Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Совершенствование методов изготовления и контроля сибиреязвенной преципитирующей сыворотки и стандартного бактерийного антигена

0030632Э2

На правах рукописи

Шморгуи Борис Игоревич

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ИЗГОТОВЛЕНИЯ И КОНТРОЛЯ СИБИРЕЯЗВЕННОЙ ПРЕЦИПИТИРУЮЩЕЙ СЫВОРОТКИ И СТАНДАРТНОГО БАКТЕРИЙНОГО АНТИГЕНА

16 00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологней и иммунология

М

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

7 4 \П\Ц 2007

МОСКВА - 2007

Работа выполнена в лаборатории качества и стандартизации лекарственных средств против анаэробных болезней животных Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ ВГНКИ)», на Тобольской и Орловской биофабриках

Научный руководитель доктор ветеринарных наук, профессор,

Заслуженный деятель науки РФ Кириллов Леонид Вениаминович (ФГУ ВГНКИ)

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Заслуженный деятель науки РФ, Шумилов Константин Васильевич (ФГУ ВГНКИ)

доктор ветеринарных наук, профессор Гаврилов Владимир Андреевич (МГАВМиБ им Скрябина К И )

Ведущее учреждение: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский

институт ветеринарной вирусологии и микробиологии» Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится мая 2007 г в " часов на за-

седании диссертационного совета Д 220 011 01 в Федеральном государственном учреждении «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ ВГНКИ)» (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5, ФГУ ВГНКИ)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ ВГНКИ

Автореферат диссертации разослан "-^У" 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат ветеринарных наук, Заслуженный ветеринарный врач Е^г^

!ОХ КрЗырев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1 1 Актуальность проблемы

Сибирская язва - остро протекающая, особо опасная зоонозная болезнь, к которой наиболее чувствителен крупный рогатый скот, овцы, козы лошади, и другие виды домашних и диких животных Среди хищников чувствительны к сибирской язве норки, соболя, лисицы клеючного содержания Слабочувствительны к заражению в естественной среде обитания собаки, кошки, волки и другие виды диких плотоядных

В настоящее время достигнуто стойкое благополучие поголовья животных России по сибирской язве, благодаря ежегодным плановым профилактическим мероприятиям, охватывающим все поголовье восприимчивых животных Поэтому указанная инфекция проявляется в настоящее время только в виде спорадических случаев, число которых имеет постоянную тенденцию к сокращению На фоне видимого благополучия, в силу биологической специфики возбудителя болезни (длительное переживание в почве и другие"), сохраняется постоянная угроза встречи животных и человека с вирулентными формами В апЖгаач Поэтому необходимо обладать совершенными средствами и методами диагностики болезни, которые позволяют, в возможно короткие сроки и максимально достоверно, ставить диагноз и, следовательно, своевременно проводить профилактические и лечебные мероприятия по купированию очагов сибиреязвенной инфекции

Диагноз на сибирскую язву ставят на основании анализа эпизоотологических данных, клинических признаков, и лабораторных исследований Одним из основных способов диагностики сибирском язвы остается метод исследования материала в реакции преципитации (реакция Асколи)

На протяжении многих лет исследователи занимались вопросом получения специфичной и активной преципитирующей сыворотки, которая достоверно и в короткий срок выявляла бы кожевенно-меховое сырье и патологический материал, полученные от животных павших при подозрении на сибирскую язву Необоснованное применение штаммов возбудителя антракса при получении сыворотки приводило к частым неудачам, так как задачу подбора штаммов, использованных при гипериммунизации продуцентов нельзя решить без детального изучения антигенной структуры возбудителя указанной болезни

Поэтому подбор новых штаммов для получения преципитирующей сибиреязвенной сыворотки и стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена на основе сравнительного изучения антигенной структуры В агйкгаси является перспективным направлением, имеющим научное и практическое значение

1.2. Цель работы и задачи исследований.

Целью работы является экспериментальное доказательство возможности изготовления и применения преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с использованием одного вакцинного бескапсульного штамма В атИгаси, вместо четырех аттенуированных штаммов, среди которых обязательно присутствие одного капсу-логенного, а также способа изготовления стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена из вакцинного штамма взамен вирулентного, при этом оба препарата по активности и специфичности не должны уступать существующим коммерческим препаратам, изготовленным по стандартной методике

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи

1 Изучить состав термостабильных преципитирующих антигенов у вирулентных и аттенуированных штаммов В ашкгаач в реакции диффузной преципитации и иммуноэлектрофорезе и на основе полученных результатов отобрать новые производственные штаммы с более широким набором специфических антигенов

2 Установить возможность использования вновь отобранных штаммов для изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворотки

3 Предложить оптимальную схему гипериммунизации лошадей-продуцентов преципитирующей сибиреязвешюй сыворотки с использованием антигена, изготовленного из одного вакцинного бескапсульного штамма

4 Изучигь активность и специфичность полученной преципитирующей сыворотки в сравнении с коммерческой сывороткой биофабричного производства

5 Установить возможность замены вирулентного производственного штамма сибирской язвы на вакцинный при промышленном изготовлении стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена

6 Изучить активность и специфичность полученного антигена в сравнении с коммерческим препаратом биофабричного производства

7 Определить активность и специфичность преципитирующей сыворотки и стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена в процессе хранения

Основные положения, выносимые на защиту

- результаты разработки, испытания и внедрения в биологическую промышленность новых способов изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с использованием вакцинного бескапсулыюго штамма 55-ВНИИВВиМ взамен ранее применяемых 4-х аттенуированных штаммов антракса,

- результаты разработки, испытания и внедрения стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена с использованием вакцинного штамма ЪЛ¥г или 55-ВНИИВВиМ взамен вирулентного штамма сибирской язвы ЗБК2

Научная новизна

Установлено, что все изученные нами сибиреязвенные штаммы (вирулентные и авирулентные) содержат идентичный термостабильный преципитирующий антиген, соответствующий стандартному сибиреязвенному антигену

Впервые показана возможность получения высокоактивной и специфичной преципитирующей сибиреязвенной сыворотки при использовании дам шперимму-низации продуцентов одного вакцинного бескапсульного штамма 55-ВНИИВВиМ взамен четырех, испульзуемых ранее, один из которых капсулогенный, а также для получения высокоактивного и специфичного стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена из вакцинного штамма 34Р2 или 55-ВНИИВВиМ, взамен вирулентного штамма сибирской язвы ЗБК2

Практическая значимость работы

На основании полученных результатов разработан оригинальный способ изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с измененной схемой гипериммунизации лошадей при использовании в качестве антигена одного вакцинного штамма Указанный способ изложен в «Инструкции по изготовлению и контролю сыворотки сибиреязвенной преципитирующей», утвержденной 03 11 1992 Главным управлением ветеринарии Минсельхозпрода РФ Материалы диссертации использованы также при разработке ТУ 10-.19 77-89 "Сыворотка сибиреязвенная прецигштирующая", утвержденных ГУ В Госагропрома СССР 05 05 1989

Предложенная схема гипериммунизации позволила уменьшить срок иммунизации лошадей па 26-30 дней, что у1гростило технологию производства и снизило материальные затраты Кроме того, изъятие из производства капсулогенного сибиреязвенного штамма М-71, обладающего достаточно высоким уровнем виру-лентностости резко снизило реактогешюстъ применяемого антигена, исключило

возможность контаминации культурой данного калсулогенного штамма других биопрепаратов, которые изготавливают на тех же биопредприятиях, что и преци-питирующую сибиреязвенную сыворотку

Одновременно разработан способ изготовления стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена, который изложен в «Инструкции по изготовлению и контролю антигена сибиреязвенного бактерийного стандартного», утвержденной ГУВ государственной комиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам 01 12 1989 года Разработанный способ получения антигена исключает из производственного процесса вирулентную сибиреязвенную культуру штамма ЗБК2, заменив ее вакцинным штаммом 34F2 или 55 ВНИИВВиМ

Материалы диссертации использованы также при разработке ТУ 10-09-26-89 "Антиген сибиреязвенный бактерийный стандартный", утвержденных ГУВ Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам 01 12 1989

Апробация работы Основные результаты исследований доложены на

- Ученых Советах ФГУ ВГНКИ в 1989-1991 годах,

- конференциях молодых ученых ВИЭВ в 1989 г, ФГУ ВГНКИ, ВНИИВВиМ в 1990 г,

- XII Пленарном заседании Межведомстве!той научно-методической комиссии по борьбе с сибирской язвой при Минздраве СССР и Государственной комиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам в 1990 году (г Ташкент!

- межлабораторном совещании научных сотрудников ВГНКИ в 2007 году

Публикация результатов исследований Основою результаты исследований изложены в 8 печатных работах, опубликованных в сборниках научных трудов ФГУ ВГНКИ, Всероссийских конференций и в научных журналах Зарегистрирован отчет по законченной теме «Разработать и внедрить промышленный способ изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с использованием вакцинных бескапсульных штаммов, усовершенствовать методы ее контроля», УДК 619 616 98 579 852 1 615 373 616 9-07, № гос регистрации 01910034968, Москва ВГНКИ, 1992 год

Объем и структура диссертации Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложения Работа иллюст-

рировапа 12 таблицами и 17 приложениями Список литературы включает 165 источников, в том числе 84 работы зарубежных авторов

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы и методы 2.1.1 Материалы

В работе использовали 25 вирулентных и 8 вакцинных сибиреязвенных и 6 ложносибиреязвенных штаммов

При выполнении экспериментальной части работы были использованы лошади в возрасте от 3 до 6 лет массой не ниже 350 кг - 30 голов, кролики массой 2,5 -3,0 кг - 106 голов

2.1.2.Мстоды

Изготовление антигенов для гипериммунизации лошадей-продуцентов пре-ципитирующей сыворотки

Вегетативные культуры сибиреязвенных штаммов выращивали на гороховом агаре в термостате при температуре (37±1) °С в течение 20-22 ч Смывали физиологическим раствором, доводили концентрацию микробных тел до 2,0-3,0 млрд в 1 см3 по оптическому стандарту мутности ГИСК им Л А Тарасевича

Полученный антиген (вегетативную культуру) проверяли на отсутствие контаминации посторонней микрофлорой, типичность морфологических, тинктори-альных и культуральных свойств

После этого высевали микробные культуры в МПБ, МППБ под вазелиновым маслом, на МПА, агар Сабуро Посевы инкубировали при температуре 37±1°С (на агаре Сабуро - при 20-24 °С) в течение 10 суток

При наличии в мазках типичной грамотрицательной культуры, состоящей из крупных палочек и цепочек, типичного роста в МПБ в виде рьклого белого осадка на дне пробирки без помутнения бульона, на МПА и агаре Сабуро в виде серовато-белых колоний с серебристым оттенком И и ЯО-форм, при отсутствии роста анаэробных культур в МППБ под вазелиновым маслом, сибиреязвенную культуру использовали для гинериммунизации лошадей

