, но снижает степень энергизованности митохондрий. Нарушения биоэнергетики головного мозга, вызванные длительной интоксикацией этанолом, не устранялись введением эссенциальных фосфолипидов. Эссенциальные фосфолипиды уменьшают гиперферментемию и умеренно снижают показатели перекисного окисления липидов в печени и головном мозге.

6. Применение адеметионина для коррекции нарушений, вызванных острой интоксикацией этанолом, препятствует развитию гиперферментемии, тормозит липопероксидацию и устраняет ингибирование дыхательной цепи митохондрий печени на фоне сохранения разобщения окислительного фосфорилирования. Адеметионин не оказывает протективного действия на активность процессов перекисного окисления липидов и биоэнергетику головного мозга при острой интоксикации этанолом.

7. На модели длительной интоксикации этанолом терапия адеметионином обеспечивает переход системы энергопродукции митохондрий печени от угнетенного состояния к гиперактивации с сохранением сопряженности процессов дыхания и фосфорилирования. В головном мозге адеметионин способствует усилению метаболического контроля функциональной активности митохондрий головного мозга и возрастанию степени их энергизованности. Уровень продуктов липопероксидации в печени и головном мозге крыс, а также активность аминотрансфераз и у-глутамилтранспептидазы в крови под влиянием адеметионина снижались до нормальных значений.

8. Терапевтическое действие гепатопротекгоров проявляется различно на моделях острой и длительной интоксикации этанолом. Эссенциальные фосфолипиды в большей степени, чем адеметионин, уменьшают гиперферментемию и активность процессов перекисного окисления липидов, улучшают энергетический метаболизм митохондрий печени и головного мозга крыс на модели острой интоксикации этанолом. Цитопротекторные и антиоксидантные свойства адеметионина выражены сильнее, чем у эссенциальных фосфолипидов, на модели длительной интоксикации этанолом.

ПЕРЕЧЕНЬ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Влияние природных соединений на окислительное фосфорилирование и перекисное окисление липидов в печени мышей при интоксикации тетрахлорметаном // Вятский медицинский вестник. - 2007. - № 4. -С. 142-144 (соавт. Коршунов ДА., Хазанов В.А.).

2. Влияние эссенциале на функциональное состояние митохондрий печени и головного мозга крыс при острой интоксикации этанолом // Бюллетень Северного государственного медицинского университета. - 2009. - № 1. -С. 233-234.

3. Функциональное состояние митохондрий печени и головного мозга крыс при хронической интоксикации этанолом // Науки о человеке: материалы X Конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск: СибГМУ. - 2009. -С. 98-99.

4. Функциональное состояние митохондрий печени и головного мозга крыс при интоксикации этанолом и коррекции эссенциале // Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения: материалы 64-й Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и студентов с международным участием. - Екатеринбург: УГМА, 2009. -С. 574-577.

5. Состояние системы энергопродукции печени и головного мозга крыс при острой и хронической интоксикации этанолом // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2010. - Т. 149, № 2. - С. 169173. (соавт. Коршунов Д.А., Слепичев В.А., Зюзькова Ю.Г., Яновская Е.А., Стыкон Г .А., Удут В.В.).

6. Влияние гептрала на биоэнергетику печени и головного мозга крыс при длительной интоксикации этанолом // Науки о человеке: материалы XI Конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск: СибГМУ, 2010. -С. 75-76.

Тираж 100. Заказ № 1052. Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники 634050, г. Томск, пр. Ленина, 40. Тел.:53-30-18.