Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Получение моноклональных антител к адгезивному антигену К88 E. Coli и разработка на их основе диагностической тест-системы

РГБ ОД

1 1 OKI

УДК 619.616.981.34 на правах рукописи

Оспанова Сауле Гельмановна

ПОЛУЧЕНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АДГЕЗИВНОМУ АНТИГЕНУ К88 Е.СОЫ И РАЗРАБОТКА НА ИХ ОСНОВЕ ДИАГНОСТИЧЕСКОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ

14.00.36 — аллергология к иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Республика Казахстан Астана 1999

Работа выполнена в биотехнологическом центре Акмолинского аграрного университета им. С. Сейфуллина Министерства науки и высшего образования Республики Казахстан

Научный руководитель: - доктор ветеринарных наук

К. К. Муканов.

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук,

профессор Т. И. Тугамбаев - кандидат биологических наук Р. Т. Тлеулиева Ведущее учреждение: - Казахский государственный

медицинский университет им. С.Д. Асфендиярова МЗО и С РК

Защита состоится __" 1999 г. часов на

заседании диссертационного совета Д 09.08.02 при Научном центре гигиены и эпидемиологии КЗ МЗО к С РК по адресу: 480002, г. Алматы, ул. Макатаева, 34.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Научного центра гигиены и эпидемиологии КЗ МЗО и С РК.

Автореферат разослан " 1999 г.

Ученый секретарь диссертационного со.йе'пз.,-доктор медицинских наук, Л

профессор I , I Ж. А. Сатыбалдиева

^Мб -^о и** - ^г - у ®

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Важнейшими условиями увеличения производства животноводческой продукции являются максимальное сохранение новорожденного молодняка и снижение заболеваемости животных путем освоения производством новейших достижений науки и передовой практики. Многочисленные литературные данные показывают, что наиболее сложный период сохранения молодняка — это первые 10-15 дней после рождения, когда он наиболее подвержен болезням желудочно-кишечного тракта — эшерихиоз, ротавирусный и коронавирусный энтериты и.т.д. На этот период приходится около 50% потерь молодняка сельскохозяйственных животных. Именно в это время животным присуща желудочнокишечная патология; риск заболеть достигает 100%, что связано с рядом физиологических особенностей их организма. Отмечено, что в становлении нормобиоза кишечной микрофлоры в постнатальном онтогенезе имеется закономерность: в первые четверо суток интенсивно заселяется в кишечнике грамотрицательная микрофлора, в которой преобладают токси-генные эшерихии, патогенные для новорожденных, страдающих гипогаммаглобулинемией.

Возбудителями эшерихиоза являются разновидности эше-рихий, имеющие факторы патогенности; энтеротоксины термолабильный и термостабильный, эндотоксин, веротоксин, адгезивные антигены и.т.д. При этом основную роль в развитии эшерихиоза играют фимбриальные адгезины, обеспечивающие бактериям возможность прикрепляться к эпителию кишечника и колонизировать его, и энтеротоксины, стимулирующие развитие диареи.

Адгезивные антигены представляют собой выросты нитевидной формы, радиально отходящие от клеточной стенки. Известны адгезины К88 (К88 ав, К88 ас, К88 аф, К99, 987Р, Б41 и.т.д. Установлено, что штаммы с адгезивными антигенами обычно продуцируют и энтеротоксин, и обладают высокой иммуногенностью. Распространенность антигенов адгезии изучают в ветеринарных лабораториях стран СНГ только с 1988 года, когда было налажено производство антиадгезивных колисывороток. При этом большинство из методов исследований основано на применении по-ликлональных антисывороток, что достаточно снижает качество проводимых исследований, обусловленное гетерогенностью антител. Необходимо также учитывать трудоемкость получения

моноспецифических сывороток, причем нельзя гарантировать идентичность качества сывороток различных партий. Альтернативой антисывороткам явились моноклональные антитела (МКА), получение которых обеспечило создание мощного и тонкого инструмента исследований практически во всех областях биологии. Основным достоинством моноклональных антител является возможность их получения в неограниченном количестве с идентичными от партии к партии физикохимическими характеристиками, что позволяет создавать на их основе стандартные диагностические реагенты.

Целью настоящей работы является получение штаммов гибридных культивируемых клеток (гибридом), продуцирующих моноклональные антитела к адгезивному антигену К88 эшерихий, и разработка на их основе экспресс-метода диагностики эше-рихиоза.

Для достижения поставленной цели перед нами были поставлены следующие задачи:

1. Отработать методы получения и очистки адгезивного антигена E.coli.

2. Получить штаммы гибридных клеток, продуцирующие моноклональные антитела к адгезивному антигену К88 E.coli.

3. Изучить основные характеристики полученных моноклональных антител.

4. Отработать условия и технику постановки сэндвич-варианта иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител для обнаружения адгезивного антигена К88 E.coli в биологическом материале животных.

Научная новизна. Впервые получены штаммы гибридных культивируемых клеток — продуцентов моноклональных антител к адгезивному антигену К88 эшерихий. Штаммы гибридных клеток ФАП и C10F6 депонированы (регистрационные номера 01/Г и 6-94) в коллекции культур клеток Научно-исследовательского сельскохозяйственного института Национального центра по биотехнологии Республики Казахстан. На штамм гибридомы C10F6 — продуцента моноклональных антител к адгезивному антигену эшерихий — получен предварительный патент Национального патентного ведомства Республики Казахстан за № 940331.1. от 16.03.94. г. Отработаны методы постановки различных вариантов иммуноферментного анализа на основе использования моноклональных антител, позволяющие иденти-

фицировать адгезивные антигены эшерихий в биологическом материале за 3-3,5 часа.