Гипериммунизания лошадей сибиреязвенным антигеном Для создания грундиммунитета лошадей иммунизировали в/к и п/к споровой культурой штамма М-71 в нарастающих дозах от 0,3 до 20,0 см3, с концентрацией 1,0 млрд микр клеток в см3 Интервал между первой и второй инъекциями антигена - 8 суток, между последующими - 3-4 дм

Антиген из вакцинных штаммов вводили лошадям внутривенно в нарастающих дозах от 5,0 до 70 см3, с концентрацией 2,0-3,0 млрд м клеток в см3 соответствующих вегетативных культур штаммов В anthracis Интервал между инъекциями - 3-4 дня

Получение сибиреязвенной преципитируюшей сыворотки Сыворотку от лошадей по окончании периода гипериммунизации (через 8-10 суток после введения последней дозы антигена) получали по следующей методике лошадей перед взятием крови, предварительно выдерживали 12 часов на голодной диете, не ограничивая водопой Затем животных термометрировали, и от имеющих нормальную температуру брали кровь из расчета 8,0 см3 на 1 кг массы продуцента в первое крововзятие и 14,0-16,0 см3 в последующие кровь собирали в градуированные стеклянные баллоны емкостью 15-20 литров Сыворотку получали цитрат-ным методом, используя стерильный 10 % раствор лимоннокислого натрия с последующим сепарироранием для отделения форменных элементов крови и дефиб-ринацией плазмы

Из сепаратора отделившуюся плазму перекачивали в дефибринатор и для превращения фибриногена в фибрин к ней добавляли 30 %-ный раствор химически чистого хлористого кальция из расчета 1,3 см3 на 1 л плазмы

Перед окончанием дефибринации плазму подвергали консервированию раствором химически чистого фенола до конечной концентрации 0,5 % После перемешивания сыворотку вместе с фибрином оставляли в дефибринаторе на 18-20 часов, охлаждая до 12-16 °С Затем сыворотка поступала в отстойник, где она выдерживалась в течение 2-х месяцев при температуре 6-12 °С, после чего подвергалась грубой фильтрации Затем сыворотка поступала на стерилизующую фильтрацию Стерильная сыворотка накапливалась в баллоне-сборнике, из которого производилась расфасовка в стерильные флаконы Флаконы над пламенем закрывали стерильными резиновыми пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками

Изготовление антигенов из бактериальной массы для использования в реакции преципитации Act оли

Культуры сибиреязвенных и ложносибиреязвенных штаммов выращивали на МПА в матровых колбах в течение 18-20 ч при температуре (37±1) °С Бактериальную массу каждого штамма снимали с агара шпателем и высушивали при температуре (37±1) °С до постоянного веса

После этого высушенную бактериальную массу растирали в фарфоровой ступке в условиях стерильного бокса и полученный порошок переносили в бутыли, где заливали его физиологическим раствором из расчета 1 3000 - 1 5000 Экстрагирование проводили 24-48 ч при температуре (40±2°С), затем фильтровали через асбестовую вату, фасовали в ампулы по 1 см3, запаивали и автоклавировали в течение 30 мин при температуре 120 °С

Изготовление антигенов из кожи и органов животных для реакции преципитации Асколи

Измельченные сухие кусочки кожи и органов (по 1-2 г) растирали в ступке с песком, переносили в цилиндр и заливали физиологическим раствором (с 0,3 % кристаллического фенола) в соотношении 1 10 и экстрагировали 18-24 ч при температуре (20±2) °С

Затем проводили фильтрацию через асбестовую вату и полученные экстракты расфасовывали в ампулы по 1 см3, запаивали и автоклавировали в течение 30 мин при температуре 120 ° С

Постановка реакции преципитации по Асколи

В уленгутовскую пробирку наливали 0,2-0,3 см3 прозрачной преципити-рующей сыворотки Если сыворотка оказывалась мутной, то ее предварительно фильтровали через асбестовую вагу Затем тонкой пастеровской пипеткой наслаивали (или подслаивали) равное количество исследуемого антигена (бактерийного, кожного или из органов), так, чтобы не перемешать компоненты и сохранить четко выраженную границу между ними

Реакция считалась положительной, если на границе между компонентами в течение 2 мин появлялось тонкое беловатое кольцо преципитации, которое при покачивании пробирки хорошо видно

Постановка реакции диффузионной преципитации (РДП) в агаровом геле Реакцию ставили по методу Оухтерлони (1949), используя оборудование фирмы ЬКВ В качестве геля применяли 1 %-ный агар Дифко, который готовили на физиологическом растворе В специально подготовленные лунки закапывали (по 23 раза) компоненты реакции (дезшггеграты-антш ены и сыворотки) Линия преци-юттации проявлялась достаточно четко уже через 24 часа Линии идентичных серологических систем сливались, неидентичных - перекрещивались

Постановка иммуноэлектрофореза (ИЭФ) Реакцию ставили по методу Грабара и Уильямса (1953) на досках фирмы LKB Для постановки использовали 1 %-ный агар Дифко, приготовленный на фосфатном буферном растворе и ионной силой 0,1 Полосы преципитации после окраски довольно четко видны в зависимости от используемого дезшггеграта штамма 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 3 1 Изучение состава термостабильных преципитирующих антигенов у вирулентных и аттенуированных штаммов

При изучении состава преципитиногенов у штаммов В anthracis нас интересовало также количественное их содержание у каждого штамма Для определения состава преципитиногенов мы изучали их способность стимулировать образование антител в организме кроликов и реагировать с гомологичными антителами m vitro в РДП и иммуноэлектрофорезе В качестве антигенов в РДП и имму ноэле строфа -резе использовали культуры штаммов В anthracis, выращенные и обработанные для РП, дезинтеграты культур, а также коммерческий сибиреязвенный бактерийный стандартный антиген

С целью получения сывороток для РДП и иммуноэлектрофореза мы гипериммунизировали кроликов приготовленными антигенами (микробные дезинтеграты штаммов М-71, СТИ-1, 34F2, Шуя-15, 55-ВНИИВВиМ)

Полученные антигены (дезинтеграты) вводили кроликам подкожно в нарастающих дозах 0,5, 1,0, 2,0, 3,0, 5,0 см3 Интервал между инъекциями составлял 4-6 суток Через 7-9 суток после последнего введения антигена кроликов обескровливали и получали сыворотку

С целью систематизации полученных данных полосы преципитации и соответствующие им антигены условно обозначали буквами А, Б, В, Г, Д, Е, Ж

В таблице 1 отражены результаты постановки РДП и иммуноэлектрофореза Из данных таблицы 1 видно, что в РДП микробные дезинтеграты формировали с сыворотками от 4-х до 6-ти полос Наиболее точно это было установлено с помощью иммуиоэлектрофореза, так как в нем разделение компонентов реакции происходит в зависимости от электрофоретической подвижности, а в РДП пассивно.

С помощью иммуноэлектрофореза было установлено, что изученные сибиреязвенные штаммы различаются по антигенному составу, но обладают преципи-тиногенами Б, В, Д, Е, Ж Антиген А содержат все штаммы, кроме 34F2 Антиген В

штаммы СТИ-1, Шуя-15, 34Н2 содержат в незначительном количестве Антиген Г выявлен у штаммов СТИ-1 и 55-ВНИИВВиМ У штамма 55-ВНИИВВиМ полоса преципитации Г формируется в реакции только с неразведенным дезинтегратом, т е антиген Г у штамма 55 содержится в незначительном количестве

Также было установлено, что стандартный сибиреязвенный антиген соответствует полосе преципитации Б, которая идентична у всех изученных штаммов

Данные по составу преципитирующих антигенов у сибиреязвенных штаммов отражены в таблице 2

После термической обработки антигенов (дезинтегратов) путем автоклави-рования при температуре 120°С в течение 1 ч, в РДП и ИЭФ было установлено, что образовывали только одну полосу преципитации Б со всеми сыворотками

Таблица 1

Результаты изучения состава преципитирующих антигенов В апгкгаая

в реакции преципитации и иммуноэлектрофорезе

Сыворотки, полученные с использованием дезинтегратов из нпаммовВас ап-¡кгасгз Количество полос преципитации в РДП (числитель) и их идентификация в ИЭФ (знаменатель) при использовании антигенов

Дезинтеграты сибиреязвенных штаммов Стандар тный антген

М-71 СТИ-1 34Р2 Шуя-15 55-ВШ1И ВВиМ

Шт М-71 6 АБ-ВДЕ Ж 6 АБ-ВДЕЖ 5 БВДЕ Ж 6 АБ-ВДЕЖ 6 АБ-ВДЕЖ 1 Б

Шт СТИ-1 6 АБ-ГДЕЖ 6 АБ-ГДЕЖ 4 БДЕЖ 5 АБ-ДЕЖ 6 АБ-ГДЕЖ 1 Б

Шт 34Е2 4 БДЕЖ 4 БДЕЖ 4 БДЕЖ 4 БДЕЖ 4 БДЕЖ 1 Б

Шт Шуя-15 5 АБ- ДЕЖ 5 АБ-ДЕЖ 4. БДЕЖ 5 АБ-ДЕЖ « АБ-ДЕЖ 1 Б

Шт 55-ВИИИВВиМ 6 АБ-ВДЕ Ж 6 АБ-ВДЕЖ 5 БВДЕ Ж 6 АБ-ВДЕЖ 6 АБ-ВДЕЖ 1 Б

Сыворотка сибиреязвенная пре-ципити рующая 4 БДЕЖ 4 БДЕЖ 4 БДЕЖ 4 БДЕЖ 4 БДЕЖ 1 Б

В дальнейшей работе были испытаны автоклавированные дезинтеграты 25

вирулентных сибиреязвениых и 6 ложносибиреязвенных штаммов В результате

работы наши предположения подтвердились, что все вирулентные сибиреязвенные

штаммы содержат идентичный термостабильный преципитирующий антиген Б

Ложносибиреязвенные штаммы также содержат термостабильный преципитино-

ген, в РП дает положительную реакцию в течение 110-160 сек

В результате проведенных исследований было установлено, что штаммы В

anthracis как количественно, так и качественно различаются по антигенному составу, но обладают идентичным для всех штаммов термостабильным прецишггирую-щим антигеном, на присутствии которого и основана реакция преципитации Аско-ли Аналогичный термостабильный преципитиноген в существенно меньшем количестве имеют и ложносибиреязвенные штаммы из рода Bacillus

Таблица 2

Состав преципитиногенов у штаммов В anthracis

Штаммы Антигены

СШ-1 АБВ.ГДЕЖ

55-ВНИИВВиМ А Б В Г. Д Е Ж

Шуя-15 Л Б В. - Д Е Ж

34F2 - Б В. - Д Е Ж

М-71 АБВ-ДЕЖ

Примечание ««» - содержатся в незначительном количестве «-» - не содержит антигена

