Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Изучение свойств моноклональных бифункциональных антител в а-эндорфину и пероксидазе хрена

л*

г'

На правах рукописи

Дергунопа Наталья Николаевна

ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ БИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К а-ЭНДОРФИНУ И ПЕРОКСИДАЗЕ ХРЕНА

Специальность 14.00.3fi - аллерголошя и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации па соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1997

Работа выполнена в Институте клинической психиатрии Научного Центра Психическою Здоровья РЛМ1Г

Научный руководитель:

кандидат биологических паук Л.Д.Дмигриев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Л.Д.Черноусов доктор биологических наук, К.Н.Ярыгин

Ведущая организация:

Институт канцерогенеза Онкологического

Научного

Центра РАМН

Защита состоится "_"_1997г.

в_часов на заседании диссертационного Ученого Совета № Д.084.14.06

при Российском государственном медицинском университете (117869, Москва, ул.Островитянова, 1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Ученый секретарь диссертационного Совета, к.м.н., доцент

Т.Е.Кузнецова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Наряду с обычными моноклональ-ными антителами (МКА) гибридомная технология позволяет получать биспецифические антитела (БИЛТ), несущие места связывания двух различных антигенов. Для получения клонов-продуцентов БИЛТ сливают две гибридомы (или, в другом варианте, гибридому и иммунные лимфоциты), секретирующие различные МКА. В образующихся гибридных гиб-ридомах (так называемых, квадромах или триомах) происходит рекомбинация легких (L, light) и тяжелых (II, heavy) цепей родительских антител, в результате чего образуется несколько видов антител, включая БИАТ (рис. 1). Несмотря на кажущуюся простоту описанного механизма, многие аспекты процесса образования квадромных антител остаются неизученными. С теоретической и практической точек зрения представляется важным выяснение вопроса о том, какой тип ассоциации L и Н цепей превалирует в гибридных гибридомах при сборке молекул антител - случайная рекомбинация, или имеет место предпочтительное связывание гомологичных цепей (то есть цепей, происходящих от одного родительского МКА). В теоретическом плане этот вопрос тесно связан с проблемой разнообразия антител. Существует гипотеза, что предпочтительная ассоциация может быть следствием процессов, направленных на отбор высокоаффинных H-L пар во время созревания В-клеток. С практической точки зрения важно то, что способ ассоциации цепей должен влиять на распределение квадромных антител. В частности, предпочтительная ассоциация гомологичных легких и тяжелых цепей повышает выход БИАТ, так как гетерологичные H-L пары, как правило, неактивны в отношении связывания с антигенами. Вместе с тем, изучение качественного и количественного состава иммуноглобулинов, секретируемых гибридными гибридомами, осложняется недостаточной разработкой методов анализа квадромных антител (смеси близких по молекулярному весу и физико-

химическим свойствам молекул). В методическом плане такой анализ оказывается достаточно сложной задачей. В особенности это относится к количественным аспектам популяций квадромных антител, которые практически не анализировались

С вопросом о взаимодействии цепей тесно связан и вопрос об анти-генсвязывающих свойствах наиболее интересного (с точки зрения биотехнологии) продукта секреции гибридных гибридом - БИАТ. В какой мере гибридная молекула сохраняет аффинность родительских антител? Сведения об этом весьма ограничены: подробное исследование антиген-связьгвающих свойств БИЛТ, полученных с помощью гибридизации клеток, было проведено в единичных работах. Таким образом, актуальным является разработка методов анализа антител, секретируемых гибридными гибридомами, изучение их антигснсвязывающих свойств и механизмов образования.

В настоящей работе предпринята попытка исследовать некоторые из этих вопросов, используя в качестве модели получепную в лаборатории нейроиммунологии НЦПЗ РАМН гибридную гибридому (квадрому), специфичную к а-эндорфину (ЭНД) и пероксидазе хрена (ПХ).

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью настоящей работы было изучение взаимодействия БИАТ с антигенами, а также разработка экспериментальных подходов, позволяющих проводить количественный и качественный анализ продуктов секреции гибридных гибридом и расшифровывать способ ассоциации Ь и Н цепей в гибридных клетках.

В задачи работы входило:

1. Разработать теоретические модели рекомбинации легких и тяжелых цепей в гибридных гибридомах, позволяющие предсказывать характер распределения антител в зависимости от способа ассоциации Н и Ь цепей.

2. С помощью аффинной хроматографии и радиоиммунологического анализа провести количественный анализ продуктов секреции трех клопов квадромы, специфичной к ЭНД и ГТХ.

3. Проанализировать аффинноочищенные фракции квадромных антител в отношении состава легких и тяжелых цепей с помощью двумерного электрофореза.

4. Путем сопоставления экспериментальных и теоретических распределений антител и результатов электрофоретического анализа Н-Ь состава расшифровать способ ассоциации легких и тяжелых цепей в квадромных клонах.

5. Изучить взаимодействие БИЛТ с антигенами, в том числе в отношении наличия или отсутствия кооперативного эффекта. Сравнить аффинность БИАТ и родительских МКА. Изучить возможность использования БИАТ в иммуноблоттинге и иммуногистохимии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. В результате проведенного исследования впервые были детально проанализированы количественные аспекты популяций квадромных антител. Также впервые проведен анализ Н-Ь состава квадромных антител с помощью двумерного электрофореза в по-лиакриламидном геле. Использование качественного и количественного методов анализа антител позволило убедительно доказать наличие гомологичного предпочтения в одной из Н-Ь пар и случайную рекомбинацию - в другой. Разработанные в настоящей работе оригинальные экспериментальные подходы и теоретические модели расширяют возможности анализа квадромных антител и механизмов, управляющих образованием этих антител в квадромных клетках. Кроме того, анализ аффинности БИЛТ, образованных квадромой, показал, что эти молекулы в полной мере сохранили антигенсвязывающие свойства родительских антител. Мы показали также отсутствие кооперативного эффекта при связывании

БИАТ с антигенами. Полученные результаты могут представлять интерес для возможного использования этого нового класса биомолекул.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Основные положения работы были доложены на Первой Международной зимней школе по нейрохимии "Новые тенденции в исследовании метаболизма мозга", Санкт-Петербург (1995).

