Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Получение, характеристика и использование моноклональных антител для иммунодиагностики бруцеллеза

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

ЛЛМЛТТТТТГКИЙ ЗООВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ

1!;| нрнг.нх ¡)у|.<|)нк-а

ЕСКЕНДИРОВА

{.'аул^ Зим ПШШШ'!

ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ИММУНОДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА

!{( 00,0;1 — с.мерттттлрная микробиология, иммунология, )М1ЫП1)т».']и1 ии и шиЬ'Ют.'мп'ЬТ1 пп.к_';зн1Г

■.К'П1!")'ПП.1Ч

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации и;| соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

АДМАТЫ, 1993

Работа выполнена в проблемной лаборатории по селъскохозяйст-венной биотехнологии Акмолинского сельскохозяйственного биотехнологического центра, лаборатории бруцеллеза НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней Минздрава Республики Казахстан.

Научный руководители: доктор биологических наук, профессор А. Ф. Дмитриев,

кандидат ветеринарных наук, доцент А. К. Булашев.

Ведущая организация — Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт.

Официальные оппоненты — доктор биологических наук, профессор

М. М. Ременцова,

кандидат ветеринарных наук, доцент А. А. Росляков.

Защита состоится « /Л » ^^ле^з^А^- 1993 г. в часов на заседании специализированного совета Д 18.01.02 при Алматинском зооветеринарном институте (480013, Алматы, пр. Абая, 28).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ал.матинского зооветеринарного института.

Автореферат разослан « 1993 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат ветеринарных иаук доцент

Н. Н. АХМЕТСАДЫК08

-Хтуальностъ темы.

Бруцеллез сельскохозяйственных животных является одной из актуальных проблем ветеринарной науки и практики.Эта болезнь причиняет огромный экономический ущерб животноводческим хозяйствам и, как зооантропонозная инфекция,представляет большую опасность для здоровья людей. Напряженная эпизоотическая обстановка по данной инфекции сложилась в регионе Северного Казахстана.

пак известно, одним из главных факторов успеха оздоровительных мероприятий является своевременное выявление и изоляция больных бруцеллезом животных - основных источников и распространителей инфекции, идпако до п ¿¿стоящего времени ветеринарная практика на располагает высокоэффективными методами и средствами диагностики бруцеллеза.

Современные биотехнологические подходы, основанные на методе гибрйдомной технологии ( G-Xohler and С.Ullstein , 1975), позволяют создать новое поколение иммунодиагностикумов на основе мококлонклькых антител (МКА). Огромное преимущество МКА перед обычными поликлональными антисыворотками заключается в том, что они являются чрезвычайно чистыми гомогенными химическими реагентами, которые могут быть получены практически в неограниченных количествах. Возможность неограниченного воспроизводства продукта со стабильными стандартизированными свойствами, более высокая чувствительность и специфичность реагентов на основе «ПСА позволяют вести работу по совершенствованию ныне существующих диагностических методов и разработке совершенно новых диагностических приемов, основанных как на обнаружении уникального антигена возбудителя бруцеллеза, так и специфических к нему антител ( ы.сог-rol et al ., 19(33; D.Rulatt et al ., I98Ö; D.Roop

at al 1987; j.Limet et ol 1987; А.К.Булашев и соавт.

199^; и др.).

Целью настоящей работы было получение штаммов гибридных культивируемых клеток (гибридом) - продуцентов моноклональных антител к специфическим антигенным детерминантам бр.уцелл и применение их в совершенствовании иммунодиагностики бруцеллеза.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

I) получить штаммы гибридом, продуцирующие моноклональные антитела к полисахаридным и белковым эпитопам бактерии рола ^гисеНг

'¿) изучить основные иммунохимические свойства полученных монс клональных антител (специфичность, агглютинобельность, константа связывания, класс иммуноглобулинов);

3) отработать условия и технику постановки твердофазного имму нофермантного анализа (ТИФА) и реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) с использованием моноклональных антител;

4) испытать диагностическую ценность моноклональных антител в ТИФА и РПГА при обнаружении противобруцеллезных антител в сыворотк крови и специфических антигенов возбудителя в патологическом материале .

Научйая новизна.

Впервые получен штамм гибридных культивируемых клеток - продуцент моноклональных антител к белку внешней мембраны бр.уцелл, ко торый защищен авторским свидетельством № 1752764 (опубл. в Бюл.№29 С использованием моноклональных антит.ел разработан*» иммунофермент-ная тест-система для обнаружения противобруцеллезных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота и изготовлен эритроцитарный диагностикум, предназначенный для экспресс-выявления антигенов бр.уцелл в патологическом материале.

Практическая значимость.

Штамм гибридомы - продуцент моноклональных антител к белку

внешей мембраны ботиелл депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур 15,II.50 под номером ЬСКК (И) о18Д.На основе моноклональных антител отработана высокочувствительная и специфичная иммуно|ерментная тест-система, позволяющая выявить противобруцеллезные антитела в сыворотке крови телок, не реагирующих на бруцеллез по результатам классических серологических реакций. Моноклональные антитела позволяют получать стабильные высокоэффективные иммуносорбенты (сенсибилизированные эритроциты, носители для ТИ$А с иммобилизированными антителами), предназначенные как для обнаружения противобруцеллезных антител, так и специфического антигена возбудителя.

Вне^рение^ Материалы диссертационной работы используются в научно-исследовательской работе лаборатории иммунодиагностики бруцеллеза Акмолинского сельскохозяйственного биотехнологического центра, в учебном процессе на кафедрах "Зоогигиены и микробиологии" Акмолинского СХИ и "Эпизоотологии и микробиологии" Ставропольского СХИ, а также включены в раздел "Инфекция и иммунитет" учебного пособия по микробиологии для студентов высших учебных заведений по специальности "Ветеринария".

