Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Моноклональные антитела к антигенам Bac. anthracis: получение и применение

На правах рукописи

Романов Михаил Геннадьевич

Моноклональные антитела к антигенам Вас. апШгааз: получение и применение.

I

16.00.03 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунологией»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

I

Москва - 2005

Работа выполнена в отделе бактерийных лекарственных средств для животных ФГУ Всероссийском государственном центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов Россельхознадзора МСХ РФ (ФГУ ВГНКИ) и лаборатории клеточных гибридов ГУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова. (ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова. РАМН).

Научные руководители: - доктор ветеринарных наук, профессор,

Заслуженный деятель науки РФ Кириллов Л.В. (ФГУ ВГНКИ) - кандидат медицинских наук Свиридов В.В. (ГУ НИИВС им. И.И. Мечникова. РАМН)

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук,

профессор'Обухов И.Л. - доктор ветеринарных наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ Гаврилов В.А.

Ведущая организация - ГНУ Всероссийский научно-

исследовательский институт экспериментальной ветеринарии имени Я.Р. Коваленко (РАСХН).

¿f7

-часов на

Защита диссертации состоится<^^жтября 2005 г. заседании диссертационного совета Д 220.011.01 при ФГУ Всероссийском Государственном центре качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ ВГНКИ) по адресу: 123022, Москва, ул. Звенигородское шоссе, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ВГНКИ.

Автореферат разослан «/^'сентября 2005 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук. Заслуженный ветеринарный врач РФ

Кдеыртв Ю.А.

Общая характеристика работы

Актуальность исследования

Сибирская язва, болезнь, которая относится к числу особо опасных зоонозных инфекций, поражающая сельскохозяйственных животных (крупный и мелкий рогатый скот, лошадей, ослов, верблюдов), диких млекопитающих, а также человека, продолжает регистрироваться во многих странах и причиняет большой экономический ущерб (Пименов Е.В., и др., 2000). Высокая заболеваемость обусловлена тем, что возбудитель сибирской язвы способен неопределённо долго сохранять жизнеспособность в почве в виде спор и образовывать стойкие стационарные очаги инфекции. В Российском кадастре, составленном на основании данных за последние 100 лет, числится более 35 тысяч мест, в которых более 70000 раз возникали вспышки сибирской язвы животных и людей. Однако, в силу исторических, социальных и экономических обстоятельств большое количество скотомогильников, одиночных мест гибели или захоронений остаётся неучтённым. Существование таких очагов в разных регионах мира, в том числе и на территории России, создает постоянную угрозу возникновения эпизоотий и заражения людей, которые могут инфицироваться в процессе переработки и использования животноводческой продукции, полученной от больных животных (мясо, шкуры, шерсть и др.). По данным Всемирной организации здравоохранения в мире ежегодно заболевает около 20 тыс. человек, нередко отмечается и летальный исход (Зубов В.В., и др., 1997).

Профилактика заболеваемости основывается на вакцинации чувствительных животных и (по эпидпоказаниям) людей. Существенное внимание в борьбе с сибирской язвой уделяется своевременной диагностике, идентификации возбудителя, выделенного от животных и в объектах внешней среды.

Традиционные методы бактериологической индикации и идентификации возбудителя включающие: приготовление и окраску мазков,

посев на питательные среды, биопробу, а также проведения ряда дополнительных исследований (тест «жемчужного ожерелья», лизабельность фагом, нммунофлюоресцентный тест), обеспечивают получение окончательного результата в сроки не ранее 2 — 3 суток от момента начала исследования, что существенно тормозит и, соответственно, усложняет проведение адекватных мер по локализации очага инфекции.

В связи с этим предпринимаются попытки по замене существующих традиционных методов выделения и индикации возбудителя сибирской язвы на более совершенные. К их числу относятся, в первую очередь, такие иммунохимические методы как ИФА. В основу всех без исключения иммунохимических методов анализа положено образование высокоспецифического комплекса между антигеном и антителом, в котором в качестве антигена могут выступать низкомолекулярные химические соединения (гаптены), белковые молекулы микробного или растительного происхождения, а также различные микробиологические объекты: бактерии, риккетсии, вирусы и т.д. Главная задача при разработке иммунодиатосгнческой тест-системы состоит в визуализации единичных взаимодействий антигена с антителом путем регистрации макроскопическою сигнала или по изменению физических свойств среды, а также увеличение чувствительности и специфичности анализа, достигаемое за счёт получения антител с максимальным аффинитетом к искомому антигену. Наиболее яркими примерами в этой области являются создание гибридомной технологии для получения моноклональных антител (МкАт) с заданными свойствами. Их использование в диагностических тест-системах в сравнении с поликлонапьными антителами обеспечивает получение более стабильных результатов при сохранении высокой чувствительности и специфичности, а стабильность свойств МкАт является определяющим фактором изготовления стандартных образцов препаратов в достаточно больших количествах. (НепсЬа! Е. А., е1 а1., 2001).

Существующая потребность в более совершенных методах диагностики, выявления Bacillus anthracis и его токсических субстанций позволило нам определить следующую цель работы.

Цель работы

Получить панель гибридом-продуцентов антител к специфичным антигенам Bac.anthracis и исследовать возможность их применения для иммунохимического анализа сибиреязвенных антигенов и конструирования диагности кумов.

Задачи исследования

При выполнении работы необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести культивирование сибиреязвенного возбудителя и сапрофитных бацилл и приготовить антигенные препараты для иммунизации животных и тестирования гибридом.

2. Подобрать схемы иммунизации мышей антигенными препаратами Bacillus anthracis оптимальные для получения гибридом-продуцентов.

3. Получить гибридомы-продуценты моноклональных антител к видоспецифичным антигенам Bacillus anthracis.

4. Изучить иммунохимическую характеристику и эффекторные свойства моноклональных антител.

5. Разработать методы использования МкАт для качественного и количественного определения распознаваемых ими антигенов.

Научная новизна и практическая значимость

Создана оригинальная коллекция стабильных гибридом-продуцентов МкАт к протективному антигену Bacillus anthracis.

Представлены доказательства преимущества применения тестов на основе МкАт по сравнению с классическими методами диагностики и идентификации возбудителя.

Положения выносимые на защиту

Получение оригинальной коллекции технологичных клонов гибридом-продуцентов антител к протективному антигену сибиреязвенного микроба.