Из полученных данных следует, что для изготовления сибиреязвенной пре-ципитирующей сыворотки и антигена сибиреязвенного бактерийного стандартного могут быть использованы вакцинные бескапсульные штаммы В апШгаси, так как в их составе всегда приветствует термостабильный преципитиноген, что в дальнейшем подтвердилось при разработке новых технологий получения сибиреязвенных сывороточных препаратов

3 2 Изучение возможности использования культуры вакцинного штамма антракса для изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворогки

Главной задачей в настоящей работе являлось изучение возможности изю-товления активной и специфичной преципитирующей сыворотки с использованием

для гинериммунизации лошадей-продуцентов одного вакцшшого бескапсульно-го штамма В апЛгааз вместо четырех, один из которых был капсулообразующим

Работа проводилась на Тобольской биофабрике, где для получения преципи-тирующей сибиреязвенной сыворотки были испытаны вегетативные культуры вакцинных бескапсульных штаммов

В опыт были взяты 30 лошадей, которых разделили на 3 группы, по 10 голов в каждой, 1-я и 2-я группы опытные, 3-я - контрольная За 1 месяц до гипериммунизации всех лошадей-продуцентов иммунизировали против сибирской язвы вакциной из штамма 55-ВНИИВВиМ

Сибиреязвенную преципитиругощую сыворотку получали по трем различным схемам

В 1-ой и 2-ой группах было сокращено количество инъекций за счет исключения этапов гипериммунизации при создании грундиммунитета

По первой схеме (опытной) лошадей гипериммунизировали культурой одного бескапсулыгого вакцинного сибиреязвенного штамма 55-ВНИИВВиМ (таблица 3) По второй схеме (опытной) лошадей гипериммунизировали культурами трех вакцинных бескапсульных сибиреязвенных штаммов Шуя-15, № 94, № 916-1 (таблица 4)

По третьей схеме (контрольной) лошадей гипериммунизировали культурами четырех сибиреязвенных штаммов М-71 (вакцинный капсульный), Шуя-15, 94, 916-1 (вакцинные бескапсульные) (таблица 5, 6)

В 3 группе (контрольной) гипериммунизация проходила в два этапа Этап 1 Иммунизировали лошадей споровой культурой штамма М-71 для создания грундиммунитета

Таблица 3

Схема гипериммунизации лошадей культурой штамма 55-ВНИИВВиМ

(схема №1)

Номер инъекции 1 2 3 4 5 6 7 8

Доза (см3) 5 10 15 20 25 30 35 40

Номер инъекции 9 10 11 12 13 14 15 16

Доза (см3) 45 50 55 60 60 60 70 70

Таблица 4

Схема гипериммунизации лошадей культурами штаммов Шуя-15, 94,916-1 _(схема №2)_

Номер Доза (см^) Наименование ан-

инъекции тигена

1 5 Шуя-15

2 10 94

3 15 916-1

4 20 Шуя-15

5 25 94

6 30 916-1

7 35 Шуя-15

8 40 94

9 45 916-1

10 50 Шуя-15

11 55 94

12 60 916-1

13 60 Шуя-15

14 60 94

15 70 916-1

16 70 Шуя-15

Всею в каждой группе было сделано по 16 инъекции

Таблица 5

Схема гипериммунизации лошадей споровой культурой __штамма М-71 (схема №3)__

Номер шгьекции способ введения Доза (см"*)

1 внутрикожно 0,3

2 внутрикожно 0,5

з внутрикожно 1,0*

подкожно 4,0

4 внутрикожно 1,0*

подкожно 10,0

5 внутрикожно 2,0*

подкожно 20,0

Примечание * - доза вводится в несколько точек

Этап 2 Продолжали гипериммунизацию лошадей внутривенно вегетативной культурой штаммов М-71, Шуя-15, 94, 916-1

Гипериммунизацию лошадей считали законченной, если положительная реакция преципитации со стандартным сибиреязвенным антигеном наступала в период до 1 мин, а с экстрактами сибиреязвенных кож до 2 мин

Таблица 6

Схема гипериммунизации лошадей вегетативными культурами

штаммов М-71, Шуя-15,94, 916-1 (схема №3)_

Номер Доза (см3) Наименование ан-

инъекции тигена

6 5 Шуя-15

7 10 94

8 15 М-71

9 20 916-1

10 25 Шуя-15

11 30 94

12 35 М-71

13 40 916-1

14 45 Шуя-15

15 50 94

16 55 М-71

17 60 916-1

18 60 Шуя-15

19 60 94

20 70 М-71

21 70 916-1

В результате проведенной работы было установлено, что преципитины начинают появляться в крови продуцентов только после шестой инъекции антигена, а после 16-ой инъекции (схемы 1, 2) и 21-ой (схема 3) у большинства продуцентов сыворотка достигает необходимого уровня активности Применение схем № 1 и 2 значительно сократило цикл гипериммунизации лошадей Результаты активности и специфичности сывороток, полученных по схемам №№ 1, 2, 3 отражены в таблице 7

Анализируя данные таблицы 7 было установлено, что сыворотка, полученная по схеме № 1 с использованием для гипериммунизации продуцентов культуры одного вакцинного бескапсульного штамма 55-ВНИИВВиМ, не уступает по активности и специфичности сывороткам, изготовленным по схемам №3 (контрольной) и № 2, а также коммерческим серийным препаратам (контрольные преципитирую-щие сыворотки)

В этом опыте подтвердилось, что микробы ложнисибиреязвенных штаммов имеют идентичный термостабильный преципитирующий а1гтиген, так как приготовленные из них автоклавированные антигены (исключение В янЬиНз) положительно реагировали в реакции преципитации Асколи с опытными и контрольными преципитирующими сыворотками

Однако, при этом время появления реакции в 4 - 6 раз дольше, чем при постановке реакции Асколи с сибиреязвенными антигенами, что свидетельствует о меньшем количестве гермостабильного антигена

3 3 Изучение активности и специфичности преципитирующей сибиреязвенной сыворотки в процессе хранения

Срок годности является важнейшим показателем качества биологических препаратов Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка считается пригодной для практического использования в течение трех лет со дня изготовления (днем изготовления считают день окончания расфасовки во флаконы) Эгот срок установлен по результатам проверки активности и специфичности указанного препарата в течение данного отрезка времени

Активность и специфичность преципитирующей сыворотки определяли после изготовления и через 1,5, 2,5, 3,5 года хранения при температуре 10-15 °С по общепринятому метод)' В результате испытаний установлено, что активность и специфичность преципитирующих сывороток практически не изменилась в течение 3,5 лет хранения (время образования кольца преципитации увеличилось на 5-10 секунд)

Таким образом, было установлено чю, преципитирующая сибиреязвенная сыворотка, полученная с использованием одного вакцинного бескапсульного штамма 55-ВНИИВВиМ, сохраняет свою активность и специфичность в течение 3,5 лет и не уступает по этим показателям коммерческому препарату

Основываясь на результатах, полученных при изучении антигенной структуры В апЛгааэ, а также при разработке усовершенствованного способа изготовления сибиреязвенной преципитирующей сыворотки нами были внесены изменения в технологическую инструкцию по изготовлению и контролю этого препарата

Таким образом, разработан новый способ изготовления сибиреязвенной преципитирующей сыворотки, позволяющей получать достаточно активный и специфичный препарат без применения капсульного штамма возбудителя сибирской язвы Исключение из технологии капсульного штамма существенно сокращает материальные и трудовые затраты на производство преципитирующей сыворотки за счет значительного сокращения цикла гипериммунизации лошадей (в среднем на 26 дней), одновременно устраняя возможность контаминации противосибиреяз-венной вакцины культурой капсульного штамма (были случаи на Орловской и Тобольской биофабриках), обладающего остаточной вирулентностью

Активность и специфичность сибиреязвенной преципитирующей сыворотки полученной по разным схемам гипериммунизации

Таблица 7

Схемы получения сывороток и Результаты проверки активности и специфичности сывороток в реакции преципитации Асколи (секунды) с антигенами

использованные штаммы Сибиреязвенный бактерийный стандартной серии Кожные положительные от животных, павших от сибирской язвы Положительные из органов павших от сибирской язвы

6 12 1 13 овца коза КРС селезенка почка печень

№1 55-ВНИИВВиМ 25 30 25 45 50 50 35 40 40

№2 Шуя-15, 94, 916-1 35 25 30 55 60 50 45 45 45

№3 М-71, Шуя-15, 94, 916-1 30 30 25 50 45 55 35 40 40

Коммерческая сыворотка сер 18 25 30 25 50 50 50 40 45 40

Коммерческая сыворотка сер 20 30 25 35 50 55 55 40 45 45

Коммерческая сыворотка сер 27 25 30 30 50 55 55 40 45 45

Коммерческая сыворотка сер 32 35 30 35 60 60 55 35 40 40

Продолжение таблицы 7

Кожные отрицательные от здоровых животных Ложносибиреязвенные микробы (антигены изготовлены по прописи стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена)

Овца Коза КРС В сег-еия В атЬга-сокЗеБ В рэеи-с!оап-Лгаш В тезеп 1епси8 В епит В виЬ-11118

№1 55-ВНИИВВиМ Отр Отр Отр 120 100 Отр 55 140 Отр

№2 Шуя-15,94,916-1 Отр Отр Отр 110 100 Отр 50 140 Отр

№3 М-71, Шуя-15,94, 916-1 Отр Отр Отр 120 120 Отр 55 160 Отр

Коммерческая сыворотка сер 18 Отр Отр Отр 115 115 Сомнит 60 160 Отр

Коммерческая сыворотка сер 20 Отр Отр Отр 110 100 Сомнит 55 160 Отр

Коммерческая сыворотка сер 27 Отр Отр Отр 120 115 Отр 50 155 Отр

Коммерческая сыворотка сер 32 Отр Отр Отр 120 110 Отр 60 160 Отр

Высокое качество опытно-промышленной серии сибиреязвенной преци-питиругощей сыворотки, полученной и использованием вакцинного бескапсулъ-ного штамма 55-ВНИИВВиМ, было установлено в результате производственных и комиссионных испытаний

Технология изготовления данного биопрепарата была внедрена в биологическое производство

3.4. Изучение возможности использования культуры вакцинного штамма антракса для изготовления стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена

При изучении состава преципитирующих антигенов у вирулентных и ат-тенуированных штаммов возбудителя сибирской язвы было установлено, что все изученные штаммы обладают идентичным термостабильным преципитирующим антигеном, на присутствии которого и основана реакция Асколи При подборе вакцинного сибиреязвенного штамма для изготовления преципитирующего антигена мы исследовали следующие штаммы М-71 (капсульный), СТИ-1, Шуя-15, 94, 916-1, 34Р2, 55-ВНИИВВиМ (два последних после автоклавирования давали в РДП наиболее четкую полосу преципитации)

Полученные таким методом антигены проверяли на активность (с 93 сериями прецинитирующей сыворотки) и специфичность Для сравнения использовали коммерческий стандартный сибиреязвенный бактерийный антиген, изготовленный по аналогичной методике из вирулентного штамма антракса ЗБК2

В результате проверки установлено, что преципитирующие антигены, изготовленные из вакцинных бескапсульных сибиреязвенных штаммов не уступают по активности и специфичности коммерческому антигену из вирулентного штамма ЗБК2 (44,9±0,7 сек), при этом наиболее активными оказались антигены, изготовлешше из штаммов 34Б2 (40,5±0,7 сек) и 55-ВНИИВВиМ (40,3±0,9 сек)

Этой работой были подтверждены данные, полученные при изучении антигенной структуры сибиреязвенных штаммов о том, что все изученные нами штаммы содержат идентичный термостабильный преципитирующий антиген, количество которого незначительно варьирует у разных штаммов Вакцинные бескапсульные штаммы 34Р2 и 55-ВНИИВВиМ были отобраны и предложены для производства стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена на био-

предприятиях, так как у этих штаммов прещтитирующий антиген находится в

наибольшем количестве, так как в РДП антигены из этих образовывали наиболее

четкие линии преципитации

3.5. Активность и специфичность опытно-промышленных серий антигена сибиреязвенного бактерийного стандартного, изготовленных из культур вакцинных бескапсульных штаммов 34Р2 и 55-ВНИИВВиМ.

