Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Молекулярно-иммунологическая характеристика антигенов бруцелл

МИНИСТЕРСТВ© СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ ОМСКОГО ГОСУДАРСТВЕННОГО АГРАРНОГО УНИВЕРСИТЕТА

УДК 619:579.841.93+636:612.017 На правах рукописи

БРОННИКОВ

Василий Сергеевич

МО Л ЕКУЛЯРНО-ИММУ НО ЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА АНТИГЕНОВ БРУЦЕЛЛ

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

од

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ОМСК 1996

Работа выполнена в лаборатории специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого скйта Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных.

Научные руководители - доктор ветеринарных наук .. ' ' . А-А-Ь^ицкий' )

~ •■ доктор биологически)« наук

Е.А.Арановская

Официальные оппоненты - доктор ветеринарных наук, ■ • - профессор В.ф.Мартынов

доктор ветеринарных наук С.К.Димов

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт (г.Казань)

Защита диссертации состоится "С0 ¡¿иЫ) 1996 г.

в чесов на заседании диссертационного совета

К.120.48.01 при Институте ветеринарной медицины Омского аграрного университета по адресу: 644007, г.Омск-7,

ул. ■ Октябрьская, 92.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института ветеринарной медицины Омского аграрного университета

Автореферат разослан "£¿¿^£-■£¿1 ' ¿996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук /¿/^С-^^у Б.М.Барабанов.

ч

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

По оценке' ФАО вОЗ (бруцеллез отнесен к числу наиболее опасных инфекционный заболеваний и в настоящее время Наибольшему риску заражения подвержены категории людей, контактирующие с сырыми продуктами животноводства и персонал, обслуживающий сельскохозяйственных животных. Лереболевание бруцеллезом сопровождается многообразием клинических признаков, длительными нарушениями физиологии и иммунного статуса организма.

Велик и экономический ущерб, причиняемый народному

хозяйству этим заболеванием. Основу потерь составляет

недополучение основной продукции — мяса, молока, резко

t

снижается выход приплода из—аа абортов, патоморфологических изменений в органах, связанных с воспроизводительной функцией. Снижается эффективность селекционной работы. Увеличиваются затраты на проведение санитарных и оранизационно—хозяйственных мероприятий .'

Живые противсбруцеллезные вакцины широко применяются ветеринарной практикой в ряде стран, в том числе в Рф. Они обеспечивают выполнение плана оздоровительно-профилактических мероприятий. фАО ВОЗ считает наиболее приемлемой из живых вакцину из штамма Бруцелла at"opTwc 19 как саму» стабильную и иммуногенную .Но ее свойство индуцировать длительное проявление серологических реакций затрудняет поствакцинальную дифференциальную диагностику бруцеллеза и оздоровление стад .

Работы по поиску новых живых вакцин затруднены, поскольку замыкаются на двух видах вакцин — из ^ - форм — агглютининогенных и из Я. - форм — слабоагглютининогенных с известными показателями по иммунитету и серопозитивности плюс- минус 1ОУ. в ту или иную сторону имея один и тот же экологический недостаток, связанный с сенсибилизацией и проявлением патоморфологических изменений в организме. На

современном этапе необходимы высркаиммуногенные экологически безопасные вакцины и эффективные схемы их применения , что возможно только с применением химически». вакцин. Увеличение

содержания в окружающей среде и продуктах питания таких иммунноактивных микроорганизмов , как.бруцеллы, повышает ряск возникновения аутоиммунных и аллергических заболеваний у животных и людей. Химические вакцины предпочтительнее, в там плане, что при использаании «иных иммунитет нестерилен в начальной стадии иммунного процесса, а сенсибилизирующая активность химической вакцины е 2-12.раз ниже, чем живой или отсутствует .

На перспективность поиска указывает наличие надежных химических вакцин при других Инфекций», а также возможность повышения и коррекции иммуного ответа с помощью широкого спектра иммуномодулирующих веществ.

Широкое распространение бруцеллеза, его социальная опасность и значительный экономический ущерб, наносимый им, указывают на актуальность изучения Солее эффективных методов профилактики этого заболевания. Исследование антигенной структуры бруцелл, поиск антигенных комплексов, прйгОдных для Создания высокоэффективных средств специфической профилактики - одно из приоритетных направлений ликвидации заболевания, по заключению экспертной комиссии фАО ВОЭ .

ЦЕЛЬ »1 ЗйДйЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Детальное изучение антигенов, определение возможности * создания химической вакцины для профилактики бруцеллеза у крупного рогатого скота на их основе составляет цель настоящего исследования.

В задачи входило «

■ — получение различных антигенных фракций бруцелл ;

— физико-химическое, иМмунна-химическое, иммунно— биологическое изучение иммунологически активных антигенов 5

— повышение естественной иммуногениости этих антигенов с помощью существующих ьрйДств и Методов;

— сравнение иммуногецнасти полученных препаратов между собой и с эталонной вакциной из штамма 19 при применении на крупном рогатом скоте.