На основе полученных моноклонапьных антител разработаны специфичные и чувствительные иммуноферментные методы качественного и количественного определения протективного антигена сибиреязвенного токсина в биологическом материале и метод выявления антител к протективному антигену в сыворотке вакцинированных животных. Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, доложены:

• на VIII Всероссийском научном форуме с международным участием им. академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2004» 23-25 мая 2004 г.

• На межлабораторном совещании специалистов ФГУ ВГНКИ 31 мая 2005 года.

• На межлабораторной конференции ГУ НИИВС им. И. И. Мечникова 3 июня 2005 года.

По материалам диссертационной работы опубликовано в периодической печати 3 научные статьи.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 6 рисунками и 10 таблицами.

Основное содержание работы

Материалы и методы

Все исследования по данной работе были проведены на базах лабораторий клеточных гибридов ГУ НИИВС им. И. И. Мечникова и лаборатории бациллярных препаратов ФГУ ВГНКИ.

В работе использовали вакцинные штаммы Вас. anthracis: 55-ВНИИВВиМ, Ихтиман, СТИ, 34F2, Пастера и метрике второй вакцины Ценковского (М-71) и следующие виды сапрофитных бацилл: Вас. cereus, Вас. megaterium, Вас. subtilis, Вас. mueoides и Вас. pseudoanthracis, полученные из музея живых штаммов ФГУ ВГНКИ МСХ РФ.

Штаммы Вас. anthracis и других видов рода Bacillus поддерживали на мясопептонном бульоне. Накопление протективного антигена (ПА) оценивали в культуральных жидкостях вакцинных штаммов Вас. anthracis (Ихтиман, СТИ, 55 - ВНИИВВиМ, 34F2, Пастера и М-71) и 5 видов сапрофитных бацилл {Вас. cereus, Вас. megaterium. Вас. subtilis, Вас. mueoides и Вас. pseudoanthracis), полученных при выращивании штаммов на среде 199 с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота в герметично закрытых пробирках в течение 20 часов при температуре 37 °С.

Работа проводилась при использовании методов гибридомной технологии иммунохимическими и биохимическими методами.

В качестве иммуногена для получения МкАт использовали культуральную жидкость Вас. anthracis штамма 55-ВНИИВМиВ, предварительно стерилизованную через мембраны «Millipore» 0,22 мкм, и протективный антиген (предоставленный сотрудниками ГНЦ ПМ, Оболенск). Эти же антигенные препараты применяли для сенсибилизации планшетов при выполнении ИФА и в качестве референтных в иммуноблотинге. Мышей линии BALB/c массой 16-18 г обоего пола иммунизировали внутрибрюшинно в дозе 15-25 мкг антигена на мышь, трижды с двухнедельным интервалом. Гибридизацию иммунных

спленоцитов с миеломой P3-X63-Ag 8.653 и культивирование гибридом выполняли в соответствии с «Методическими рекомендациями по получению гибридом-продуцентов МкАт к бактерийным антигенам» (Москва, 1986). Контроль за ростом гибридных клонов осуществляли, используя инвертированный микроскоп (Leitz, Германия). Скрининг клонов выполняли методом непрямого иммуноферментного анализа (ИФА), при этом для сенсибилизации полистироловых 96-луночных планшетов (Costar, США) использовали 3 вида антигенов: 1) ПА в концентрации 0,75 мкг/мл, 2) ультразвуковой дезинтеграт культуры Вас. cereus, 3) ультразвуковой дезинтеграт Вас. pseudoanthracis. Сорбцию антигенов осуществляли в течение 16-18 часов при температуре 4 °С. Время проведения иммунологической и ферментативной стадий реакции составляло по 1 часу при температуре 37 °С. Комплекс Аг-Ат выявляли конъюгатом меченных пероксидазой из корня хрена кроличьих антител к иммуноглобулинам мыши («Имтек», Россия). В качестве субстратной смеси использовали раствор 0,4 мг/мл о-фенилендиамина в фосфат-цитратном буфере рН 5,0 с 0,0015% Н202. Уровень ферментативной активности регистрировали на фотометре Dynatech MR 5000 при длине волны 492 нм.

Иммунофлуоресцентный анализ проводили на стёклах с предварительно фиксированными микробными клетками возбудителя, на которые наносили гамма-глобулиновые фракции асцигных жидкостей мыши, содержащих МкАт, с последующим проявлением реакции кроличьими антителами к иммуноглобулинам мыши, меченными флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ). Учёт реакции проводили под масляной иммерсией в люминесцентном микроскопе.

Позитивные культуры клонировали методом лимитирующих разведений. Для подсчета клеток использовали камеру Горяева. Отобранные клоны хранили в жидком азоте.

Изотип МкАт к ПА определяли ИФА с использованием козьих антител против мышиных иммуноглобулинов классов М, А и подклассов G («BioRad», США) и соответствующего антивидового пероксидазного конъюгата.

МкАт нарабатывали в виде асцитических жидкостей, которые получали от сингенных мышей, предварительно обработанных пристаном (Sigma США), путем внутрибрюшинного введения им по (4-5)х10в гибридных клеток. МкАт выделяли осаждением сернокислым аммонием 50% насыщения с последующим диализом против 0,01 М фосфатно-солевого буфера pH 7,2. Концентрацию белка определяли на спектрофотометре при X = 280 нм.

Синтез пероксидазных коньюгатов антител проводили в соответствии с условиями, описанными ранее (Nakane Р.К. et al., 1974). В 0.5 мл дистиллированной воды растворяли 2 мг пероксидазы хрена (ПХ, Олайне Латвия), добавляли 0.1 мл свежеприготовленного 0.2 М NaI04 и перемешивали в течение 20 мин при комнатной температуре, а затем диализовали против 1 мМ ацетатного буфера, pH 4.5, в течение ночи при 4°С. С помощью Ыа2СОз доводили pH раствора до 9.5 и сразу же добавляли 4 мг антител (IgG) в 0.5 мл 0.01 М КББ, содержащего 0.13 М NaCl, pH 9.5 и перемешивали 2 часа. Затем вносили 50 мкл. раствора NaBH» (4мг/мл) и инкубировали при 4 °С в течение 2 часов с периодическим помешиванием. Полученный конъюгат диализовали против 2000-5000-кратного объема ФСБ, pH 7,2. Конъюгат стабилизировали внесением БСА до концентрации 5 мг/мл, добавляли равный объем глицерина и хранили при -20 °С.

С помощью данной процедуры получали конъюгаты кроличьих антител к иммуноглобулинам лошади (АЛ-ПХ).