Апробация^ Результаты настоящей работы были доложены на научной конференции Троицкого ветеринарного института (г.Троицк, 1989), научно-практической конференции Ставропольского СХИ (г.Ставрополь, 1991г.), научно-практических конференциях Целиноградского (ныне Акмолинского) СХИ (г.Целиноград, 1990,1992гг.), Всесоюзной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии (г.Целиноград, 1991г.), расширенном заседании сотрудников ветеринарного факультета и биотехнологического центра Акмолинского СХИ (г.Акмола, 1993г.).

Основные положения, вьиосимые на защиту.

1. Моноклональные антитела, имеющие специфичность к эпито-пам белки внешней мембраны и липополисахарида оруцелл, повышают диагностическую ценность твердофазного иммуноферментного анализ; при серологическом исследовании животных на бруцеллез.

2. Ёритроцитарные диагностикумы, изготовленные на основе мо-никлональных антител, обеспечивают высокую чувствительность, специфичность и воспроизводимость реакции пассивной гемагглюхинации при исследовании патилигического материала на бруцеллезный антиген.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 каучньн статей и получено I авторское свидетельство ьы изобретение.

Об-bgM и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, оосуждения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения Список литературы включает 206 источников, в том числе 131 иностранных. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 2 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы

Работа выполнена в проблемной лаборатории по сельскохозяйственной биотехнологии Целиноградского (ныне Акмолинского) сельскохозяйственного биотехнологического центра, лаборатЬрии бруцеллеза МИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней Минздрав Республики Казахстан и в хозяйствах Акмолинской области.

Бактериальные антигены. В работе были использованы следующие виды И штаммы бруцедл: Brucella abortusI9, 54, 99 и 544;Brucella melitensls BII5, I6M, Rev -1,498; Brucella suis 1330 и 1000,Brucella ovis 428, Интактныв клетки Yersinia enterocoliti

-009 штамм 389, Salmonella urbana 122/41; Salmonella godesberg 632;Salnonella landau 556 были предоставлены проф. Б.В. Начальником (НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней Минздрава Республики Казахстан). Ктюмв того, в качестве бактериальных антигенов были использованы Escherichia coli о65, а также коммерческие диагностик.умы - дизентерийные Ташкентского НИИВС (Shigella sonnei .Shigella flexneri .Shigella newcastl^, вибриозный Витебской биофабрики ( Campliylobacter fetus veneralis ).

Яипополисахаридные антигены были получены по методу H.Baker and J.Vi'ilson (I960). Поли-Б антиген выделяли методом экстрагирования трихлоюуксусной кислотой ( по R.Diaz et al 1979) и методом ступенчатого осадцения этанолом (по S.Diaz et al 1981).

Белки внешней мемебраны бруцелл выделяли по методу L.Tabatabai et al (1979). Ультразвуковой дезинтвграт Br.abortus 19

(УЗД-АГ) получали воздействием ультразвука низкой частоты (22 кгц) и высокой интенсивности (50-70 вт/см^) на суспензию клеток в течение 10-15 минут. По окончании озвучивания микробную взвесь центрифугировали 30 мин при 18000 об/мин и надосадочную жидкость использовали в качестве антигена.

Для культивирования клеточных культур использовали среду нже-1640 с добавлением 10% фатальной сыворотки теленка, 0,05 мг/л пиру вата натрия, 0,003 мл/л 2-меркаптоэтанола. Мышей линии BALB/c иммунизировали внутрибрюшинно по схема, описанной И.И. Фридлян-ской (1988). Гибридизацию клеток миеломы X63-Ag8.653 со спленоцитами иммунных мышей проводили по методу V.Oi et л.Herzenberg (1980). В качестве сливающего агента использовали 45$ раствор полиэтиленгликоля - 4000. Селекцию гибридных клеток проводили на среде ГА1 (гипоксантин-аминоптерин-тимидин). Антитель-

-о—

нуа активность гибридных клеток определяли путем исследования культуральной жидкости в реакции микроагглютинации (Pi.iA) и тверд! фазном имм.уноЗясментном анализе (ТййА). Клонирование гибридом npi водили методом лимитирующих разведений ( J-God-ins et al ., J98; Асцитньте жидкости получали культивированием клеток гибридом в брюшной полости сингенных мышей, предварительно обработанных npw таном (И,6,10,14-тетраметилпентадекан). Иммуноглобулины из асцит-ной жидкости высаливали насыщенным раствотэом сульфата аммония. Специфичность моноклональных антител определяли в РМА, непрямом и сэндвич - вариантах ТША, реакции пассивной гемагглютинации (PJ и методом иммуноблотинга (по H.Towbin et al, 1979). Константу связывания моноклональных антител устанавливали по методу J.Ueat-ty et al ., (1987). Класс и подкласс моноклональных антител-двойной иммунодиффузией (по o.ouchterlony (1958).

Диагностическая ценность "сэндвич" - вашанта твердофазного иммунофеоментного анализа была испытана на образцах сыворотки

ктэови 791 телки из 8 хозяйств Целиноградской (ныне Акмолинской)

%

области с различной эпизоотической ситуацией по бруцеллезу.

Эффективность эритроцитарного диагностикума апробирована на образцах молока, шерсти и навоза овец из неблагополучных по бруцг лезу хозяйств Талды-Курганской области. Всего происследовано III' проб молока, 73 пробы шерсти, 70 пооб навоза и 4 пробы содержимое желудка абортированных плодов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ Получение гибридных культивируемых клеток-продуцентов

моноклональных антител Для получения штаммов гибридных культивируемых клеток (гибридом) -продуцентов моноклональных антител (МКА) к специфическим антигенным дятеоминантам бактерии рода brucella нами было прове-

лено две гибридизации. При первой - миеломная линия клеток ХзЗ-

8.653 была гибридизирована со спленоцитами мышей, иммунизированных поли-Б антигеном бруцелл, а при второй - с лимфоцитами мышей, иммунизированных белками внешней мембраны (ЕШ) бруцелл.