Практическая значимость. Получены моноклональные антитела, которые могут быть использованы для дифференциации К88 адгизинпозитивных штаммов эшерихий от других перекрестно реагирующих микроорганизмов, а так же в качестве высокоспецифических иммунореагентов при разработке эффективных диагностикумов. Сэндвич-вариант иммуноферментного анализа на основе полученных моноклональных антител может быть использован для экспресс - обнаружения адгезивного антигена К88 эшерихий.

Внедрение. Материалы диссертационной работы используются в лабораториях инфекционных заболеваний животных биотехнологического центра, отделе бактериологии Республиканской ветеринарной лаборатории и на кафедре заразных болезней факультета ветеринарной медицины Акмолинского аграрного университета им. С. Сейфуллина.

Апробация. Основные результаты работы доложены на Республиканской научно-практической конференции "Резервы биотехнологии, ветеринарной медицины и зоотехнии в повышении эффективности животноводства", г. Алматы, 1995; Международной научно-практической конференции " Аграрная наука на рубеже веков", г. Акмола, 1997; на конференции "Актуальные проблемы сельскохозяйственной биотехнологии", посвященной 40-летию научно-исследовательского сельскохозяйственного института Национального центра по биотехнологии Республики Казахстан, п.г.т. Гвардейский, 1998; итоговой научно-практической конференции медицинской академии г. Астаны, 1998 год; Международной научно-практической конференции, посвященной 120-летию К.И. Скрябина, г. Астана, 1998 г.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Штаммы гибридных культивируемых клеток ФАП, 4Н4, 4F4 — продуценты моноклональных антител к эпитопу адгезивного антигена К88 E.coli (белку с мол. массой 25 КДа).

2. Сэндвич-вариант иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител как экспресс метод обнаружения адгезивного антигена К88 ( за 3 -3,5 часа ). Чувствительность теста - 3-6 нг/мл антигена К88 , 250-300 тыс. микроб, кл/мл.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на _страницах и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, 3 глав исследований, заключения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения. Список использованных источников литературы включает 180 наименований работ. Материалы иллюстрированы 13 таблицами, 3 фотографиями, 3 графиками, 1 диаграммой.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований. Работа выполнена в проблемной лаборатории инфекционных болезней молодняка сельскохозяйственных животных биотехнологического центра Акмолинского аграрного университета в соответствии с программой НИР по теме:

"Разработать и освоить производство тест-системы на основе моноклональных антител для диагностики эшерихиоза с учетом факторов патогенности эшерихий" (номер Госрегистрации 0194РК00982).

В работе были использованы штаммы Escherichia coli 09, 0101, 0141 и К12 К88 ав, К12 К88 ас, К12К88 ad, полученные из бактериологической лаборатории Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии. Штаммы 09, 0101 являются позитивными по антигену К99, штамм 0141 - по антигену F41; штаммы К12 К88 ав, К12 К88 ас и К12 К88 ad - по антигенам К88ав, К88 ас и К88 ad Е. coli соответственно. Штаммы цитробактер, протеев и непатогенных эшерихий получены из Акмолинской НИВС, штаммы шигелл - из НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней МЗ PK.

Получение очищенных препаратов адгезивных антигенов. Выделение и очистку адгезивных антигенов К88, К99, F41 эшерихий проводили по методам, описанным Orskov I., Orskov F. (1967) и Isaacson R. E. (1977). Гомогенность полученных чистых препаратов адгезивных антигенов определяли методом электрофореза по Laemmli V.K. (1970). Концентрацию белка в препаратах антигена определяли методом связывания белка с Кумасси синим по Брэдфорду М.М. (1976).

Гибридомная техника (V. Oi, Herzenberg , 1980). Для получения гибридных культивируемых клеток — продуцентов моноклональных антител к адгезивному антигену К88 эшерихий

использовали мышей линии BALB/c 8 недельного возраста. Иммунизацию мышей проводили внутрибрюшинно 0,010 мг очищенного препарата адгезивного антигена К88 эшерихий в 0,3 мл неполного адъюванта Фрейнда и 0,6 мл 0,01М ФСБ рн 7,2 в 1-й день иммунизации. Последующие иммунизации — на 7, 11, 12 и 13-й дни проводили той же дозой антигена без адъюванта Фрейнда. Спустя три дня после последней иммунизации сыворотку крови иммунизированных мышей исследовали на наличие антител против адгезивного антигена К88 эшерихий в иммуно-ферментном анализе. Гибридомы получали путем слияния клеток миеломы Х63 — Ag 8.653 и иммунных спленоцитов. В качестве сливающего агента использовали 45% раствор полиэтиленгликоля — 4000. Для культивирования клеток использовали коммерческую среду RPMI -1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки плода. Селекцию гибридом проводили в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин. Клонирование гибридных клеток проводили методом лимитирующих разведений (J. Godig et.al., 1983). Для получения препаративных количеств моноклональных антител, гибридные клетки культивировали в брюшной полости мышей линии BALB/c. Очистку моноклональных антител из ас-цитной жидкости осуществляли методом высаливания сульфатом аммония до 50% насыщения. Изотип антител определяли б реакции диффузионной преципитации (РДП) с моноспецифическими сыворотками к субклассам иммуноглобулинов фирмы Sigma, США. Константу связывания моноклональных антител определяли по методу J. Beaty et. al. (1987). Специфичность моноклональных антител к адгезивному антигену К88 эшерихий определяли методом иммуноблотинга (JL А. Остерман, 1981).

