Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Экспресс-обнаружение возбудителя сибирской язвы в иммуноферментном анализе

УДК 619-658 512 616 981 51(616-07)

На правах рукописи

003446430

Муханбеткалиев Брсын Ергазыевич

ЭКСПРЕСС-ОБНАРУЖЕНИЕ ВОЗБУДИТЕЛЯ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ В ИММУНОФЕРМЕНТНОМ АНАЛИЗЕ

Специальность 16.00.03 - Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

2 2 СЕН №8

Костанай, 2008 г

003446439

Работа выполнена в лаборатории иммунохимии и иммунобиотехно-логии РГП «Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан» и на кафедре ветеринарной микробиологии и биотехнологии Казахского агротехнического университета им. С. Сейфуллина

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук,

профессор Булашев А К,

Официальные оппоненты-

Ведущая организация:

доктор ветеринарных наук, профессор Никитин Е Б

кандидат ветеринарных наук Кайыпбай Б Б

Научно-исследовательский ветеринарный институт АО «КазАгроИнновация»

Защита состоится «29» сентября 2008 года в 10ю часов на заседании объединенного диссертационного совета ОД 18 08 03 при Казахском агротехническом университете им. С Сейфуллина

по адресу: 111000, г. Костанай, пр. А. Байтурсынова, 47. Конфе-ренцзал Костанайского государственного университета им А. Байтурсынова

E-mail: agun@mbox kz. http //www.agun kz

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Костанайского государственного университета им. А. Байтурсынова.

Автореферат разослан «¿{у> августа 2008г

Ученый секретарь объединенного диссертационного совета, ,

поктоп ветепинаоных наук. ппоАессоо ЛУп^у^пУ Т Ж Аблоахманов

L A* * A A It 0 V f А

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сибирская язва продолжает занимать важное место среди болезней, наносящих значительный ущерб животноводству и представляющих угрозу жизни и здоровью человека (Черкасский Б Л., 2002). Несмотря на достигнутые успехи в изучении проблемы сибирской язвы, до сих пор это заболевание имеет довольно широкое распространение во многих странах мира, в том числе и на территории постсоветского пространства (Белова Е В и др., 2004).

На сегодняшний день территория Казахстана остается одной из самых неблагополучных по данной инфекции среди стран СНГ Ежегодно в республике регистрируются как единичные, так и групповые случаи заболевания сибирской язвой среди людей и сельскохозяйственных животных. Такая ситуация обусловлена биологическими особенностями возбудителя, что придает сибирской язве характер почвенно-очаговой инфекции, носящей стационарный характер (Кадастр стационарно-неблагополучных по сибирской язве пунктов РК, 2003)

В последние годы проблема экспресс-индикации возбудителя сибирской язвы приобрела особую актуальность и в связи с зарегистрированными случаями биотерроризма Чрезвычайно высокая поражающая способность и устойчивость к факторам внешней среды делают этот возбудитель одним из наиболее привлекательных для использования его в качестве биологического диверсионного агента (НеБеЬоп N & а1, 1993).

Сейчас в ветеринарной и медицинской лабораторной практике существует ряд методов для диагностики сибирской язвы и выявления возбудителя в объектах внешней среды и сырье животного происхождения В частности широко применяют методы, определяющие фенотипи-ческие различия штамма, в том числе определение характера роста на различных питательных средах, чувствительность к пенициллину и гамма-фагу, образование капсулы, взаимосвязь со специфическими лекти-нами, проба на ферментацию углеводов, тест на образование сибиреязвенного токсина и ряд других (Агбарян А Г , 2001). Однако эти методы не полностью удовлетворяют ветеринарную и медицинскую практику из-за способности бацилл изменять оцениваемые характеристики, которая выражается в неоднозначности получаемых результатов при установлении видовой принадлежности Кроме того, они требуют много времени и средств

В последнее время существенный прогресс в сфере диагностики инфекционных болезней был достигнут благодаря современным успехам молекулярной биологии, иммунологии, биотехнологии и генетики Наряду с традиционно применяемыми при диагностике сибирской язвы серологическими реакциями, такими как реакция термопреципитации по А сколи, реакция диффузной преципитации (РДП), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), люминесцентно-серологический метод и др.,

предложен целый ряд молекулярно-биологических методов Одним из современных методов диагностики бактериальных инфекций считается полимеразная цепная реакция (ПЦР) (Ramisse V , 1995; Вишняков И Ф, 1999, Цыбанова ЛЯ, 2002) На сегодняшний день для индикации и идентификации возбудителя сибирской язвы рекомендуются различные модификации ПЦР, такие как использование флуорофорсвязанных праймеров, маркировка мишеневой ДНК дигексигенином, «гнездная» ПЦР тест-система Однако ПЦР-анализ требует дорогостоящего оборудования, реактивов и поэтому имеет ограничение в части внедрения в лабораторную практику

В этой связи к наиболее перспективным методам следует отнести иммуноферментнЬш анализ (ИФА), который в последнее время находит все большее применение в разработке методов диагностики особо опасных инфекционных болезней (Булашев А К , 1995; Бакирова Г А, 2001; Сураншиев Ж. А., 2002; Дюсенова Г.Т., 2005) Возможность проведения некоторых вариантов ИФА (точечный вариант) в полевых условиях, вкупе с высокой чувствительностью и экспрессивностью данного анализа открывает широкие перспективы в разработке сигнальных методов диагностики. Как известно, специфичность и чувствительность любой иммунологической реакций зависит от используемых антител или антигенов В этой связи получение против В anthracis однородных по всем свойствам иммуноглобулинов, так называемых моноклональных антител (МКА), имеет большую практическую значимость

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось разработка экспресс-метода обнаружения возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды на основе использования моноклональных антител к полисахаридному антигену клеточной стенки В anthracis

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи

1 Выделить полисахаридный антиген В anthracis и изучить его им-мунохимические и антигенные свойства

2 Получить штаммы гибридных культивируемых клеток - продуцентов моноклональных антител к полисахаридному антигену В anthracis

3 Изучить основные иммунохимические свойства полученных моноклональных антител

4 Определить условия постановки точечного ИФА для обнаружения возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды.

5 Провести лабораторные испытания диагностической тест-системы и разработать научно-техническую документацию на Набор ИФА для индикации возбудителя сибирской язвы

Научная новизна. Установлено, что в клеточной стенке В anthracis имеется полисахаридный антиген, с молекулярной массой 28 кДа, характерны только для сибиреязвенной бациллы

Впервые создан штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus - продуцент моноклональных антител против полисахаридно-

го антигена клеточной стенки В anthra.cn с авторским названием ЗР11, что подтверждено предварительным патентом РК на изобретение (авторское свидетельство № 51722 от 16.04 2007 г, бюль № 4) На основе моноклональных антител (штамм 403) к полисахаридному антигену В аыкгаси отработаны условия приготовления иммуноферментного конъюгата, позволяющего проводить «прямой» и «сэндвич» варианты ИФА для обнаружения сибиреязвенного микроба

На основе моноклональных антител гибридомы ЗБП разработана иммуноферментная тест-система, позволяющая проводить исследования по обнаружению сибиреязвенного микроба в объектах внешней среды.

Практическая ценность работы. Моноклональные антитела, синтезируемые штаммом гибридных культивируемых клеток с авторским названием ЗБП (депонирован в Республиканской коллекции микроорганизмов, г. Астана), предлагаются к использованию научно-исследовательским учреждениям страны при разработке и совершенствовании методов идентификации возбудителя сибирской язвы

Нормативно-техническая документация на «Набор иммунофер-ментной тест-системы для индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды», рекомендуется для скрининга почвы, воды, кормов и др. на наличие в них возбудителя сибирской язвы (согласована с Департаментом ветеринарии МСХ РК 20.12.2005 года и прошла экспертизу в Комитете технической стандартизации и метрологии Министерства индустрии и торговли РК № 002/00800 от 26 декабря 2005).