НЙУЧЙАЯ НОВИЗНА

Определены химические, иммукнохимические особенности антигенных комплексов бруцблл, различающихся по иммуннобио-

логическом активности.

Изучены особенности проявления протективного эффекта на разным видак лабораторных и крупный животных при применении иммуногенов различного состава.

Испытана на крупном рогатом скоте мимическая противобру-целлвзнаа вакцина, применявшаяся при иммунизации людей.

Сконструирован иммунагенный комплекс, позволяющий создавать защиту от заражения выше уровня вакцины из штамма 19.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

Результаты проведенных исследований дополняют новыми научными данными сведений о возможности создания мимическим прртивобруцеллезных вакцин, вносят определенный в»: -ад в изучение антигенные комплексов бруцалл и решение проблемы оптимизации системы специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота .

Составлены методические рекомендации по испытанию в производственных условиях химической вакцины против бруцеллеза крупного рогатого скота. Они утвеждены ГУВ ГК СССР па продовольствию и закупкам.

Составлена НТД (заявка на разработку, техническое задание) на опытную партию химической противобруцеллезной вакцины.

Наработаны и испытаны лабораторные серии вакцин в количестве 20 тыс. доз для крупного рогатого скота.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы по теме диссертации представлены на конференциях ВНИИБТЖ 1986, 1987 гг.; ОГБИ - 1987, 1933, 1990 гг.; ИЭВСиДБ-1987,1988,1995 гг.}СиЙНИИСХоза - 1929 г.IАМН СССР, ВАСХНИЛ, РАСХН-1939,1991 гг.; координационном совещании по туберкулезу и бруцеллезу/ ВНИИБ7*.- ОМСК, 1793-1 заседаниям Ученый Советов ВНИИБТК 1987-1994 гг.

Номер госрегистрации ....... .

ПУБЛИКАЦИИ.

По материалам диссертации опубликовано 16 научных статеГ. НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ I

— результаты физико-химического, иммуннохимического, иммуннобиологического исследования антигенов бруцелл:

- оптимальный вариант химической противобруцвллезний

вакцины для иммунизации крупного рогатого скота.

ОБЬЕП И СТРУКТУРА РАБОТЫ.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы,собственных исследований, обсуждения полученным результатов,выводов, практических предложений, Списка использованной литературы <всего 667 источников, в том числе 2BI иностранных) и приложения.

Работа изложена на 165 страницах машинописного текста и имеет 34 таблицы, 7 рисунков.

3.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

3.1.МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Выращивали бакмасеу и проводил)-! бактериологические исследования на обычных производственны» питательных средах — МППГГА, МППГГБ и эритрит-агаре.

Иммунобиологическое воздействие антигенных комплексов бруцелл изучали на 394 морских свинках, ,214 белых мышах, 39 кроликах, 426 крысах линии " 'Ш Й - Vio <• и крупном рогатом скоте.

Содержание белка в антигенных препаратах определяли по методу полисахаридов ho ^ЧО.

Спектрофотометрия использовалась для анализа состава антигенных комплексов бруцелл. Анализ в ультрафиолетовой ( 200 - 400 нм ) и ближней инфракрасной <760 - 1100 нм ) областях спектра проводили На спектрофотометре Сф - 4А, а поглощение в инфакрасной области спектра ! 760 - 1 мм ) на спектрофотометре tt — 20.

Серологические исследования (реакция агглютинации, связывания комплемента, непрямой и пассивной гемагглютинации, кольцепреципитации, Кумбса, Роз-Бенгал проба) проводили по общепринятым методикам с использованием стандартных антигенов.

Иммунодиффузию в геле Для определения концентрации специфических серологически активных антигенов, в комплексе . выделенных биополимеров, Проводили с целью титрации их для дальнейших мммунохимических исследований и оценивали по

• выраженности полос преципитации в агаровом геле или агарозе, содержащих противобруцеллезные антитела.

Иммуноэлектрарез проводили в агаровом геле, содержащем 1,5% агара, при рН 3,6, наслоенном (2,5мм) на стекле.

Гиперчувствительность замедленного типа (ГЧЗТ1 учитывали по выраженности' реакции на Бнутрикожное введение в области шеи коммерческого бруцеллина ВИЭВ в дозв 0,1мл вакцинированным животным и учете реакции через 24-43-72 часа, а также в тесте отека лап у мышей при сенсибилизации их 100мг атигена и разрешаюей дозе 10 мкг антигена, вводимого на 14-21 сутки сенсибилизации. Учет этрй реакции производился с помощью микрометра, которым через 24 часа после введения тест-системы вычисляли величину отека.