Схема иммунизации мышей линии вдыз/с , использованная нами' в процессе получения моноклональнкх антител против поли-Б антигена и БШ бруцелл, оказалась вполне пригодной лля стимулирования иммунной системы организма подопытных животных на выработку достаточного количества специфических антител. Так, титры антител в сыворотке крови иммунных мышей против препаратов-антигенов (поли-Б и БВМ) в твердофазном иммуноферментном анализе (ТИЩА) составили 1:6400 и 1:12800 (соответственно). Однако антитела, образованные при иммунизации мышей поли-Б антигеном, реагировали в реакции микроагглютинации ШШ в титре 1:640, тогда как сыворотка крови мышей, иммунизированных БВМ, агглютинировали клетки бруцелл в более низких титрах - 1:160. Это, видимо, свидетельствует о ведущей роли полисахаридных эпитопов в агглютинобельности цельных клеток.

В результате двух гибридизации из 384 засеянных лунок рост клонов гибридом наблюдали в ¿44 (63,5%) в первом слиянии и в 328 (85,4%) во втором слиянии, т.е. процент гибридизации был довольно высок. Результаты тестирования гибридом первого и второго слияния в ТИ$А показали, что соответственно у 13 (5%) и. 21 (6$) клонов клеток обнаруживается антительная активность по отношению к поли-Б и БВМ антигенам. Причем, наличие специфических антител в культу-ральной жипкости у всех 13 клонов первого слияния установлено как по результатам ТИФА, так и РМА, тогда как из числа активных гибридом второго слияния только 9 или 40% клонов продуцировали антитела, обладающие агглютинирующими свойствами.Антитедопродуцирующая способность указанных штаммов была проверена трижды, с помочью упо-

мянутых иммунологических реакций с интервалом 3-4 дня. В результате установлено, что среди гибридом первого слияния культураль-ные жидкости (супернатанты) клонов 5Д<:, аА9, 7F10 и 7CI0 содержали наиболее активные антитела, о чем свидетельствуют их высокие титры по отношению к использованным антигенам как в РМА, так и в ТИ$А.

Из второго слияния один клон, названный как IC3, отличался от других гибридом наиболее высокой активностью против БВМ бру-целл в ТИФА. Моноклональные антитела, вырабатываемые этим клоном не обладали агглютинирующим свойством. Вышеупомянутые клоны были отобраны для дальнейшей работы и клонированы методом лимитирующи разведений.

Специфичность моноклональных антител каждого клона гибридом определялась как в культуральной, так и в асцитной жидкости. У всех клонов гибридом на 3-4 день культивирования в ростовой сред концентрация МКА достигала 35-45 мкг/мл, а при внутрибрюшинной прививке сингенным мышам - 4-8 мг/мл., т.е. количество антител в асцитной жидкости увеличивалось в IOO-üOO раз. При этом титры ан тител в асцитной жидкости были выше по сравнению с таковыми в ро товой среде в среднем в 400 раз. К моменту завершения настоящей работы отобранные штаммы гибридом прошли l'¿ пассажей в культуре клеток и 7 пассажей на сингенных мышах.

Характеристика моноклональных антител, специфичных к полиса харидному антигену бруцелл.

Специфичность моноклональных антител, вырабатываемых клонам: ЬДИ, 5А9, 714о и 7CI0, определяли в РМА и ТИФА с использован» в качестве антигенов интактных клеток, липополисахаридов (ЛПС) и поли-Б антигенов различных видов и форм бруцелл. Кроме того, МКА

гибрилом были испытаны на перекрестную реакцию с микроорганизмами, имеющими сходную антигенную структуру с бруцеллами -Y.entero-colitica 09, K.coli , С.fetus veneralis . В каждом ва-

рианте выполнено по 8 опытов.

Результаты изучения специфичности МКА упомянутых клонов гибридных клеток в реакции микроагглютинации приведена в табл. I. Результаты изучения специфичности моноклональных антител в РмА

Виды и югаммы бактерии

Титры моноклональных антител

5Д2

5А9 I 1

7F10 ! VCI0 !

Br.abortus 19 ( g> 1:16 1:64 1:64 1:32

1:12800 1:51200 1:51200 1:25600

Br.abortus 54 ( S) 1:8 1:32 1:64 1:32

1:6400 1:25600 1:51200 1:12800

Br.melitensisgev_j ^ g) 1:4 1:8 1^4 _

1:1600 l73200 1:6400 17800

Br.melitensis J6M (g) 1:16 _ 1:32 _I:32 J.-A__

1:3200 lT64G0 I:1Й800~ 1:1600

Br.suis 1330 ( g 1:64 1:64; 1:64

1:25600 I:5I200- 1:25600" ~T:5I200-

Br.ovis 428 (R ) 1:8 __Ш6__ 1:64

I:I600~ 175200 1:25600 "1751200

Y.enterocolitica 09 _ 1:2__ 1:4__ 1^4_ IiZ_

1:400 1:1600 " 1:1600 1:400

Примечание: в знаменателе - титры антител в асцитной жидкости, а в числителе - в культуральной среде

Как показали результаты Pi«lA, исследуемые моноклональные ант тела четырех клонов гибридом имеют различный уровень специфичности по отношению к использованным видам бруцелл. Так, МКА штамма 7CI0 обладают высокой степенью сродства с клетками вг. ovis 428 ( И ) и Вг. suis 1330 (s) - 1:51200, тогда к их титры против Br.melitensis Kev -I ( 3 ) и I6M С S ) не превы шали 1:1600. МКА штаммов 5А9 и 7CI0 обладали одинаковой специфичностью по отношению к ar.suis 1330 (ii) - 1:51200, одна ко они существенно отличаются по сродству к Br.ovis 428 С (соответственно 1:3200 и 1:51200). Аналогичные результаты полу чены при использовании МКА штаммов 5Д2 и 7?Ю . Испытуемые антитела вступали в слабую перекрестную реакцию с клетками Y. enterocolitic<39 (1:400-1:1600) и нз связывались с другими грам отрицательными бактериями, использованными в постановке РМА.