По теме диссертации опубликовано семь печатных работ: тезисы и шесть статей.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 100 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты, обсуждение результатов, выводы и список литературы (100 источников). Диссертация иллюстрирована 8 фотографиями, 9 таблицами, 8 рисунками.

Рис.1. Антитела квадромы. Легкая (L() и тяжелая (Hj) цепи антител к антигену 1 (АГ1), легкая (Ь2) и тяжелая (Н2) цепи антитела к антигену 2 (АГ2). (А) - случайная рекомбинация легких и тяжелых цепей IgG; (Б) -предпочтительная рекомбинация но обеим цепям; (В) - предпочтительная рекомбинация по одной паре цепей.

| II | 1-ое родительское | | || 2-ое родительское

антитело

(А)

L, 1||1 1||1 1||1

Hi анти-АГ1 антитела

БИАТ

антитело

'II ' I I I I L2

анти-АГ2 антитела Н2

|||< |||> |Ц|

функционально неактивные антитела

(Б)

анти-ЛП AT

БИАТ

анти-АГ2 AT

(В)

БИЛТ

'II1

'II

анти-АГ! АТ

анти-АГ2 АТ

II

неактивные АТ

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

КЛЕТОЧНЫЕ ЛИНИИ. В качестве источников моноспецифических и биспецифических МКЛ мы использовали панель ранее полученных в лаборатории иммунологии НЦПЗ РАМН гибридом, секретирующих МКА к ЭНД (гибридома Р8/40Е9, субкласс ПХ (гибридома 36Р9, суб-

класс 1§01) и три клона тетрадомы 52С10, продуцирующую БИАТ ЭНД-ПХ (^023/^01) [Мэбзшо е1 а1, 1992].

АФФИННАЯ ОЧИСТКА АНТИТЕЛ ИЗ АСЦИТА. Моноспецифические антитела (к ЭНД Г1Х) очищали путем одностадийной аффинной хроматографии соответственно на ЭНД-сефарозе и ПХ-сефарозе. Лсцитные жидкости и культуральные супернатанты тетрадом могут содержать до 10 типов антител (рис. 1). Для получения антител асциты или культуральные жидкости последовательно фракционировали на колонках с ПХ-сефарозой и ЭНД-сефарозой. В результате было выделено четыре фракции антител: антиэндорфиновые, антипероксидазные, бифункциональные и неактивные. По специфичности эти антитела могут быть разделены на 4 фракции (рис. 1): антипероксидазные АТ и антиэндорфиновые АТ (эти антитела могут включать молекулы, у которых одно плечо образовано сочетанием гетерологичных легких и тяжелых цепей), неактивные антитела (у которых оба плеча образованы гетероло-гичными парами Ь и II цепей) и БИАТ. Выход БИАТ в квадромных асци-

тах был довольно высоким и составлял около 30% суммарного иммуно-логически активного IgG квадром.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ ПОЛУЧЕННЫХ АНТИТЕЛ. Во всех полученных фракциях антител была проверена специфичность. Антиэндорфино-вые антитела (наряду с БИАТ) обладали способностью связывать Ш1-ЭНД, а также связываться с ЭНД в твердофазном ИФА. Антиперокси-дазные и бифункциональные антитела связывали ПХ в твердофазном ИФА (ПАП-тесте). Только биспецифические антитела обладали активностью в твердофазном ИФА с двумя антигенами (double-antigen ELISA), т.е. одно их плечо связывалось с ЭНД, абсорбированным на поверхности иммунных планшет, а второе - с пероксидазой хрена (схема ИФА с двумя антигенами приведена на рис. 2).

Рис. 2. Схема твердофазного иммуноферментного анализа с двумя антигенами.

1 /БСА iQy

-I БИАТ Поверхность плашки

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАВНОВЕСНОЙ КОНСТАНТЫ АССОЦИАЦИИ МОНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ И БИСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ В ОТНОШЕНИИ САЙТОВ, СВЯЗЫВАЮЩИХ а-ЭНДОРФИН. Равновесную константу ассоциации (Ка) сх-эндорфина с родительскими анти-ЭНД антителами и с эндорфинсвязывающим сайтом БИАТ ЭНД-ПХ определяли методом Скэтчарда, с использованием меченного Ш1 эндорфина. На рис.3 приведены графики Скэтчарда, характеризующие связывание ЭНД

ЭНД - а-эндорфин ПХ - пероксидаза хрена БИАТ - моноклоналыгае биспеци-фическое антитело

БСА - бычий сывороточный альбумин

с момоспецифическими антителами, БИЛТ и биспецифическими антителами в присутствии избытка ПХ. Можно видеть (рис. 3), что графики Скэтчпрда представляют из себя прямую линию, причем наклон прямых к оси абсцисс одинаков во всех рассматриваемых случаях.

связавшегося с антителами; р - концентрация "свободного" эндорфина. а. - моноклональные антитела к эндорфину; и -бифункциональные антитела; ф - бифункциональные антитела в присутствии избытка пероксидазы хрена.