Пратективный эффект определяли путем заражения через один — три месяца после вакцинации иммунизированные животных введением 4 — 10 инфицирующих доз (ИД) двум— суточной вирулентной культуры.

Культуру вводили подкожно (лабораторные животные) или на коньмиктиву (крупный рогатый скот).

3.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

3.2.1.АНАЛИЗ ХИМИЧЕСКОГО И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА АНТИГЕНОВ БРУЦЕЛЛ.

Для химического анализа были вг«яты образцы антигенов с предварительно определенной иммуна-бйологичеекой активностью. Необходимо была выяснить, на чем основано резкое отличие действия 1-ой, 2-ой и 3-ей модификации Р-вариантов бруцеллезных антигенов.

Определялись особенности химической структуры разнотипных антигенов бруцелл (Р, ГП, БПА) , за счет каких биополимеров реализуется их протективная активность, , способность инициировать иммунологические реакции в организме.

Химическим анализом установлено (табл.1), что наиболее иммуногенная модификация РЗ, представленная в ряду нерастворимых антигенов комплексом РЗнр, в растворимых — РЗр, характеризуется повышенным содержанием белка и сумк рных Сахаров. Это указывает на щадяший режим данной методи! 1

получения антигена и на пониженное содержание балластный веществ в данных комплексах. Ewe большее содержание Сахаров в БПА с несколько сниженным содержанием остальных компонентов.

Этим, вероятно, обьвсниетея высокий уровень иммуногенности данного вакцинирующего комплекса, который сравйим с протективным эффектом коммерческой противобруцеллезной вакцины, так как, по мнению многих авторов, натнвные полисахариды микробной клетки « помимо антигенности, обладают иммуностимулирующей активностью.

ТАБЛИЦА 1..

ХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АНТИГЕННЫХ КОМПЛЕКСОВ БРУЦЕЛЛ АНТИГЕН!СУММАРНЫЕ САХАРАУ. s БЕЛОКУ. ! ФОСФОЛИПИДЫХ ММОЛЬ/МГхЮ-З

Р1нр 3,74 28,0 19,4 0,256

Р2нр 2,5 34,3 не анализировалось

РЗнр 6,25 36,В 23,1 0,304

Pip 2,93 9,93 10,46 0,138

Р2р 4,11 15,7 не анализировалось

РЗр 19,6 36,5 '30,14 0,396

ГП 21,7 10,3 72,0 0,530

БПА 57,6 22,1 26,9 0,354

Гликолротеидная фракция <ГП) содержит большое количество углевбдных компонентов, уступая по этому показателю только БПА, но значительна меньше белка, по ■ сравнении с высакоиммунными препаратами.

Таким образом, выявлено более высокое содержание белков, Сахаров и фосфолипидов в изучаемых РЗ-антигенных комплексах бруцелл, по сравнению с Р1 й Р2 - комлексами. Содержание Сахаров выше всего в БПА — антигене, а фосфолипидов в гликопротеидной фракции бруцелл.

СПЕКТГОФОТОМЕТРИЯ АНТИГЕНОВ При помощи спектрофотометриИ в ультрафиолетовой части спектра первоначально было установлено отсутствие нуклеиновых кислот в ГП, Рр и БПА-фракцимх бруцелл, . так как поглощение при длине полны 260нм незначительно. При длине волны 2В0нм

поглощение ГП достигало высокого уровня, что

свидетельствовало ой "насыщенности данного антигена аминокислотами, то есть высоком содержании пептидов. В дальнейшем данное исследование проводили для предварительной оценки концентрации белка в анализируемых фракциях с целью оптимизации условий проведения последующего анализа антигенов.

В последнее время широко применяется исследование инфракрасных спектроз поглощения смесей веществ с целью определения составляющих смеси и расшифровки их структуры. Исследовались спектры инфракрасного поглощения шести образцов антигенных комплексов йруцелл. Анализ проводился "вслепую" для получения объективных результатов. Полученные в эксперименте данные отражены в таблице 2.

ТАБЛИЦА 2

РЕЗУЛЬТАТЫ ИК-СПЕКТРОфОТОМЕТРИИ ОБРАЗЦОВ АНТИГЕНОВ

НОМЕР ОБРАЗЦА АНТИГЕННОГО КОМПЛЕКСА :ИНТЕРПРЕТАЦИЯ

15 : 16 17 : 13 : 19 20 : ПОГЛОЩЕНИЯ

1 о 3 4 5 6 7

; ! 520с. : ! ( CCC )

: ! 540с. : i ! CCH >

550сл: : 560г. s 550сл.: 560cp.г ( CH 2 )

¿20сл: £>20о. сл: 620сл.s 620ср.: : 620cp.:

720сл: : 770сл.: : < C-H )

ЗЗОсл: ! ЗЗОср.s :

870СЛ! : 370с. ; ;

: 900сл. : : t 900сл.: ( C-C )