Активность моноклональных антител изучали в реакции агглютинации и иммуноферментного анализа. Для приготовления конъюгата моноклональных антител с пероксидазой хрена использовали перйодатный метод (Накане, 1974).

Эффективность различных вариантов иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител в сравнении с традиционными методами диагностики эшерихиоза и обнаружения адгезивных антигенов определяли путем исследований проб фекалий, взятых от 144 поросят, 80 телят, 55 ягнят и образцов патологического материала (паренхиматозные органы, кишечник, брыжеечные лимфоузлы) от 8 павших поросят с признаками заболевания эшерихиозом.

Статистический анализ результатов исследований проводили по методу Г.Ф. Лакина (1990).

1. Получение моноклональных антител к адгезивному антигену К88 E.coli

В качестве источника адгезивного антигена К88 Е. coli были использованы штаммы бактерий К12 К88ас, К12 К88 ав, К12 К88 ад, полученные из лаборатории бактериологии Всеросийского НИИ экспериментальной ветеринарии (Москва), и К88 адгезин-позитивный штамм из лаборатории противобактериозной биотехнологии КазГАУ (Алматы).

Для определения влияния состава питательных сред и условий культивирования на синтез фимбрий К88, бактериальные культуры высевали на мясо — пептонный бульон (МПБ), мясо — пептонный агар (МПА) , жидкую и твердую среды Минка, 5% кровяной ахвр.Поаеа>1 культивировали при 37JC в статическом состоянии и при непрерывной аэрации. В качестве отрицательного контроля были взяты К88 адгезинпозитивные штаммы E.coli, выращенные при 18°С. Согласно обзору литературы, при температуре 18°С, эшерихии не продуцируют фимбрии. Наличие фимбрий К88 определяли в реакции микроагглютинации (РМА) с моноспецифическими сыворотками против адгезивного антигена К88 (ВИЭВ, Москва).

Результаты исследований показали, что на уровень продукции фимбрий К88 оказывают влияние как состав питательных сред, так и условия культивирования. Полученные нами результаты также подтвердили данные литературы: К88 адгезинпозитивные штаммы, выращенные при 18°С не агглютинировались моноспецифическими сыворотками против адгезивного антигена К88. Штаммы E.coli, выращенные на 5% кровяном агаре при 37°С, давали ярко выраженную агглютинацию на четыре креста, тогда как культуры эшерихий, выращенные на МПБ, МПА и средах Минка агглютинировались моноспецифическими сыворотками слабо.

Результаты исследований также показали, что выращивание в условиях аэрации в двухфазной системе (на границе твердой и жидкой сред) значительно увеличивает выход адгезина К88.

С целью выбора наиболее оптимальных методов отделения фимбрий К88 от поверхности клеток, нами были опробованы различные способы обработки бактериальной массы. Результаты экспериментов показали, что гомогенизация является наиболее оптимальным методом выделения фимбрий К88, в сравнении с нагреванием на водяной бане при температуре 65°С. Обработка клеток 2М мочевиной, успешно применяемая при выделении фимбрий К99 и F41, как установлено нами, разрушает агглю-тинабельные свойства фимбрий К88.

Для очистки антигена К88 использовали методы, описанные R.E. Isaacson (1977) и I. Orskov, F. Orskov et.al (1967). Метод Orskov I., Orskov F. et.al, предусматривающий осаждение ледяной уксусной кислотой и последующее ультрацентрифугирование, оказался более эффективным и позволял получать 0,25 — 0,5 мг/мл очищенного препарата антигена К88. На электрофо-реграмме антиген К88 распределялся в виде одной белковой полосы в зоне с молекулярной массой 25 КДа.

Двухнедельная схема иммунизации мышей линии BALB/c очищенным препаратом адгезивного антигена К88 E.coli оказалась вполне пригодной для стимулирования иммунной системы организма мышей линии BALB/c на выработку достаточного количества специфических антител против используемого антигена (Таблица 1).

Таблица 1

Титры специфических антител в сыворотке крови иммунизированных мышей линии ВАЬВ/с

Группа мышей Антиген ДЛЯ иммуни-низации Титры антител в

РМА ИФА

К88ас К88ав К88ад К88ас К88ав К88ад

1 К88 1:512 1:128 1:64 1:51200 1:12800 1:6400

2 К88 1:256 1:64 1:32 1:25600 1:6400 1:3200

Как видно из таблицы, титры специфических антител в сыворотке крови иммунизированных животных были достаточно высокими. Причем антитела реагировали со всеми тремя вариантами анти гена К88 — К88ас, К88ав и К88ад. Наивысший титр

иммунной сыворотки установлен относительно антигена К88ас, как в реакции микроагглютинации (РМА), так и в иммунофер-ментном анализе (ИФА), и составил 1:512 и 1:51200 соответственно. В качестве источника иммунных лимфоцитов были использованы селезенки мышей с наиболее высокими титрами специфических антител. Всего было проведено две гибридизации. Результаты первоначального тестирования клонов гибридных клеток — продуцентов моноклональных антител (МКА) против адгезивного антигена К88, использованного для иммунизации мышей, приведены в таблице 2. Таблица 2

Результаты гибридизации иммунных спленоцитов с клетками миеломы

Гибри- Антиген Число Количество Количество клонов

диза- для имму- засеян- лунок с гиб- продуцентов МКА

ция низации ных ридомами по результатам

лунок ИФА РМА

1 К88 384 175 (45,57%) 8(4,57%) 8(4,57%)