Для уточнения специфичности МкАт проводили иммуноблоттинг. Антигенный материал (ПА - 5 мкг) подвергали электрофорезу в 10 % ДСН-ПААГ (Towbin Н., et al., 1979).

После разделения осуществляли перенос образца на нитроцеллюлозную мембрану («Bio-Rad», США) полусухим способом при

постоянном токе 50 мА в течение 16 часов при комнатной температуре. В последующем мембрану резали на треки и инкубировали с исследуемыми образцами МкАт и проявляли пероксидазным коньюгатом антавидовых антител. В качестве хромогена использовали 4-хлор-1-нафтол.

Для оценки уровня антител к протективному антигену иммунизировали морских свинок различными дозами вакцины из штамма 55-ВНИИВВиМ Титры анти-ПА антител определяли в ИФА. В качестве заражающей культуры для морских свинок использовали матрикс второй вакцины Ценковского.

Результаты исследования

Одним из направлений совершенствования лабораторной диагностики является разработка и внедрение в практику новых методов и средств обнаружения возбудителей инфекционных^ заболеваний, одной из совершенных основ для конструирования подобных методов могут служить МкАт. Реагенты, созданные на их основе, все шире применяются в исследовательских и диагностических целях.

Настоящая работа, посвященная разработке методов количественной оценки антигенов сибиреязвенного микроба на основе использования МкАт, состояла из ряда этапов: получение МкАт; изучения их свойств; разработки методов определения видоспецифичных антигенов и оценки пригодности этих методов для идентификации Вас. аМИгасЬ и стандартизации вакцинных препаратов по уровню синтеза ПА.

Получение гибридом-продуцентов к диагностически значимым антигенам Вас. апМгапз потребовало оптимизации условий проведения ряда предварительных этапов, в частности, подбора наиболее эффективных схем иммунизации мышей и получения стимулированных спленоцитов - одного из партнеров при слиянии клеток, а также выбора метода скрининга гибридных культур для выявления антителопродуцентов. В качестве последнего был использован непрямой вариант ИФА, удовлетворяющий требованиям специфичности и высокой чувствительности при выявлении минимальных

концентраций белка в пробе. Оптимизация условий постановки ИФА состояла в подборе антигенных препаратов для адсорбции на твёрдой фазе для отбора культур и последующего определения их специфичности к использованным антигенам. При сенсибилизации планшетов использовали растворы антигенов с концентрацией по белку 0,5-10 мкг/мл.

Сравнение различных схем иммунизации мышей линии ВАЬВ/с УЗ-дезинтегратами микробных клеток и спор Вас. аШИгаси, полученных из штаммов 55-ВНИИВВиМ и СТИ, с эффективностью гибридизации стимулированных этими антигенами спленоцитов с миеломными клетками и выходом активных и стабильных антителопродуцентов позволило установить, что при получении гибридом-продуцентов к соматическим антигенам Вас. аЫИгаЫз применение длительных циклов иммунизации мышей не сопровождается увеличением выхода позитивных клонов.

Использование более продолжительных по времени схем иммунизации с многократным введением иммуногена и сочетания его с другими антигенными препаратами, например УЗ-дезинтегратом Вас. атИгаск или при использовании неполного адъюванта Фрейнда приводило лишь к затягиванию опыта и не обеспечивали достаточного выхода позитивных клонов. Вероятно, при одновременном введении ПА с другими антигенными компонентами, иммунный ответ на балластные белки проявляется в большей степени. При этом антигенная нагрузка на одно животное не должна превышать 100 мкг/мл.

Наиболее эффективный выход клонов-продуцентов анти-ПА Вас. аш/ггасм антител также наблюдался при использовании короткой схемы (не более 3 инъекций). Бустерную (заключительную) инъекцию вводили внутривенно или внутрибрюшинно за 3 суток до гибридизации клеток.

На первом этапе работы были предприняты попытки получить антитела к видоспецифичным антигенам вегетативных клеток и спор, для этого в качестве антигенов были выбраны дезинтеграты соматических клеток

и спор Вас. аМИгаш., полученные различными способами (обработка ультразвуком, диметилсульфоксидом, трихлоруксусной кислотой и т.д.). Полученные в результате этих опытов гибридомы синтезировали антитела, не обладавшие видоспецифичными свойствами, все позитивные МкАт перекрёстно взаимодействовали с дезинтегратами сапрофитных бацилл как в ИФА, так и в ИФЛА. Это косвенно подтверждает, что состав соматических клеток и спор многих бацилл в значительной степени представлен перекрёстно реагирующими антигенами (таб. 1).

Таб. 1. Взаимодействие полученных МкАт с дезинтегратами спор в ИФА и цельными инактивированными спорами в ИФлА.

№ Ü Взаимодействие с различными представителями рода Bacillus

Вас. anthracis Вас. cereus Вас. megaterium Вас. subiilis Вас. mucoides Вас. pseudoanthr acts

ИФЛ ИФлА ИФЛ ИФлЛ ИФА ИФлА ИФА ИФлА ИФА ИФлА ИФА ИФлА

1 107 ++ +++ ++ +++ ++ ++ -н- + -Н- + ++ +

2 2А2 +++ +++ ++ +++ ++ + -н- + ++ + ++ +

3 206 +++ - ++ - ++ - ++ - ++ - +++ -

4 2D9 +++ - ++ - - ++ - ++ - ++ -

Примечание «+» положительный результат (количество крестов определяет интенсивность реакции), « - » отрицательный результат.

В последующем в качестве антигенов для иммунизации были использованы культурапьные жидкости Вас. anthracis (содержащие компоненты токсина) и очищенный протективный антиген для получения антитоксических антител.

В результате, при использовании различных схем иммунизации в пяти процедурах гибридизации нами было получено: 4 первичные гибридные культуры к споровым антигенам, 33 к антигенам вегетативной клетки и 85 первичных гибридом к протективному антигену.

Из исследованных МкАт видоспецифичными оказались только антитела к протективному антигену, свойства которых позволяют считать их потенциально пригодными для использования в качестве инструмента для выявления IIA Вас. anthracis.

Таб. 2. Опыты гибридизаций при получении МкАт к антигенам Вас. ап1ИгаЫз.