В табл. 2 показаны результаты, полученные при изучении сп цифичности моноклональных антител в непрямом ТИФА.

Табл. 2

Специфичность МКА к различным полисахаридным антигенам в ТИФА

Полисахаридные I Титры моноклональных антител___

антигены_____Г~5Д2__1 ~5А9~ I l 7CI0__

ЛПС Br.abortus 99( S ) , 1:8

1:1600

ЛПС Br.melitensisI6M( ¡S) 1:2__

1:400~

ЛПС Y.enterocolitioa09 1:2

1:200

поли-Б Br.abortus 54( б) Р0_

1:64 _ 1:64 1:16

1:204805 ХТ204800" I:3200

___1:32 1:8__ 1:4

1:102400 "ï:3200 1:800

1:8 1:4 ___1:2

т-згоо 1:1600 " ï:400"

___Р0__ PO__ PO _

1:100 " ïTioo " "PO "

_____________I__I_______I____2_____i____3___!_J_

поли-Б Br.meliten- I6M(a) __P0__ __IjJ„ __Ij_8__PQ

sis iTlOO "ТТёоо" 1:1600 1:100

поли-Б Br.neliten-

3is BII5 (R) ____Il§4___ 1:8

I:3200~ 1:204800 1:204800 1:3200

Примечания: I) в знаменателе - титры антител в асцитной жидкости, а в числителе - в культуральной среде 2) Р0 - реакция отрицательная

Данные таблицы свидетельствуют о том, что МКА гибридом 5А9 и 7F10 оказались более активными в ТЩА по сравнению с другими клонами клеток (5Д2 и 7CI0). Так, титры МКА клонов 5А9 и 7F10 против ЛИС Br.abortus 99 и поли-Б антигена Br.melitensis BII5 были равны 1:204800, тогда как МКА гибридом 5Д2 и 7CI0 слабее реагировали с упомянутыми антигенами. Отметим, что МКА культуральной среды и асцитной жидкости клонов 5Д2 и 7CI0 на реагировали с поли-Б антигеном Br.abortus 54, хотя с аналогичным антигеном Вг.шеИ-tensis BII5 они взаймодействовали в титре 1:8 и J:3200 соответственно. МКА клонов 5А9 и 7F10 также слабо реагировали с поли-Б антигеном ■or.abortus 54 и ^r.melitensis I6A1. МКА гибридных клеток 7F10 и 5А9, имея высокую специфичность по отношению к ЛПС Br.abortus 99 (1:204800), существенно отличались по сродству к ЛПС Br.melitensis I6M (соответственно 1:3200 и 1:204800). Ште-ресно отметить, что МКА вьшеуказанных клонов гибридом реагировали с поли-Б антигеном Br.melitensis BII5 () в высоких титрах, тогда как с аналогичным антигеном br.melitensis I6M (S ) эти антитела взаймодействовали очень слабо.

По результатам непрямого ТИФА с использованием в качестве антигенов интактных клеток бруцелл моноклональные антитела всех че-

-т-

тырех клонов гибридом также оказались более специфичными к ¿т. abortus , нежели к Br.melitensis . Такая специфичность особенн хорошо выражена у МКА клона 7F10 . Кроме того, антитела указан ной гибридомы имели самую высокую константу связывания (аффинное среди МКА, направленных против полисахаридных детерминант бруцел 1хЮ~%, что обуславливает их пригодность для разработки иммуно-тестов на основе TttfeA.

Специфичность моноклональных антител к углеводным детермина там полисахаридного антигена бруцелл доказана и методом иммунобл тинга. Согласно его результатам МКА взаимодействуют с полисехари ными эпитопами поли-Б антигена Br.melitensis BII5, который бы. использован в качестве антигена для иммунизации мышей, а также с ЛПС Зг.abortus 19, но не реагируют с ЛПС Y.enterocolitica 09 Как известно, Br.melitensis BII5, являясь представителем Н -формы бруцелл, лишен О-специфической цепи. В этой связи мы полаг. ем, что полученные нами клоны гибридом, в том числе и , я:

ляются продуцентами МКА против "кор" участка полисахаридной моле' кулы бруцелл. Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомами 5Д2 и 5А9, относятся к иммуноглобулинам ( Ig) класса G лодклас! 2а, а антитела штаммов гибридных клеток yFlO-IgG^ , 7CI0 - IgGs Характеристика моноклональных антител,полученных против белкового антигена бруцелл Моноклональные антитела гибридомы IC3, полученной в результ. гибридизации лимфоцитов мышей, иммунизированных белками внешей мембраны (БВМ) Br.aelitensis I6M, с миеломной линией клеток Ag8.653 были испытаны на специфичность в ТИФА по отношению к растворимым антигенам и интактным клеткам бруцелл и некторох грш отрицательных бактерии, имеющих антигенное сходство с возбудителе бруцеллеза. Специфичность МКА клона IC3 в непрямом варианте ТИФА представлена в тсбл.З.

Специфичность ЖА клона IC3 к различным бактериальным антигенам в ТЩА

Виды бактериальных антигенов

Титры моноклональных антител

в культуральной ! в асцитной

среде ! жидкости

ВВП Вг.abortus БВМ Br.melitensis БВМ Вг.suis 1330

I6M

19

1:32 1:4 . 1:16 РО РО

1:3200

1:800

1:6400

BBivl Y.enterocdilitica 09

РО

ЛПС ■Ьг. abortus

19

РО

Примечание: БВМ - белки внешней мембраны Л1Ю - липополисахариды РО - реакция отрицательная

Как видно из таблицы, МКА гибридомы IC3 взаймодействуют как ; БВМ Br.melitensis I6M, использованного для иммунизации животных, ?ак и с аналогичными антигенами Вг.abortus 19 и ßr.suis 1330.