Основные положения, выносимые на защиту:

- Иммунохимические и антигенные свойства полисахаридного антигена клеточной стенки В агЛНгас1&\

- Свойства моноклональных антител штаммов гибридных клеток, полученных путем слияния миеломной линии Х63 Ag 8 653 с лимфоцитами мышей ВАЬВ/с, иммунизированных полисахаридным антигеном В аШкгаси,

- Диагностическая ценность иммуноферментного антисибиреязвенного конъюгата;

- Иммуноферментная экспресс тест-система на основе моноклональных антител для индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на республиканской научно-теоретической конференции молодых ученых и студентов, посвященной 50-летию Целины (г Астана, 2004), научно-практической конференции молодых ученых Казахской государственной медицинской академии «Актуальные вопросы медицины» (г Астана, 2005); республиканской научно-теоретической конференции молодых ученых, аспирантов, магистрантов, студентов и школьников «Сей-Луллинские чтения-1» посвяшенной 110-летию со дня рождения Сакена Сейфуллина. (г Астана, 2005)

Публикации результатов работы. Материалы диссертационных исследований опубликованы в шести научных трудах Получен предварительный патент PK на изобретение

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения. Список использованных источников включает 224 наименований, в том числе иностранных 128 Материалы иллюстрированы 15 таблицами, 14 рисунками.

2 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Материалы и методы исследований. Работа выполнена в 20032007 гг. в лаборатории иммунохимии и иммунобиотехнологии РГП «Национальный центр биотехнологии Республики Казахстан» и на кафедре ветеринарной микробиологии и биотехнологии Казахского агротехнического университета им С. Сейфуллина в рамках научной программы «Разработка научных основ новых методов диагностики и лечения наиболее тяжелых заболеваний, их выявление в экологически неблагоприятных регионах Казахстана» на 2001-2005 годы

Испытания специфичности моноклональных антител к полисаха-ридному антигену клеточной стенки Bacillus anthracis методом иммуно-ферментного анализа проводились в Казахском научном центре карантинных и зоонозных инфекций им. М Айкимбаева Министерства здравоохранения PK, г. Алматы

В работе были использованы цельные клетки, а также полисахарид-ный антиген клеточной стенки, белково-липополисахаридный комплекс, белковый антиген клеточной стенки Bacillus anthracis СТИ-1, ЛПС антиген и цельные клетки Bacillus subtilis, О-ПС антиген Brucella abortus 19 и цельные клетки Brucella melitensis 16М, Escherichia coli, Salmonella Dublin. Кроме того, при изучении активности и специфичности моноклональных антител в Казахском научном центре карантинных и зоонозных инфекций им М Айкимбаева использовались клетки шестидесяти двух вирулентных сибиреязвенных штаммов, Bacillus anthracis штаммов Ценковского 71/12 и СТИ-1 и штамм Bacillus cereus.

В качестве патологического материала использовали искусственно контаминированные цельными клетками вакцинного штамма Bacillus anthracis СТИ-1 пробы почвы, кормов, воды, а также селезенку и печень крупного рогатого скота.

Полисахаридный антиген получали из липополисахаридной фракции выделенной из вегетативных клеток Bacillus anthracis методом вод-но-фенольной экстракции по О. Westphal (1965) путем гидролиза 1°/о-ную уксусной кислотой с последующей очисткой гель-фильтрационной хроматографией на колонке с сефядексом G-200.

Электрофоретическое разделение исследуемых материалов проводили по методу J. Laemmli et al. (1970).

Для гибридизации использовали ииеломную линию клеток X63Ag 8.653 и иммунные спленоциты, полученные путем иммунизации мышей линии BALB/c полисахаридным антигеном Bacillus anthracis по заранее отработанной методике. Гибридизацию клеток миеломы X63Ag 8 653 и иммунных спленоцитов проводили по методу V.Ol, L Herzenberg (1980).

Клонирование гибридных культивируемых клеток проводили методом лимитирующих разведений по J Coding (1980)

Класс и подкласс полученных моноклональных антител определяли с помощью двойной иммунодиффузии по методу О Ouchterlony (1958) Специфичный антисибиреязвенный конъюгат с использованием МКА штамма 4D3 готовили по стандартной методике. Контроль активности конъюгата осуществляли путем определения его рабочего титра в прямом варианте твердофазного ИФА

Точечный твердофазный иммуноферментный анализ (дот-ИФА) проводили на полосках нитроцеллюлозной мембраны фирмы Millipor, размером 5x45 мм в 8-ми точках через каждые 5 мм наносили 0,001 мл раствора моноклональных антител из каждого разведения 2.2 Результаты исследований

2.2.1 Накопление бактериальной массы, выделение и очистка полисахаридного антигена клеточной стенки В. anthracis. В процессе наблюдения за посевным материалом отмечалось, что при инкубировании в термостате (+37°С), первые признаки роста заметны через 3 часа с момента посева. К 16-18 часам культивирования наблюдается полное колониеобразование по всей поверхности агара, а после 20 часов роста наблюдалось интенсивное спорообразование В мазках, окрашенных по Граму, наблюдались крупные палочки характерные для сибиреязвенной бациллы, которые располагались по одиночке или соединялись в цепочки В небольших количествах наблюдались споры, представляющие собой овальные, иногда круглые образования При микроскопии мазков, наличие посторонних микроорганизмов обнаружено не было

Инактивированную взвесь бактериальной массы В anthracis трехкратно отмывали физиологическим раствором (pH 7,0-7,2) при 5000 об/мин в течение 30 минут В дальнейшем из полученной бактериальной массы методом водно-фенольной экстракции по О. Westphal выделили липополисахаридный комплекс. Полисахаридный антиген из фракции ЛПС отделяли путем гидролиза 1% уксусной кислотой, результаты приведены в таблице 1

Как видно из таблицы, выход сырой бактериальной массы клеток В anthracis из 2000 мл питательной среды составлял от 19 до 42 граммов или 0,95-2,1%. При этом, после кислотного гидролиза фракции ЛПС сибиреязвенного микроба, доля полисахаридного антигена в зависимости от количества бактериальной массы бацилл составила 0,360-1,5 мг, или

0,002-0,0036%. Растворы ПС содержали от 94,4 до 97,2% углеводов, а остальные 2,8-5,6%, или 0,042 мг приходились на примесные белки.

Таким образом, применение метода водно-фенольной экстракции по О. Westphal для выделения ЛПС из бактериальной массы В аткгаш СТИ-1, с последующим гидролизом 1%-ной уксусной кислотой, позволяет получать антигены с максимальным содержанием углеводов и минимальным наличием примесей.

Таблица 1 - Результаты выделения ПС В аЫНгаси СТИ-1 водно-фенольным методом по О \Vestphal

№ п/п партии Выход сырой бактериальной массы с 2000 мл МПА в Доля выхода ПС в Наличие белка в полученном ПС в

граммах % мг % мг %

1 28,6 1,43 0,750 0,0026 0,042 5,6

2 19,0 0,95 0,360 0,002 0,0 0,0

3 28,0 1,4 0,750 0,0027 0,042 5,6

4 42,0 2,1 1,5 0,0036 0,042 2,8

5 22,0 1,1 0,750 0,0034 0,042 5,6

На следующем этапе с целью получения чистого препаративного полисахарида, полученные фракции полисахаридного антигена очистили методом гель-фильтрационной хроматографии на сефадексе 0-200 с использованием в качестве элюата 0,5М ЫаС1 В результате элюирова-ния полисахаридный антиген выходил двумя фракциями. При этом содержание углеводов после концентрирования составляла в среднем в первом пике - 0,06 мг/мл, во втором пике - 0,250 мг/мл Кроме этого отмечено, что во фракциях соответствующих первому пику выявлялись следы белка (по Брэдфорду), тогда как фракции второго пика были свободны от примесных белков.