В дальнейшем на Тобольской биофабрике были изготовлены опытно-промышленные серии сибиреязвенного антигена из штаммов 34Р2 и 55-ВНИИВВиМ, которые были испытаны в производственных условиях в сравнении с коммерческим препаратом В результате проведетплх исследований установлено, что опытно-промышленные серии сибиреязвенного антигена изготов-лешше из штаммов 34Р2 и 55-ВНИИВВиМ не уступают по активности (с 15 сериями преципитирующей сыворотки) и специфичности коммерческим биофабричным сериям данного препарата Время образования кольца преципитации с опытными антигенами составляло 35,0+0,8 сек

В соответствии с приказом Главного управления ветеринарии Госагро-прома СССР № 49 от 12 06 1989 г на базе Центральной ветлаборатории были проведены комиссионные испытания с целью определения активности и специфичности опытно-промышленных серии антигена сибиреязвенного бактерийного стандартного, изготовленных из культур вакцинных бескапсульных штаммов 34Р2 и 55-ВНИИВВиМ

Испытанию были подвергнуты антиген сибиреязвенный бактерийный стандартный сер №1 из штамма 34р2, а также коммерческие серии (всего 5 серии) антигена, изготовленного из вирулентного штамма ЗБК2

Результаты комиссионных испьгшгий показали, что антиген, изготовленный из вакцинных бескапсульных штаммов антракса по показателям активности и специфичности не уступает коммерческому препарату, изготовленному из вирулентного капсулогенного сибиреязвенного штамма ЗБК2 Время образования кольца преципитации наступало в течение 15-20 сек

На основании полученных результатов комиссия сделала следующие выводы опытно-промышленные серии антигенов, изготовленные из вакцинных бескапсульных штаммов 55-ВНИИВВиМ и 34Р2, не уступают по активности и специфичности коммерческим сериям антигена, изготовленного из культуры ви-

рулентного штамма ЗБК2 Стандартный сибиреязвенный бактерийный антиген может изготавливаться как из штамма 55-ВНИИВВиМ, так и из штамма 34¥2 Такая технология получения антигена внедрена в биофабричное производство, препарат приметается в ветеринарной практике для контроля активности сибиреязвенной сыворотки

3 6 Изучение активности и специфичности стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена в процессе хранения

Стандартный сибиреязвешшш бактерийный антиген, изготовленный по утвержденной методике, считается пригодным для практического использования в течение 3-х лет со дня изготовления Этот срок был установлен опытным путем по результатам проверки активности и специфичности препарата в течение различных сроков хранения

Активность и специфичность антигена определяли непосредственно после его изготовления и через 1,5, 2,5, 3,5 года хранения при температуре 10-15°С по общепринятому методу В результате испытаний установлено, что активность опытно-промышленных серий антигенов практически не изменилась в течение 3,5 лет хранения (время образования кольца преципитации увеличилось на 10-15 сек)

Таким образом, стандартный сибиреязвенный бактерийный антиген, полученный из вакцинного беекапсульного штамма 55-ВНИИВВиМ или 34Р2 сохраняет свою активность в течение 3,5 лет и не уступает по этим показателям коммерческому препарату, изготовленному из вирулентного штамма ЗБК2

Получение стандартного преципитирующего антигена из вакцинного беекапсульного сибиреязвенного штамма взамен вирулентного позволяет исключить возмояшость заражения сибирской язвой людей, участвующих в производстве, контаминации окружающей среды споровой формой возбудителя болезни, а также контаминации вирулентной культурой антракса биопрепаратов, которые готовят на тех же предприятиях, и в целом существенно упрощает технологию изготовления препарата

На способ получения антигена сибиреязвенного бактерийного стандартного разработана и утверждена постоянная нормативная документация

- «Инструкция по изготовлению и контролю ангигена сибиреязвенного бактерийного стандартного», утверждена ГУВ Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам 01 12 1989 г

- «Технические условия (ТУ 10-09-26-89) «Антиген сибиреязветшый бактерийный стандартный», утверждены ГУВ Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам 01 12 1989 г

В 1989 г предложенная нами технология изготовления антигена сибиреязвенного бактерийного стандартного внедрена на Тобольской, а с 1994 г на Орловской биофабриках, где ее и применяют по настоящее время

Исследования по разработке нового способа изготовления антигена сибиреязвенного бактерийного стандартного выполнены в соответствии с планом НИР ВГНКИ ветпрепаратов по заданию 02 04 07 Д НТП 0 сх 68 Госагропрома СССР во ВГНКИ ветпрепаратов и на Тобольской биофабрике в период с 1988 -1992 г г

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Работу по совершенствованию способов изготовления преципитирующей сибиреязвеннои сыворотки и стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена необходимо было провес ги, базируясь на сравнительном изучении антигенной структуры вирулентных и аттенуированных (вакцинных) сибиреязвенных штаммов, преимущественно при определении наличия растворимых белковых преципитиногенов

Антигенную структуру В апАггаси изучали в РДП и иммуноэлектрофоре-зе В качестве антигенов использовали нативные и автоклавированные дезинте-граты микробов разных сибиреязвенных и ложносибиреязвенных штаммов В результате удалось получить активные в антигенном отношении препараты В реакциях использовали гакже и коммерческий стандартный сибиреязвенный (прецгатитирующий) антиген

В перекрестных реакциях диффузионной преципитации в агаровом геле (РДП) и иммуноэлектрофорезе (ИЭФ) было установлено, что все взятые сибиреязвенные штаммы (34Р2, 55-ВНИИВВиМ, М-71, СТИ-1, Шуя-15) отличаются по антигенному составу и содержат от пяти до семи растворимых преципитиногенов Методом иммуноэлектрофореза было также установлено, что антиген Б идентичен и содержится у всех изученных штаммов и соответствует стандарт-

ному сибиреязвенному антигену При постановке РДП и ИЭФ с автокливиро-ванными дезинтегратами 25-ти вирулентных сибиреязвенных штаммов было подтверждено, что все они имеют один идентичный термостабильный преципи-тирующий антиген, аналогичный коммерческому бактерийному антигену (Б), который в основном участвует в реакции преципитации Асколи Этот же прици-питиноген (Б) имеют и другие представители рода Bacillus, кроме В subtilhs

Полученные данные позволили сделать вывод, что для изготовления диагностических препаратов (преципитируюгцая сыворотка и стандартный бактерийный антиген) могут быть использованы бескапсульные вакцинные сибиреязвенные штаммы, так как все они содержат идентичный термостабильный преци-питиноген - «Б» Для реализации этой идеи на Тобольской биофабрике была получена прецигаггарующая сыворотка по 3-м схемам гипериммунизации с ис-пользовашгем в качестве антигенов одного бескапсульного вакцинного штамма (55-ВНИИВВиМ), трех бескапсульных вакцинных штаммов (Шуя-15, 94, 916-1), контрольная схема - предусматривающая использование одного капсульного (М-71) и трех бескапсульных вакцинных сибиреязвенных штаммов (Шуя-15, 94, 916-1)

Сравнительные испытания полученных препаратов показали, что преци-питирующая сыворотка, изготовленная с использованием штамма 55-ВНИИВВиМ по активности и специфичности не уступает сывороткам, изготовленным по двум другим схемам гипериммунизации

Таким образом, данные о идентичности термостабильного приципитино-гена у различных вирулентных и авирулентных штаммов В anthracis позволили предложить новую технологию изготовления сибиреязвенной преципитирующей сыворотки с использованием в качестве антигена для гипериммунизации продуцентов одного вакцшшого штамма 55-ВНИИВВиМ Новая технология позволила значительно сократить цикл гипериммунизации лошадей (в среднем на 26 дней) за счет исключения из схемы гипериммунизации штамма М-71, а также существенно снизить трудовые и материальные затраты при производстве препарата

Высокая специфическая активность преципитирующей сыворотки, изготовленной по новой технологии, с использованием штамма 55-ВНИИВВиМ под-

тверждена при производствешгых и комиссионных испытаниях ее опытно-промышленных образцов

Для определения сроков годности преципитирующей сыворотки, изготовленной по новой технологии была испытана ее активность и специфичность в сравнении с коммерческой сывороткой непосредственно после изготовления, также через 1,5, 2,5, 3,5 года (срок наблюдения) хранения при температуре 10-15 °С В результате испытаний было установлено, что активность и специфичность преципитирующей сыворотки практически не снизилась за 3,5 года хранения при избранном температурном режиме

Технология изготовления сибиреязвенной преципитирующей сыворотки с использованием вакцинного бескапсулыгого штамма 55-ВНИИВВиМ внедрена в 1992 года на Тобольской биофабрике, а с 1994 года - используется Орловской биофабрикой, где и применяется по настоящее время

Для изготовления стандартного сибиреязвенного бактериткн о антигена было использовано 7 вакцинных штаммов М-71 (капсулыгый), СТИ-1, Шуя-15, 94, 916-1, 34Р% и 55-ВНИИВВиМ - бескапсульные Из культур этих штаммов по действующей технологической инструкции были изготовлены преципитирую-щие антигены, которые были испытаны в сравнении с коммерческим препаратом (изготовлен из вирулентного сибиреязвенного штамма ЗБК2) Было замечено, что штаммы 34Р2 и 55-ВНИИВВиМ продуцируют термостабильный преципити-ноген в существенно большем количестве и антигены из этих штаммов образуют кольцо преципитации в реакции Асколи быстрее, чем антигены из других штаммов В дальнейшем штаммы 34Р2 и 55-ВНИИВВиМ были рекомендованы для изготовления стандартного преципитирующего антигена на биопредприятиях (Можно использовать как первый, так и второй штамм)