)тметим, что антитела данного клона гибридных клеток не вступали в юрекрестн.ую реакцию с БВМ бактерии Y.enterocolitica , 09, которые, сак известно, имеют антигенное сходство с бруцеллами. Как следовало >жидать, испытуемые МКА не реагировали с липополисахаридом бруцелл. 1нтактные клетки бруцелл в ТША определялись только антителами ас-щтной жидкости. Причем, интенсивность реакции была низкой, чем при ^пользовании БВМ. Это, видимо, связано с малой концентрацией специфического антигена, адсорбированного твердой фазой, в случае ис-тользования цельных бактериальных клеток. МКА клона IC3 не связываюсь как с клетками ^.enterocolitica 09, так и с ¿.coli и C.fe-;us veneralis , что свидетельствует о уникальности белкового эпито-ia, против которого получены антитела.

Согласно результатам определения класса иммуноглобулинов к аффинности испытуемых йКА, штамм гибридных клеток IC3 продуцирует

_п

антитела класса ig-G^ с константой связывания 2x10 М. Результаты иммуноблотинга показали, что ivlKA штамма гибридомы IC3 направлены против детерминанты белка внешней мемебраны бруцелл с молекулярной массой 14КД.

Использование моноклональных антител в серодиагностике бруцеллеза.

Моноклональные антитела штамма гибридных клеток 7F10 »которые специфичны к эпитопам полисахаридного антигена бруцелл, и гибридомы IC3, направленные против белковой детерминанты внешней мембраны бруцелл, были использованы нами в твердофазном иммунофер-ментном анализе для обнаружения противобруцеллезных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота. Принцип выявления антител против бруцелл, содержащихся в сыворотке крови, с помощью предлагаемой нами иммуноферментной тест-системы (№ffC) основан на использовании МКА штамма гибридомы 7F10 или IC3 в сондвич-ТИФА в качестве первых антител.

Сначала 96-луночный планшет для микротитрования сенсибилизируется моноклональными антителами гибридомы 7?1 о или IC3, а затем в его ячейки вносится ультразвуковой дезинтеграт клеток Зг*abortus 19 (УЗД-АГ). При этом МКА каждого клона гибридом связываются с антигенами бруцелл, которые содержат родственные для них эпитопы. После отмывки излишка антигена проводят исследование проб сывороток крови на наличие протиЕобр.уцеллезнкх антител. При наличии в образце антител против бруцелл на твердой фазе образуется комплек МКА клона гибридомы 7F10 или IC3 + УЗД-АГ + специфические антитела, который выявляется с помощью антивидозых иммуноглобулинов, меченых пероксидаэой хрена, и субстрата этого фермента - орто1енилен-

диамина по окрашиванию жидкости в коричневый цвет различной интенсивности.

Предлагаемая иммуноферментная тест-система была испытана на образцах сыворотки крови, взятых от телок благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйств перед вакцинацией и ревакцинацией против данной инфекции (табл.4).

Табл. 4

Изучение диагностической ценности различных вариантов иммуносЬерментного анализа

пОТ1!Количество^* Сроки ^Эпизооти- Г Реагировало по

^ВЬюГ , ВаНИЯ ! $руцелле- 1 ™ !ной «й-сиот.

х03_в 1 зу !-------]73Д- 71ЖК ТЖЛ

| | ! ,Е-АГ ,АГ ¡тло ,1СЗ

"Г "г ' з " - , - ~

1 32

2

3 175

4 Юй

5 50

6 20

7 1И0

8 240

перед вакцинацией благополучное — - -

перед вакцинацией благополучное _3__ 5,7 " - -

перед вакцинацией неблагополучное 5 18 7577 13

перед вакцинацией неблагополучное - 279" о "578 о

перед вак- неблагопо- 2 1

цинацией лучное 4 и

перед вакцинацией неблагополучное - - ____ 5 ™ ' "V

перед ревакцинацией - благополучное ___ ~о7ё" 4 17з" -

перед ревакцинацией - неблагополучное 46 ГО" 4074 36,6 6 ¿6, |

¡Л::мечания: I) е знаменателе - количзстео реагирующих животных в процентах, а в числителе - абсолютное число '<■) (-) - реакция отрицательная

3) Е-АГ - единый бруцеллезный антиген

4) УЗД-АГ - ультразвуковой дезинтеграт бруцелл Всего исследовано 791 телка, из них 431 гол. - перед первой

вакцинацией в возрасте 4-5 мес. и 360 гол. - перед ревакцинацией в возрасте 16-18 мес. Как видно из таблицы, перед вакцинацией были исследованы образцы сывороток крови (175+102.+50+20)347 телок из неблагополучных хозяйств. Все поголовье не реагировало на бруцеллез по результатам классических серологических реакций (РА и РБП), однако в непрямом Т№А и иммуноферментной тест-системой выявлены противобруцеллезные антитела в крови некоторых телок. Так, '¿,9% животных из хозяйства №3 (совхоз им.С.М.Кирова) по результатам непрямого ТША с единым бруцеллезным антигеном имели в сыворотке крови специфические антитела. При использовании в данном иммуно-тесте ультразвукового дезинтеграта бруцелл количество телок, реагирующих на бруцеллез, повысилось в '¿ раза, а среди поголовья хозяйства №4 (совхоз "^аря") выявлены <¿,9% животных с антителами против УЗД-АГ. Отметим, что предлагаемая нами иммуноферментная тест-система с -МКА клона 7^10 обнаружила наличие специфических антител в сыворотке крови 10,¿¿^ и 5,8% животных хозяйств Jl!¡№3 и 4 соответственно, а при использовании в качестве первых антител ЖА клона, гибридомы IC3 в этой тест-системе количество реагирующих телок составило соответственно 7,4$ и '¿,9%. Телки, принадлежащие хозяйствам №5 (совхоз "йльиновский") и ÍÍ6 (совхоз "40 лет Казахстана) не реагировали как по результатам классических серологических реакций, так и непрямого ТША, однако противобруцеллезные антитела

по данным имм.унофедаентной тест-системы обнаружены в образцах сывороток крови некоторых животных обоих хозяйств. Телки благополучного хозяйства И (совхоз "Заречный") не реагировали на бруцеллез по результатам всех использованных серологических тестов. У 3-х голов животных другого благополучного хозяйства - 152 (совхоз "Красноярский") отмечены положительные результаты только по непрямому ТЩ>А.