Компоненты и реакции Гибридизация

1 2 3 4 5

Антиген дезинтеграт спор дезинтеграт вег. форм дезинтеграт вег. форм протективный антиген протективный антиген

Засеяно лунок 192 192 288 288 288

Положительные при первичном тестировании 22 27 93 12 184

Отобрано при повторном тестировании и заморожено 4 8 25 2 83

Таким образом, из представленных МкАт требованию видоспецифичности отвечали только антитела, полученные в опытах с использованием в качестве иммуногена очищенного ПА, предоставленного сотрудниками ГНЦ ПМ, Оболенск.

Для характеристики антител первоначально использовали их сульфатаммонийные преципитаты из культуральной среды, а в последующем и асцитные жидкости. После клонирования гибридом и дальнейшего исследования продуцируемых ими моноклональных антител было отобрано 5 наиболее технологичных культур, сохранявших высокую антителопродукцию при культивировании в лабораторных условиях и асцитогенность при пассировании на мышах (таб. 3).

Таб. 3. Изотипы МкАт и характер взаимодействия МкАт с культуральными жидкостями бацилл в ИФА.

МкАт Изо- Взаимодействие с ПА Взаимодействие с дезинтегратами в ИФА, титры.

тип Титры МкАт в КЖ Титры МкАт в АЖ В.алЛгасй В.тедШп ит В.5иЬШ В.тисок1 05 б.рввис/о иШтсю В.сегеиа

1А1 ДО, 3000 5х 10« 16000 - - - - -

2В6 ДО, 2500 4,5 х 10« 8000 - - - - -

ЗА2 ДО, 5000 6 х 10« 32000 - - - - -

305 ДО, 3000 5х 10« 16000 - - - - -

ЗС12 ДО, 2500 4х 10« 16000 - - - - -

Примечание: «-» - отрицательный результат ИФА. КЖ - культуральная жидкость; АЖ - асцитная жидкость.

Изучение специфичности антител к ПА, проводимое в иммуноблотинге с использованием препаратов нативных и меченных пероксидазой МкАт, показало, что все антитела проявляли полосу 83 кДа, соответствующую цельной молекуле ПА и других компонентов с меньшей молекулярной массой. Это свидетельствует о сохранности антигенсвязывающей способности антител после конъюгирования с пероксидазой. Различия в числе выявляемых разными антителами полос в иммуноблотинге с препаратами ПА, на наш взгляд, можно объяснить различиями в тонкой специфичности антител, распознаваемых им эпитопов антигена или различной концентрацией антител. При сравнении МкАт из нашей коллекции с антителами к ПА любезно предоставленными П.Г.Свешниковым (Всероссийский центр молекулярной диагностики и лечения, ВНЦМДЛ), картина в иммуноблотинге была сходной.

Рисунок № 1. Взаимодействие МкАт в иммуноблоттинге с ПА Вас.аШИгаск при его разделении в 10% полиакриламидном геле.

12 3 4 5 6 7

-94

- 43

-30

1. Анти-ПА сыворотка мыши.

2. Анти сибиреязвенная сыворотка лошади.

3. 3012-ПХ.

4. 2В6-ПХ.

5. ЗА2-Г1Х.

6. 1А1-ПХ.

7. 205-ПХ.

На следующем этапе исследовали пригодность отобранных антител для конструирования диагноста кума для выявления протективного антигена в сэндвич-варианте ИФА, при котором одни антитела используются для

сенсибилизации планшета и захвата антигена, а другие в виде пероксидазног о конъюгата - для выявления антигена. Антитела должны иметь разную эпитопную направленность - не конкурировать между собой при связывании с антигеном. Конкурентное связывание в ИФА проводили на полистироловых планшетах, предварительно сенсибилизированных протективным антигеном в объёме 200 мкл (0,35 мкг/мл). Затем в лунки попарно вносили все отобранные МкАт и МкАт-ПХ в разлицных сочетаниях в концентрациях предварительно определённых в ИФА, и составлявших 50 % от их максимального связывания. На основании полученных данных построили следующие гистограммы (рис.2) По оси ординат указан процент торможения связывания одного из МкАт-ПХ, по оси1 абсцисс названия каждого из немеченных МкАт (тормозящих связывание МкАт-ПХ) (рис.2).

Результаты исследования свидетельствуют о том, что только два варианта антител (1А1 и 205), конкурируют между собой за связывание с антигеном, то есть направлены к одной и той же или стерически близко расположенным антигенным детерминантам, но не конкурируют с остальными МкАт(ЗА2, 2В6, 3012). Для МкАт ЗА2, 2В6, 3012 не обнаружено заметного подавления перекрёстного связывания. Можно заключить, что отобранные 5 вариантов МкАт распознают 4 различных эпитопа в молекуле ПА. При этом незначительный процент связывания меченных моноклональных антител при торможении теми же МкАт вызвано, возможно, снижением аффинности меченных МкАт по сравнению с немечеными.

Рис. 2. Конкурентное взаимодействие МкАт.

Конкурентный анализ отобранных нами МкАТ с антителами, предоставленными сотрудниками ВНЦМДЛ, показал, что из десяти предоставленных антител два конкурировали с антителами ЗА2 из нашей коллекции. Таким образом полученные нами МкАт расширяют спектр выявляемых эпитопов на молекуле протективного антигена.

Далее была оценена способность моноклональных антител связывать ПА после сорбции их на пластике. Для этого были проанализированы все возможные попарные сочетания отобранных антител для сенсибилизации планшетов и их пероксидазных конъюгатов (таб. 4).

Таб. 4. Подбор пары антител для выявления протективного антигена в сэндвич варианте ИФА*

Конъюгат МкАт-ПХ.

205-ПХ 1А1-ПХ ЗА2-ПХ 2В6-ПХ 3012-ПХ

МкАт на твердой фазе. Ю5 — 0,30 1,13 0,26 1,08

1А1 0,10 — 2,03 0,81 1,95

ЗА2 2,42 2,42 — 2,25 2,10

2В6 0,20 0,28 0,25 — 0,46

3012 0,14 0,18 0,23 0,10 —

приведены значения оптической плотности п£и = 49йм, при концентрации 11А 1 мкг/мл.

В качестве сенсибилизирующих наилучшими оказались МкАт ЗА2. Другие антитела после адсорбции на пластике теряли антигенсвязывающую способность, что можно объяснить определенной ориентацией молекул сорбированных на пластике иммуноглобулинов при которой центры связывания с ПА закрыты.