2 К88 288 106 (36,80%) 4(3,77%) 4(3,77%)

В результате двух гибридизаций миеломных клеток и спленоцитов из 384 засеянных лунок, рост гибридных клеток наблюдался в 175 (45,57%) в первом случае, и в 106 (36,8%) во втором, т.е. процент гибридизации был довольно высок. Результаты тестирования гибридных клонов в иммуноферментном анализе и реакции агглютинации показали наличие специфических антител к адгезивному антигену К88 эшерихий в культуральной жидкости у 8 (4,57%) и 4 (3,77%) гибридом соответственно. Все 8 клонов гибридных клеток, полученных при первой гибридизации, оказались нестабильными и уже при 4-5 тестировании не содержали антитела. Стабильные штаммы гибридом — продуцентов моноклональных антител к адгезивному антигену К88 были получены при второй гибридизации. Штаммы гибридом, обозначенные как ФАП, 4F4, 4Н4 и 1F8 сохраняли антительную активность в течение 8 пассажей с интервалом в 3-4 дня (Таблица 3).

и

Таблица 3

Продукция штаммами гибридом ФАП, 4F4, 4Н4 и 1F8 моноклональных антител к антигену К88 эшерихий

Штаммы гибридом Титр антител в культуральной жидкости

ИФА РМА

ФАП 1:512 1:64

4F4 1:128 1:16

4Н4 1:256 1:32

1F8 1:8 1:4

Клоны ФАП, 4F4 , 4Н4 были отобраны для дальнейших исследований и реклонированы методом лимитирующих разведений. Процент выхода позитивных субклонов при реклониро-вании был достаточно высок для всех гибридных штаммов и составил соответственно 97% , 87% и 62,5%.

От каждого штамма гибридомы для дальнейших иссследований было отобрано по одному субклону: 4G4D7, 4F4G7 и 4Н4В2.

2. Характеристика моноклональных антител к адгезивному антигену К88 E.coli

Одним из основных характеристик гибридом является их продуктивность при культивировании клеток in vitro и in vivo.

Продуктивность гибридом in vitro определяли методом непрямого ИФА в течение 8 дней после высева их на 24 — луночные планшеты с полной ростовой средой. Штамм гибридомы ФАП обладал высокой продуктивностью и синтезировал до 50 мкг/мл антител, тогда как штаммы клеток 4Н4 и 4F4 продуцировали до 25 мкг/мл антител. МКА штамма ФАП начинают выявляться в культуральной среде на 2-й день, а МКА остальных гибридом - на 3-4-й день после высева клеток. Динамика накопления антител в культуральной среде у испытуемых гибридом также различна. Так, у штамма ФАП наблюдается два пика продукции антител - на 3-й и 5-й дни, а у гибридом 4Н4 и 4F4 - один пик. Активная продукция моноклональных антител данными штаммами гибридом наблюдается на 5-6-й день культивирования.

Продуктивность моноклональных антител штаммами гибри-дом-продуцентов значительно возрастает при культивировании в условиях in vivo. Гибридомы в условиях in vivo образовывали асцитную жидкость в количестве 5-10 мл при концентрации МКА от 8 до 16 мг/мл. Стабильность продуцирования антител штаммами гибридом ФАП, 4F4, 4Н4 сохранялась на протяжении 15

пассажей в культуре и 5 пассажей — на животных (срок наблюдения).

Результаты определения классов и подклассов моноклональ-ных антител в реакции диффузионной преципитации с моноспецифическими антисыворотками к подклассам иммуноглобулинов мыши (Sigma, США) показали, что моноклональные антитела относятся к иммуноглобули-нам подкласса G1 (Таблица 4).

Одним из важных свойств МКА, является константа связывания (Ксв.), для определения которой использовали непрямой вариант иммуноферментного анализа. Наиболее высокая константа связывания определена у моноклональных антител, продуцируемых штаммом гибридомы ФАП, которые в концентрации 156 и 106 нг — связывали 50% антигена — 2,7х108 М"1. Более низкие показатели Ксв. были у МКА, вырабатываемых штаммами гибридом 4F4 и 4Н4 - 3,1хЮ7М"' и 1,4х107М-1 соответственно, связывавшие 50% адгезивного антигена К88 в концентрациях 2750 -1500 и 2125 — 1750 нг. Высокая концентрация МКА в асцитной жидкости в сравнении с культуральной, как и следовало ожидать, обусловила существенную ра'зницу между титрами накопления антител в условиях in vitro и in vivo. Титры антител в асцитной жидкости были выше в сравнении с таковыми в культуральной среде, в среднем в 400 раз.

Результаты изучения основных характеристик моноклональных антител приведены в таблице 4.

Таблица 4

Основные характеристики моноклональных антител

Штам- Под- Константа Титры МКА К какому

мы класс связывания в культуре в асците белку

гибри- антител получены

дом антитела

ФАП IgGl 2,7x10« М-' 1:256 1:102400 25 Кда

4F4 IRGI 3,1x10? М-' 1:64 1:12800 25 КДа

4Н4 IgGl 1,4x107 М-' 1:8 1:3200 25 КДа

С целью изучения гомогенности молекул иммуноглобулинов, препараты МКА, очищенные высаливанием сульфатом аммония, анализировали методом электрофореза в 11 % полиакриламидном геле в присутствиии 0,1% додецилсульфата натрия. Результаты электрофореза показали наличие у всех МКА крупных белковых

полос в зоне с молекулярной массой 67,5 КДа (тяжелая цепь) и 29,5 КДа (легкая цепь).