Для определения сроков годности опытно-промьппленных серий антигенов изготовленных из вакцинных бескапсульных сибиреязвенных штаммов была испытана их активность и специфичность в сравнении с коммерческим антигеном непосредственно после изготовления и через 1,5, 2,5, и 3,5 года хранения при температуре 10-15°С В результате испытаний было установлено, что активность и специфичность опытно-промышленных серий антигенов практически не снизилась за 3,5 года хранения

При производственных и комиссионных испытаниях опытно-промышленные серии антигена сибиреязвенного бактерийного стандартного, изготовленного из вакцинных штаммов 34F2 и 55-ВНИИВВиМ были признаны удовлетворяющими существующим требованиям по показателям активности и специфичности На стандартный бактерийный антиген разработана и утверждена постоянно действующая документация Новая технология изготовления антигена внедрена в практику биологической промышленности и использовалась на Тобольской биофабрике, а с 1992 г и по настоящее время на Орловской биофабрике

Замена вирулентного штамма возбудителя сибирской язвы на вакцинный бескапсульный штамм при производстве стандартного бактерийного антигена позволило упростить технологию изготовления препарата (исключение этапа обезвреживания сибиреязвенной бакмассы), а также полностью исключить риск заражения работников биопредприятий сибирской язвой

Таким образом, нами разработаны и внедрены в практику биологической промышленности новые технологии изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворотки и стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена на основе использования бескапсульных авирулентных вакцинных шгаммов, что позволило сделать производство сибиреязвенных диагностических препаратов эпидемиологически и экологически безопасным

За истекший период изготовлено и реализовано во все регионы Российской Федерации преципитирующей сибиреязвенной сыворотки - 23 580 литров, стандартной сибиреязвенного бактерийного антигена - 1 305 литров

ВЫВОДЫ

1 Установлено, что штаммы сибиреязвенных микроорганизмов капсуль-ные - вирулентные и бескапсульные - вакцинные обладают общим идентичным термостабильным антигеном, который вступает в реакцию преципитации (реакция Асколи) со специфической сибиреязвешюй сывороткой

2 Разработана, испытана и внедрена в практику схема гипериммунизации лошадей-продуцентов преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с использованием в качестве антигена культуры вакцинного бескапсульного штамма 55-ВНИИВВиМ

3 Разработана, испытана и внедрена в практику технология изготовления стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена на основе применения бескапсульного вакцинного штамма (55-ВНИИВВиМ или 34Р2)

4 Преци питиругощая сибиреязвенная сыворотка и стандартный сибиреязвенный бактерийный ангиген, изготовленные по новой технологии, не уступают по активности и специфичности коммерческим образцам указанных препаратов

5 Активность и специфичность преципитиругошей сибиреязвенной сыворотки и стандартного бактерийного антигена, изготовленных с использованием авирулентных вакцигшых бескапсульных штаммов практически не изменилась в процессе их хранения в течение 3,5 лет (срок наблюдения)

6 Замена производственных вирулентных капсульных штаммов на авиру-лентные вакцинные полностью исключают возможность заражения людей, контаминацию окружающей среды капсульными культурами В атИгасн и имеет важное социальное, экологическое и экономическое значение

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Предлагается применять на биопредприятиях новые способы получения преципитирующей сибиреязвеннои сыворотки и стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена на основе использования авирулентных вакцинных штаммов, вместо вирулентных капсулогенных штаммов

Разработана и утверждена в установленном порядке нормативная документация

- Инструкция по изготовлению и контролю антигена сибиреязвенного бактерийного стандартного, утверждена ГУВ Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам 01 12 1989г

- ТУ 10-09-26-89 Антиген сибиреязвенный бактерийный стандартный, утверждены ГУВ Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам 01 12 1989 г

- Временная инструкция по изготовлению и контролю сыворотки сибиреязвенной преципитирующей, утверждена директором ВГНКИ 30 12 1990 г

- ТУ 10 19 77-89 Сыворотка сибиреязвенная преципитирующая, утверждены ГУВ Госагропрома СССР 05 05 1989 г

- Инструкция по изготовлению и контролю сыворотки сибиреязвенной преципитирующей, утверждена ГУВ МСХ и продовольствия РФ 03 И 1992 г

- Изменения в инструкцию по изготовлению и контролю сыворотки сибиреязвенной преципитирующсй, утверждены директором ВГИКИ 30 12 1994 г

- Извещение №1 об изменении ТУ 10 19 77-89, утверждено директором ВГНКИ 30 12 1994 г

Список научных работ опубликованных по теме диссертации.

1 Шморгун Б И Изготовление сибиреязвенного антигена из вакцинных бескапсульных штаммов / Сб науч трудов ВИЭВ - М - 1989 - с 17-18

2 Шморгун Б И, Маничев А А Использование авирулентных сибиреязвенных штаммов для изготовления сибреязвенного бактерийного антигена /Сб науч трудов ВГНКИ-М -1990-е 21-22

3 Шморгун Б И, Маничев А А Изучение состава термостабильных преципитиногенов у возбудителя антракса / Межвед Научно-метод Комиссия по борьбе с сибирской язвой - Ташкент - 1990 с 79-80

4 Шморгун Б И , Маничев А А Использование вакцинных штаммов В апйкаск для изготовления стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена / «Ветеринария», 1991 - №7 - с 30-32

5 Шморгун Б И, Маничев А А Усовершенствованный способ изготовления преципетирующей сибиреязвенной сыворотки / «Ветеринария», 1995-№1 - с 30-34

6 Маничев А А, Шморгун Б И Сравнительное изучение антигенной структуры разных ш гаммов возбудителя штамма сибирской язвы / Сб науч трудов ВГНКИ - М - 1995 - с 147 - 157

7 Маничев А А , Ипатенко Н Г , Саленко Л С , Шморгун Б И Динамика накопления сибиреязвенного гермостабильиого антигена в организме кроликов, вакцинированных против сибирской язвы и инфицированных / Сб науч трудов ВГНКИ - М - 1996 - с 82-86

8 Ипатенко Н Г , Шморгун Б И, Саленко Л С Компоненты для реакции преципетации при сибирской язве / «Ветеринария», 1999 - №10 - с 15-17

ФГУ вниивсгэ

Москва, Звенигородское ш , 5 Заказ ¿ЪХ/С Тираж 100 экз

Сибирская язва - остро протекающая, особо опасная зоонозная болезнь, к которой наиболее чувствителен крупный рогатый скот, овцы, козы лошади, и другие виды домашних и диких животных. Среди хищников чувствительны к сибирской язве норки, соболя, лисицы клеточного содержания. Слабочувствительны к заражению в естественной среде обитания собаки, кошки, волки и другие виды диких плотоядных.

В настоящее время достигнуто стойкое благополучие поголовья животных России по сибирской язве. Благодаря ежегодным плановым профилактическим мероприятиям, охватывающим все поголовье восприимчивых животных. Поэтому указанная инфекция проявляется в настоящее время только в виде спорадических случаев, число которых имеет постоянную тенденцию к сокращению. На фоне видимого благополучия, в силу биологической специфики возбудителя болезни (длительное переживание в почве и другие), сохраняется постоянная угроза встречи животных и человека с вирулентными формами В. аыкгааз. Поэтому необходимо обладать совершенными средствами и методами диагностики болезни, которые позволяют в возможно короткие сроки и максимально достоверно ставить диагноз и, следовательно, своевременно проводить профилактические и лечебные мероприятия по купированию очагов сибиреязвенной инфекции.

Диагноз на сибирскую язву ставят на основании анализа эпизоотических данных, клинических признаков, и лабораторных исследований. При этом лабораторные исследования имеют решающее значение, поскольку болезнь может протекать без характерных клинических признаков и пато-логоанатомических изменений - при подозрении на сибирскую язву животных не вскрывают. В ветеринарных лабораториях используют следующие диагностические тесты: микроскопия мазков-отпечатков, бактериологические исследования с целью выделения чистых культур и изучения их свойств, идентификация выделенных культур по культуральным и биохимическим свойствам, биопроба на лабораторных животных, серологические исследования.

Одним из основных способов диагностики сибирской язвы остается метод исследования материала в реакции преципитации (реакция Асколи).

На протяжении многих лет исследователи занимались вопросом получения специфичной и активной преципитирующей сыворотки, которая достоверно и в короткий срок выявляла бы кожевенно-меховое сырье и патологический материал, полученные от животных павших при подозрении на сибирскую язву. Необоснованное применение штаммов возбудителя антракса при получении сыворотки приводило к частым неудачам, так как задачу подбора штаммов, использованных при гипериммунизации продуцентов нельзя решить без детального изучения антигенной структуры возбудителя указанной болезни.

В настоящее время по этому вопросу опубликовано много работ отечественных и зарубежных авторов, но сравнительная характеристика антигенной структуры различных штаммов возбудителя сибирской язвы недостаточно изучена. Поэтому подбор новых штаммов для получения преципитирующей сибиреязвенной сыворотки и стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена на основе сравнительного изучения антигенной структуры В. аМкгааз является перспективным направлением, имеющим научное и практическое значение.

Цель работы

Разработать способ изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с использованием одного вакцинного бескапсульного штамма В. аШкгааз, вместо четырёх аттенуированных штаммов, среди которых обязательно присутствие одного капсулогенного; разработать способ изготовления стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена из вакцинного штамма взамен вирулентного, при этом оба препарата по активности и специфичности не должны уступать существующим коммерческим препаратам, изготовленным по стандартной методике.

Задачи исследований:

1. Изучить состав термостабильных преципитирующих антигенов у вирулентных и аттенуированных штаммов В. ашкгаая в реакции диффузной преципитации и иммуноэлектрофорезе и на основе полученных результатов отобрать новые производственные штаммы с более широким набором специфических антигенов.

2. Установить возможность использования вновь отобранных штаммов для изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворотки.

3. Предложить оптимальную схему гипериммунизации лошадей-продуцентов преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с использованием антигена, изготовленного из одного вакцинного бескапсульного штамма.

4. Изучить активность и специфичность полученной преципитирующей сыворотки в сравнении с коммерческой сывороткой биофабричного производства.

5. Установить возможность замены вирулентного производственного штамма сибирской язвы на вакцинный при промышленном изготовлении стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена.

6. Изучить активность и специфичность полученного антигена в сравнении с коммерческим препаратом биофабричного производства.

7. Определить активность и специфичность преципитирующей сыворотки и стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена в процессе хранения.

Научная новизна. Установлено, что все изученные нами сибиреязвенные штаммы (вирулентные и авирулентные) содержат идентичный термостабильный преципитирующий антиген, соответствующий стандартному сибиреязвенному антигену. Впервые показана возможность получения высокоактивной и специфичной преципитирующей сибиреязвенной сыворотки при использовании для гипериммунизации продуцентов одного вакцинного бескапсульного штамма 55-ВНИИВВиМ взамен четырёх, используемых ранее, один из которых капсулогенный, а также для получения высокоактивного и специфичного стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена из вакцинного штамма ЪА1?г или 55-ВНИИВВиМ, взамен вирулентного штамма сибирской язвы ЗБКг

Практическая значимость. На основании полученных результатов разработан оригинальный способ изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с изменённой схемой гипериммунизации лошадей с использованием в качестве антигена одного вакцинного штамма. Указанный способ изложен в «Инструкции по изготовлению и контролю сыворотки сибиреязвенной преципитирующей»; утвержденной 03.11.1992 Главным управлением ветеринарии Минсельхозпрода РФ. Материалы диссертации использованы также при разработке ТУ 10-, 19.77-89 "Сыворотка сибиреязвенная преципитирующая", утвержденный ГУВ Госагропрома СССР 05.05.1989.