Серологическое исследование сывороток крови телок хозяйства неблагополучного по бруцеллезу (совхоз "Софиевский"), перед ревакцинацией показало, что 19,55? животных реагируют по РА и <2,5% по РБП. Примерно у такого же количества телок (19,15?) обнаружены противобруцеллезные антитела в непрямом ТЩА с Е-АГ. С использованием УЗД-АГ в этом же тесте выявлено до 40,4% телок, имеющих в крови специфические антитела. По данным испытуемой иммуно-ферментной тест-системы противобруцеллезные антитела содержались в сыворотке крови 35,6% ( МКА уяю ) и '¿Ь,6% (л!КА 103). Отметим. что как по результатам классических серологических реакций, так и иммуноферментной тесг-системы специфические антитела не обнаружены в крови телок хозяйства №7 (учхоз ЦСХИ), благополучного по бруцеллезу, хотя получены положительные результаты у 0,8% и 3,3% животных по непрямому ТЩА с использованием в качестве антигенов соответственно Е-АГ и УЗД-АГ.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о высокой чувствительности разработанной нами иммуноферментной тест-системы на основе МКА штаммов гибридом 10 или 1СЗ при обнаружении противобруцеллезных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота. Предлагаемая тест-система может быть использована для выявления специфических антител против бруцелл в сыворотке

крови зараженных телок, не реагирующих на бруцеллез по результатам классических серологических реакций при исследовании их перед вакцинацией (в возрасте 4-5 мес.).

Экспресс-обнаружение бруцеллезных антигенов с , помощью моноклональных антител в реакции пассивной гемагглютинации Изготовление эритроцитарных диагностикумов на основе моноклональных и поликлональных антител, а также индикация бруцеллезных антигенов в образцах патологического материала проводилась с участием сотрудников лаборатории диагностики бруцеллеза (зав.лаб. проф. С.А.Амиреев) и лаборатории иммунодиагностики (зав.лаб.проф. Б.В.Каральник) НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней Минздрава Республики Казахстан.

Основными компонентами реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) явились эритроциты барана, сенсибилизированные моноклональ-ными антителами гибридных клеток БАМ или БША - эритроцитарный диагностикум (ЭД),образцы суспензии бруцелл и других микроорганизмов, а также исследуемые пробы патологического материала. Чувствительность эритроцитарного диагностикума оценивали по показателям минимальных агглютинирующих доз бактерии. В каждом варианте с отдельной взвесью выполнено по 8 опытов.

Эритроцитарный диагностикум из ША гибридомы БИМА лучше агглютинировал клетки Вг.abortus 19 (623,0+25,7 тыс.кл.), Вг. abortus 544 (574,0±38,9 тыс.кл) и' Br.suis ' 1330 (659,0± 24,4 тыс.кл.), чем препарат, изготовленный из ША гибридных клеток БАМА )соответственно 708,0i24,3 тыс.кл.;I070,0±8ü,ö тыс.кл.; 2540,0±128,0 тыс.кл.). Однако у последнего диагностикума показатель минимальной агглютинирующей дозы был существенно ниже по отношению к клеткам Бг.abortus 99(305,0-20,2 тыс.кл. против

-19476,0*32,9 тыс.кл.). Следует отметить, что чувствительность ЭД из использованной коммерческой поликлональной сыворотки была ниже, чем из обоих препаратов моноклональных антител.

Наиболее важно сопоставить специфичность ЭД, приготовленных из поли и моноклональных антител. В качестве показателя специфичности ЭД было использовано соотношение минимальных агглютинирующих данный эритроцитарный диагностикум доз гетерологичных и гомологичных бактерий. Считали, что чем«больше величина этого соотношения, тем вьпле специфичность. Установлено, что ни один из штаммов гетерологичных бактерии (иерсинии, сальмонелл, шигелл и туляремии (не агглютинировал ЭД на основе моноклональных антител даже в дозе 875 млн.кл/мл. Показатели специфичности ЭД из МКА гибридом БАМА и ВИДА составили соответственно 215 и 1700. При этом агглютинирующая активность этих же гетерологичных бактерий в отношении ЭД из поликлональных антител была достаточно высокая и высокая и соответственно показатель специфичности - сузественно более низким (i.enterocolitica 09 - 9I,7tô,6 млн.кл. и 23,3* 3,7; Salmonella urbana - Ю,9± 1,3 млн.кл. И 2,8±0,4; Salmonella godesberg - 37,5*5,0 млн.кл. И 9,6*1,5, Salmonella landau

- 51,7*1,3 млн.кл. и 13,4Í2,I;shigella sonnei 11,7*0,3 млн.кл. и 3,0*0,5; shigella flexneri , Shigella newcastle И l'ranoisella tularensi-s 7,8 млн.кл. И 2,0. Таким образом, специфичность бруцеллезных ЭД, изготовленных из моноклональных антител двух упомянутых клонов гибридом несопоставимо выше, чем у аналогичного диагностикума на основе поликлональных антител.

Эритроцитарный диагностикум, изготовленный из МКА гибридных клеток БАМА, был испытан на образцах молока, шерсти и навоза овец,

-¿ü-

неблагопслучных по бруцеллезу отар в сравнении с бактериологически методом (табл.о).