930сл: : 930сл.: 930сл.t 1 CH 2 )

9£0слг 960сл. : : 950ср.■ - : •

! 9а0сл.; 990ср.t 930cp.s 990cp.t < C-H- )

1040ос: ЮЗОср. s 1040ср: : J040cp: ЮЗОос: ( C-P-C )

ЮЗОос: loaocp s 1030с.з 1070ocs 1030c,: ЮЗОос:

1130cps 1120ср.: 1130с.! 1120с.i 1120c.s 1120c.! 1 CH 2 »

ИбОср: 1160сл.s : i140cps : 1140c.s < CH 2 ),

! ! ! : 1300СЛЗ 1300слз ( СН 2 >

1320сл: : г 1350слз I г С С-Н- >

13В0слг 1390ср.з : 1390слз « 5 < СН 2 >

1410СЛ! 1400ср.з 1400ср: * 1400ср! 1400срз

: 1450сл г1400ослз14Э0ослз 1460слз 1460слз ( СН 3 )

1470СЛ! 1470сл.: 1470ел> 1470СЛ! 1470слз 1470слз

г 1500сл.з : 1500слз 1500слз 1500сл« < /И -Н )

> 1520ср.: 1520СЛ! 1520слз 1520срз 1520слз

1540слз 1540с. з 1540срз 1540ерг 1Б40ср| 1540срз

1550ср: 1550с. ! 1550ср8 1350срз 1550ср>.1Й50ср> < С=0 )

1660с.: 1660с. ! 1660с.! 1660с.I 1660с.: 1660с.!

1740ср: I I : 8 : (/У-Н 2| С-Ь >

2В60с.« 2Э50ср.з 2В60слз 2В60сл! 2Е60слз 2860сл> ( С-Н > гааосл: з : 1 «■•>'-

2930с.8 2930с. ! 2930ср« 2930с.> 2930с.I 2930с.« ( С-Н )

2960ср: 2960ср.з 2960сл» 2960ср! 2960ср» 29Ь0срз < С-Н )

г : з ЗЮОслз ¿100слз З100слз(/У-Н ; Ь-Н )

г < з 3150СЛ! I 1

з ЗЗООсл.:. х 3400СЛ» ЗЗООсл» з

3400с.! 3450с. з 3450с.з 3450осз 3450с.з 3450осз

ПРИМЕЧАНИЕ* сл.- слабая интенсивность поглощения} ср.-средняя; е.— сильная; ос.— очень сильная} осл.- очень слабая.

ОБРАЗЕЦ 15 (ЛПС) представляет ейвой липополисанаридный комлекс с присутствием небольшого количества белков. О большом содержании липидов свидетельствует как характерная, довольно интенсивная полоса поглощения с максимумом около 1750 см-1, так и интенсивные полосы соответствующие валентным колебаниям связей С-Н в интервале волновых чисел 2000-3000 см-1. Полисахариды проявляют себя в спектре в виде очень интенсивного поглощения около 1000—1150 см—1, где регистрируются различные деформационные колебания групп СН; СН2. В поглощение на участке 1600-1700 см-1 дают вклад. Как полисахариды, так липиды и белки. О присутствии белков можно судить по наличию группы полос с ЬбщиМ максимумом около 1560 см-1 (АМИД 2). Во всех спектрах исследованных образцов

присутствует очень широкая интенсивная полоса, которая связывается с колебаниями i N-Н),<0-Н). Максимум ее в спектре образца 15 расположен около 3400 см-1. Остальные полосы поглощения в спектре этого обааца являются менее характерными.

ОБРАЗЕЦ 16 <РЗнр) представляет собой, вероятно, комплекс различных белков. В спектре образца нет характерного для липидов поглощения около 1750 см-1. Значительно слабее полосы поглощения (С-Н) в интервале волновых чисел 2300-3000 см-1. Поглощение на участке спектра от 1000 до 1150 см-1 может быть связано с наличием полисахаридов и белков.Но в спектрах полисахаридов это поглощение в отличие от белкоа очень интенсивное. В данном случае группу полос в интервале 1000— 1500 см—1 следует приписать главным образом белкам. Впрочем, исходя из анализа спектра, не исключается присутствие полис ах аридов.

ОБРАЗЕЦ 17 (РЗр) - .белково-полисахарйдный комплекс. Спектр довольно слабый, но в нем можно выделить полосы, характерные ,как для белков - 1600-1700 см-1 (АМИД 1), 1500-16Ö0 см-1 (АИИД 2> , 1240 см-1 (АМИД 3), так и для полисахаридов — интенсивное поглощение в интервале 1000-}150 см-1 и 1600-1700 см-1. Появляется новый по сравнению со спектрами предыдущих образцов интенсивный пик поглощения около 1130 см-1.