Анализируя полученные данные можно сделать вывод, что полисахаридный антиген В аШИгаая при очистке гель-фильтрационной хроматографией, элюируется двумя фракциями, при этом примесные белки с частью углеводов высвобождаются в первом пике, соответственно второй пик представляет собой чистый полисахарид свободный от примесей

В дальнейшем для подтверждения полученных результатов, а также с целью определения молекулярной массы полученного полисахарида провели электрофоретическое разделение вышеуказанного антигена Электрофоретический анализ проводили в вертикальном электрофорезе в градиенте полиакриламидного геля На электрофореграмме полисаха-

ридный антиген соответствующий второму пику при очистке гель-фильтрацией проявлялся одной полосой в районе 28 кДа. Данные результаты показывают эффективность выбранной нами методики для выделения полисахаридного антигена из вегетативных клеток В. апМгаш, что подтверждается чистотой полученного антигена.

2.2.2 Антигенные и серологические свойства полисахаридного антигена В. аШИгааБ. На первом этапе, полученный ПС-антиген В. ап-ЖгаЫя был изучен в реакции иммунодиффузной преципитации в геле по ОисЫ:ег1опу. Реакцию ставили на 1% агарозе, с использованием коммерческой сибиреязвенной преципитирующей сывороткой и сыворотки крови крупного рогатого скота и овец, иммунизированных вакциной СТИ против сибирской язвы. Кровь от иммунизированных животных брали через 2 недели после иммунизации. Результаты реакции оценивали через 24 - 48 часов, по наличию линий преципитации

Результаты исследований показывают, что ПС-антиген В. аШИгаЫ реагирует в РИД с формированием четко выраженной линии преципитации только со стандартной сибиреязвенной преципитирующей сывороткой, в то время как с иммунными сыворотками коров и овец линии преципитации не обнаружены, что видимо, связано с низкой концентрацией специфичных антител в антисыворотках.

Серологические свойства полисахаридного антигена В. аыкгаая были изучены и в непрямом ИФА с вышеуказанными сибиреязвенными сыворотками овец и крупного рогатого скота. Результаты изучения серологических свойств в непрямом ИФА показали, что исследуемый по-лисахаридный антиген обладают достаточно высокой активностью при выявлении сибиреязвенных антител в сыворотке крови животных (рисунок 1).

Разведение сывороток

1 Сыв. овец ■ Сыв. КРС □ Не иммун сыв Рисунок I - Серологические свойства ПС-антигена В. агаИгат в ИФА

Как видно из данных диаграммы, титр выявляемых сибиреязвенных антител в образцах крови вакцинированных овец достигал 1:3200, а у крупного рогатого скота 1 12800 При этом оптическая плотность была выше при исследовании сыворотки крови крупного рогатого скота.

Анализ полученных результатов показывает, что полученный антиген обладает достаточной серологической активностью при выявлении сибиреязвенных антител

Для определения антигенных свойств ПС-антигена В аыНгат и возможности использования его в качестве иммуногена при получении штаммов гибридом, синтезирующих моноклональные антитела, данный антиген был использован для иммунизации мышей линии ВАЬВ/с. Тестирование сывороток крови иммунных мышей на содержание специфических антител против полисахаридного антигена В стМгат проводили в непрямом ИФА (таблица 2)

Таблица 2 - Титр антител иммунизированных мышей линии ВАЬВ/с в непрямом ИФА

Группа мышей Концентрация антигена на одну инъекцию, мг/мл Титр антител

I 0,02 1.1600

II 0,05 1-6400

III 0,1 1:6400

Как видно из таблицы, определение специфической активности сывороток крови трех групп мышей линии ВАЬВ/с, иммунизированных ПС В агйкгат показало эффективность использованной нами схемы иммунизации Оптимальное сочетание пяти инъекций способствовало появлению достаточного количества сывороточных антител с высокой степенью их сродства к использованному антигену. Титры специфических антител в сыворотке крови мышей, иммунизированных ПС, против аналогичного антигена в ИФА колебались в пределах 1-1600 - 1 6400 Это указывает на активную индукцию клонов В-лимфоцитов, продуцирующих антитела заданной специфичности.

2.2.3 Получение штаммов гибридных культивируемых клеток-продуцентов моноклональиых антител к полисахаридному антигену В. апИггааз. Из каждой группы мышей отбирали животных с максимальными титрами антител, селезенки которых были использованы в качестве источника иммунных лимфоцитов Всего было проведено три серии гибридизации миеломной линий X63-Ag 8.6.5.3. с лимфоцитами каждой группы мышей с целью получения наилучшего результата слияния клеток. При первом слиянии клеток из 384 засеянных лунок рост клонов наблюдался в 57 лунках, те. процент слияния составил 14,8%, при второй и третьей гибридизации выход клонов гибридом составил соответственно 1,6% и 6,25%

Тестирование гибридом на продукцию антител начинали проводить с того момента, когда наблюдалось незначительное пожелтение ростовой среды, и клетки гибридом занимали более 30% поверхности лунок

Результаты первичного тестирования гибридных клонов в иммуно-ферментном анализе показали наличие специфических антител в куль-туральной жидкости только у 4 гибридом при первой гибридизации, что составило 7,01% Из 30 клонов, выделенных в последующих слияниях, ни один клон не обладал специфической антительной активностью против изучаемого антигена.

С целью оптимизации проводимых исследований из числа активных клонов для дальнейших работ были отобраны два штамма 3F11 и 4D3, которые отличались высокой пролиферирующей активностью и продуктивностью моноклональных антител

На следующем этапе работы были проведены серии опытов по изучению морфологических и культуральных свойств гибридных клеток в условиях т vitro.

Результаты исследований показали, что гибридомы штаммов 3F11 и 4D3 хорошо растут в ростовой среде, представляющей собой RPMI1640 с 10% сывороткой плода коровы, 2x10"3 М L- глутамина, lxlО"3 М пиру-вата натрия при температуре 37,5°С в атмосфере с 5% СО2.

Характер роста гибридом - стационарная суспензия При посеве в матрасы гибридомы состоят из слабо прикрепляющихся к подложке округлых клеток размером с исходную миеломную линию, цитоплазма гибридом имеет вид тонкого ободка вокруг ядра

Штаммы гибридных культивируемых клеток сохраняли способность продуцировать специфические моноклональные антитела в течение не менее 5 пассажей на мышах линии BALB/c (срок исследований) Для культивирования гибридомы 4D3 в условиях in vitro необходимо 5-6 дней для образования монослоя при этом концентрация моноклональных антител достигает до 8-15 мкг/мл в 1 мл ростовой среды Для образования монослоя при культивировании гибридных клеток 3F11 достаточно 4-5 дней, при этом концентрация моноклональных антител достигает 15-30 мкг/мл в 1 мл ростовой среды

Таким образом, установлено, что полученные методом клонирования субклоны штаммов гибридных культивируемых клеток 3F11 и 4D3 имеют генетическую однородность и сохраняют стабильность синтеза иммуноглобулинов, имеющих сродство к эпитопам полисахаридного антигена В anthracis

Как показали предыдущие исследования, культивирование гибридом в условиях ш vitro дает возможность получать специфичные антитела только в ограниченных количествах, поэтому для массовой наработки моноклональных антител, необходимо отрабатывать методики культивирования гибридных клеток в условиях т vivo

С этой цечью гибридомные клетки ттттаммов 3F11 и 4D3 пассировали в организме (брюшной полости) мышей линии BALB/c Гибридом-

ные клетки, суспендированные в 2 мл неполной ростовой среды, однократно инокулировали внутрибрюшинно в дозе 2 млн клеток.