Предложенная схема гипериммунизации позволила сократить количество инъекций антигена, по сравнению с существующей, за счет отсутствия необходимости создания грундиммунитета у продуцентов и тем самым уменьшить срок иммунизации лошадей на 26-30 дней, что упростило технологию производства и снизило материальные затраты. Кроме того, изъятие из производства капсулогенного сибиреязвенного штамма М-71, обладающего достаточно высоким уровнем вирулентностости, исключает возможность контаминации культурой данного штамма других биопрепаратов, которые изготавливают на тех же биопредприятиях, что и преципитирую-щую сибиреязвенную сыворотку.

Одновременно разработан способ изготовления стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена, который изложен в «Инструкции по изготовлению и контролю антигена сибиреязвенного бактерийного стандартного», утверждённой ГУВ государственной комиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам 01.12.1989 года. Разработанный способ получения антигена исключает из производственного процесса вирулентную сибиреязвенную культуру штамма ЗБКг, заменив её вакцинным штаммом 34р2 или 55 ВНИИВВиМ.

Материалы диссертации использованы также при разработке ТУ 1009-26-89 "Антиген сибиреязвенный бактерийный стандартный", утвержденных ГУВ Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам 01.12.1989.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на:

- Ученых Советах ФГУ ВГНКИ в 1989-1991 годах;

- конференциях молодых ученых ВИЭВ в 1989 г., ФГУ ВГНКИ, ВНИ-ИВВиМв 1990 г.,

- XII Пленарном заседании Межведомственной научно-методической комиссии по борьбе с сибирской язвой при Минздраве СССР и Государственной комиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам в 1990 году (г. Ташкент)

-межлабораторном совещании научных сотрудников ВГНКИ в 2007 г.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ. Зарегистрирован отчет по законченной теме «Разработать и внедрить промышленный способ изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с использованием вакцинных бескапсульных штаммов, усовершенствовать методы её контроля», УДК 619:616:98:579.852.1: 615.373:616.9-07, № гос. регистрации 01910034968, Москва ВГНКИ, 1992 год.

Положения, выносимые на защиту:

- результаты разработки, испытания и внедрения в биологическую промышленность новых способов изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с использованием вакцинного бескапсульного штамма 55-ВНИИВВиМ взамен ранее применяемых 4-х аттенуированных штаммов антракса;

- результаты разработки стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена с использованием вакцинного штамма 34¥г или 55-ВНИИВВиМ взамен вирулентного штамма сибирской язвы ЗБКг.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Характеристика Bacillus anthracis

По современной классификации возбудитель сибирской язвы животных и человека вид Bacillus anthracis принадлежит к классу Schizomycetes, отряду (порядку) Eubacteriales, семейству Bacillaceae, и роду и подроду Bacillus (Колесов С.Г., 1976). Этот род объединяет 48 видов аэробных или факультативно анаэробных бацилл, которые разделены на две группы: в первую включено 22 вида, во вторую - 26 видов. Лучше изучены бациллы первой группы. Наиболее близкие к бацилле антракса по антигенной структуре являются, такие виды: В. cereus, В. anthracoides, В. pseudoanthracis, В. mycoides, В. subtilis и др. Все они сапрофиты, кроме В. cereus, которая синтезирует активный фермент патогенности лецитиназу и способна вызывать пищевые токсикозы (Ипатенко Н.Г., 1996).

Bacillus anthracis - сравнительно крупная палочка (длина - 3,0-10,0 мкм, ширина - 1,0-1,3 мкм), неподвижная, образует капсулы и споры. По Граму красится положительно, но в молодых и старых культурах встречаются грамотрицательные клетки.

В препаратах, приготовленных из крови и тканей, больных или погибших от сибирской язвы животных, неокрашенные бактериальные клетки имеют форму гомогенных прозрачных палочек со слегка закругленными концами. Палочки лежат поодиночке или соединены в короткие цепочки (Колесов С.Г., 1976).

Бациллы, выращенные на плотных или жидких питательных средах, формируют цепочки разной длины. В мазках культур штаммов, давших в жидких питательных средах типичный рост в виде хлопьевидного осадка, палочки чаще располагаются длинными цепочками, а в изготовленных из культур с атипичным диффузным ростом они образуют короткие цепочки, состоящие из 3-5 члеников.

В окрашенных препаратах внутренние концы палочек выглядят обрубленными или слегка вогнутыми, а свободные внешние концы - закругленными.

Бацилла ферментирует с образованием кислоты, но без газа: глюкозу, мальтозу, медленно сбраживают сахарозу, трегалозу, фруктозу и декстрин. Арабинозу, рамнозу, галактозу, лактозу, маннозу, раффинозу, инулин, манит, дульцит, сорбит, инозит не сбраживает. Крахмал гидролизует. Утилизирует цитраты (соли лимонной кислоты), образуют ацетилметидкарбинол и в следствии этого дает положительную реакцию Фогес-Проскауэра (Коле-сов С.Г., 1976).

Бациллы в организме животного и при культивировании на искусственных питательных средах с большим содержанием нативного белка образуют капсулу.

Капсула имеет несколько слоев. Внутренняя часть ее образована кислыми мукополисахаридами, наружная - мукопептидами и полипептидами (Ипатенко Н.Г., 1996).

Капсула, состоящая из 98 % воды, обладает защитным осмотическим действием против притока большого количества воды в клетку, а также защищает её от различных воздействий среды, в том числе и от иммунных механизмов организма и в частности препятствует фагоцитозу и способствует фиксации бацилл к клеткам макроорганизма.

Капсулу сибиреязвенного микроба составляет поли-Д-глутаминовая кислота, которая является одним из факторов вирулентности В. амИгаая (Бакулов И.А., 2001).

Важнейщим свойством, присущим возбудителю сибирской язвы, является способность образовывать при неблагоприятных условиях споровые формы, обеспечивающие микробу неопределенно длительное сохранение жизнеспособности во внешней среде (почве, придонном иле и других субстратов).

Типичные сибиреязвенные споры сильно преломляют свет; овальной, иногда округлой формы, расположены поодиночке размером 1,2-1,5 '

0,8-1,0 мкм. При образовании споры находятся в центре палочки, не превышая поперечника клетки (Колесов С.Г., 1976).

В сухом остатке вегетативных клеток бацилл содержится 6,80 % азота и 12,00-13,50 % минеральной золы, в сухом остатке спор - соответственно 12,14 и 41,15 %. Клетки сибирской язвы образуют ферменты липазу, диастазу, протеазу, желатиназу, дегидрадазу, цитохромоксидазу, пероксидазу, каталазу, аргиназу и др. (Ипатенко Н.Г., 1996). Споры содержат аланинра-целазу, нуклеозидрибозидазу, аденозиндезаминазу.

Одним из основных факторов патогенности возбудителя сибирской язвы Bacillus anthracis является бинарный трехкомпонентный экзотоксин, который образуется в процессе жизнедеятельности микроба in vivo. Экзотоксин также можно получить in vitro на специальных средах. Его продуцируют как вирулентные, так и авирулентные (бескапсульные) штаммы возбудителя сибирской язвы (Г.В. Дунаев, 1972).

Сибиреязвенный токсин (экзотоксин) состоит из трех отдельных белков - протективного (иммуногенного) антигена (РА, фактор II), летального (LF, фактор III) и отечного (эдематогенного, воспалительного) (EF, фактор I) - факторов с молекулярной массой 85, 83 и 89 кД соответственно. Все три компонента сибиреязвенного экстрацеллюлярного токсина обладают антигенными свойствами и серологически активны (Бакулов И.А., 2001; Т.С. Dixon, 1999).

При изучении химической природы факторов сибиреязвенного токсина было установлено, что II и III факторы являются гетерогенными в молекулярном отношении протеинами, а I фактор - липопротеином (D.C. Fisch, R.E.Lincoln, 1967; A.Buzzell, 1967; M.H.Wilkie, M.K. Ward, 1967; D.C. Fisch et al., 1968). Было установлено, что I фактор содержит 12 % азота, 6,2 % золы, 6,4 % углеводов, 0,7 % фосфора и менее 3 % липидов, соответственно II фактор - 13,9 % азота, 1,6 % золы, 3,7 % глюкозы, 0,2 % фосфора. В очищенном препарате III фактора обнаружено до 90 % протеина, и до 15,1 % азота, 0,2 % золы, меньше 0,5 % глюкозы и 0,05 % фосфора (J. L.

Stanley, К. Sargeant, H. Smith, 1960; J. L. Stanley, H.Smith, 1961; H. Smith, J. L. Stanley, 1962; N.Stamatin, 1964).

С целью выяснения иммуногенности каждого из трёх названных компонентов сибиреязвенного токсина N.Eckert, P.F. Bonventre (1963); V.G.Mahlandt с соавт. (1964) провели экспериментальную работу на морских свинках и крысах. Они установили, что фактор III обладал выраженными иммуногенными свойствами и защищал против заражения спорами возбудителя антракса оба вида животных, а также и против заражения крыс полным комплексом токсина. Фактор II иммунизировал против заражения спорами крыс и морских свинок, но оказался не иммуногенным при заражении токсином крыс. Фактор I не обладал иммунизирующими свойствами, однако с помощью реакции иммунодиффузии в геле в сыворотке крови морских свинок обнаружены антитела, титры которых не превышали 1 :4,1 : 8. Это подтверждается работами Leppla S.H., 2002; Linie S.F., 2004; Reu-veny S„ 2001; Modyeri M., 2003.

5. ВЫВОДЫ

1. Установлено, что штаммы сибиреязвенных микроорганизмов: капсульные-вирулентные и бескапсульные-вакцинные обладают общим идентичным термостабильным антигеном, который вступает в реакцию преципитации (реакция Асколи) со специфической сибиреязвенной сывороткой.

2. Разработана, испытана и внедрена в практику схема гипериммунизации лошадей-продуцентов преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с использованием в качестве антигена вакцинного бескапсульного штамма 55-ВНИИВВиМ.

3. Разработана, испытана и внедрена в практику технология изготовления стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена на основе применения бескапсульного вакцинного штамма (55-ВНИИВВиМ или 34¥2).

4. Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка и стандартный сибиреязвенный бактерийный антиген, изготовленные по новой технологии, не уступают по активности и специфичности коммерческим образцам указанных препаратов.