DEPA3EH 18 (ГП) - спектр его отличается от спектров предыдущих образцов. В низкочастотной области вместо широкой, слаборазмытой полосы с общим максимумом около 550 см-1 наблюдаются более резкие перекрывающиеся полосы в виде одной сильной с максимумами S20, 540, 560 см-1 и средней интенсивности полосы с максимумом 620 см—1. Появились полосы средней интенсивности окало 330, 870, 950, 990 см-1. Полосы, характерные для белков наблюдаются такими же, как и в спектре образца 17. Вероятно, образец 18 - белково-углеводный комплекс с иной природой , углеводного компонента, чем в предыдущих образцах.

ОБРАЗЕЦ 19- (ГПн) - бЕЛково-полисахэридный комплекс. Отличается от> предыдущего образца большим содержанием

полисахаридов.

ОБРАЗЕЦ 20 (БПА) - белково-полисахэридный комплекс с преимущественным содержанием полисахаридов. Самая интенсивная группа полос в спектре находится в области различных деформ-щионных колебаний связей (С-Н) 1000-1150 см—1. Довольно интенсивное поглощение, связанное с колебаниями баз (СНЗ) около 1400 см-1. В интервале 1600-1700 см-1 в поглощение дают вклад , как белки, так и полисахаридные компоненты, причем, последние — в большей мере , если судить по болшой разнице интёнсивйостей групп полос в интервалах 1500-1600 и 1600-1700 см-1.

Таким образом, проанализировано строение антигенов и обнаружено отличие от остальных, Ямаполммеров входящих.в ГП и ГПн-комплексы, а также более высокое содержание полисахаридов, в ГПн—Фракции бруцелл и незначительное их наличие в нерастворимой Р-фракии микробной клетки.

ЭЛЕКТРОФОРЕЗ АНТИГЕНОВ Электрофорвтическая подвижность в нативном состоянии у антигенов ГП и Р-комплексов отсутствовала, что указывает на комплексоойразование субьединиц этих препаратов. Причем комплексы, образуемые низкомолекулярными гликопротеидами, нестойкие и полностью распадались.-на составляющие при воздействии 0,54 додецилсульфата натрия . При хранении гликопротеидов в неконцентрированных растворах стабильное комплексообразование не наблюдалось. Более стойкик-и к дезинтеграции оказались Р-антигенные комплексы. Они разрушались' лишь при значительном ¿оздейстойи химических, . Физических или механических.факторов.

С помощью электрофореза в ПААГ, определены молекулярные массы антигенов. БПА й растворимые Р—антигены бруцелл состоят в основном из биополимеров, . молекулярная масса которых укладывается в интервал 30-40 кД. У гликопротеидов этот показатель значительно ниже — около 10 килодаль гон.

3.2.РЕЗУЛЬТАТЫ ИММУН0ХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА РЕАКЦИЙ АГГЛЮТИНАЦИИ Реакция агглютинации (РА).после применения разнотипных антигенов бруцелл представлена на рйс'. 1 «средние значения по результатам нескольких опь гов).

Наиболее выражена эта реакция у морсчих свинок. Они сильно реагируют, как на введение гликопротеидов бруцел/) (ГП), так и на белково-полисахаридный антиген (БПА). Высота титров сопоставима с реагированием на живую высокоагглютини-ногеннуга вакцину. Дажй слабоаглютининогенный комплекс РЗнр, где антигенные детерминанты видоизменены, вызывает

значительный ответ у морских свинок, хотя и в 2 раза меньший, чем при использовании высокоактивных антигенов. ТИТР ! - 100

- во х X

п х X

- 60 ;< ^ я #

X к X #

- 40 Я !< ;; К X # й X я

Й X X » X II Й X *

- 20 Я X н К :< » н «

V

ГП РЗнр БПА шт 19

.РИС.1.ВЫСОТА ТИТРОВ В РА У РАЗНЫХ ВИДОВ ЖИВОТНЫХ. ИММУНИЗИРОВАННЫХ АНТИГЕЙАМИ БРУЦЕЛЛ Я — крысы 5 X - морские свинки ; в — крупный рогатый скот

■Рысота титров и количество реаггирутощих животных при изучении действия антигенов на линейных крыс в два раза меньше,чем у морских свинок.' Причем, если ответ крыс на введение ГП, , БПА и шт. 19 достоверно Отличается .друг от друга, реакция на нераЬтвОримый комплекс РЗнр тзкжй в 2 раза нм*е,

У крупного рогатого скота картина неснопн' иная. Наиболее реактогенной оказалась живая вакцина из шт.19, хотя проявление РА не- превысило уровня реагирования - морских спинок, но значительно выше, чей у крыс. Ответ на введение БПА у крупного рогатого скота равен реагированию крыс по высоте титров. При введений ГП у крупного рогатЬго скот* вырабатывается йгглтотининов меньше, чем у крыс в два раза, чем у свинок в 4 раза. Использование РЗнр у этих животных не

выявляет агглютинины в диагностически значимы« титрах.