Электрофорез в ПААГ с ДСН показал, что препараты МКА, синтезированные гибридомами - высокоочищенные иммуноглобулины, т к. на электрофореграммах наблюдались только две белковые фракции с молекулярной массой в области 66 кД и 20 кД, что соответствует электрофо-ретической подвижности тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов

Известно, что одним из важных свойств моноклональных антител является аффинность, которая характеризует уровень сродства антитела к испытуемому антигену, т.е степень совпадения (комплементарности) конфигураций активного центра антитела и антигенной детерминанты Аффинность антител может быть количественно измерена с помощью определения константы связывания В этой связи в иммунологических реакциях, основанных на использовании твердой фазы (носителя), используются антитела с высокой аффинностью Показатели константы связывания моноклональных антител штаммов 3F11 и 4D3 были достаточно высокими: соответственно 1,0х10"9М и 2,5х10"8М

Следующим этапом исследований было изучение специфичности и активности моноклональных антител штаммов 3F11 и 4D3 в непрямом варианте ИФА При проведении опытов были использованы растворимые антигены и цельные клетки как В. anthracis, так и других видов микроорганизмов Результаты опыта представлены в таблице 3

Результаты исследований показывают, что моноклональные антитела, продуцируемые штаммами гибридом 3F11 и 4D3, активно взаимодействуют как с растворимыми, так и с корпускулярными антигенами В anthracis При этом наибольший титр антител наблюдается при детекции полисахаридного антигена, где титр антител штамма 3F11 составил -1 32 в культуральной жидкости и 1 51200 в асцитной жидкости, а титр антител штамма 4D3 равнялся соответственно 1.16 и 1 25600. Слабая перекрестная реакция испытуемых антител с растворимым антигеном В subtihs (1:200 и 1.400) и корпускулярным антигеном В cereus (1.200) объясняется близкородственностью данных антигенов с антигенами сибиреязвенной бациллы. Растворимый антиген Brucella abortus штамма 19 и корпускулярные антигены Brucella mehtensis 16М, Escherichia coli, Salmonella dublin наряду с цельными клетками В subtilis не вступали в реакцию с МКА ни в культуральной, ни в асцитной жидкости

Примечателен тот факт, что активность моноклональных антител обоих штаммов, была относительно низкой в отношении поверхностного белкового антигена В anthracis в сравнении с полисахаридным антигеном. Так титр антител штамма 3F11 составил - 1:4 в культуральной жидкости и 1 1600 в асцитной жидкости, тогда как культуральная жидкость штамма 4D3 вообще показала отрицательный результат, при титре 1:400 в асцитной жидкости Данное обстоятельство подтверждает степень чистоты полученного и использованного нами полисахаридного антигена. То есть моноклональные антитела штаммов 3F11 и 4D3 обла-

дают высокой специфичностью именно к полисахаридному антигену В anthracis.

Таблица 3 - Изучение специфичности и активности МКА в непрямом ИФА

№ п/п Виды антигенов Титры моноклональных антител

3F11 4D3

вкультур-ой| васцит-1 ной в культур- 1 васцит-ой 1 ной

жидкости жидкости

Растворимые антигены.

1 Почисахаридный антиген В anthracis 1 32 1 51200 116 1 25600

2 Поверхностный белковый антиген В anthracis 1 4 1 1600 РО 1 400

3 Белково- иипополисахаридный комплекс В Anthracis 1 4 1 3200 1 4 1 6400

4 ЛПС антиген В subtihs РО 1 200 РО 1 400

5 О-ПС антиген Br abortus 19 РО РО РО РО

Корпускулярные антигены-

6 В anthracis 1 32 1 6400 1 16 1-3200

7 В anthracis СТИ-1 1-32 1:12800 1 16 1 12800

8 В anthracis Ценковского 1 8 1 3200 14 1 3200

9 В subtilis РО РО РО РО

10 В cereits РО 1 200 РО 1 200

11 Br melitensis 16М РО РО РО РО

12 Escherichia coll РО РО РО РО

13 Salmonella dubhn РО РО РО РО

Примечание РО - реакция отрицательная

С целью подтверждения полученных нами результатов, монокло-нальные антитела гибридомы ЗБП были подвергнуты исследованию в непрямом ИФА на специфичность с 62 патогенными и 2 вакцинными штаммами В ашИгаФ, а также с 1 штаммом В сегеш из коллекции Казахского научного центра карантинных и зоонозных инфекций им М Айкимбаева Министерства здравоохранения РК. При испытании моно-клональных антител патогенные штаммы использовались в вегетативной, споровой и капсульной формах, а вакцинные штаммы В апЖгат и штамм В сегеш в вегетативной и споровой Реакцию оценивали по окрашиванию субстрата Результаты исследования показали, что испытуемые моноклональные антитела штамма ЗБ11 выявляют В ап^гат в вегетативной форме - 93,5% случаях, а в споровой и капсульной формах -88,7% и 98,4% случаях соответственно При этом 4 штамма В аЫкгаш (6,5%) в вегетативной форме, 7 штаммов (11,3%) в споровой форме и 1

штамм (1,6%) в капсульной форме испытуемыми антителами не выявлялись Однако, стоит отметить, что штаммы В аЫкгаш, которые не выявлялись моноклональными антителами по одной форме обнаруживались при исследований в двух других формах, кроме штамма №47 который детектировался только в вегетативной форме, где получен слабоположительный результат. Из 62 патогенных штаммов В амИгасю, 51 штамм (82,3%) выявлялся исследуемыми моноклональными антителами во всех трех формах.

Исследуемые антитела также четко выявляли и оба вакцинных штамма В апЖгаш, как в вегетативной, так и в споровой формах Специфичность моноклональных антител к полисахаридному антигену В аЫкгаш в данных исследованиях подтверждается тем, что изучаемые антитела не выявляют близкородственный штамм В сегеш ни в вегетативной, ни в споровой формах.

Анализируя результаты проведенных исследований можно заключить, что методом гибридомной технологии получены клоны гибридных клеток, стабильно синтезирующие моноклональные антитела против по-лисахаридного антигена В аЫЬгаш Изучение специфичности и чувствительности полученных антител показало их высокую активность в отношении возбудителя сибирской язвы, в то время как другие близкородственные бациллы ими не выявлялись Данные результаты дают основания полагать, что полученные МКА могут использоваться в качестве реагентов при конструировании диагностических тест-систем для обнаружения сибиреязвенного микроба в объектах окружающей среды

2.2.4 Разработка тест-системы ИФА на основе моноклональных антител для индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды.

Приготовление иммуиоферментного конъюгата. Известно, что иммуноферментный анализ в настоящее время находит все большее применение в диагностической практике Чувствительность и специфичность ИФА в значительной степени определяются активностью применяемых антител, конъюгированных ферментами Сущность приготовления конъюгата для ИФА заключается в ферментной метке одного из исходных компонентов реакционной системы, которая в дальнейшем легко детектируется визуально или соответствующим высокочувствительным физико-химическим методом,

В связи с этим на следующем этапе исследований мы конъюгирова-ли моноклональные антитела к полисахаридному антигену В аыЬгааз (штамм 403) пероксидазой хрена, используя при этом ковалентный способ приготовления иммуиоферментного конъюгата Контроль активности конъюгата осуществляли путем определения его рабочего титра в прямом варианте твердофазного ИФА. За рабочий титр конъюгата, принимали его разведение, при котором выявлялось наименьшее количество полисахаридного антигена сибиреязвенного микроба при отсутствии окрашивания в контроле. Рабочий титр конъюгата, который считается при-

годным для комплектации набора, должен быть не менее 1:500. Очистку коньюгата от не связавшихся реагентов проводили методом гель-фильтрации на колонке с сефадексом 0-200.