5. Активность и специфичность преципитирующей сибиреязвенной сыворотки и стандартного бактерийного антигена, изготовленных с использованием авирулентных вакцинных штаммов, практически не снизилась в процессе их хранения в течении 3,5 лет (срок наблюдения).

6. Замена производственных вирулентных капсульных штаммов на авирулентные вакцинные полностью исключает возможность заражения людей, контаминацию окружающей среды капсульными культурами В. ап-Мгаая и имеет важное социальное, экологическое и экономическое значение.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

Предложены способы получения преципитирующей сибиреязвенной сыворотки и стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена с использованием авирулентных бескапсульных вакцинных штаммов, вместо вирулентных капсулогенных.

Способ изготовления преципитирующей сибиреязвенной сыворотки с использованием одного вакцинного штамма внедрён на Тобольской биофабрике в 1992 году, и на Орловской биофабрике - с 1994 года, где и используется по настоящее время. Способ изготовления стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена внедрён на Тобольской биофабрике с 1989 года, а на Орловской биофабрике - с 1994 года и используется по настоящее время.

Материалы диссертации использованы при разработке следующей нормативной документации:

- Инструкция по изготовлению и контролю антигена сибиреязвенного бактерийного стандартного, утверждена ГУВ Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам 01.12.1989г.

- ТУ 10-09-26-89 Антиген сибиреязвенный бактерийный стандартный, утверждены ГУВ Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам 01.12.1989 г.

- Временная инструкция по изготовлению и контролю сыворотки сибиреязвенной преципитирующей, утверждена директором ВГНКИ 30.12.1990 г.

- ТУ 10.19.77-89 Сыворотка сибиреязвенная преципитирующая, утверждены ГУВ Госагропрома СССР 05.05.1989 г.

- Инструкция по изготовлению и контролю сыворотки сибиреязвенной преципитирующей, утверждена ГУВ МСХ и продовольствия РФ 03.11.1992 г.

- Изменения в инструкцию по изготовлению и контролю сыворотки сибиреязвенной преципитирующей, утверждены директором ВГНКИ 30.12.1994 г.

- Извещение №1 об изменении ТУ 10.19.77-89, утверждено директором ВГНКИ 30.12.1994 г.

Заключение

Таким образом, обобщая литературные данные по разработке и использованию преципитирующей сибиреязвенной сыворотки, можно сделать вывод, что на протяжении многих лет различные исследователи занимались вопросами совершенствования методов получения специфичной и активной преципитирующей сыворотки, которая достоверно и в короткий срок выявляла бы кожевенно-меховое сырье и патологический материал, полученные от животных павших при подозрении на сибирскую язву. Преципитирую-щая сибиреязвенная сыворотка, которая готовилась в период с 1927 по 1941 годы путем гипериммунизации лошадей антигеном из матрикса 1-ой вакцины Ценковского, обладала недостаточным уровнем специфичности.

С 1941 по 1953 годы преципитирующую сибиреязвенную сыворотку готовили с использованием для гипериммунизации лошадей вирулентных культур В. апШгаав, обезвреженных формалином (метод Н.М. Никифоровой и М.И. Ананьева). Недостатком этого метода являлись длительность процесса гипериммунизации и повышенная реактивность лошадей на вводимые им сибиреязвенные формолкультуры. При этом нередко имели место случаи гибели животных в процессе гипериммунизации, а также сохранялась опасность заражения работников производства и окружающей среды. При этом получаемая сыворотка была недостаточно активной.

Начиная с 1952 по 1991 годы, биофабрики готовили преципитирующую сибиреязвенную сыворотку путем гипериммунизации лошадей живыми слабовирулентными и иммуногенными культурами штаммов сибирской язвы (метод С.Г. Колесова и В.Н. Грачева). Недостатком этого метода являлся небольшой срок использования лошадей (из-за отхода), длительный период процесса гипериммунизации необходимость грундиммунизации, а также использование капсульного сибиреязвенного штамма М-71 (вторая вакцина Ценковского), создающего угрозу контаминации живых противо-сибиреязвенных вакцин, которые, как правило, готовятся на тех же биопредприятиях, что и сибиреязвенные диагностические и лечебные сыворотки и глобулины. Все это и послужило предпосылкой к проведению исследований в направлении использования вакцинных бескапсульных сибиреязвенных штаммов, а возможно одного штамма для использования его в качестве антигена при гипериммунизации лошадей-продуцентов с целью получения активной и специфичной преципитирующей сыворотки для постановки реакции Асколи и стандартного бактерийного антигена, что в случае удачи полностью освобождало сывороточное производство от использования капсулогенных и вирулентных штаммов В. атЬгаЫз.

3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Материалы и методы

Исследования выполнены согласно плану НИР ВГНКИ в период с 1988-1993 гг. в ФГУ ВГНКИ и на Тобольской биофабрике.

3.1.1. Материалы

Сибиреязвенные штаммы: вирулентные - ЗБКг, Коломна, Тула, 4-7, №17, 34, 37, 46, 47, 76, 81, 228, 230, 231, 243, 253, 362, 833, 992, 1051/35, 1159, 1168, 2555/18, 2781, 3305; вакцинные - СТИ-1, 34Р2, 55-ВНИИВВиМ, Шуя-15, 94, 916-1, Ихтиман, М-71 (матрикс 2-ой вакцины Ценковского).

Ложносибиреязвенные штаммы: В. ап1кгасо1йе8 № 1213, В. megaterium № 182, В. яиЫШз №6633, В. рБеийоапШгааз №104, В. теБеШеп-сш № 66, В. сегеиз №8035.

Растворы: 0,9 % раствор хлористого натрия (физиологический) с рН 7,2-7,4; 10 % раствор лимоннокислого натрия; 5 % раствор хлорамина; 5 % раствор фенола; 30 % раствор хлористого кальция; фосфатный буферный раствор с ионной силой 0,1.

Питательные среды: 2 % мясо-пептонный агар (МПА); агар Дифко; агар Сабуро; мясо-пептонный бульон (МПБ) с рН 7,2-7,4; мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) под вазелиновым маслом. Гороховый агар, используемый для получения биомассы сибиреязвенных культур (антигенов) при изготовлении сибиреязвенной преципитирующей сыворотки, который готовили по следующей прописи: 1 кг спелого гороха вымачивали в водопроводной воде в течение 18 часов. Вымоченный горох заливали десятью литрами дистиллированной воды, добавляли 50 г хлористого натрия и варили 1,5-2,0 часа до размягчения гороха. Затем полученный отвар доводили до исходного объёма дистиллированной водой, устанавливали рН 7,7-7,8, фильтровали через лавсановую ткань и добавляли 3 % агар-агара. Полученный гороховый агар фильтровали через ватно-марлевый фильтр, разливали в стеклянные бутыли-четверти по 400-500 см , стерилизовали при температуре 120 °С в течение 30 минут, затем использовали для выращивания сибиреязвенных культур.

Препараты. Антиген сибиреязвенный бактерийный стандартный 1975 год выпуска, серии №№: 6-8; 1983 г., серии №№: 8, 17-19, 21-23, 25, 26, 28; 1985 г., серии №№: 23, 24, 26, 30, 31, 34-36, 39,41^3,45, 46,48, 50, 51, 5356, 61, 62, 64, 67, 68, 78, 79; 1986 г., серии №№: 1, 2, 4-6, 8-10, 12- 15, 19, 21, 22, 24, 56, 70; 1987 г., серии №№>: 26-28, 30-38, 47; 1988 г., серии №№: 20, 33, 39-59; 1989 г., серии №№: 25, 30, 35; 1990 г., серии №№: 18-20, 27, 30, 32; 1991 г., серии №№: 61-65.

Сыворотка сибиреязвенная преципитирующая 1983 года выпуска серии №№: 8, 17-23, 25, 26, 28; 1984 г., серии №№: 23, 24, 26, 30, 31, 34-36, 39,41-43, 45, 46, 48, 50, 51; 1985 г., серии №№: 51, 53-56, 61, 62, 64, 67, 68, 78, 79; 1986 г., серии №№: 1, 2, 4 - 6, 8 - 10, 12 - 15, 19, 21, 22, 24, 56, 70; 1987 г., серии №№: 26 - 28, 30 - 38, 47; 1988 г., серии №№: 20, 33, 39 - 59; 1989 г., серии №№: 25, 30, 35; 1991 г., серии №№: 40,46, 50.

Использовали антигены, приготовленные из высушенных паренхиматозных органов животных, павших от сибирской язвы; антигены из сухих кож животных (лошадей, крупного рогатого скота, овец, коз, кроликов), павших от сибирской язвы и приготовленные из пресносухих кож здоровых животных, а также антигены из микробных клеток Вас. ап1кгасо1йв8, Вас. рзеийоаМкгаЫз.

Приборы и оборудование. Микроскоп биологический световой по ГОСТ 8284-78, аппарат для иммуноэлектрофореза фирмы ЬКВ, потенциометр типа рН - 340, центрифуга Т-24 (ГДР) с частотой вращения до 5000 g, термостат с температурой (37±1) °С, холодильники с температурой (4±2) °С и (-35 ± 5) °С, автоклав вертикальный по ГОСТ 9586-75, торзионные весы типаВ-801.

Животные. Лошади в возрасте от 3 до 6 лет массой не ниже 350 кг -30 голов, кролики массой 2,5-3,0 кг - 106 голов.

3.1.2. Методы

Изготовление антигенов для гипериммунизации лошадей-продуцентов преципитирующей сыворотки.

Вегетативные культуры сибиреязвенных штаммов выращивали на гороховом агаре в термостате при температуре (37±1) °С в течение 20-22 ч. Смывали физиологическим раствором, доводили концентрацию микробных тел до 2,0-3,0 млрд в 1 см по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Полученный антиген (вегетативную культуру) проверяли на отсутствие контаминации посторонней микрофлорой, типичность морфологических, тинкториальных и культуральных свойств. Для этого на обезжиренных предметных стеклах делали мазки микробных культур, высушивали, фиксировали в течение 15 мин в спирт-эфире, окрашивали по Граму, просматривали под микроскопом.

После этого высевали микробные культуры в МПБ, МППБ под вазелиновым маслом, на МПА, агар Сабуро. Посевы инкубировали при температуре (37±1) °С (на агаре Сабуро - при 20-24 °С) в течение 10 суток.

При наличии в мазках типичной грамполсшгельной культуры, состоящей из крупных палочек и цепочек, типичного роста в МПБ в виде рыхлого белого осадка на дне пробирки без помутнения бульона, на МПА и агаре Сабуро в виде серовато-белых колоний с серебристым оттенком К и Ю-форм, при отсутствии роста анаэробных культур в МППБ под вазелиновым маслом, сибиреязвенную культуру использовали для гипериммунизации лошадей.

Гипериммунизация лошадей сибиреязвенным антигеном.

Для создания грундиммунитета лошадей внутрикожно и подкожно иммунизировали споровой культурой штамма М-71 в нарастающих дозах

3 ^ от 0,3 до 20,0 см , с концентрацией 1,0 млрд. микр. клеток в см . Интервал между первой и второй инъекциями антигена - 8 суток, между последующими - 3-4 дня.