Посла заражения животных, предварительно иммунизированных разнотипными антигенами, наблюдается нарастание выработки агглютининов в короткие сроки. Причем у животных, устойчивых к заболеванию, в результате освобождения от бруцелл, титры агглютининов снижаются. У заразившихся продолжают нарастать и сохраняются на высоком уровне длительное время. Поэтому по наличию реакций и их степени через Месяц после заражения можно судить об эффективности применяемым антигенов.

Введение любых антигенов животным, предварительно имму минированным высокоагглютининогенными противобруцеллезными вакцинами, провоцирует выработку высокого уровня агглютинирующих антител на'длительное время.

У морских свинок иммунизированных слабоаглютининогенной вакциной ио штамма 82 последующее введение гликопротеидов бруцелл не индуцировало диагностически значимого уровня агглютининов, на ревакцинация БПА стимулировала длительные реакции е высоких титрам. 'Крупный рогатый скот неоднократно иммунизированный слабоагглютининогенно^ вакциной из штамма 62 при применении бруцеллезных антигенов Р-типа проявляет значительно меньшую агглютининогенность, ' по сравнению . с животными ревакцинированными той же вакциной. Так, через три месяца после ревакцинации, агглютинины выявлялись у 16У. коров с Р-антигеном примененным для реиммунизации, причем их титр не превышал 50 МЕ, а после использования штамма 82 реагировало 10'/ Животных на 50 НЕ и В'/. 100 МЕ и выше. К 10. ти месяцам агглютинины у животных первой группы не выявлялись вообще, е то время как среди иммунизированных живой вакциной определялись в диагностически значимых титрах у 6Х коров. Это указывает на облегчение и ускорение дифференциально-диагностически х мероприятий при применении в качестве вакцины антигенов Р-типа^

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА.

Специфическая активность системы комплемента (рис.2) при использовании разнотипных антигенов бруцелл у разных видов кивотных подобна структуре выявления агглютининов. Так и в

этом случае высокоотвечаннцими ралаются морские Применение ГП, БПА и штамма 19 у ник стимулирует связывания комплемента (РСК) в равнозначно высоким

Использование реактивность.

Р-антигена

показало

два раза

свинки, реакцию титрам, меньшую

ТИТР

100-: : X X X X X X

90—1 X X X >: X

80-: э X X X X # « X X

70 : X .4 X У. # # X X

60-5 Я X X й X » й X #

г Н >: X н я » и X в

50-1 Н X X « X к X #

й и X Н X и X #

40-: а X * . Й X Я х « « X

ч X Я и Н X # Н X #

30-: я X » Н X и X « а X #

й X « н X н X й X «

20-: я X » Й X а X н X #

д X н X « а X « й X «

10-: н X « й X и X » к X #

ГП РЗнр БПА шт. 19

РИС. 2.ПОКАЗАНИЯ РСК ПРИ ИММУНИЗАЦИИ РАЗНОТИПНЫМИ АНТИГЕНАМИ БРУЦЕЛЛ

ВИД ЖИВОТНЫХ: Я - КРЬ'П-': х - МОРСКИЕ СВИНКИ;

« - КРУПНЫЙ РОГАТЫЙ СКОТ.

Уровень реагирования крыс . значительно ниже . Даже введение высокоактивным антигенов не превысило (¿^активность морских свинок на Р—антиген. А реакции возникающие на Р— антиген у крыс ниже в 1,5 раза , чем на ГП и БПА.

Система комплемента у крупного рогатого скота реагирует иначе, чем у крыс и морских свинок» Она отличается при

в

- Ib -

использовании всвк исследуемых антигенов. В отличив от РА наибольший ответ вызывает введение БПА, живая вакцина стимулирует несколько меньшую реактивность. Использование ГП индуцирует производство комплементсеязывамщих антител в два pasa меньше, чем применение БПА. Самыми низкоактивными антигенами оказались биополимеры Р-типа. Уровень антител от •этого антигвна в 2, 3, 4 - раза меньше, чем при использовании ГП, шт. 19 vi БПА, соответственно.

Способы и приемы, обуславливающие снижение или повышение уровня агглютининов, аналогичным образом изменяют наличие компементсвязывакнцих антител. Особенностью этой реакции при бруцеллезе как на введение живой вакцины, так и антигенных комплексов различной природы, является более позднее возникновение диагностически-значимых титров антител на 714—ый день и медленное угасание их продукции.

У коров, неоднократно иммунизированных вакциной из штамма 82, использование Р-антигенов вывывает более низкую реактивность, по сравнению с ревакцинацией штаммом 82: Так через три месяца на Р—антиген реагирует в РСК 4% животных, а на штамм 02 — 13/Í. Через 10. месяцев реакция исчезает у

всех животных. При использовании Р—антигенов в качестве иммуногена РСК можно проводить гораздо раньше, чем при применении живой вакцины.