Специфичность моноклональных антител к белковому антигену К88 доказана методом иммуноблотинга, т.е. посредством перевода электрофореграммы фимбриального адгезина К88 на нитроцеллюлозную мембрану и последующей постановкой ИФА. Как показали результаты иммуноблотинга, моноклональные антитела специфически взаимодействовали с белком с молекулярной массой — 25 КДа, представляющим собой очищенный препарат адгезивного антигена К88 эшерихий.

Изучение взаимодействия моноклональных антител с ав, ас и ад вариантами адгезивного антигена К88 эшерихий в реакции агглютинации, непрямом и сэндвич-вариантах иммунофермен-тного анализа, показало, что моноклональные антитела обладают высокой специфичностью ко всем трем вариантам адгезивного антигена К88 (К88ав, К88ас, К88ад) как в очищенном виде, так и при использовании интактных клеток К88 позитивных штаммов E.coli. Испытуемые моноклональные антитела не взаимодействовали с адгезивными антигенами К99 и F41 эшерихий, а также с цельными клетками К99 позитивных штаммов E.coli 09 и 0101, F41 позитивным штаммом E.coli 0141 и с непатогенным штаммом E.coli Т-40, являющимся отрицательным по всем адгезивным антигенам. Высокая специфичность моноклональных антител также была доказана отсутствием перекрестной реакции с гете-рологичными бактериями (протеус, цитробактер, салмонеллы, шигеллы), которые могут быть причиной ложноположительных результатов, как в иммуноферментном анализе, так и в реакции агглютинации.

Как показали результаты исследований, моноклональные антитела, продуцируемые штаммом гибридомы ФАП, более активны в иммуноферментном анализе в сравнении с остальными штаммами гибридом (4F4 и 4Н4). Так, минимальная концентрация адгезивного антигена К88, выявляемая МКА штамма ФАП, составила в непрямом ИФА - 6x1 О*5 мг/мл, в сэндвич ИФА — 3x10-6мг/мл, тогда как у МКА гибридом 4Н4 и 4F4 эти показатели были равны 2,5x10" — ЗхЮ*5 и 5x10 4 — 6х105 мг/мл соответственно. По результатам иммуноферментного анализа с использованием в качестве антигенов интактных клеток К88

позитивных штаммов Е.соП, моноклональные антитела гибридомы ФАЛ также оказались более активными, нежели МКА остальных штаммов. Полученные данные вполне согласуются с результатами определения константы связывания моноклональных антител (Ксв.) которая, как известно, является мерой аффинности (Таблица 4) и позволяют сделать вывод о том, что антитела, продуцируемые штаммом гибридомы ФАП, обладают высокой аффинностью, т.е. прочностью соединения с эпитопом антигена и могут быть использованы для разработки методов обнаружения адгезивного антигена К88 эшерихий на основе моноклональных антител.

3. Обнаружение антигена К88 Е. coli в сэндвич-варианте иммуноферментного анализа

В результате многочисленных экспериментов по определению оптимальных условий постановки данного иммунологического теста, нами разработан для обнаружения адгезивного антигена К88 сэндвич-вариант иммуноферментного анализа на нитро-целлюлозной мембране (ДОТ-ИФА). Предлагаемый метод отличается высокой чувствительностью, быстротой и несложностью в выполнении, в сравнении с постановкой реакции на полистироловых планшетах.

Принцип обнаружения адгезивного антигена К88 в предлагаемом нами диагностическом тесте основан на применении МКА штаммов ФАП, 4Н4, 4F4 в сэндвич—варианте ИФА в качестве первых антител, в качестве вторых — моноклональных антител шт. ФАП, конъюгированных с ферментом - пероксидазой хрена. Постановка реакции осуществляется на нитроцеллюлозной мембране (НЦМ) фирмы Millipor, размером 5x45 мм. Для проведения анализа необходимо полоски НЦМ с точечной адсорбцией первых МКА выдерживать в испытуемом материале. Затем, после процедуры отмывки, носитель переносят в раствор МКА, меченных пероксидазой хрена. При наличии в образце антигена К88 на бумаге образуется комплекс: МКА — антиген К88 — МКА, меченные пероксидазой. При добавлении субстрата 4-хлор-1-нафтол комплекс выявляется по образованию серофиолетовых точек. Чувствительность метода составляет 3x10"5 - 6х10_6 мг белка в 1 мл или 2,5-ЗхЮ5 микробных клеток в 1 мл.

Результаты исследований показали, что оптимальной концентрацией МКА, наносимых на нитроцеллюлозную мембрану, является концентрация 20х10"4 мг/мл и ниже. Раститровка МКА наносится в объеме 0,001 мл. Определение титра конъюгатов моноклональных антител штамма гибридомы ФАП с ферментом пероксидазой хрена, показало их достаточно высокую активность - 1:500 - 1:1000.

Сравнительную эффективность предлагаемой тест — системы, бактериологического и серологического методов и непрямого варианта иммуноферментного анализа на основе МКА, определяли путем исследования проб фекалий и образцов паренхиматозных органов (сердце, легкое, почки, селезенка), кишечника и брыжеечных лимфоузлов павших поросят. Отбор проб и обработку материала, а также постановку бактериологического анализа осуществляли согласно "Методическим указаниям по бактериологической диагностике колибактериоза молодняка сельскохозяйственных животных" (1981). Постановку реакции агглютинации осуществляли на предметных стеклах. Моноклональные антитела использовали в разведении 1:10. Положительным контролем служили агглютинирующие сыворотки к адгезивному антигену К88, отрицательным — нормальная сыворотка белых мышей.