Антиген из вакцинных штаммов лошадям вводили внутривенно в нао растающих дозах от 5,0 до 70 см , с концентрацией 2,0-3,0 млрд. микр. клео ток в см соответствующих вегетативных культур штаммов В. аШкгаыБ. Интервал между инъекциями - 3-4 дня.

Получение сибиреязвенной преципитирующей сыворотки.

Сыворотку от лошадей по окончании периода гипериммунизации (через 8-10 суток после введения последней дозы антигена) получали по следующей методике: лошадей перед взятием крови, предварительно выдерживали 12 часов на голодной диете, не ограничивая водопой. Затем животных термометрировали, и от имеющих нормальную температуру брали кровь из расчета 8,0 см на 1 кг массы продуцента в первое крововзятие и 14,0-16,0 см в последующие кровь собирали в градуированные стеклянные баллоны емкостью 15-20 литров. Сыворотку получали цитратным методом, используя стерильный 10 % раствор лимоннокислого натрия с последующим сепарированием для отделения форменных элементов крови и дефиб-ринацией плазмы. 1

Раствор 10 % лимоннокислого натрия добавляли из расчета 34,0 см на 1 л крови. Внутреннюю поверхность баллонов увлажняли этим раствором так, чтобы в баллоне не оставалось следов конденсационной влаги. Во время взятия крови раствор лимоннокислого натрия перемешивали с кровью круговыми движениями баллона 2-3 раза за период крововзятия.

По окончании крововзятия содержимое баллона осторожно перемешивали и подсоединяли баллон к вакуумной системе для перекачки крови в приемные бачки сепараторного отделения, откуда кровь поступала в сепаратор. Когда сепараторный баллон наполнялся десятью литрами цитратной крови, запускали сепаратор. После того, как скорость вращения барабана достигала 4000§ (обычно через 2-3 мин после включения сепаратора), открывали кран бачка, из которого кровь поступала в приемник сепаратора.

Из сепаратора отделившуюся плазму перекачивали в дефибринатор и для превращения фибриногена в фибрин к ней добавляли 30 %-ный раствор химически чистого хлористого кальция из расчета 1,3 см3 на 1 л плазмы.

Раствор хлористого кальция готовили в 3-х литровых бутылях. Дефибри-нацию плазмы проводили в 600-литровых дефибринаторах с электрическим приводом на мешалку, делающую поочередно по 8 оборотов то в одну, то в другую сторону в течение одной минуты. Дефибринация заканчивалась обычно за 35-45 мин.

Полноту перехода фибриногена в фибрин определяли по следующей методике: в пробирку наливали 7,0-9,0 см испытуемой сыворотки и добавляли 5,0-6,0 см3 насыщенного раствора хлористого натрия, смесь тщательно перемешивали и оставляли на 5-10 мин в покое. Прозрачность смеси являлась показателем достаточно полного перехода фибриногена в фибрин.

Перед окончанием дефибринации плазму подвергали консервированию 0,5 %-ным раствором химически чистого фенола из расчета 100,0 см 5 %-ного раствора фенола на 900,0 см3 плазмы при постоянном перемешивании. После перемешивания сыворотку вместе с фибрином оставляли в де-фибринаторе на 18-20 часов, охлаждая до 12-16 °С. По истечении этого времени сыворотку перекачивали по трубопроводу через нижний кран в отстойник, где она выдерживалась в течение 2-х месяцев при температуре 612 °С, после чего отстоявшаяся сыворотка по трубопроводу поступала для грубой фильтрации. На следующий день сыворотка по трубопроводу (при давлении не более 0,5 атм) поступала на стерилизующую фильтрацию. Стерильная сыворотка накапливалась в баллоне-сборнике, из которого производилась расфасовка в стерильные флаконы. Флаконы над пламенем закрывали стерильными резиновыми пробками и обкатывали алюминиевыми колпачками.

Изготовление антигенов из бактериальной массы для использования в реакции преципитации Асколи.

Культуры сибиреязвенных и ложносибиреязвенных штаммов выращивали на МПА в матровых колбах в течение 18-20 ч при температуре (37±1) °С. Бактериальную массу каждого штамма снимали с агара шпателем и высушивали при температуре (37±1) °С до постоянного веса.

После этого высушенную бактериальную массу растирали в фарфоровой ступке в условиях стерильного бокса и полученный порошок переносили в бутыли и заливали его физиологическим раствором из расчета 1:3000 - 1:5000. Экстрагирование проводили 24-48 ч при температуре (40±2) °С, затем фильтровали через асбестовую вату, фасовали в ампулы по 1 см , запаивали и автоклавировали 30 мин при температуре 120 °С.

Изготовление антигенов из кожи и органов животных для реакции преципитации Асколи.

Измельченные сухие кусочки кожи и органов (по 1-2 г) растирали в ступке с песком, переносили в цилиндр и заливали физиологическим раствором (с 0,3 % кристаллического фенола) в соотношении 1:10 и экстрагировали 18-24 ч при температуре (20±2) °С.

Затем проводили фильтрацию через асбестовую вату и полученные экстракты расфасовывали в ампулы по 1 см , запаивали и автоклавировали в течение 30 мин при температуре 120 °С.

Постановка реакции преципитации по Асколи.

В уленгутовскую пробирку наливали 0,2-0,3 см прозрачной преци-питирующей сыворотки. Если сыворотка оказывалась мутной, то ее предварительно фильтровали через асбестовую вату. Затем тонкой пастеровской пипеткой наслаивали (или подслаивали) равное количество исследуемого антигена (бактерийного, кожного или из органов), так, чтобы не перемешать компоненты и была четко выражена граница между ними.

Реакция считалась положительной, если на границе между компонентами в течение 2 мин появлялось тонкое беловатое кольцо преципитации, которое при покачивании пробирки хорошо видно.

Постановка реакции диффузионной преципитации (РДП) в агаровом геле.

Реакцию ставили по методу Оухтерлони (1949), используя оборудование фирмы ЬКВ. В качестве геля применяли 1 %-ный агар Дифко, который готовили на физиологическом растворе. В специально подготовленные лунки закапывали (по 2-3 раза) компоненты реакции (дезинтеграты-антигены и сыворотки). После внесения компонентов иммунодиффузию

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА ^ проводили в специальной влажной камере при комнатной температуре. Реакцию учитывали через 24, 48 и 72 часа после последнего внесения компонентов в лунки. Линия преципитации проявлялась достаточно четко уже через 24 часа. Линии идентичных серологических систем сливались, неидентичных - перекрещивались.

Постановка иммуноэлектрофореза (ИЭФ).

Реакцию ставили по методу Грабара и Уильямса (1953) на досках фирмы ЬКВ. Для постановки использовали 1 %-ный агар Дифко, приготовленный на фосфатном буферном растворе и ионной силой 0,1. В специально подготовленные лунки вносили примерно по 2 мкл дезинтегратов (антигенов) из исследуемых штаммов. После электрофоретического разделения белков (в течение 2 ч) в продольную канавку, прорезанную в агаре, вносили по 0,05 см сыворотки, полученной с использованием дезинтегратов из исследуемых штаммов. Иммунодиффузия проходила в течение 24 часов во влажной камере.

После иммунодиффузии в течение 3 суток проводили иллюирование белков, которые не участвовали в преципитации. Затем пластинки с гелем накрывали фильтровальной бумагой и высушивали в термостате при температуре (37±1) °С. Для окраски белков применяли амидо черный 10В. Полосы преципитации после окраски довольно четко видны в зависимости от используемого дезинтеграта штамма.

3.2. Разработка методов получения преципитирующей сибиреязвенной сыворотки и стандартного сибиреязвенного бактерийного антигена с использованием культуры вакцинного штамма антракса

3.2.1. Изучение состава термостабильных преципитирующих антигенов у вирулентных и аттенуированных штаммов

При изучении состава преципитиногенов у штаммов В. аШкгааБ нас интересовало также количественное их содержание у каждого штамма. Для определения состава преципитиногенов мы изучали их способность стимулировать образование антител в организме кроликов и реагировать с гомологичными антителами in vitro в РДП и иммуноэлектрофорезе. В качестве антигенов в РДП и иммуноэлектрофорезе использовали культуры штаммов В. anthracis, выращенные и обработанные для РП, дезинтеграты культур, а также коммерческий сибиреязвенный бактерийный стандартный антиген.

С целью получения сывороток для РДП и иммуноэлектрофореза мы гипериммунизировали кроликов приготовленными антигенами (микробные дезинтеграты штаммов М-71, СТИ-1, 34F2, Шуя-15, 55-ВНИИВВиМ). Дезинтеграты микробных клеток получали по методу A.A. Маничева 1983. Для этого культуру каждого штамма выращивали на МПА при температуре (37±1) °С в течение 16-20 ч, смывали и центрифугировали трехкратно в физиологическом растворе по 40 мин при 10000g для отмывки от питательной среды. После этого разводили осадок физиологическим раствором до концентрации 20,0 млрд микробных клеток в 1 см3 по оптическому стандарту мутности ГИСК им. JI.A. Тарасевича. Микробные клетки, содержащиеся в полученной суспензии, разрушали путём пятикратного замораживания при температуре (-35±5) °С и оттаивания при температуре (37±1) °С. Степень полного разрушения клеток контролировали с помощью светового микроскопа и высевов дезинтеграта на МПА. Посевы должны оставаться стерильными. В 1 см получаемого дезинтеграта содержалось 10-15 мг белка.

Полученные антигены (дезинтеграты) вводили кроликам подкожно в а нарастающих дозах: 0,5; 1,0; 2,0; 3,0; 5,0 см . Интервал между инъекциями составлял 4-6 суток. Через 7-9 суток после последнего введения антигена кроликов обескровливали и получали сыворотку.

С целью систематизации полученных данных полосы преципитации и соответствующие им антигены условно обозначали буквами А, Б, В, Г, Д, Е, Ж. В таблице 1 отражены результаты постановки РДП и иммуноэлектрофореза.

Из данных таблицы 1 видно, что в РДП микробные дезинтеграты формировали с сыворотками от 4-х до 6-ти полос. Наиболее точно это было установлено с помощью иммуноэлектрофореза, так как в нем разделение компонентов реакции происходит в зависимости от электрофоретической подвижности, а в РДП пассивно.

С помощью иммуноэлектрофореза было установлено, что все изученные сибиреязвенные штаммы различаются по антигенному составу, но обладают преципитиногенами Б, В, Д, Е, Ж. Антиген А содержат все штаммы, кроме 34?2. Антиген В штаммы СТИ-1, Шуя-15, 34?2 содержат в незначительном количестве. Антиген Г выявлен у штаммов СТИ-1 и 55-ВНИИВВиМ. У штамма 55-ВНИИВВиМ полоса преципитации Г формируется в реакции только с неразведённым дезинтегратом, т.е. антиген Г у штамма 55 содержится в незначительном количестве.