3.4.ПРОТЕКТИВНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ АНТИГЕННЫХ КОМПЛЕКСОВ БРУЦЕЛЛ.

На начальных этапах работу акцентировали на изучении молекулярной структуры антигенов, определении функциональной активности отдельных биополимеров- Изучении их роли в процессе паразитирования и механизму развития иммунитета. В дальнейшем, вследствие создаваемых рыночных отношений в науке, работа была переориентирована на прикладное значение, на поиск путей создания высокоиммуногенных препаратов для практического внедрения.

Использование разных тидов и штаммов бруцелл для получения Р-антигенов (табл.3) стимулировало . разную эффективность специфической резистентности. Нерастворимые Р-антигены из штаммов 19, 54, 99 создавали наибольшую зашит у. от заражения еирулен-ными штаммами разных -идов бруцелл. При

сроке испытания один месяц их применении ¡защищает 100Х животных,.а при трех месячном промежутке между иммунизацией и проверкой 60-80"/.. Иммуногвнность растворимой фракции ниже, 67 и 25X соответственно, через один и три месяца при заражении

Р—антиген, полученный из бруцелл этого вида, защищает только полоеийу животных от 10 ИД (инфицирующих доз), еще меньшую эффективность дало .применение Р-антигена из инагглютининогенного штамма 16/4 — не заразилась только треть животных. в

ТАБЛИЦА 3

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ РАЗЛИЧНЫХ ШТАМПОВ БРУЦЕЛЛ.ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ХИМИЧЕСКИХ ПРОТИВОБРУЦЕЛЛЕЗНЫК ВАКЦИН И ЗАРАЖЕНИЯ

пп!Кол-!Вацинирующий1ИсХодный во з комплекс s штамм

Заражающий!Срок проверки!Доля

штамм : иммунитета sиммунных,%

1 3 6 : Р6 а. 99 В. м. 565 3 1 мес. : 66,7

2 i 6 3 Р6 :В. а. 99 В. м. 565 : 3 мес. 3 25,0

3 ! 6 .- С1 s В. а. 99 В. м.565 : 1 мес. . : 100,0

4 s 6 : С1 : В. а. 99 В. м. 565 : 3 мес - : 30,0

5 ! 6 .: С2 : В. а. 99 В. м.565 3 1 мес. г 100,0

6 3 6 : С2 :В. а. 99 В. м. 565 : 3 мес. 3 60,0

7 ! 6 : А зВ. а.99 в. м.565 •- 1 мес. 3 33,3

a s 5 з С * В. а. 19 В. а. 54 : 1 мес. 3 100,0

9 : 5 : С—54 зВ. а. 54 в. а.54 : 1 мес. 3 100,0

10: 5 : С-16 :Ь. а.16/4 в. а. 54 : 1 мес. : 33,0

11: 3 • С— зВ. м. 563 в. а.54 з 1 мес. . : 50,0

12: 5 з С :В. а. 19 в. а.54 3 3 мес. : 75,0

В настоящее время для создания иммуногеиов pre шире используются природные и синтетические имчу! -имодуляторы. Р—антигенные комплексы нельзя назвать нативнмми, так как при

их получении наряду с процессами инактивации и дезинтеграции

i

происходит одновременно камплексообразование с

иммуноактивиы^и поликатионами. Данные препараты представляют собой уже готовую химическую вакцину. Это утверждение в большей мере относится к нерастворимым Фракциям, так как по результатам иммуноэлектрофорезй растворимых фракций'

присутствия в ник поликатионов установить не удалось.

Проводили раздельную титрацию иымуномодуляторов составляющим комплекс с большей дозой ГП. Титрация низкомолекулярного поликатиона П6 показала эфектнвность его применения в интервале доз от 2 мг до 32 мкг, на морскую свинку. Нерастворимый макроглобулярный поликатион показал «Уровень активности независящий от титраЦии, что указывает на необходимость его изучения в более широком интервале доз. Иммуномодулятор природного происхождений — ЕК, в дозе 3 мг . внутрикожно, создавал иммунодеЪрессиеное состояние за счет перераздражени» иммуной системы. Но снижение дозы до одного миллиграмма индуцировало стимулирующий эффект. Более низкие дозы также оказывают иммуностимулирующее действие на морских свинок, вплоть до ЗЬ мкг на голову. Дальнейшее снижение содержания инмуномпдулятора, при равном наличии антигена бруцелл, не стимулирует достаточной защиты от заражения.

Выявлено отличие иммуномодулирукэдего действия препаратов в зависимости от вида иммунизируемых животных.