Результаты определения активности и рабочей концентрации полученного конъюгата в ИФА представлены в таблице 4.

Анализ результатов ИФА показывает, что приготовленный нами конъюгат обладает достаточной активностью и чувствительностью. В разведениях 1:400 и 1:800 наблюдается четкое выявление титрации антигена, при этом чувствительность конъюгата составила, соответственно 0,01 и 0,02 мкг/мл. Разведение конъюгата в 1:1600 и 1:3200 резко снизило его активность, что отразилось на чувствительности реагента. По данным позициям антиген выявлялся в концентрациях 2,5 и 10 мкг/мл соответственно. В дальнейших исследованиях конъюгат использовали в разведении 1:800, так как в данной концентрации обеспечивается достаточная активность и высокая чувствительность позволяющая обнаруживать в исследуемых материалах до 0,02 мкг/мл специфичного антигена.

Таблица 4 - Оценка активности иммуноферментного конъюгата в прямом ИФА

Концентрация антигена (мкг/мл)

Разведение конъюгата

.100

1:200 1:400 1:800 1:1600 1:3200

Оптическая плотность

Таким образом, в результате данного этапа работ, нам удалось получить высокочувствительный иммуноферментный конъюгат специфичный к полисахаридному антигену В. агЛЬгаси. Данный конъюгат может быть использован в качестве реагента при разработке иммуно-ферментной тест-системы для обнаружения сибиреязвенного микроба в объектах внешней среды.

Отработка условий постановки точечного ИФА. Одним из наиболее чувствительных методов при диагностике различных вирусных, бактериальных, грибковых и паразитарных болезней человека и животных является твердофазный иммуноферментный анализ

Высокую точность измерений обеспечивают только специальные анализаторы, поэтому ИФА применяется в основном в лабораториях. Кроме того, свойства микротитровальных планшетов, используемых для анализа, изменяются от партии к партии, от планшета к планшету и даже от лунки к лунке так называемый краевой эффект. Наряду с этим, в последнее время наблюдается тенденция к снижению стоимости диагностических исследований В связи с этим наибольшую популярность приобретают простые методы анализа, не требующие дорогого оборудования. Метод ИФА вследствие модификации также претерпел изменения, стал более надежным, более простым в исполнении и приемлемым по цене Так в модифицированном варианте для адсорбции различных антител или антигенов вместо внутренних поверхностей лунок микротитровальных планшет, на которых не очень эффективно адсорбируются реагенты, используют нитроцеллюлозные мембраны Такую модификацию называют точечный твердофазный иммуноферментный анализ (dot-ELISA) В точечном ИФА минимальный объем растворов антител или антигена наносят на нитроцеллюлозную или подобную подложку в виде серии точек, что позволяет выполнить гораздо большее число анализов с тем же количеством реагентов. Исходя из этого, в наших исследованиях, принцип обнаружения В anthracis в объектах внешней среды или в патологическом материале был основан на применении моноклональных антител в точечном сэндвич- варианте иммуноферментного анализа с использованием в качестве носителя нитроцеллюлозной мембраны

Для этого готовили двухкратные разведения моноклональных антител штамма 3F11 с исходной концентрацией 8,0 мг/мл в ЗФР' 1 50, 1 100, 1 200, 1.400, 1:800, 1-1600, 1.3200 и 1-6400 На поверхность полоски нитроцеллюлозной мембраны (45x5 мм) с диаметром пор 0 45 мкм в 8-и точках наносили по 0,001 мл раствора МКА из каждого разведения и оставляли при комнатной температуре до полного высыхания нанесенных образцов Активные участки сенсибилизированной полоски пассировали 1 % раствором БСА в течение 1 часа, отмывали ее ЗФР-Тв 3 раза по 2 минуты. После чего погружали в экстракт исследуемого материала (инактивированные цельные клетки В anthracis, В subtilis, полисахарид-ный антиген) на 1,5 часа при 37°С В качестве положительного контроля одну полоску носителя погружали в раствор стандарного сибиреязвенного антигена для реакции преципитации, предварительно разведенного 1 1000 в ЗФР. Отрицательным контролем служила полоска нитроцеллюлозной мембраны, выдержанная в физиологическом растворе. Затем повторяли процедуру отмывки носителя и переносили их в раствор конъюгата В качестве конъюгата использовали МКА штамма 4D3, меченные перок-сидазой хрена. Инкубировали 1 час при 37°С. Отмывали носитель от не-

связавшихся компонентов реакции и переносили в раствор субстрата фермента, состоящей из перекиси водорода и хромогена 4-хлор -1-нафтола Реакцию останавливали через 3-5 минут путем отмывки полосок нитроцеллюлозной мембраны дистиллированной водой. Учет результатов анализа проводили после высыхания нитроцеллюлозных полосок. Положительная реакция характеризуется появлением серо-фиолетовых точек с убывающей интенсивностью окраски на поверхности носителя, инкубированного в растворе положительного контрольного антигена Нитроцеллюлозная мембрана, выдержанная в физиологическом растворе, должна оставаться чистой, без следов серо-фиолетового цвета Результаты иммуноферментного анализа считали положительным при появлении на носителе хотя бы одной точки серо-фиолетовой окраски, соответствующей определенному разведению МКА нанесенных на носитель и отрицательным, если поверхность остается чистой

На предварительном этапе нами были отработаны оптимальные условия и техника постановки прямого сэндвич варианта ИФА. Для этого изучалось влияние физико-химических факторов (температура, ионная сила и значения рН реакционной среды, продолжительность взаимодействия, концентрационные соотношения) на чувствительность и специфичность теста. Оптимальными принимали такие условия, при которых предельное разведение обнаруживаемого сибиреязвенного антигена достигало 5-10 мкг/мл, т е наблюдалось проявление серо-фиолетовых точек с высокой интенсивностью окрашивания во всех восьми точках нанесения моноклональных антител с вышеуказанной концентрацией искомого антигена. Для определения оптимальных параметров каждый этап ИФА ставили в пяти повторах

Результаты исследований показали, что оптимальными концентрациями МКА, наносимых на нитроцеллюлозную мембрану в восьми точках, является концентрация, начиная с 160 мкг/мл до 1,25 мкг/мл Равновесие в реакции антитело-искомый антиген наступало через 1,5-2 часа, а в реакции (антитело+антиген)-конъюгат достигало через 1 час инкубирования при температуре +37°С Устранение неспецифических эффектов типа "твердая фаза-белок", и "белок-белок" осуществлялось промывочными буферными растворами, включающими неионный детергент (твин-20)

Известно, что основными критериями оценки эффективности любой серологической или иммунологической реакции является изучение их чувствительности и специфичности по отношению к искомому антигену. Поэтому, мы на следующем этапе, изучали данные параметры предлагаемого нами сэндвич варианта точечного ИФА с использованием двух моноклональных антител к полисахаридному антигену В ашИгаст, один из которых конъюгирован с ферментом При этом в качестве объектов исследования использовали образцы растворимых и корпус-¡п/попннх йнтигрнпи В апЖглпч В чиЬЫгч и ттттих микгюооганизмов

Г------------— ' ' ' ' А * А А

в двукратных разведениях с убывающей концентрацией.