В таблице 1 суммированы результаты трех независимых опытов по определению аффинности моноспецифических и бисиецифических антител к ЭНД Разброс Ка в разных опытах связан с использованием различных партий меченого ЭНД и обычен для подобного рода эксперимен-

тов. В целом, не наблюдается достоверных различий Кя для моноспецифических и биспецифических антител.

Таблица 1

Равновесные константы связывания альфа-эндорфина с моноспецифическими (анти-ЭНД) и биспецифическими (анти-ЭНД-ПХ) моноклональны-ми антителами.

Специфичность Присутствие второго антигена (ПХ) Ка (х107)

опыт 1 опыт 2 опыт 3

Анти-ЭНД - 2,29±0,29 1,61+0,15 1,93±0,06

БИАТ, анти-ЭНД-ПХ - 2,22±0,22 1,61+0,13 2,34+0,15

БИАТ, анти-ЭНД-ПХ 1,25x107 М 2,13±0,24 1,93±0,03 --------- .] 2,22±0,05

В опытах 1,2 и 3 использовали разные партии меченого 1-эндорфина.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ РАВНОВЕСНОЙ КОНСТАНТЫ АССОЦИАЦИИ МОНОСПЕЦИФИЧЕСКИХ И БИСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНИТЕЛ В ОТНОШЕНИИ САЙТОВ, СВЯЗЫВАЮЩИХ ПЕРОКСИДАЗУ ХРЕНА. Аффинность родительских анти-ПХ МКА 36Р9 и связывающего ПХ плеча БИАТ определяли твердофазным иммуноферментным методом. Планшеты насыщали аффинноочищенными кроличьими АТ к 1§0 мыши и последовательно инкубировали с антителами к ПХ или с БИАТ и пероксида-зой хрена в различных концентрациях. Параллельно определяли активность тех же количеств пероксидазы в отсутствие антител. В контрольных опытах было показано, что избыток антител не влияет на активность пероксидазы. Кривые связывания строили в координатах Скэтчар-да и определяли равновесную константу ассоциации, характеризующую связывание пероксидазы с моноспецифическими антителами, БИАТ и БИАТ в присутствие избытка сх-ЭНД. В таблице 1 представлены результаты трех независимых опытов по определению аффинности моноспецифических АТ и БИАТ в отношении ПХ. Можно видеть, что и в этом слу-

чае не наблюдается достоверного изменения аффинности бифункциональных антител в сравнении с родительскими монофункциональными антителами 36Р9.

Таблица 2

Равновесные константы связывания пероксидазы хрена с моноспецифическими (анти-ПХ) и биспецифическими (анти-ЭНД-ПХ) моноклональ-ными антителами.

Специфичность Присутствие второго антигена (ЭНД) К, (х109)

опыт 1 опыт 2 опыт 3

Лнти-ПХ - 0,97±0,47 0,90±0,12 0,65±0,14

БИЛТ, ан-ти-ЭНД/ПХ - 0,95±0,41 0,63±0,22 0,47±0,07

БИАТ, ан-ти- эн,д/пх 1,145х10~'М Н.О. 0,64+0,28 Н.О.

Опыты 1, 2 и 3 поставлены с разными партиями пероксидазы хрена; и.о. - не определяли.

ВЛИЯНИЕ ИЗБЫТКА ОДНОГО ИЗ АНТИГЕНОВ НА СВЯЗЫВАНИЕ БИСПЕЦИФИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ СО ВТОРЫМ АНТИГЕНОМ. БИАТ являются весьма удобной моделью для выяснения вопроса о том, влияет ли связывание антигена с одним из плечей антитела на антиген-связывающую способность второго плеча. Данные, представленные в таблицах 1 и 2 (последняя строка в каждой таблице) свидетельствуют о том, что более чем тысячекратный (в сравнении с концентрацией антител) молярный избыток одного из антигенов в инкубационной смеси не влияет на аффинность БИАТ в отношении второго антигена. Избыток ПХ достоверно не влияет на аффинность БИАТ в отношении ЭНД, точно так же, избыток ЭНД не влияет на аффинность БИАТ в отношении ПХ. Таким образом, в наших опытах не наблюдалось кооперативного эффекта при связывании антигенсвязывающих центров БИАТ с антигенами.

Рис.4. Иммуногистохимическая локализация а-эндорфина в гипофизе крысы с помощью моноклональных бифункциональных антител со специфичностью к н-эндорфину и пероксидазе хрена.

а)

б)

■

Л' А-цм-

п

Срезы гипофизов инкубировали с раствором очищенных биспецифических антител и пероксидазы хрена в течение ночи при 0°С. Пероксидазную реакцию проводили с помощью диаминобензидина. а - передняя доля гипофиза, б - промежуточная (П) и задняя (3) доли гипофиза.

Рис.5. Иммуноблоттинг экстракта гипофиза быка с помощью моноклональных бифункциональных антител со специфичностью к а-эндорфину и пероксидазе хрена.

-проопиомеланокортин {5-липотропин эндорфины

После блоттинга нитроцеллюлозную пластину разрезали на полоски, соответствующие электрофореграмме индивидуального белкового образца. Полоски инкубировали со смесью биспецифических антител и пероксидазы хрена (10 мкг/мл на каждую). Указаны позиции проопиомеланокортина, |5-липотропина и эндорфинов.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ БИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ В ИМ-МУНОГИСТОХИМИИ И ИММУНОБЛОТТИНГЕ Для иммуногистохи-мического окрашивания срезы гипофиза, фиксированные глутаровым альдегидом, инкубировали с аффинноочищенными БИАТ в присутствии ПХ. Способность БИАТ одновременно связывать два антигена, а-ЭНД и ПХ, давала возможность проводить иммунопероксидазное окрашивание в одну стадию. После инкубации срезов с субстратом ПХ (диаминобензидином) наблюдалось интенсивное окрашивание промежуточной доли гипофиза. В передней доле было выявлено относительно небольшое количество эндорфин-положительных клеток, в задней доле окрашивание отсутствовало (рис.4).