Табл.5

Результаты использования ЭД из МКА для обнаружения антигенов бруцелл в патологическом материале.

Виды патоло-1" Количество ! Вмпрлрня wvm,-rv™ Выявлено наличие гического исследован- i °b«e-'ieHd кулыура антигенов бруцелл

материала ! ных проб -------—г---------—------,------

. ! количест- а ! кол-во •

j во проб ! /о ! проб ! %

_________]___________i_________L________[________L______

молоко III? 10 0,90 87 7,79

тереть 73(_£I-)+ HB - 25 34,2

73

навоз 70 (—HB - 16 22,9

70

содержимое л .

желудков 4(--—)+ ш . ^ ^

аборт-плодов 3 lUJ

Примечания: I) + - в знаменателе количество проб,исследованных ЭД, а в числителе - бактериологическим методом 2) HB - культура бруцелл не выделена

Всего было исследовано III7 проб молока овец. Культура ( Br.melitensis ) была выделена из 10 образцов молока (0,90$) ЭД подтвердил наличие бруцеллезных антигенов по всех пробах, положительных по результатам бактериологического анализа и дополнительно выявил антигены патогена в 77 образцах. Из 73 исследованных проб шерсти бруцеллезный антиген в РПГА с ЭД обнаружен в 25 34,2%), в т.ч. и в 21 образцах, из которых не удалось выделить культуру возбудителя. Последняя не была выделена и из 30 проб на-

воэа, исследованных бактериологическим методом, хотя в 16 образцах из 70, подвергнутых анализу предлагаемым диагностикумом выявлены аптигемы бруцелл. Причем, 8 из 16 образцов навоза имели отрицательные результаты по бактериологическому анализу. Бруцел-лы не выявлены из содержимого желудка 4 аборт-плодов, хотя у '¿х из них обнаружены антигены бруцелл.

Таким образом, изготовленный нами эритроцитарный диагностику)/, на основе моноклональных антител повышает чувствительность и специфичность РПГА, что позволяет использовать данный тест в экспресс , обнаружении бруцеллезных антигенов в патологическом материале.

ВЫВОДЫ:

1) Получены штаммы (клоны) гибридных культивируемых клеток-гибридом, продуцирующие моноклональные антитела против полисаха-ридного и белкового эпитопов бактерии рода Brucella.

2) Моноклональные антитела штаммов гибридом 5Д2, 5А9,

и 7CI0 специфичны к "кор" участку полисахаридного антигена бруцелл и взаимодействуют со всеми использоыанными видами и штаммами бруцелл s -и R -форм как в реакции микроагглютинации, так и в твердофазном иммунофермантном анализе.

3) Штамм гибридомы IC3 вырабатывает моноклональные антитела, специфичные к неагглютинобельному белку внешней мембраны бруцелл с молекулярной массой 14 килодальтон.

4) Продуктивность штаммов гибридом составляет в среднем 35-45 мкг моноклональных антител на I мл культуральной среды и

4-8 мг на I мл асцитной жидкости. Моноклональные антитела полученных гибридных клеток относятся к иммуноглобулинам класса G (5Д2 И 5А9 - IgG2a ; 7CI0 - IgG2b ; 7F10 и IG3 - IgO^.

5) Моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридомы

7о , шеют относительно высокую константу связывания (аффин

g

ность) равной 1x10" ы. Антитела этого штамма клеток оказались более специфичными к клеткам ^г.abortus t чем Br.melitensis.

6) Моноклональные антитела гибридом сохраняли свои первоначальные свойства при многократном пассаже гибридом-продуцентов

в культуре клеток и на сингенных мышах.

7) Сэндвич-вариант твердофазного иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител штаммов гибридом урю и IC3 оказался более чувствительным при исследовании сывороток крови телок на противобруцеллезные антитела, чем непрямой ТША и классические серологические реакции (РА и РБЛ).

8) Отработана и испытана иммуноферментная тест-система для серодиагностики бруцеллеза, которая может быть использована для выявления инфицированных телок, не реагирующих на бруцеллез по результатам классических серологических реакций.

9) Изготовлен антительный моноклональный эритроцитарный диагностикум для экспресс-обнаружения антигенов бруцелл в патологическом материале. Чувствительность и специфичность эритро-цитарного диагностикума, изготовленного из моноклональных антител, несопоставимо выше, чем у аналогичного препарата на основе поликлональной сыворотки.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ЛРЕДОШЕНШ

I. Штамм гибридных культивируемых клеток tliua Musculus L -продуцент моноклональных антител к белку внешней мембраны бруцелл с авторским названием IC3 депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных (г.Санкт-Петербург) 15.11.90 под номером ВСКК (П) 518Д. Моно-клональные антитела этого штамма использовать для дифференциации

бпуцелл от других перекрестно-реагирующих микроорганизмов.

2. Эригропиташый лиагностикум, изготовленный на основе моноклональных антител штамма гибоиломы БА«А, может быть использован для экспресс-обнаружения бруцеллезных антигенов в патологическом материале.

3. Телок неблагополучных по бруцеллезу хозяйств перед вакцинацией исследовать серологически с помощью иммуноферментной ■тест-системы, которая обладает высокой чувствительностью при выявлении сеоопозитивных животных, чем классические реакции.

' СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1) Булашев А.К., Дмитриев А.Ф., Шенжанов К.Т., Ескендирова С.З. Оценка состояния плацентарного барьера больных бруцеллезом коров //Рук.дел.в ВНИИТЭИ 14.02.89 »177 BC-89.-PJK. сев 30 " Инфекционные болезни животных" - 1989. -¡56. -С. 16.

2) Булашев А.К., Шенжанов К.Т., Ескендирова С.З., Боровиков С.Н. Иммунологичекая реактивность новорожденных телят в бруцеллезном стаде //Актуальные проблемы интенсификации животноводства в исследованиях молодых .ученых Южного Урала: Тез. док л. зональной науч. конф. -Троицк, 1989. -С.20-21.