Полученные в этой серии экспериментов результаты свидетельствуют о том, что наибольшей чувствительности удается достичь при использовании в качестве конъюгированных с пероксидазой МкАт 1А1 и 205. По данным титрования референтного препарата протективного антигена

чувствительность теста составляет 5-7 нг ПА в мл (рис. 3).

Рис. 3. Кривые титрования ПА в сэндвич - ИФА при использовании различных проявляющих моноклональных антител, меченных пероксидазой

хрена.

нгУмп

В какой мере данная чувствительность достаточна и обеспечивает достоверное выявление ПА в биологическом материале было установлено в опытах оценки продукции ПА различными вакцинными штаммами сибиреязвенного микроба. Оказалось, что концентрация протективного антигена в культуральной жидкости разных штаммов к 20 часу культивирования микроба достигает 1-2 мкг/мл (таб. 5), что в сотни раз выше чувствительности теста и обеспечивает корректное и достоверное выявление ПА и идентификацию Вас.аыИгаЫз по данному признаку.

Таблица 5. Оценка уровня продукции протективного антигена различными вакцинными штаммами Вас. anthracis in vitro.

Штаммы Вас. anthracis. 55- ВНИИВВиМ СТИ-1 Ихтиман 34F2 М-71

ПА, мг/мл 1,5 1,2 1,9 1,6 0,9

Следует отметить, что для двухсайтового связывания антигена в сэндвич-вариантах ИФЛ не всегда удается подобрать оптимальную пару моноклонапьных антител. Иногда исследователь располагает лишь одним образцом моноклонапьных антител требуемой специфичности. Для подобного случая опробован вариант выявления ПА на основе использования только одного варианта МкАт, примененных для сенсибилизации планшетов. В качестве вторых антител была использована антисибиреязвенная поликлональная лошадиная сыворотка. Для проявления реакции был использован лероксидазный конъюгат полученных в лаборатории гибридом моноклонапьных антител к иммуноглобулину лошади. Этим самым обеспечивалась большая специфичность выявления лошадиных антител по сравнению с применением поликлональных антител к иммуноглобулинам лошади конъюгированных с пероксидазой хрена. Кроме того, при этом варианте тестирования удавалось даже несколько повысить чувствительность реакции за счет связывания с ПА не одной, а большего числа молекул антител. Также нужно отметить, что для выявления ПА по данной схеме необходимо наличие только одного варианта МкАт.

Рис. 4. Кривые титрования ПА в сэндвич - ИФА при использовании МкАт ЗА2 на твёрдой фазе и лошадиного противосибиреязвенного иммуноглобулина.

2,5

В 1

§

г 1,5

0,5

2

♦

0

■Г--т--

О 0,3 1 3 10 30 100 300 1000

НГ/МП

Заключительным этапом нашей работы явилась оценка содержания антител к протективному антигену в сыворотке морских свинок, вакцинированных различными дозами споровой сибиреязвенной вакцины из штамма 55-ВНИИВВиМ. Для оценки в ИФА уровня антител обычно используются планшеты, сенсибилизированные антигеном, к чистоте и качеству которого предъявляются определенные требования. Выделение и очистка ПА весьма сложны и требуют определенных условий экспериментов. Поэтому для сенсибилизации планшетов мы использовали культуральную жидкость вакцинного штамма Вас.амИгаш, содержащую протективный антиген, который захватывался МкАт ЗА2 сорбированными на планшетах. Далее в лунки вносили пробы исследуемых образцов сыворотки в различных разведениях и соответствующий антивидовой пероксидазный конъюгат антител. В соответствии с принятым протоколом испытания через две недели после вакцинации животным вводили разрешающую дозу возбудителя и

оценивали выживаемость свинок в группах. Кровь для определения уровня антител к ПА в ИФА отбирали за три дня до заражения у животных.

Таб. 6. Результаты эксперимента по оценке титров антител к ПА в сыворотках морских свинок.

Группы свинок 1 опытная группа 2 опытная группа 3 опытная группа Контроль

Количество животных 10 10 10 5

Вакцинальная доза на голову (вакцина из штамма 55-ВНИИВВиМ) 120 млн. спор 12 млн. спор 1,2 млн. спор —

Значения титров антител в ИФА но группе р сыворотке крови на 12 день после вакцинации 1:344 1:176 1:84 0

Количество павших после заражения 2-ой вакциной Ценковского (М-71) 0 1 4 5

Анализ данных позволяет заключить, что содержание антител к ПА у вакцинированных животных зависит от дозы веденной вакцины и определяет выживаемость животных при введении разрешающей дозы возбудителя.

Таким образом, можно заключить, что данный вариант анализа пригоден для характеристики вакцинных штаммов по интенсивности продукции ими протективного антигена, определения титров антисибиреязвенных антител в сыворотках крови вакцинированных животных антител, а также как возможный вариант выявления ПА в исследованиях но клонированию гена ПА и получении генноинженерных конструкций как вакцинных препаратов нового поколения.

Выводы

1. Получена оригинальная коллекция гибридом-продуцентов моноклональных антител к протективному антигену Вас. anthracis, распознающих четыре различных антигенных детерминанты.

2. На основе отобранных моноклональных антител разработаны варианты количественного сэндвич-ИФА, позволяющие достоверно определять нротективный антиген Вас. anthracis в культуральных жидкостях с чувствительностью 5-7 нг/мл. Данный тест видоспецифичен и дифференцирует возбудителя сибирской язвы от других представителей рода Bacillus по признаку токсинообразования.

3. Разработанный метод ИФА с использованием моноклональных антител пригоден для характеристики вакцинных штаммов Вас. anthracis по их способности продуцировать ПА и формировать анти-ПА иммунитет.

4. Предложена возможность оценки степени защищенности вакцинированных животных по уровню антител к протективному антигену.

. Практические предложения «Методические рекомендации по идентификации штаммов Вас. апЛгааз в ИФА с помощью моноклональных антител». Утвержденные директором ФГУ ВГНКИ академиком РАСХН А.Н. Паниным. Авторы: Романов М.Г., Яковлева И.В., Кириллов Л.В., Свиридов В.В. Москва, 2005.

Список работ опубликованных по теме диссертации

1. Романов М.Г. - Моноклональные антитела в ветеринарии. Сборник научных трудов ВГНКИ, том 64,2003, с. 31-42.

2. Романов М.Г., Яковлева И.В., Кириллов Л.В., Свиридов В.В. — Использование моноклональных антител для выявления протективного антигена Вас. атИгаЫз. Медицинская иммунология, том 6, № 3-5, май-октябрь, 2004, с.249-250.