При ДСН-электрофорезе и последующем иммуноблоттинге экстракта гипофиза быков с БИАТ было выявлено три полосы (рис. 5), соответствующие по молекулярному весу предшественнику эндорфинов -проопиомеланокортину и продуктам его процессинга: р-липотропину (М,« 10000) и эндорфинам (Мг~ 1700-3400; а, р и у эндорфины в одной полосе). В данном случае иммунопероксидазное окрашивание также осуществляли в одну стадию.

В целом, характер окрашивания бифункциональными антителами срезов гипофиза и полосы, выявляемые в экстрактах гипофиза при иммуноблоттинге, аналогичны таковым, получаемым с МКА к ЭНД.

ИЗУЧЕНИЕ АССОЦИАЦИИ ЛЕГКИХ И ТЯЖЕЛЫХ ЦЕПЕЙ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ ВНУТРИ КВАДРОМ. Распределение антител, образованных квадромными клетками, может зависеть от ряда факторов, важнейшим из которых является, по-видимому, поведение легких и тяжелых цепей во время сборки молекул антител. Обычно считают, что функционально активные плечи антител образуются в результате ассоциации гомологичных легких и тяжелых цепей, в то время как плечо, об-

разованное гетерологичными Н-Ь цепями, неактивно. Поэтому в квадро-мах с гомологичной предпочтительной Н-Ь ассоциацией можно ожидать более высокого выхода БИАТ, чем при случайной рекомбинации легких и тяжелых цепей, в процессе которой большинство антител будут иметь одно или два неактивных плеча (рис. 1). Выяснение вопроса о том, насколько часто встречается гомологичная Н-Ь предпочтительность в квадромных линиях, осложняется недостаточной разработкой методов анализа квадромных антител. Рассмотрим модели, которые позволяют проанализировать влияние на состав квадромного следующих факторов: 1) способа ассоциации цепей и 2) относительной скорости продукции родительских цепей.

Модель I. Случайная рекомбинация легких и тяжелых цепей.

Такие квадромы образуют 10 изоформ антител (рис. 1, А). Доля каждого вида антител в общем пуле молекул может быть определена произведением долей соответствующих Н-Н и 1^Ь комбинаций, участвующих в образовании данного антитела. При условии неактивности гетерологичных Н-Ь пар, эти изоформы могут быть разделены на четыре группы, в соответствии со специфичностью антител: БИАТ, анти-АГ], анти-АГ2 и неактивные антитела (анти-АГ) и анти-АГ2 - специфичность родительских МКА, АГ] и АГ2 - обозначения двух разных антигенов). Доли этих групп могут быть выражены следующими формулами (выво/ формул см. в "Приложении" к диссертации):

(I) БИАТ У1 = 2Ы /г г

(II) анти-АГ, у2 = (1 +2Ь +21) ¡г г

(III) анти-АГ2 уз = (Ь2 I2 +2Ъ2\ +2Ы г) ¡г г

(IV) неактивные у4 = (Ь2 +2Ы +12 ) /г г

где Ь - отношение внутриклеточных концентраций различных родительских Н цепей ( Ь=[Н2]/[Н1]), 1 - соответствующее отношение кон-

центраций родительских L цепей (1=[ Lj] / [Li]), azr =(l+h)2x(l+l)2 - общее число равновероятных исходов.

Модель II. Тяжелые цепи проявляют абсолютную предпочтительность по отношению к гомологичным легким цепям.

Такие квадромы образуют только три вида антител (БИАТ, анти-АГ] и анти-ЛГ2), как показано на рис. 1, Б. При условии случайного образования Н-Н пар и синтеза легких цепей в эквимолярном количестве к тяжелым цепям, распределение этих антител может быть выражено следующим образом: yj : у2 : у, = 2h : 1 : h 2 , где h = [Н2] / [HJ. Максимальный выход БИАТ составляет 50% (при эквимолярном синтезе, h =1).

Модель III. Гомологичное предпочтение в одной H-L паре.

В этой модели тяжелые цепи одного родительского антитела проявляют абсолютное предпочтение к гомологичным легким цепям, в то время как тяжелые цепи другого родительского антитела могут соединяться с гомологичными и гетерологичными легкими цепями, как изображено на рис. 1, С. Для простоты модели предполагается избыточный синтез легких цепей, так что образование H-L пар не изменяет существенным образом относительные доли L] и Ь2 цепей во внутриклеточном пуле легких цепей. Н-Н пары образуются случайно. При этих условиях доля БИАТ в общем пуле квадромных антител (избыточные L цепи не учитываются) может быть выражена уравнением: yj=6hl/zp, где zp=4+2h+h2+6hl+21h2+l2h2 - общее число равновероятных исходов. Соответствующие формулы для остальных фракций (анти - АГ], анти-АГ2, и неактивных антител) приведены в "Приложении".

В табл. 3 представлены примеры теоретически возможных количественных распределений антител для этих моделей. Очевидно, -что кроме рассмотренных крайних случаев полной свободы H-L рекомбинирования и полного его ограничения в реальных квадромах возможны также различные промежуточные ситуации относительного предпочтения.