Для постановки непрямого варианта ИФА, на полоски НЦМ наносили раститрованные (начиная с разведения 1:2) в 8 лунках планшет образцы испытуемого материала. После высыхания нанесенных образцов, свободные участки носителя забивали 1% БСА в течение часа при 37°С. Затем полоски последовательно инкубировали в растворе моноклональных антител к адгезивному антигену К88 и антивидовых антител, меченных пероксидазой хрена. После каждого этапа инкубирования, повторяли процедуру отмывки. Реакцию проявляли раствором субстрата, состоящего из перекиси водорода и 4-хлор-1-нафтола. В качестве отрицательного контроля использовали образцы материала, взятые от здоровых животных, положительного — двукратные разведения препарата антигена К88, растированного на 12 лунок.

Разработанный нами способ идентификации адгезивного антигена К88 был испытан при исследовании проб фекалий, взятых от 43 поросят с диарейным синдромом в сравнении с

бактериологическим анализом, реакцией агглютинации и непрямым вариантом иммуноферментного анализа.

Бактериологическим анализом от 43 животных было выделено 39 (90,7%) культур E.coli. Культурально — биохимические свойства выделенных культур E.coli полностью соответствовали описанию. Методом биологической пробы на белых мышах выявлено, что 16 из выделенных культур эшерихий являются патогенными, что составило 37,2% от общего числа исследованных проб. С целью выявления адгезинпозитивности, выделенные бактериологическим анализом культуры E.coli были высеяны на 5% кровяной агар и исследованы в реакции агглютинации с моноспецифической сывороткой и моноклональными антителами (МКА) к данному адгезину. В реакции агглютинации с моноспецифической сывороткой наличие адгезивного антигена было выявлено в 6 (13,9%) пробах фекалий. Использование в данном тесте в качестве иммунореагента моноклональных антител привело к повышению его специфичности и позволило обнаружить антиген К88 в 11 (25,6%) образцах фекалий. Причем, все выявленные в реакции агглютинации К88 адгезинпозитивные культуры Е. coli оказались патогенными по результатам биопробы.

Непрямой вариант иммуноферментного анализа оказался менее чувствительным, чем сэндвич вариант. Так, методом непрямого ИФА антиген К88 выявлен в 12 пробах, что составило 27,9% от числа исследованных проб. Следует отметить, что данным тестом не удалось обнаружить наличие специфического антигена у 4 патогенных по результатам биопробы культур эшерихий. Тогда как сэндвич вариантом иммуноферментного анализа были полностью подтверждены положительные результаты биопробы и дополнительно выявлено 9 проб с содержанием антигена К88, в двух из которых культура не выделена.

Таким образом, использование моноклональных антител значительно повышает специфичность реакции агглютинации и позволяет выявить в сэндвич-варианте иммуноферментного анализа максимальное количество положительных проб с содержанием адгезивного антигена К88 (48,8%).

Диагностическую ценность реакции агглютинации, непрямого и сэндвич ИФА на основе моноклональных антител также определяли путем исследования образцов патматериала, взятых из кишечника, сердца, селезенки, почки, легких, и брыжеечных лимфоузлов 8 павших поросят с признаками заболевания эше-рихиозом.

Бактериологическим методом из 48 проб патологического материала было изолировано 22 культуры эшерихий, из которых по результатам биопробы на белых мышах 11 оказались патогенными, что составило 22,9% от общего числа исследованных образцов. В реакции агглютинации с моноклональными антителами наличие К88 адгезинпозитивных культур выявлено в 8 пробах патматериала (16,7%). Методом непрямого ИФА не удалось обнаружить антиген у 2 патогенных культур эшерихий, дополнительно к результатам реакции агглютинации выявлена 1 положительная проба. Тргда как сэндвич-вариантом ИФА антиген К88 идентифицирован в 15 (31,3%) образцах исследуемого материала, причем были полностью подтверждены положительные результаты биопробы. Результаты исследований свидетельствуют, что сэндвич вариант ИФА является более чувствительным и специфическим тестом в сравнении с РА и непрямым ИФА, что также подтверждено высокими показателями определения специфического антигена К88 в кишечнике — у 7 (87,5%) животных, в брыжеечных лимфоузлах — у 3 (37,5%), в сердце - у 3 (37,5 %) , в селезенке и почках — у 1 животного (12,5%).

Образцы патологического материала от 8 павших поросят и проб фекалий, взятых от 43 поросят, исследованные в предыдущих опытах, также анализировались на предмет присутствия адгезивных антигенов К99 и , выявляемых, в основном, при эше-рихиозе телят и ягнят. Исследования проводили согласно "Наставления по применению набора для обнаружения адгезивных антигенов К99 и Р41 методом иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител", утвержденного ГУВ МСХ Республики Казахстан 30.10.94 г. Результаты приведены в таблице 5.

Таблица 5

Обнаружение адгезивных антигенов К88, К99 и Р41 эшерихий в патологическом материале поросят сэндвич-вариантом ИФА

Патма- Всего Наличие адгезивных антигенов

териал проб К99 К88 Б41 К99+К88 К88+Р41 К88+ И41

+К99

Паренхи- 48 4 15 1 1 - -

матозные 8,3 31,3 2,1 2,1

органы

Фекалии 43 5 21 2 2 1 1

11,6 48,8 4,6 4,6 2,3 2,3

Примечание: в числителе — количество проб , в которых обнаружены соответствующие адгезивные антигены; в знаменателе — эти же показатели выражены в процентах от общего числа исследованных проб.