3. Романов М.Г., Кириллов Л.В., Яковлева И.В., Свиридов В.В. - ИФА для определения протективного антигена Вас. апМгаЫз. Журнал ветеринария, № 5,2005, с. 27-30.

г

»г

«

ВНИИВСГЭ, 2005 г.,

г. Москва, Звенигородское шоссе, 5

зак. 100/1, тираж 100 экз.

С1 5 8 0 б

РНБ Русский фонд

2006^4 15953

л

J

Сибирская язва, болезнь, которая относится к числу особо опасных зоонозных инфекций, поражающая сельскохозяйственных животных (крупный и мелкий рогатый скот, лошадей, ослов, верблюдов), диких млекопитающих, а также человека, продолжает регистрироваться во многих странах и причиняет большой экономический ущерб [3, 7, 8]. Высокая заболеваемость обусловлена тем, что возбудитель сибирской язвы способен неопределённо долго сохранять жизнеспособность в почве в виде спор и образовывать стойкие стационарные очаги инфекции. Существование таких очагов в разных регионах мира, в том числе и на территории России, создает постоянную угрозу возникновения эпизоотий и заражения людей, которые могут инфицироваться в процессе переработки и использовании животноводческой продукции, полученной от больных животных (мясо, шкуры, шерсть и др.). По данным Всемирной организации здравоохранения в мире ежегодно заболевает около 20 тыс. человек, нередко отмечается и летальный исход [1-6].

В России в настоящее время зарегистрировано около 72 тыс., потенциальных очагов сибирской язвы [7]. Однако, в силу исторических, социальных и экономических обстоятельств большое количество скотомогильников, одиночных мест гибели или захоронений остаётся неучтённым, и по данным ряда исследователей именно они являются источником поступления возбудителя сибирской язвы в природную среду [7]. В итоге, государственный комитет санитарно-эпидемиологического надзора (Госкомсанэпиднадзор Минздрава РФ) оценивает эпидемическую обстановку в отдельных регионах страны как напряженную [3,7].

Перспективы совершенствования методов борьбы с сибирской язвы, как в медицинской, так и в ветеринарной практике напрямую связаны с созданием и применением в повседневной работе быстрых и достоверных методов обнаружения и идентификации возбудителя, а также с совершенствованием существующих средств профилактики.

Традиционные методы бактериологической индикации и идентификации возбудителя включающие: приготовление и окраску мазков, посев на питательные среды, биопробу, а также проведения ряда дополнительных исследований (тест «жемчужного ожерелья», лизабельность фагом, иммунофлюоресцентный тест), обеспечивают получение окончательного результата в сроки не ранее 2-3 суток от момента начала исследования, что существенно тормозит и соответственно усложняет проведение адекватных мер по локализации очага инфекции.

Иммунохимические методы, которые успешно применяются для индикации патогенных микроорганизмов и соответствующих антител уже более 50 лет, позволят во многом решить эту проблему [8, 51]. Примером могут служить созданные за последние годы лабораторные тест-системы для диагностики таких болезней как бруцеллез, туберкулёз, бешенство, иерсиниоз и др. [76, 109].

В основу всех без исключения иммунохимических методов анализа положено образование высокоспецифического комплекса между антигеном и антителом, в котором в качестве антигена могут выступать низкомолекулярные химические соединения (гаптены), белковые молекулы микробного или растительного происхождения, а также различные микробиологические объекты: бактерии, риккетсии, вирусы и тд. Главная задача при разработке иммунодиагностической тест-системы состоит в визуализации единичных взаимодействий антигена с антителом путем регистрации макроскопического сигнала или по изменению физических свойств среды, а также увеличение чувствительности и специфичности иммуноанализа, достигаемое за счёт получения антител с максимальным аффинитетом к искомому антигену и разработке молекулярных систем усиления результата специфического взаимодействия антигена с антителом. Наиболее яркими примерами в этой области являются создание гибридомной технологии для получения моноклокнальных антител (МкАт) с заданными свойствами. Их использование в диагностических тест-системах в сравнении с поликлональными антителами обеспечивает получение более стабильных результатов при сохранении высокой чувствительности и специфичности, а стабильность свойств МкАт является определяющим фактором изготовления стандартных образцов препаратов в достаточно больших количествах. [35, 108].

Существующая потребность в более совершенных методах диагностики, выявления Bacillus anthracis и его токсических субстанций позволило нам определить следующую цель работы.

Цель работы

Получить панель гибридом-продуцентов антител к специфичным антигенам Вас.anthracis и исследовать возможность их применения для иммунохимического анализа сибиреязвенных антигенов и конструирования диагностикумов.

Задачи исследования

При выполнении работы необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести культивирование сибиреязвенного возбудителя и сапрофитных бацилл и приготовить антигенные препараты для иммунизации животных и тестирования гибридом.

2. Подобрать схемы иммунизации мышей антигенными препаратами Bacillus anthracis оптимальные для получения гибридом-продуцентов.

3. Получить гибридомы-продуценты моноклональных антител к видоспецифичным антигенам Bacillus anthracis.

4. Изучить иммунохимическую характеристику и эффекторные свойства моноклональных антител.

5. Разработать методы использования моноклональных антител для качественного и количественного определения распознаваемых ими антигенов.

Научная новизна

Создана оригинальная коллекция стабильных гибридом-продуцентов моноклональных антител к протективному антигену Bacillus anthracis.

Представлены доказательства преимущества применения тестов на основе моноклональных антител по сравнению с классическими методами диагностики и идентификации возбудителя.

Положения, выносимые на защиту

Получение оригинальной коллекции технологичных клонов гибридом-продуцентов антител к протективному антигену сибиреязвенного микроба.

На основе полученных моноклональных антител разработаны специфичные и чувствительные иммуноферментные методы качественного и количественного определения протективного антигена сибиреязвенного токсина в биологическом материале и метод выявления антител к протективному антигену в сыворотке вакцинированных животных. Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, доложены:

• на VIII Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2004» 23-25 мая 2004 г.

• На межлабораторном совещании специалистов ФГУ ВГНКИ 31 мая 2005 года.

• На межлабораторной конференции ГУ НИИВС им. И. И. Мечникова 3 июня 2005 года.

По материалам диссертационной работы опубликовано в периодической печати 3 научные статьи.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав собственных исследований,

Выводы

1. Получена оригинальная коллекция гибридом-продуцентов моноклональных антител к протективному антигену Вас. anthracis, распознающих четыре различных антигенных детерминанты.