Таблица 3

Расчетные количества 1§0, продуцируемого гипотетическими квадромами с различным типом ассоциации Н и Ь цепей в процессе сборки 1§С моле-

Гипотетические квадромы (№) 1 1 3 4 5 6

Вид Н/Ь ассоциации Случайная ассоциация Н и Ь цепей Предпочтительная ассоциация Н и Ь цепей в обеих Н-Ь парах е Предпочтительная ассоциация Н и Ь цепей в одной гомологичной Н-Ь паре

Продукция цепей родительских Эквивалентная Неэквива лентная Эквивалентная Неэквива лентная Эквивалентная Неэквива лентная

ь' 1 2,5 1 4 1 2,99

1' 1 2,5 1 4 1 2,49

Состав квадромы (%): БИАТ (I) 12,5 8,3 50,0 32,0 37,5 27,3

анти-АГГ (II) 31,25 7,3 25,0 4,0 18,75 6,1

анти-АГ2°(Ш) 31,25 67,7 25,0 64,0 37,5 61,1

неактивные АГ(ГУ) 25,0 16,7 0 0 6,25 5,5

Общий (1+И+Ш+1У) 100 100 100 100 100 100

Отношения: анти-АГ1 и анти-АГ2 1:1 1:10 1:1 1:16 1:2 1:10

БИАТ и сумма других АТ® 1:7 1:11 1:1 1:2 1:1,67 1:2,7

БИАТ и неактивные АГ 1:2 1:2 50:0 32:0 6:1 5:1

- [Н2]ь/ [Щ, где [НгЫН,]. 1 - то же для Ь цепей. 1 =[Ь,] / [Ц], где [^НЩ.

Специфичность МКА, продуцируемых родительскими гибридомами.

^Гетерологичные Н-Ь пары (Н[-Ь2 и Н2-Ь[) подразумеваются неактивными.

В квадромах N2 1 и № 2 две родительские тяжелые цепи (Н1 и Н2) рекомби-нируют случайным образом с легкими цепями (Ь, и Ь2). Н-Н соединение также случайно. Иллюстрация на рис. 1, А.

еВ квадромах № 3 и № 4 Н1 цепи ассоциируют только с Ц цепями и Н2-только с Ь2 (рис. 1, Б). Н-Н связывание случайна и Ь2 цепи согласно допущению синтезируются в избытке над Н! и Н2, соответственно, или в примерно эквимолярном им количестве.

В квадромах № 5 и № 6 Н2 цепи ассоциируют случайно с Ц и Ь] цепями, но Н1 ассоциирует только с Ц (рис. 1, В). Н-Н связывание случайно. Ц и Ь2 цепи согласно допущению синтезируются в избытке над Н1 и Н2 цепями, соответственна

'Сумма анти-АГ1, анти-АГ2 и неактивных АТ (П+Ш+1У).

Как следует из рассмотренных формул, при случайной рекомбинации легких и тяжелых цепей выход БИАТ (У1) не может превышать 12,5% общего квадромного ^С (причем, этот максимум достигается при равном

синтезе родительских цепей, Ь = I = 1). Кроме того, при условии свободного Н-Ь рекомбинирования отношение БИАТ и неактивных антител [у,/у2 =2Ы/(Ьг+2Ы+12)] не может превышать 0,5. Предпочтительная ассоциация гомологичных легких и тяжелых цепей является предпосылкой более высокого выхода БИАТ, что может быть проиллюстрировано примерами 3-6 в табл. 3. Таким образом, вышеуказанные параметры могут использоваться для подтверждения наличия гомологичной Н-Ь предпочтительности в гибридных гибридомах.

Нами были количественно определены фракции антител, продуцируемые квадромой ЭНД-ПХ, после разделения антител по их специфичности (см. выше). В результате фракционирования культуральных супер-патаптов трех клонов квадромы были получены фракции БИАТ, анти-ЭНД, анти-ПХ и неактивных антител. Концентрации антител в культуральных супернатантах определяли радиоиммунологически. В табл. 4 приведены результаты количественного определения антител в образцах культуральной среды от трех квадромных клонов 56А9, 56Е8, и 57Р9. Во всех клонах большинство секретируемых антител составляли анти-пероксидазные антитела: 54,6 - 70,3% от общего количества ^О в среде. Доля антиэндорфиновых антител была на порядок меньше: 4,4 - 7,2%. Концентрация БИАТ в культуральной среде достигала 34,7 - 83,2 мкг/мл, что составляло 19 - 34%. суммарного На долю неактивных антител приходилось только 3,4 - 4,6%. Полученные распределения антител были соотнесены с теоретическими моделями рекомбинации легких и тяжелых цепей. Выход БИАТ п изученных нами клонах (19,0 - 34,2%) был в 1,5 -2,7 раза выше максимального теоретически возможного значения (12,5%) для гипотезы случайной рекомбинации легких и тяжелых цепей. Это отклонение было особенно значительным в клонах 56А9 и 56Е8. Таким образом, гипотеза о случайном характере Н-Ь ассоциации в изученных клонах представляется крайне маловероятной (с вероятностью р < 0,001,

согласно критерию х ). Кроме того, экспериментально полученные распределения антител не соответствуют гипотезе о случайном характере H-L ассоциации и по другому параметру - отношению БИАТ и неактивных антител (у]/у4, модель I). Экспериментальное значение этого параметра составило 5-8, что на порядок выше теоретического максимума для данной модели (0,5). С другой стороны, такие распределения возможны как при предпочтительной ассоциации гомологичных легких и тяжелых цепей в гибридных гибридомах (модель II, табл. 3 примеры №№ 3-4 в табл.3), так и при гомологичном предпочтении в одной H-L паре (модель III, примеры 5-6 в табл. 3).