Как следует из таблицы, адгезивные антигены К99 и Р41 в исследуемых образцах патматериала поросят выявляются значительно реже, нежели адгезивный антиген К88. Так, адгезивный антиген К99 обнаружен в 4 (8,3%) образцах паренхиматозных органов и 5 (11,6%) пробах фекалий. Адгезивный антиген Р41 в сравнении с антигеном К99 выявлялся в испытуемых образцах материала реже.

Также следует отметить, что антигены адгезии К99 и Р41 в 2,1% — 4,6% случаев выделялись в ассоциации с антигеном К88.

С целью изучения выявляемое™ адгезивного антигена К88 эшерихий у молодняка сельскохозяйственных животных, предлагаемой нами тест — системой были исследованы пробы фекалий

поросят, телят и ягнят (Таблица 6).

Таблица 6

Идентификация адгезивных антигенов эшерихий в пробах фекалий молодняка с/х животных сэндвич — вариантом ИФА

Живот- Кол- Адгезивные антигены

ные во К99 Б41 К88 К99+ К99+ Р41+К88

проб Р41 К88 +К99

Поросята 93 8 6 52 - 6 ?

8,6 6,5 55,9 6,5 2,1

Телята 80 34 22 10 16 5 2

42,5 27,5 12,5 20 6,3 2,5

Ягнята 55 32 6 4 6 2 -

58,1 10,9 7,3 10,9 3,6

Примечание: в числителе — количество проб , в которых обнаружены адгезивные антигены; в знаменателе — эти же показатели выражены в процентах.

Адгезивные антигены К99, F41 и К88 были выявлены у всех исследованных животных. Из таблицы 7 видно, что у телят чаще обнаруживаются адгезивные антигены К99 и F41 как в отдельности (42,5 и 27,5%), так и в ассоциации (20%). У ягнят наиболее часто обнаруживается антиген К99 (58,1%), в сравнении с F41 (10,9%) и К88 (7,3%). Результаты исследований свидетельствуют, что адгезивные антигены К99 и F41 у поросят выявляются значительно реже, в сравнении с антигеном К88. Так, антиген К99 был выявлен в 8 (8,6%) пробах фекалий поросят в виде моноантигена и в 6 (6,5%) в сочетании с адгезином К88. Адгезивный антиген F41 был выявлен в 6 (6,5%) пробах; ассоциации с антигеном К88 не обнаружено. Антиген К88 в исследуемом материале поросят обнаружен в 55,9% случаев, причем 78,8% выявленных К88 адгезинпозитивных культур были патогенными по результатам биопробы. Между случаями обнаружения адгезивного антигена К88 E.coli и патогенностью выделенных культур эшерихий установлена тесная прямая корреляционная связь. Из общего числа идентифицированных соответственно в трех опытах (n,=43; n2=48; n3=93) К88 адгезинпозитивных культур E.coli -76,3%, 73,3% и 78,8%, были патогенными по результатам биопробы (г, = 0,77; г2 = 0,80; г3 = 0,76; Р<0,001).

Таким образом, результаты исследований, проведенных сэндвич вариантом иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител, показали, что адгезивный антиген К88 эшерихий играет существенную роль при эшерихиозе поросят. Высокие показатели коэффициентов корреляции результатов сэндвич-варианта иммуноферментного анализа с данными биопробы также свидетельствуют об эффективности разработанного нами метода для экспресс-обнаружения адгезивного антигена К88 E.coli.

ВЫВОДЫ

1. Культивирование К88 адгезинпозитивных штаммов эшерихий в двухфазной системе (на границе двух сред - жидкой среды Минка и 5% кровяного агара) повышает продукцию антигена К88 и позволяет сократить время очистки.

2. Получены штаммы (клоны) гибридных культивируемых клеток ФАП, 4Н4, 4F4, продуцирующие моноклональные антитела подкласса Gl к адгезивному антигену К88 эшерихий (белку с

молекулярной массой 25 Кда). Продуктивность штаммов гибридом составляет в среднем 25 - 50 мкг/мл антител в культуральной среде и 8 - 16 мг/мл в асцитной жидкости.

3. Моноклональные антитела штамма гибридомы ФАП обладают высокой степенью сродства к антигену К88 (константа связывания 2,7х108 М" , в сравнении с МКА 4Н4, 4F4(Kcb.-

7-17-1

1,4x10 M - 3,1x10 M ), и использованы в разработке экспресс-метода для обнаружения антигена К88.

4. Использование МКА значительно повышает специфичность реакции агглютинации по обнаружению антигена К88(25,6%), в сравнении с поликлональными антителами(13,9%).

5. На основе использования моноклональных антител разработан экспресс-метод обнаружения антигена К88 эшерихий - сэндвич вариант иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител. Чувствительность метода составляет 3-6 х 10"6мг белка в 1 мл или 2,5-3 х105 тыс. микробных клеток в мл.

6. Антиген К88 выделяется чаще у поросят (55,9%), чем антигены К99 (8,6%) и F41 (6,5%). У телят антиген К88 выявляется в 12,5% случаев, у ягнят - 7,3%.