2. На основе отобранных моноклональных антител разработаны варианты количественного сэндвич-ИФА, позволяющие достоверно определять протективный антиген Вас. anthracis в культуральных жидкостях с чувствительностью 5-7 нг/мл. Данный тест видоспецифичен и дифференцирует возбудителя сибирской язвы от других представителей рода Bacillus по признаку токсинообразования.

3. Разработанный метод ИФА с использованием моноклональных антител пригоден для характеристики вакцинных штаммов Вас. anthracis по их способности продуцировать протективный антиген и формировать анти-ПА иммунитет.

4. Предложен метод оценки степени защищенности вакцинированных животных по уровню антител к протективному антигену.

Практические предложения

Методические рекомендации по идентификации штаммов Вас. anthracis в

ИФА с помощью моноклональных антител». Утвержденные директором ФГУ

ВГНКИ академиком РАСХН А.Н. Паниным. Авторы: Романов М.Г., Яковлева

И.В., Кириллов J1.B., Свиридов В.В. Москва, 2005 г.

Заключение

Сибирская язва - одна из опасных остропротекающих инфекционных болезней животных и человека, раз возникнув в какой-либо местности, она может укорениться, сохраняя на многие десятилетия угрозу повторных вспышек. Разработка методов быстрой и точной идентификации возбудителя сибирской язвы актуально для своевременной диагностики заболевания.

Одним из направлений совершенствования лабораторной диагностики возбудителей инфекционных заболеваний является разработка и внедрение в практику новых методов и средств обнаружения патогенных микроорганизмов для своевременного проведения мероприятий по предотвращению распространения заболевания и выявлению очагов потенциальной инфекции. В части создания высокоактивных и высокоспецифичных диагностических препаратов для выявления возбудителя сибирской язвы и его токсических субстанций, одним из перспективных направлений исследований признано конструирование иммунодиагностических препаратов на основе МкАт.

В ряде зарубежных публикаций описано получение МкАт против антигенов трех основных компонентов токсина (летального, отечного и протективного факторов) [82, 83], а также к основному соматическому антигену Вас. anthracis, которые успешно применяют как в диагностических, так и в лечебных целях. Сведения об использовании подобных препаратов в нашей стране в доступной литературе нами не обнаружены.

Целью настоящей работы являлось получение МкАт к диагностически значимым видоспецифичным антигенам сибиреязвенной бациллы и изучение возможности создания на их основе высокоэффективных препаратов, пригодных для анализа проб из объектов внешней среды и клинического материала, а также оценка уровня экспрессии ПА различными вакцинными штаммами in vitro.

В работе использовали шесть вакцинных штаммов Вас. anthracis и пять видов сапрофитных бацилл, полученные из коллекции музея ФГУ ВГНКИ ветпрепаратов. Из штамма 55-ВНИИВВиМ Вас. anthracis, а также пяти основных видов сапрофитных бацилл, которые, по многочисленным литературным данным, имеют максимальный антигенный перекрест с возбудителем сибирской язвы, готовили антигенные препараты: УЗ-дезинтеграт микробных клеток и спор, споры инактивированные 1% формалином, а также культуральные жидкости выше перечисленных бацилл для определения токсических экзокомпонентов. В качестве экспериментальных животных применяли мышей линии BALB/c, массой 18-20 граммов, полученных из питомника РАМН «Крюково». Миеломными партнерами при гибридизации служили клетки мышиной линии P3-X63.Ag8.653. Получение гибридом-продуцентов МкАт к антигенам Вас. anthracis потребовало оптимизации ряда условий проведения различных этапов, в частности, подбор наиболее эффективных схем иммунизации мышей и получения стимулированных спленоцитов, выбор метода скрининга МкАт и тд.

В качестве последнего был использован непрямой вариант ИФА, удовлетворяющий требованиям специфичности и высокой чувствительности при выявлении минимальных концентраций белка в пробе. Для сенсибилизации планшетов использовали растворы антигенов с концентрацией 1-10 мкг/мл белка.

Сравнение различных схем иммунизации мышей линии BALB/c УЗ-дезинтегратами микробных клеток и спор Вас. anthracis, полученных из штаммов 55-ВНИИВВиМ и СТИ, с эффективностью гибридизации стимулированных этими антигенами спленоцитов с миеломными клетками и выходом активных и стабильных антителопродуцентов позволило установить, что при получении гибридом-продуцентов к соматическим антигенам Вас. anthracis не следует применять длительный цикл иммунизации мышей.

Наиболее эффективный выход клонов-продуцентов анти-ПА Вас. anthracis антител также наблюдался при использовании короткой схеме (не более 3-4 инъекций). Бустерную (заключительную) инъекцию вводили за 3 суток внутривенно или внутрибрюшинно.

Использование более продолжительных по времени схем иммунизации с многократным введением иммуногена и сочетания его с другими антигенными препаратами, например УЗ-дезинтегратом Вас. anthracis или при использовании неполного адъюванта Фрейнда приводило лишь к затягиванию опыта и не обеспечивали достаточного выхода позитивных клонов. Вероятно, при одновременном введении ПА с другими антигенными компонентами, иммунный ответ на балластные белки проявляется в большей степени. При этом антигенная нагрузка на одно животное не должна превышать 100 мкг/мл.

Первоначально в качестве антигенов были использованы дезинтеграты соматических клеток и спор Вас. anthracis. Во всех опытах по получению гибридом-продуцентов МкАт к эпитопам видоспецифичных антигенов клеточной стенки или споровых антигенов, отмечалась быстрая утрата признака антитело продукции большинством из первично позитивных (по результатам тестирования в ИФА) культур. При последующем определении видоспецифичности полученных антител все отобранные образцы пекрёстно взаимодействовали с антигенами многих видав из рода Bacillus как в ИФА так и в ИФлА. На втором этапе работы в качестве антигенов для иммунизации были использованы культуральные жидкости Вас. anthracis (содержащие компоненты токсина) и очищенный протективный антиген для получения антитоксических антител.

В результате, при использовании различных схем иммунизации в шести процедурах гибридизации нами было получено: 4 первичные гибридные культуры к споровым антигенам, 33 к антигенам вегетативной клетки и 85 первичных гибридом к протективному антигену, антитела от 5 из которых были проклонированны и полностью охарактеризованы. Первоначальным источником антител во всех случаях служили супернатанты гибридом, которые с целью концентрирования и увеличения сроков сохранности преципетировали сульфатом аммония при 50% насыщении. Полученные таким в результате препараты использовались для определения изотипа, специфичности и активности отобранных антител.