Для проверки этих предположений мы провели двумерный электрофорез в геле фракций антител, полученных после аффинной хроматографии квадромного асцита, а также двух родительских антител (рис. 6). Этот метод позволил однозначно различить легкие цепи обоих родительских антител: каждая цепь образует по два четких изоэлектрических варианта. Пятна, соответствующие антипероксидазным легким цепям, располагаются в более кислой области. Во фракциях БИАТ и антипе-рокси-дазных антител квадромного асцита были обнаружены легкие цепи обоих родительских антител (рис. 6, в, д). В антиэндорфиновой фракции квадромных антител обнаруживаются только пятна, соответствующие антиэндорфиновой легкой цепи (рис 6, г). В целом, полученные результаты могут свидетельствовать в пользу сильной предпочтительности между тяжелыми и легкими цепями антиэндорфиновых антител. Антиперокси-дазные тяжелые цепи, по-видимому, свободно сочетаются как с гомологичными, так и с гетерологичными легкими цепями. Иными словами, в случае анализируемой нами квадромы ЭНД-ПХ имеет место распределение антител, соответствующее теоретической модели 3 (гомологичное предпочтение в одной H-L паре). Следует отметить, что эти рассуждения

щелочной

67000" 43000-

зоооо-

кислыи

г

1...

\-/

и и

Рис.4. Анализ легких и тяжелых цепей антител квадромы 52С10 и родительских моноклональных антител с помощью двумерного электрофореза. Наносили около 20 мкг аффинноочшценных антител. Первое направление - изоэлектрофоку-сирование в амфолинах с рН 4,5. Второе направление - электрофорез в 12,5%-ном ПААГ в присутствии Об- N3.

а - родительские анти-эндорфиновые антитела; б - родительские анти-пероксидазные антитела; в - биспецифические антитела; г - анти-эндорфиновая фракция квадромы; д - антипероксидазная фракция квадромы. Позиции Н и Ь цепей указаны стрелками. - легкая цепь антиэндорфиновых антител, Ьг - легкая цепь антипероксидазных антител. II - зона тяжелых цепей.

основаны на предположении, что гетерологичные сочетания легких и тяжелых цепей неактивны. Таким образом, распределение антител в проанализированной нами квадроме наглядно показывает, что как предпочтительный, так и случайный характер ассоциации Н-Ь цепей может иметь место в гибридных гибридомах.' Таблица 4

Количественный состав антител, продуцируемых квадромными клонами

Фракция' Клон 56А9 Клон 56Е8 Клон 57F9

мкг/млЬ %' / ь мкг/мл мкг/млЬ %'

БИАТ(1) 83,2+7,0 34,2 67,ft±6,3 28,9 34,7±0,9 19,0

Анти-ЭНД (II) 16,1±2,8 6,6 10,2+0,5 4,4 13,1±0,7 7,2

Анти-ПХ (III) 132,8±17,1 54,6 147,2+8,1 63,3 128,2±6,8 70,3

HeaKTMniiMc(IV) 11,2И), 1 4,6 7,910,6 3,4 6,5±0,7 3,5

Общий IgG (I+II+III+IV) 243,3 100 232,2 100 182,4 100

Общий IgG в нефракционированных супернатантах 243,5±36,1 217,5+34,5 н.о.

Отношение анти-ЭНД и анти-ПХ антител 1:8 1:14 1:10

Отношение БИАТ и суммы других антител (II+III+IV) 1:2 1:2,5 1:4

Отношение БИАТ и неактивных антител 7:1 8,5:1 5:1

а Квадромные супернатанты разделяли с помощью аффинной хроматографии на 4 фракции: БИАТ (I), анти-ЭНД AT (И), анти-ПХ AT (III) и неактивные AT (IV). Концентрации AT в полученных фракциях и в нефракционированных супернатантах были определены радиоиммунологически.

Концентрации AT даны для 1 мл культурального супернатанта квадром. Мкг, М±т, п=3 (значения являются результатами трех измерений).

с% содержание AT относительно общего IgG (I+II+III4-IV). и.о.- не определяли.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами были изучены антигенсвязывающие свойства БИАТ со специфичностью к эндорфину и пероксидазе хрена. Молекула БИАТ была образована двумя "половинами", которые относились к разным субклассам ^С: тяжелая цепь эндорфинсвязывающсй половины относилась к субклассу 1§С2а, сайт, связывающий пероксидазу, был образован Н цепыо субкласса 1§С1. По результатам нашей работы, аффинноочищен-ные БИАТ и родительские МКА имели одинаковые равновесные константы ассоциации при связывании соответствующих антигенов, несмотря на то, что тяжелые цепи родительских антител относились к разным субклассам Результаты нашей работы можно сравнить со сходным

по задачам исследованием, проведенным Аллардом с соавторами [АНагс! е1 а1, 1992]. В этой работе были изучены БИАТ, специфичные к фоллит-ропину и галактозидазе, которые продуцировались тремя неидентичными квадромными клонами. Авторы не обнаружили изменения аффинности БИАТ по сравнению с родительскими МКА даже в том случае, когда тяжелые цепи принадлежали к разным субклассам мыши. Таким образом, несмотря на некоторое различие в подходах, в работе Алларда и в нашем исследовании получены весьма сходные результаты. Кроме того, наши данные свидетельствуют, что молекулы БИАТ обладают достаточной гибкостью, чтобы обеспечить независимое взаимодействие двух ан-тигенсвязывающих сайтов с соответствующими антигенами вне зависимости от молекулярной массы антигенов. Так, связывание избытка ПХ (Мг~40000) с БИАТ 52С10 не влияло на аффинность антител к ЭНД (Мг~1600); сходным образом, связывание бифункциональных антител с избытком ЭНД не влияло на их аффинность в отношении НХ. Таким образом, кооперативный эффект при связывании бифункциональных антител с антигенами отсутствовал. Это согласуется с наблюдениями об отсутствии кооперативное™ между двумя антигенсвязывающими центрами

моноспецифических антител при их взаимодействии с антигенами [Kranz et al, 1982].