7. Установлена высокая положительная корреляционная связь между способностью продуцировать адгезивный антиген К88 и патогенностью у выделенных культур E.coli ( г= 0,8; Р^0,001).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus Musculus L. — продуцент моноклональных антител к адгезивному антигену К88 эшерихий с авторским названием ФАП, депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых культур клеток Научно - исследовательского сельскохозяйственного института Национального центра по биотехнологии Республики Казахстан 28.05.98 под регистрационным номером 01/Г. Моноклональные антитела этого штамма могут быть использованы для дифференциации К88 адгезинпозитивных штаммов эшерихий от других перекрестиореагирующих микроорганизмов.

2. Сэндвич — вариант иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител штамма ФАП рекомендуется использовать как экспресс—метод для обнаружения адгезивного антигена К88 эшерихий в биологическом материале животных.

Список опубликованных работ

1. Муканов К.К., Мукантаев К.Н., Оспанова С.Г. Набор для обнаружения К99 и F41 адгезивных антигенов эшерихий методом иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител. // Материалы международной конференции по актуальным проблемам вирусологии и микробиологии. Пгт. Гвардейский ч. 2, 1994. - с. 134.

2. Муканов К.К., Мукантаев К.Н., Оспанова С.Г. Получение и характеристика моноклональных антител к F41 антигену эшерихий. // Совершенствование мер борьбы с болезнями сельскохозяйственных животных // Сб. науч. трудов Кыргызского СХИ, ч. 2,- Бишкек, 1994.

3. Муканов К. К., Мукантаев К. Н., Оспанова С. Г. Влияние моноклональных антител к К99 и F41 антигенам на адгезивные свойства эшерихий. // Журнал "Вестник науки Акмолинского СХИ" № 1 - 1994. - С. 93-97.

4. Оспанова С.Г., Муканов К.К., Ахметсадыков H.H. Получение очищенных препаратов препаратов К88 фимбриального адгезина эшерихий. // Резервы биотехнологии ветеринарной медицины и зоотехнии в повышении эффективности животноводства. Сб. науч. трудов. Алматы, 1995. — С. 43-45.

5. Оспанова С.Г., Муканов К.К. Моноклональные антитела к адгезивному антигену К88 эшерихий. // Журнал "Вестник науки Акмолинского аграрного университета им. С.Сейфуллина" — № 10 - 1998. - С. 26-28.

6. Оспанова С.Г., Муканов К.К. Иммунореагенты на основе моноклональных антител // Материалы итоговой конференции Медицинской Академии — Астана, 1998.

7. Оспанова С.Г., Муканов К.К. Иммуноферментная тест-система для обнаружения адгезивного антигена К88 эшерихий. Мат. междунар. конф. "Актуальные проблемы сельскохозяйственной биотехнологии" // Журнал "Биотехнология. Теория и практика" № 1-2 (5-6) - 1998. - С. 137-138.

8. Оспанова С.Г. Использование моноклональных антител при иденти-фикации адгезивного антигена К88 эшерихий. // Сборник научных статей Международной научно-практической конференции "Ветеринарная наука в период экономических реформ посвященной 120-летию академика К.И. Скрябина — Астана, 1999. - С. 103-105.

Останова Сэуле Гельманкызы

К88 адгсзивп антигешне моноклоналдык, антидене т1зу жэне олардыц непзшде диагностикалык, тест жуйесш жасау

Биология гылымдарыныц кандидаты дэрежесш алу ушш усынылган диссертациясы

14.00.36 — аллергология жэне иммунология ТТЙ1Н1

Диссертациялык, жумыстыц мацсаты — К88 адгезивп антигешне моноклоналдык, антидене т1зу жэне олардыц непзшде диагностикалык; тестжуйесш жасау. Зертгеу нэгижеанде эшерихийдш К88 адгезиви антигешне моноклонаддык антидене т1зетщ 6ipHeme штаммдар алынган (ФАП, 4F4, 4Н4). ФАП моноклоналдык; антидене непз1нде патологиялык, материалдан К88 адгезиш бар штаммдар тез арада (3-3,5 сагат) аныкдау ушш иммунды фермент тест жуйес1 зер

К.ОЙЫЛДЫ.

Иммунды ферментпктест жуйесшщ сез1мталдыгы 3-6 нг/мл К88 антигеш, 250-300 мын,. микр. улп./мл.

Ospanova Saule Gelmanovna

Production of monoclonal antibodies to the K88 fimbrial adhesin of E.coli and creation on its basic of diagnostic test system

Dissertation for the degree of candidate of biological scienses 14.00.36 - allergology and immunology

RESUME

The purpose of dissertation was production of monoclonal antibodies to the K88 fimbrial adhesin of E.coli and creation on its basic of diagnostics test system.

Several strains (FAP, 4F4, 4H4) of Mab-producers were obtained with the help of the hybridomic technique. The Mab were directed against a purified preparation of K88 antigen of E.coli (the proteine with molecule weight 25 Kda). The monoclonal antibodies FAP were used in developing ELISA test for the express detection (3-3,5 hour's) of K88 adhesive antigen of E.coli in the samples, obtained from infected animals. The sensitivity of the ELIZA-system is a 3-6 ng/ml of K88 antigen and 2,5 -3 x 103 cells/ ml. The significant role of K88 adhesin by diarrhea in neonatal pigs was determined with the help of ELIZA-system.

Подписано в печать 04.06.99 г. Заказ 285. Тираж 100 экз. Издательство "Ценные бумаги" г. Алматы, т. (3272) 33-38-26

тел. 33-38-26, 33-34-87