Таким образом из представленных МкАт требованию видоспецифичности отвечали только антитела полученные в опытах с использованием в качестве иммуногена очищенного ПА, предоставленный сотрудниками ГНЦ п. Оболенск.

Изучение специфичности антител в отношении отдельных субъединиц ПА, проводимое в иммуноблотинге, позволило выявить 4 варианта взаимодействия у 5 моноклональных антител к протективному антигену. Все антитела выявляли цельную молекулу ПА (ПА 83), но по-разному взаимодействовали с отдельными продуктами его деградации.

В ИФА оценивалось взаимодействие МкАт с очищенным ПА при первичном и повторном тестировании, а также проводился анализ видоспецифичности антител с культуральными жидкостями сибиреязвенного штамма 55-ВНИИВВиМ и сапрофитных бацилл. Все полученные МкАт обладали выраженными видоспеспецифичными свойствами и взаимодействовали только с культуральными жидкостями Вас. anthracis, связывая протективный антиген, секретируемый только сибиреязвенными штаммами. Наиболее активным оказалось МкАт ЗА2. Перекрестное взаимодействие, определяемое в ИФА с сапрофитами, было близко к фоновому уровню. Таким образом, реакционная способность и активность МкАт позволяет считать их потенциально пригодными для использования в качестве средства контроля за ПА Вас. anthracis.

Следующей задачей настоящей работы была разработка системы анализов на основе полученных и изученных МкАт для качественного и количественного определения ПА. Для создания подобных иммуноферментных анализов необходимо использовать стандартный препарат выделенного и очищенного антигена, который будет служить референтным образцом. Оценка содержания исследуемого антигена в тестируемых образцах в таком случае осуществляется посредством выражения концентрации вещества через интенсивность иммуноферментной реакции в соответствии с таковой для референс-образца. В качестве стандартного образца мы использовали очищенный ПА что позволило нам разработать и охарактеризовать несколько вариантов количественного ИФА для данного антигена.

Сначала необходимо было подобрать пару антител, не конкурирующих между собой при связывании с антигеном. Для этого были оценена активность приготовленных пероксидазных коныогатов каждого из МкАт к ПА.

Затем в ИФА исследовали попарно конкуренцию за связывание с ПА конъюгатов и немеченых моноклональных антител. Результаты исследования свидетельствуют о том, что отобранные 5 вариантов МкАт распознают 4 различных эпитопа в молекуле ПА и пригодны для двухсайтового связывания молекулы ПА парами МкАт и создания сэндвич-варианта ИФА для выявления ПА.

Далее была оценена способность моноклональных антител сохранять антигенсвязывающую способность после сорбции их на пластике, проанализированы все возможные сочетания отобранных антител для сенсибилизации планшетов и их пероксидазных конъюгатов.

В качестве сенсибилизирующих наилучшими оказались МкАт ЗА2. Другие антитела после адсорбции на пластике теряли антигенсвязывающую способность, что можно объяснить определенной ориентацией молекул сорбированных иммуноглобулинов.

Полученные в этой серии экспериментов результаты свидетельствуют о том, что наибольшей чувствительности удается достичь при использовании в качестве конъюгированных с пероксидазой МкАт 1А1 и 2G5. По данным титрования референтного препарата протективного антигена чувствительность теста составляет 5-7 нг ПА в мл.

В какой мере данная чувствительность достаточна и обеспечивает достоверное выявление ПА в биологическом материале было установлено в оцытах оценки продукции ПА различными вакцинными штаммами сибиреязвенного микроба. Оказалось, что концентрация протективного антигена в культуральной жидкости разных штаммов к 20 часу культивирования микроба достигает 1-2 мкг/мл, что в сотни раз выше чувствительности теста.

Таким образом, можно заключить, что данный вариант анализа пригоден как для характеристики вакцинных штаммов по интенсивности продукции ими протективного антигена, так и для выявления ПА в исследованиях по клонированию гена ПА и получении генноинженерных конструкций как вакцинных препаратов нового поколения.

Следует отметить, что не всегда удается подобрать оптимальную пару моноклонаольных антител для двухсайтового связывания антигена в сендвич-вариантах ИФА. Иногда исследователь располагает лишь одним образцом моноклональных антител требуемой специфичности. Для подобного случая опробован вариант выявления ПА на основе использования только одного варианта МкАт, примененных для сенсибилизации планшетов. В качестве вторых антител была использована антисибиреязвенная поликлональная лошадиная сыворотка. Для проявления реакции был использован пероксидазный конъюгат полученных в лаборатории гибридом моноклональных антител к иммуноглобулину лошади. Эти самым обеспечивалась большая специфичность выявления лошадиных антител по сравнению с применением поликлональных антилошадиных конгъюгатов. Кроме того, при этом варианте тестирования удавалось даже несколько повысить чувствительность реакции за счет связывания с ПА не одной, а большего числа молекул антител.

Заключительным этапом нашей работы явилась оценка содержания антител к протективному антигену в сыворотке морских свинок, вакцинированных различными дозами споровой сибиреязвенной вакцины из штамма 55-ВНИИВВиМ. В соответствии с принятым протоколом испытания через две недели после вакцинации животным вводили разрешающую дозу возбудителя и оценивали выживаемость свинок в группах. Перед заражением у животных отбирали кровь для определения уровня антител к ПА в ИФА. Поскольку для оценки уровня антител необходимо сенсибилизировать планшеты протективным антигеном, выделение и очистка которого весьма сложна и требует особых условий эксперимента, для сенсибилизации планшетов использовали культуральную среду вакцинного штамма Вас. anthracis, протективный антиген из которой заякоривался на планшете через моноклональные антитела ЗА2. Далее в лунки вносили пробы исследуемых образцов сыворотки в различных разведениях и соответствующий антивидовой пероксидазный конъюгат антител.

Анализ данных позволяет заключить, что содержание антител к ПА у вакцинированных животных зависит от дозы веденной вакцины и определяет выживаемость животных при введении разрешающей дозы возбудителя.

Таким образом, можно заключить, что на основе использования полученных моноклональных антител разработаны специфичные и чувствительные иммуноферментные методы качественного и количественного определения протективного антигена сибиреязвенного токсина в биологическом материале и метод выявления антител к протективному антигену в сыворотке вакцинированных животных.