Следует отметить, что во всех исследованиях, где наблюдалось сохранение антигенсвязывающей активности при сочетании негомологичных L и Н цепей, имело место существенное уменьшение аффинности антигенсвязывающих сайтов [Hudson et al, 1987; Smith-Gill et al, l',1^]. Поскольку мы не обнаружили снижения аффинности ни у одного из сн-тигенсвязывающих сайтов БИАТ, можно предполагать, что БИАТ и родительские МКА имеют одинаковую структуру активных центров. Анализ цепей БИАТ, специфичных к ЭНД-ПХ, в двумерном электрофорезе также свидетельствует в пользу того, что эти антитела, имеют "правильную" структуру, изображенную на рис. 1. Данные по цепьевсму составу антиэндорфиновых антител квадромного асцита, полученные с помощью двумерного электрофореза, говорят о том, что "правильнага" структуру имеют rio крайней мере эндорфинсвязывающие сайты, ßo фракции квадромных антиэндорфиновых антител отсутствует L цепь ти-пероксидазных антител (рис. 6).

Использование БИАТ со специфичностью ЭНД-ПХ в иммуногистохимии и в иммуноблоттинге также позволило продемонстрировать их эффективность. Так, при одностадийной инкубации срезов гипофиза со смесью БИАТ с ПХ имело место окрашивание эндорфинпродуциругскцях клеток, подобное тому, которое наблюдалось при использовании конъ-югата моноклональных антител к ЭНД с ПХ. Тот же эффект достигался при использовании смеси БИАТ с ПХ для выявления предшественника эндорфинов - проопиомеланокортина, после иммуноблоттинга экстрактов гипофиза.

Клетки-продуценты БИАТ являются удобной моделью, с по;.юшъю которой можно in vivo изучать такое явление, как наличие (или отсутствие) предпочтительного связывания гомологичных (принадлежав' zx

одному антителу) L и II цепей антител в процессе сборки молекул иммуноглобулина. Нами предложены теоретические модели распределения квадромных антител по их специфичности, которые, во-первых, учитывают характер ассоциации цепей IgG и, по-вторых, относительную скорость синтеза родительских L и II цепей. Наряду с этим разработан количественный метод анализа продуктов секреции гибридных гибридом, который основан на аффинной очистке антител и их последующем количественном определении. Таким образом, концентрации антител различной специфичности, которые продуцируются данной кпадромой, можно соотнести с теоретическими моделями распределения и сделать вывод о характере ассоциации (случайном или предпочтительном) L и Н цепей родительских антител. Мы исследовали распределения антител, секрети-руемых тремя субклопами квадромы, продуцирующей ЛТ со специфичностью к ЭНД и ПХ. В культуральпых супернатантах определялось количество антипероксидазных, антиэндорфиновых, бифункциональных и неактивных антител. Сравнение экспериментально полученных распределений антител с теоретическими моделями приводит к заключению о предпочтительном гомологичном соединении тяжелых и легких цепей обоих родительских антител (апти-ЭНД и анти-ПХ). Однако анализ цепьевого состава аффинноочищенных фракций методом двумерного электрофореза подтверждает сильное гомологичное предпочтение только в отношении L и Н цепей антиэндорфиновых антител. Это следует из того, что в анти-ЭНД антителах, полученных из квадромного асцита, не обнаруживается легкая цепь анти-пероксидазных антител. По данным двумерного фореза было бы точнее сказать, что практически не образуются (или не секретируются) антитела, образующиеся при сочетании тяжелой анти-ЭНД и легкой анти-IIX цепи. Во фракции антипероксидазных антител квадромы обнаруживаются легкие цепи анти-ЭНД и анти-ПХ антител.

В целом, полученные результаты свидетельствуют об относительно высоком уровне продукции БИАТ в исследованных клонах (табл.4). Высокий уровень секреции БИАТ в квадромах сопряжен главным образом с наличием предпочтительной ассоциации Ь и Н цепей в антиэндорфино-вых антителах.

Общая картина ассоциации легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов в гибридных гибридомах может быть получена только путем анализа характера ассоциации цепей антител панели квадром. Показано [Ое Ьаи е1 а1, 1992], что только в относительно небольшом числе случаев (в 4 комбинациях Н и Ь цепей из 16 проанализированных) может иметь место предпочтительная ассоциация Ь и Н цепей родительских антител. Анализ характера ассоциации цепей в квадроме ЭНД-ПХ, где гомологичное предпочтение происходит только в одной паре, свидетельствует о том, что оба типа ассоциации цепей - случайный и предпочтительный - могут иметь место в гибридных гибридомах.

Таким образом, проведенный нами анализ свойств БИАТ со специфичностью ЭНД-ПХ, сконструированных с гибридомным способом, показал, что эти гибридные молекулы в полной мере сохранили антиген-связывающие свойства родительских антител. Не наблюдалось кооперативного эффекта при связывании бифункциональных антител с антигенами. По-видимому, БИАТ имеют "классическую" структуру: каждый из антигенсвязывающих сайтов образован сочетанием гомологичных Н и Ь цепей. Кроме того, нами продемонстрировано, что оба типа ассоциации легких и тяжелых цепей антител, случайный и предпочтительный, могут иметь место в гибридных гибридомах.