Результаты исследования показали, что предлагаемая нами тест-система из исследуемых растворимых антигенов, наиболее полно выявляет полисахаридный антиген В anthracis, предел детекции составил 0,002 мг/мл Другие антигены сибиреязвенной бациллы обнаруживались только при достаточно больших концентрациях Так пределы обнаружения поверхностного белкового антигена и белково-липополисахаридного комплекса В anthracis составили соответственно 0,2 и 0,1 мг/мл. Из цельных клеток тест-система выявляла только сибиреязвенные микробы Так, если минимальное количество выявляемых клеток В anthracis СТИ-1 составила 2x103 м к /мл, то сибиреязвенные бациллы Ценковского детектировались до разведения 5><103 м.к/мл. Что касается близкородственных сапрофитных бацилл, то липополи-сахаридный антиген В subtilis детектировался только при концентрации 1,0 мг/мл, в то время как его цельные клетки тест-система не выявляла

Очень важно было при разработке иммуноферментной тест-системы изучить его специфичность в отношении В cereus, так как многие рекомендуемые и используемые иммунологические и серологические реакции при выявлении сибиреязвенной бациллы перекрестно реагируют с этим близкородственным микроорганизмом Предлагаемая нами тест-система детектировала В cereus только при содержании 5*108 м.к /мл Другие микроорганизмы, как в виде растворимого антигена (О-ПС антиген Br abortus 19), так и в виде цельных клеток (Br melitensis 16М, Escherichia coli, Salmonella dubliri) предлагаемой нами тест-системой не выявлялись

Таким образом, результаты проведенных исследований дают основания предположить, что предлагаемая нами тест-система обладает достаточной чувствительностью и специфичностью в отношении сибиреязвенного микроба. Поэтому в последующих исследованиях мы изучали эффективность анализа при выявлении патогена из объектов внешней среды

Как известно, основными резервуарами возбудителя сибирской язвы являются объекты внешней среды почва, вода и корма, в которых он может сохраняться и размножаться длительное время и в дальнейшем передаваться восприимчивым животным При этом почва играет преимущественную роль в возникновении сибиреязвенного эпизоотического процесса Установлено, что в оптимальных условиях возбудитель сибирской язвы пребывает в почве не в анабиотической споровой форме, а совершает определенный цикл: вегетативные клетки - споры - вегетативные клетки и т д Инфицированные сибиреязвенной бациллой корма и вода также представляют серьезную угрозу, так как наряду с угрозой заражения животных возникает высокая вероятность инфицирования людей. Кроме того, в качестве альтернативного варианта были исследованы искусственно контаминированные селезенка и печень крупного рогатого скота С целью оценки эффективности метода, весь инфициро-

ванный материал был подвергнут исследованию в непрямом твердофазном ИФА.

Результаты показали, что в целом точечный сэндвич вариант им-муноферментного анализа более эффективен при выявлении сибиреязвенного микроба из объектов окружающей среды, чем непрямой вариант ИФА.

Так при исследовании почвы (рисунок 2) и воды точечный вариант ИФА выявлял до 5,0х 103 и 1,0х103 м.к./мл соответственно, тогда как при постановке непрямого ИФА показатели индикации составили соответственно до 2,5*104 и 1,0*104 м.к./мл. Однако при исследовании корма чувствительность обоих тестов была на одном уровне до 1,0x104 м.к./мл. Исследование паренхиматозных органов на наличие антигенов сибирской язвы показали следующие результаты. В экстрактах печени, как дот-ИФА, так и непрямой ТИФА выявляли бацилл до концентрации 1,0x103 м.к./мл, в то время как в экстрактах селезенки чувствительность дот-ИФА была равна 2,5x104 м.к./мл, а непрямой ТИФА 5,0x104 м.к./мл.

1 2 3

6 7

10 11 12

Примечание: 1 - Отрицательный контроль;

1 . V \ е:'

] ' 1 | т «■

1 :'■■ ■\л 1

5 ' ■ 1

1 1 ■}'г,; ч

| щ \ 1 *! V ,4 1 -.

13 14

клетками В. аЫкгаш в концентрации от 5,0x10 до 5,0хЮ3 м.к./мл

Рисунок 2 - Исследование проб почвы в дот-ИФА

Анализ полученных данных показывает, что предлагаемая нами иммуноферментная тест-система на основе моноклональных антител к полисахаридному антигену В. апМгат вполне пригодна для индикации сибиреязвенного микроба в объектах внешней среды. Что касается сравнительно низкой выявляемое™ контаминированного антигена из паренхиматозных органов, в сравнении с другими исследуемыми материалами (почва, корм и вода), то данное обстоятельство требует дальнейшего более углубленного изучения.

выводы

1 Водно-фенольная экстракция липополисахарида из бактериальной массы В anthracis и последующая его очистка с помощью гель-фильтрационной хроматографии позволяют получить полисахаридный антиген с молекулярной массой 28 кДа

2 Полисахаридный антиген В anthracis обладает антигенными и иммуногенными свойствами, титр сибиреязвенных антител в ИФА у крупного рогатого скота, иммунизированного живой вакциной СТИ-1, составил 1'12800, а использование препарата в качестве иммуногена стимулировало иммунную систему мышей BALB/c на выработку специфических антител

3 Получено 2 штамма гибридных культивируемых клеток Mus mus-cuius с авторскими названиями 3F11 и 4D3, стабильно продуцирующие моноклональные антитела класса IgM к полисахаридному антигену В anthracis с константой связывания 1,0хЮ"9М и 2,5х10'8М соответственно.

4 Клетки гибридом 3F11 и 4D3 имеют способность активно расти в условиях in vivo в организме однолинейных мышей, синтезируя моноклональные антитела к полисахаридному антигену возбудителя сибирской язвы. При этом концентрация специфических иммуноглобулинов за 10 дней культивирования штаммов-продуцентов достигает 8 мг/мл при объеме асцитной жидкости не менее 6 мл.

5 Моноклональные антитела обоих штаммов гибридом позволяют дифференцировать возбудителя сибирской язвы от близкородственных сапрофитов В subtilis и В cereus в иммуноферментном анализе

6 Эпитоп, специфичный для возбудителя сибирской язвы, доступен для моноклональных антител в 88,7%, 93,4% и 98,4% случаях при выявлении соответственно споровых, вегетативных и капсульных форм В anthracis.

7 Разработанная диагностическая тест-система на основе иммуно-ферментного анализа способна выявлять от 1,0x104 до 1,0x10 3 м к /мл сибиреязвенного микроба в исследуемых материалах

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus (авторское название 3F11), депонированный в коллекции микроорганизмов НЦБ РК рекомендуется использовать в качестве дешевого источника однородных антител, специфичных к В anthracis

2 «Набор иммуноферментной тест-системы для индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды» (НТД на реагенты «Набора...» согласована с Департаментом ветеринарии МСХ РК 20 12.2005 года и прошла экспертизу в Комитете технической стандартизации и метрологии Министерства индустрии и торговли № 002/00800 от 26 декабря 2005) рекомендуется использовать для индикации возбудителя сибирской язвы в объектах внешней среды

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1 Муханбеткалиев Е Е , Булашев А К , Бакирова Г А., Шенжанов К Т Антигенные и серологические свойства липополисахаридного антигена Bacillus anthracis. II Вестник Семипалатинского государственного университета им Шакарима г Семей, 2004 г Спецвыпуск Материалы Республиканской научно-практической конференций «Ветеринарная наука и практика - производству». С 109-112

2 Получение и изучение серологических свойств липополисахаридного антигена Bacillus anthracis //Тезисы докладов Республиканской научно-теоретической конференции молодых ученых и студентов, посвященной 50-летию освоения целинных и залежных земель г Астана, 2004 г С 199-200

3 Муханбеткалиев Е Е., Булашев А К , Бакирова Г А, Шенжанов К.Т. Получение штаммов гибридных культивируемых клеток синтезирующих моноклональные антитела к Bacillus anthracis II Материалы научно-практической конференции молодых ученых Казахской государственной медицинской академии «Актуальные вопросы медицины» г Астана 2005 г С 43-44.