3) Ескендирова С.З., Булашев А.К., Боровиков С.Н., Барамова ili.A. Получение моноклональных антител к бактериям рода Бруцелла //Вестник сельхкохоз.науки Казахстана. -1990. -№10. -С.68-71.

4) Булашев А.К., Ескендирова С.З. Ромахов В.А.'-, Касьянов А. В., Несмеянов В.А-. Использование моноклональных антител в диагностике бруцеллеза животных //Бюллетень ВИЭВ. -te.,1990. -Вш.'73.С.84-89.

5) Ескендирова С.З., Булашев А.К. Индикация полисахаридннх антигенов брупелл с помощью моноклональных антител // Вклад молодых ученых и специалистов в научно-технический прогресс сель-скохоз. производства: Тез.докл. науч. конф. -Ставрополь, 1991.

6) Ескендирова С.З., Булашев А.К., Шенжанов К.Т. Новое диагностическое средство при бруцеллезе животных //БиотехнологияСприложение к экспресс-информации "Новости науки Казахстана") -Алма-Ата, 199I. -С.107-108.

7) Булашев А.К., Боровиков С.Н., Ескендирова С.З.. Сабирзя-нова Ф.Ф. Моноклональныа антитела в диагностике бруцеллеза живот-

ных //материалы Всесоюз.науч. конф. по с.-х.биотехнологии. -Целиноград, 1991. -0.124-126.

8) Студенцова В.К.. Каральник Б.В., Груиина Т,А., Булашев

А.К.. Боровиков G.H., Абдирасилова A.A.. Ескендирова 0.3. Сравнительная экспериментальная оценка различных сорбированных реагентов из моноклональных антител в индикации антигенов бруцелл// Материалы Всесоюз. науч. конф. по с.-х. биотехнологии.Целиноград. 1991. -С.132-133.

9) Булашев А.К.. Ахметшин Р.З.. Боровиков С.Н., Ескендирова С.З. Моноклональные антитела в диагностике антропозоонозов //материалы 5 объединненного съезда гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов. паразитологов и инфекционистов Казахстана.-Алма-Ата, 1991. -Т.6. -С.19-20.

10) Булашев А.К., Дмитриев А.Ф., Шенжанов К.Т.. Боровиков С.Н Ескендирова С.З. //Способ диагностики внутриутробного инфицирования ягнят бруцеллезом - Положит .решение ВНИИГПЭ. -08.06.91.-За явлено 06.09.90 №4862905/13.

11) Булашев А.К., Ескендирова С.З., Дмитриев А.а.. Боровиков С.Н.. Шенжанов К.Т. // Штамм гибридных культивируемых клеток животных - продуцент моноклональных антител к бактериям рода Бруцелла

- A.C. №1752764, СССР, МКИ CI2 5/00 - № 4882330/13. -Заявлено 16.11.90; Опубликов. Б.И. 07.08.92, М29

РЕЗЮМЕ

Диссертациялыц жумыстыц мацсаты - бруцеллез ауруьмьщ цоздыру-аысына ^арсы моноклональды антиденелерх ендхретгн гибридтх торна-лардыц турлер1н алу жене оларды осы 1ндетт1 дер кезгнде аныцтай алатын диагностикальщ тэс1лдердх жет!лд1ру нолында цолдану.

Гибридомальщ техниканщ кемегхмен моноклональды антиденелерд1 насап ¡лыгаратыц торлалардьщ б1рнеше турлер1 алынган. Бул антидене-лер Бруцелла туцымдастарына жататын бактериялардыц сыртк;ы торша н;абыгында орналасщан белок жэне полисахарид эпитопторына багыттал-ган.

IC3 жэне 7FI0 деп белгхленген гибрадомалардьщ антиденелерх сэндвич-иммучцы фермент тэсШнде 3-4 айльщ бузауларды^ дан селде-

pin ';руцеллез аурукна зерттеу кез1нде цолданылган. Бул тас1Л к;азхр-ri кезде практикада кец ^олданылып журген агглютинация реакциясы-на жэне роз-бенгал сынауына Караганда бхриама жегарды сезгмталдьш; корсеткен.

БАМА жене Б12.1А дегек атз.улары бар гибридттк тор'лалардыц анти-денелерхн "жамылган" цанныц Кызыл TYP.ipaiKTepi бруцеллез ауруыныц к,оздырушысыныц антнгендархц тез ареда нойдкч сутхнде, жгнхнде, ца-нкнда жэне iui тасталган урщтардыц организмхнде аныцтау мадсатында жанпиа /пассизтх/ агглютмниция реакциясында сыналган.

йогарда аталган тэс1лдер1Н практикада цолданылуы -бруцеллез хн-детхне и;арсы багытталган малдэртгерлхк шаралардыц тихмдхлхген арт-тыра тусед1.

The purpose of the dissertation was to get hybriaoma cells whifch produce Brucella specific monoclonal antibodies ( Mab ) and develope effective diagnostic methods on the base of using МдЪ.

Several strains of ¡.lab-producers were obtained with the help

of hybridomic technique. ..ab were directed against outer membrane proteins or polysaccharides epitopes of Brucella.

The diagnostic value of ¿¡ab of hybridonas designated as 1Cj and 7-b'l J in sandwich ELISA was tested as compared with Agglutination Test and Hose uengale Plate Test. ¡¡LISA was considerably more sensitive than conventional serologic methods in detection brucella specific antibodies in sera from calves at the age of 3-4 months.

blab ВАШ. and BYr.iA were used in developing Erythrocyte Haemag-a^lutination Test for express-detection of Brucella antigens in the samples of siieeps ailk.wool and fecos as well as in the stomach contents of aborted fetuses.

Application of the diagnostic methods to practice will increase

efficiency of i-iational brucellosis eradication program.

-__