вывод ы

Изучены продукты секреции гибридной гибридомы (квадромы) 52С10, синтезирующей бифункциональные антитела со специфичностью к и-эндорфину и пероксидазе хрена; показано:

1. В квадроме 52С10 II и Ь цепи антиэндорфиновых антител ассоциируются предпочтительным образом, п то время как II цепи антипе-роксидазных антител одинаково эффективно ассоциируются как с анти-эндорфиновыми, так и с антинероксидазными Ь цепями. Таким образом, оба типа ассоциации II и I, цепей - случайный и предпочтительный, имеют место в данной квадроме.

2. В бифункциональных антителах со специфичностью к а-эндорфину и пероксидазе хрена сайты связывания с «-эндорфином образованы ассоциацией II и Ь цепей анти-эндорфиновых антител; сайты связывания с пероксидазой образованы сочетанием II и Ь цепей антипе-роксидазных антител. Сочетание гетерологичных (происходящих от разных антител) Н и I, цепей приводит к образованию неактивных антител.

3. Аффинность (равновесная константа ассоциации) сайтов бифункциональных антител, связывающих а-эндорфин и пероксидазу, тождественна аффинности соответствующих сайтов родительских антиэндорфиновых и антипероксидазных антител.

4. Избыток и-эндорфина не влияет на аффинность бифункциональных антител в отношении пероксидазы; сходным образом, избыток пе-роксидазы не влияет на аффинность бифункциональных антител в отношении «-эндорфина. Кооперативный эффект при связывании антител с антигенами отсутствует.

5. Показана эффективность бифункциональных антител в иммуно-гистохимии (тестирование эндофин-продуцирующих клеток гипофиза) и иммуноблоттинге (идентификация предшественника эндорфинов - про-опиомеланокортина).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ИЗЛОЖЕНЫ В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ:

1. Yu. S. Massino, Е. A. Kizim, N. N. Dergunova, V. М. Vostrikov and A. D. Dmitriev. 'Construction of a quadroma to u-endorphin/horseradish peroxidase using an actinomicin D-resistant mouse myeloma cell line'.Immunology Letters, 1992, 3, 33, p.217-222.

2. H. H. Дергунова, Ю. С. Массино, E. А. Кизим, А. Д Дмитриев. "Изучение взаимодействия бифункциональных моноклональных антител с антигенами радиоиммунологическим методом". Бюлл. экспер. биол. мед., 1993, т. 166, № 9, стр. 299-301.

3. Дмитриев А. Д., Массино Ю. С., Дергунова Н. Н., Кизим Е. А., Сегал О. Л., Смирнова М. Б., Востриков В. М., Коляскина Г. И. "Получение и свойства бифункциональных моноклональных антител к «-эндорфину и пероксидазе хрена" в сб. "Моноклональные антитела в ней-робиологии" под ред, чл.-корр. РАМН, проф, Штарка М.Б. и к.б.н. Старостиной М.В. Новосибирск, 1995, стр. 144-159.

4. Н. Н. Дергунова "Иммунохимическая характеристика моноклональных бифункциональных антител к сх-эндорфину и пероксидазе хрена" - Тезисы 1-ой Международной зимней школы для молодых русских ученых по Нейробиологии. Нейрохимия, 1995, т. 12, вып. 2, стр.62.

5. А. Д. Дмитриев, Ю. С. Массино, Н. Н. Дергунова, Е. А. Кизим, О. Л. Сегал, М. Б. Смирнова, В. М. Востриков, Г. И. Коляскина "Моноклональные биспецифические антитела: получение и изучение ан-тигенсвязывающих свойств" Вестник РАМН, 1996, №4, стр.46-51.

6. М. Б. Смирнова, Н. Н. Дергунова, Е. А. Кизим, Ю. С. Массино, В. А. Никулина, О. Л. Сегал, Е. Б. Терешкина, Г. И. Коляскина и А. Д. Дмитриев. "Изучение антигенсвязывающих свойств биспецифических антител" Биохимия, 1997, т.62, №1, стр.51-59.

6. М. Б. Смирнова, IL Н. Дергунова, Е. Л. Кизим, Ю. С. Массино, В. Л. Никулина, О. Л. Сегал, Е. Б. Терешкипа, Г. И. Коляскина и А. Д. Дмитриев. "Изучение антигенсвязмвающих свойств биспецифических антител" Биохимия, 1997, N° 1, стр.51-59.

7. Y. S. Massino, N. N. Dergunova, Е. A. Kizim, М. В. Smirnova, Е. В. Tcri-shkiiia, (">. I. Knlvasl<itia, Д. IX Dmilricv. 'Quanlilalivc analysis of I he products of JgG chain recombination ill hybrid hybridomas based on affinity chromatography and radioimmtmoasssay'. Journal of Immunological Methods, 1997, vol. 201, pp.57-66.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Предложенный комплексный подход анализа продуктов секреции кпадромы к u-гждорфину и нероксидазе хрена может быть полезен при анализе квадром к другим антигенам и определении типа ассоциации легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов (случайного или предпочтительного).

2. Применение бифункциональных антител упрощает процедуру выявления специфических антигенов в иммупоблоттинге и иммуногистохимии за счет проведения иммуноферментного окрашивания R один этап.

Участок множительной техники ОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН

Заказ {62 Тираж 100 экз.