4 Муханбеткалиев Е Е Клонирование и наработка моноклональных антител к полисахаридному антигену Bacillus anthracis. II Тезисы республиканской научно-теоретической конференции молодых ученых, аспирантов, магистрантов, студентов и школьников «Сейфуллинские чтения-1» посвященной 110-летию со дня рождения Сакена Сейфулли-на г Астана 2005 г С 129-130.

5 Муханбеткалиев Е.Е., Булашев А К , Бакирова Г А , Шенжанов К.Т. Получение моноклональных антител к полисахаридному антигену Bacillus anthracis И Вестник науки Казахского государственного агротехнического университета им. С. Сейфуллина г Астана Т.5, №1, 2006 г. С.148-154

6 Муханбеткалиев Е Е Характеристика моноклональных антител к полисахаридному антигену Bacillus anthracis II Вестник науки Казахского государственного агротехнического университета им С Сейфул-линаг Астана №2 (41), 2006 г С 117-121.

7 Муханбеткалиев Е.Е , Булашев А К, Бакирова Г А, Шенжанов К Т Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L, -продуцент моноклональных антител к полисахаридному антигену Bacillus anthracisll Предварительный патент PK на изобретение. № 18391 от 16 04 2007 г, бюллетень № 4.

Муханбеткалиев Ерсш Ергазырш

«Иммунды ферментпк талдаумен ciöip жарасы коздырушысын экспресс тэсшмен аныктау»

Мал дэр1герл1п гылымдарыныц кандидаты шлыми дэрежесш ¡здену

диссертациясы

16 00 03 - Мал дэр1герл1к микробиология, вирусология, эпизоотология, микология мюсотоксикологиямен 6ipre жэне иммунология

ТУЙ1Н

Зерттеу нысаны: Жумысты орындау барысында Bacillus anthracis СТИ-1 вакцинальщ штамыньщ бутш жасушаларымен жасуша кабыргаларыныц полисахаридт1 антигендер1, зертханалык ак тышкандар мен 7-8 апталык жастагы BALB/c тышкандары, ipi кара малдар мен койлардыц иммунды к;ан сары сулары, сондай ак Bacillus anthracis СТИ-1 вакцинальщ штамыньщ бутш жасушаларымен колдан контаминацияланган топырак, азык, су, ipi к;араныц талаш мен бауыр ynrinepi колданылды

Ж^мыстыц максаты: Bacillus anthracis жасуша кабыргасыныц полисахаридт1 антигенше тел1МД1 моноклоналды антиденелер негшнде коршаган орта объектшершен ciöip жарасы коздырушысын аныктауга арналган экспресс тэсшд1 эзфлеу

Осы мак;сатка жету уппн Keneci мшдеттер койылды

1 Bacillus anthracis бакгериясынан полисахарида антиген белга алу жэне оныц иммунохимиялык; жэне антигендш касиеттерш айкындау

2 Bacillus anthracis-тщ полисахаридл антигенше телшд1 моноклоналды антиденелерд1 тузетш гибридт1 жасушалар штамын алу

3 Алынган моноклоналды антиденелердщ непзп иммунохимиялык касиеттерш аныктау

4 К.оршаган орта объектшершен ci6ip жарасы коздырушысын аныктауга арналган нуктел1 иммунды ферментпк талдаудыц койылым шарттарын айкындау

5 Ciöip жарасы коздырушысыныц индикациясына арналган иммунды ферментпк талдау жиынтыган зертханалык сынактан етгазу жэне норматив-п-техникальщ кужаттарды эз1рлеу

Зерттеу эдктери Bacillus anthracis-тщ вегетативп жасушаларынан О Westphal (1965) эд1сх бойынша белщш алынган липополисахаридп фракциясын 1%-ды ырке кышкылымен гидролиздеу аркылы полисахаридт1 антиген алынды.

Зерттеуге алынган улплердщ электрофорезг J Laemmli et al (1970) эд1С1 бойынша журпз1лд1

Будандастыруга X^Ag 8 653 миелома жасушалары мен Bacillus anthracis-тш полисахаридл антигендершен иммунделген BALB/c тышкандарыныц спленоциттер1 пайдаланылды. X63Ag 8.653 миелома жасушалары мен иммунды спленодитгерш будандастыру ж^мыстарыУ Oi, L. Herzenberg (1980) ЭД1С1 бойынша 1ске асырылды.

Гибридп жасушалар есшдшерш клондау J Coding (1980) эдюшен лимит суйылту аркылы орындалды

Алынган моноклоналды антиденелердщ класы мен класс тармагын О. Ouchterlony (1958) ТЭС1Л1 бойынша иммунды диффузиялык реакциясымен аньщтадык 4D3 гибрида жасушалар штамынын моноклоналды анхиденелерш колдана отыра ci6ip жарасына телшд1 пероксидазалык конъюгат стандартты эдюпен дайындалды Дайындалган теладц конъюгаттьщ белсендшп мен ж^мыс титрш аньщтау катгы фазалы иммунды ферментпк талдаудьщ тжелей койылымы аркылы журпзшд1

Нуктел1 иммунды ферменттш талдауды (дот-ИФТ) квлем1 5x45 мм болатын нитроцеллюлозальщ мембрана жолактарына (Millipor) моноклоналды антиденелердщ эр с^йылтымдарын 0,001 мл мелшерщде тамызу аркылы жургхздш

Зерттеу нэтижелери В anthracis штамыньщ бактериялык массасынан сулы-фенолды экстракциялау аркылы алынган липополисахаридт1 гель-фильтрацияльщ хроматография эдосшен тазартып, молеклальщ салмагы 28 кДа болатын полисахаридл антиген алынды

В anthracis-хщ полисахаридл антигеншщ иммуногендш жэне антигендш касиеттер! жогары болды СТИ-1 вакцинасымен иммунделген ipi караныц ci6ip жарасына к;арсы тузшген антиденелердщ титр! 1 12800 болды, ал иммуноген ретшде колданылган препарат BALB/c тыпщандарыныц организмшдеп иммундык; жуйелершщ кызыметш ынталандырып, тел1мд1 антиденелердщ кеп мелшерде тузшуш камтамасыз ететщцт айкындалды.

В anthracis-тщ пописахаридт1 антигенше карсы, IgM класына жататын, антигенмен байланысу константасы 1,0х10'9М жэне 2,5х10"8М болатын моноклоналды антиденелрд1 бфкалыпты тузетш 3F11 жэне 4D3 деп аталатын Mus musculus гибридт1 жасушалар штамдары алынды

3F11 жэне 4D3 гибридома жасушалары ВАЬВ/с тышкандарыньщ организмшде (in vivo жагдайында) белсенд! турде кебейш, ci6ip жарасы крздырушысына карсы моноклоналды антиденелерд1 6ip калыпты синтездей алатындыга байкалды 10 кун бойы m vivo жагдайында ест енген гибридт1 жасушалардан алынган тел1МД1 иммуноглобулиндердщ концентрациясы 8 мг/мл к;урады

Аталмыш гибридома штамдарыньщ моноклоналды антиденелер1 ci6ip жарасы коздырушысын В subtilis и В cereus сапрофигпк бактерияларынан иммунды ферментпк талдауда ажыратуга мумюндж беред!

Моноклоналды антиденелер ci6ip жарасы коздырушысыныц споральщ, вегетативтж жэне капсулалык формаларын сэйкесшше 88,7%, 93,4% и 98,4%-ында аньисгады.

Иммунды ферментпк талдау непзшде эзфленген диагностикалык тест-жуйесп зерттеуге алынган материалдардан ci6ip жарасы бактериясын 1,0x104 - 1,0x103 м ж /мл мелшершде аныктауга мумкшдш беред1

Гылыми жацалыгы: В anthracis-тщ жасуша кабыргасында тек ciôip жарасы бацилласына тэн, молекулальщ салмагы 28 кДа кэдзайтын полисахаридп антиген болатындыгы аньщталды

Алгаш рет В anthracis-тщ жасуша кабыргасыньщ полисахаридп антигешне телшд1 моноклоналды антиденелерд1 синтездейтш, авторлык атауы 3F11, Mus. musculus гибридл жасушалар штамы алынды (енертапкыштыкка бершген авторлык куэлк № 51722, 16 04 2007 ж, бюль № 4). В anthracis-т'щ полисахаридп антигешне карсы алынган 4D3 штамыньщ моноклоналды антиденелершен иммунды ферменттж конъюгатты дайындау жагдайлары оцтайландырылды Аталмыш конъюгат ci6ip жарасы микробын иммунды ферментпк талдаудыц «ткелей» жэне «сэндвич» койылымдарында аньщтауга мумкхндш беред!

3F11 гибридомасыньщ моноклоналды антиденелер1 непзшде коршаган орта объектшершен ci6ip жарасы коз дыру шы сын табуга мумкшдш беретш иммунды ферментпк тест-жуйеа эз1рленд1

Енпзу дэрежеск КР ¥БО микроорганизмдер коллекциясына сактауга бершген Mus musculus гибридп жасушалар штамын (авторлык; атауы 3F11) В anthracis-ке телшд1 б1ртект1 антиденелердщ арзан кез1 ретшде пайдалануга усынылады

«К^оршаган орта объектшершен ci6ip жарасы коздырушысын аныктауга арналган иммунды ферментпк тест-жуйеа жиынтыгы» (жиынтьпсгьщ НТК, КР АШМ ветеринария Департаментмен 20 12 2005ж. макулданды жэне Индустрия жэне сауда министрлшнщ техникалык стандартгау жэне метрология КомитеЛнде сараптама жYpгlзiлдl, 26 желтоксан 2005 ж. № 002/00800) коршаган орта объектшершен ci6ip жарасы коздырушысын индикациялауда колдануга болады

Колдану аумагы: Ветеринария саласы

Mukhanbetkaliyev Y Yersyn

«The express train-detection of the activator of the Siberian ulcer in enzyme-linked immunosorbent assay»

The dissertation on scientific degree competition of candidate of veterinary sciences

16 00 03 - veterinary microbiology, virology, epizootology, mycology with mycotoxicology and immunology

RESUME

Object of research: At performance of work polysaccharide antigens of intact cells and cellular wall of Bacillus anthracis STI -1, whit mice and 7-8 weeks aged BALB/c mice, immune antiserum of large horned livestock and sheep, and intact cells of vaccine strain of Bacillus anthracis STI-1 artificial contaminated soil, forages, water, sample of spleen and a liver of large horned livestock were used

The purpose of the work: Is development of the express method based on the monoclonal antibodies special for polysaccharide antigen of B anthracis cell wall to detect anthrax pathogen in environmental objects

To get to the purpose following tasks are required.

1 To isolate polysaccharide antigens of B anthracis and to determine its immune-chemical and antigenic properties

2 To obtain monoclonal antibody producing hybrid cell strain polysaccharide antigens of B anthracis.

3 To study the basic immune-chemical properties of obtained monoclonal antibodies

4 To define requirements for take dot blotmg for detection of the anthrax pathogen in environmental objects

5 To do a laboratonal test to ELISA test system for anthrax pathogen induction and prepare normative-technical documents

Methods of research: By hydrolyze in 1% acetic acid the polysaccharide antigens separated from the polysaccharide fraction which isolated from vegetative cells of Bacillus anthracis by the method of O Westphal (1965)

The obtained samples separated with electrophoresis by the J Laemmli et al (1970) method

For hybridization used X63Ag 8.653 myeloma cell line and spleen cells of the BALB/c mice immunized with polysaccharide antigen of Bacillus anthracis Hybridization of X63Ag 8 653 myeloma cells and immune spleen cells were done by the method of V Oi, L Herzenberg (1980)

Hybrid culture cells cloned by the limited diluting method of J Coding (1980)

The class and subclass received monolonal antibodies were defined by double immunodiffusion method of O Ouchterlony (1958) Specific anti-

anthrax peroxidase conjugate prepared with monoclonal antibody produced from 4D3 hybrid cell strain in the use of standard technique The activity and working titre of conjugate were defined by solid phase direct ELISA

In the solid phase Dot blot drop 0,001 ml of monoclonal antibody in every dilution to the 5x45 mm sized points of the blotmg nitrocellulose membrane (Millipore)

Results of researches: Polysaccharide isolated from B anthracis strain bacterial mass by hydro-phenol extraction method and then purified by gel filtration chromatography, obtained polysaccharide antigen which 28 kDa in molecular mass

Polysaccharide antigen of B anthracis has high antigenic and immunochemical properties the titre of antibodies of large horned livestock which immunized with STI-1 to anthrax is 1.12800 And the immunogen increase the function of immune system in the BALB/c mice and promotion of production of specific antibodies in high level is observed

Obtained two Mus musculus hybrid cell strains stably producing monoclonal antibodies against polysaccharide antigens of B anthracis, they are called 3F11 and 4D3 respectively The monoclonal antibodies belong to IgM type and with a constant of linkage, 1,0x10-9M and 2,5x10-8M accordingly.

The ability of 3F11 and 4D3 hybrid cells actively proliferate in the organism of BALB/c mice (in vivo), and stably producing of monoclonal antibodies against pathogen of anthrax is observed The concentration of hybrid cell produced immunoglobulin at the in vivo condition during ten days is 8 mg/ml

Monoclonal antibodies of so called hybndoma strains are allow to differentiate the pathogens of the anthrax from closely related saprophytes B sub-tihs and B cereus in ELISA.

Monoclonal antibodies determine sporous, vegetative and capsular forms of anthrax pathogens as 88,7 %, 93,4 % and 98,4 % respectively

Developed diagnostic test-system based on ELISA allows to detect anthrax bacteria from l,0xl04 to 1,0*103 m c/ml m investigated materials.

Scientific novelty: Anthrax-specific polysaccharide antigen with molecular mass 28 kDa m cellular wall of B anthracis is determined

For the first time obtained Mus Musculus hybrid culture cell strain with author's name 3F11, which synthesis monoclonal antibodies against polysaccharide antigen of cellular wall of B anthracis, that is confirmed by preliminary patent PK for the invention (the copyright certificate 51722 from 4/16/2007, bulletin 4) Optimized the conditions of prepare immune- en-zimic conjugate with the monoclonal antibody of 4D3 strain against polysaccharide antigen of B. anthracis. The conjugate allow to detect anthrax microbe with "direct" and "sandwich" ELISA

Developed a ELISA test system based on monoclonal antibody of 3F11 hybndoma to detect anthrax pathogens m investigated environmental objectives

Introduction of results of researches: Strain hybrid cultivated cells Mus musculus hybrid culture cell strain (the author's name 3F11), deposited in collections of microorganisms NCB RK, it is recommended to use as a cheap source of the homogeneous antibodies specific to B anthracis

«ELISA the test-system for detection of the pathogen of the anthrax in environmental objects» (the reference document on reagents is coordinated with Department of veterinary science Ministry of agricultural RK 12/20/2005 and has passed examination in Committee of technical standardization and metrology of the Ministry of the industry and trade 002/00800 in December, 26th 2005) to use for detection of the pathogen of the anthrax in environmental objects

Scope: Veterinary science

Сдано в набор 19 08 2008 Формат 60x84 Ш6 Уел печ л 1,68

Подписано в печать 18 08 2008 Заказ №7133 Тираж ЮОэкз

Типография Казахского агротехнического университета им С Сейфуллина, 2008 г Н 010011, г Астана, пр Победы, 62 а