Гликопротеиды, не освобожденные от диализуемых фракций, позволили бащитить всех опытных животных, что подчеркивает мммунозначимости нпзкомолекулирных соединений. Причем проявилась серилогическая активность при вакцинации, отсутствующая у очищенных структур. Это дает основание предположить о создании, при растворении недиализованного комплекса антигенов, макроеезикул на основе фосфо 1Ипндного компонента, определенного химическим анализом данной фракции.

При . создании химической противобруцеллезной вакцины использовали методики получения антигенов, дающие наиболее нммуногенные комплексы. Так гликопротеиды выделяли из жибыи бруцелл в щадящих условиях, когда микроорганизмы остаются жизнеспособными не менеее суток. Полученные ГП-онтигень! не очищали от ниэкомолекулярных примесей. СПА применяли наиболее иммуногенных серий, причем для создания бруцеллезной химической вакцины (БХВ), БПА подвергали гамма-облучению. Это, согласно предыдущим исследованиям, снижает токсичность и значительно повышает' иммуногенность препарата. Р-аити, !.иы выделяли при низких значениях рН.

Установлено, что наибольшую эффективность от заражения

имеет ревакцинация нерастворимой Р—вакциной по Фону, созданному живой вакциной йз штамма 19. Однако такая схема будет неприемлема для практики, вследствие высоких серологических реакций провоцируемых введением даже слабоаглютинииногенной мимической вакцины на этом йммуном Фоне,

Использование БПА по фону слабоагглютининогенной вакцины из штамма 32, хотя и стимулировало достаточно надежную специфическую защиту, но, по-видимому, не найдет в подобном виде практического применения также из-за провокации длительно проявляющихся серологических реакций.

Гликопротеиды, полученные из высокозгглгатининогениого штамма, при применении по Фону елабоагглютининогенной вакцины из штамма 82, йо провоцировали, диагностически значимых серологических реакций. Животные, Вакцинированные по этой схеме, устойчивы к воздействию вирулентной культуры. Данная Схема наиболее приемлема для использования -химической вакцины в практике, так как не осложнит поствакцинальную диагностику у крупного рогатого скота. Гликопротеидный комплекс с поливинилпир; олидоном создавал более высокую защиту от заражения у крупного рогатого скота, чем живая вакцина . из штамма 19, применявшаяся для контроля.

ВЫВОДЫ.

1.Высокая доля нативных, неразрушенные биополимеров бру— целл соответствует высокой иммуногеннЬсти антигенного комплекса.

2.Стереохимическая блокировка антигенных детерминант в Р-вакцимо высокомолекулярным полиэлектролитом не отменяет их иммунобиологической активности,а лишь способствует уменьшению серологических реакций,

3.Гликопротеиды бруцелл,неочищенные от ни?>-п><"-- /лярных полисахаридов и фосфолипидов, имеют еысокую иммуногенность без иммуномодулирующих средств, по мере очистки активность их снижается.

4.Бруцеллы содержат функциональные серологически неактивные биополимеры - растворимая Р-фракция,способные обеспечивать защиту от заражения. .

5-Коньюгации с полиэлектролитом p©3KQ повышает иммуноген— ность антигенов бруцелл, причем наиболее эффективны высокомолекулярные поликатноны.

¿.При выделении антигенных комплексов из вирулентных штаммов получаются более иммуногенныв вакцины на ии основе.

7.Способ инактивации микроорганизма влияет на иммуноген— ность получаемых антигенных комплексов, наиболее приемлемо совмещение процессов инактивации, дезинтеграции и комплекса-образования с иммуностимуляторами.

а.Лилосемы определенного состава повыше»т иммуногенность заключенных в них антигенов и снижают серопозитивность.

9.Химические противобруцеллеаныв вакцины способны индуцировать достаточно непременный и полноценный иммунитет к оаболеваниЮ| превышающий, в некоторых случаях, уровень живых вакцин,

10.Подсирая схему применения разнотипных химических вакцин, можно значительна повысить их иммуногенность.

11.Лиофилизация обеспечивает длительное сохранение спе-. цифической активности вакцинирующих комплексов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Социальная. и экологическая безопасность химических противрбруцеллезнык Вакцин, их высокая протективная активность, упрощение дпфферениальмой диагностики и возможность проведений ее в короткие после иммунизаии сроки свидетельствуют о их перспективности и позволяют. нам рекомендовать данные вакцины для широкого изучения в качестве седств специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота.

"Рекомендации по проведению производственного испытания химической противобруцеллеоной вакцины." утверждены ГУВ ГК по продовольствию и закупкам СМ СССР 17 июля 1990 г.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1.Бронников в.С. Сравнительная оценка антигенных комплексов бруцелл.// Бруцеллез сельскохозяйственных животных: Сб. науч. Тр, /РАСХНИЯ, ВН1.ИБТЖ. - Омск, 1909.- С 12-16.

2.Красиков А.П.,Бронников B.C. Влияние иммунорегуляторов на иммуногенность противойруцеллезных препаратов// Там же. С.73-78.

3.Новицкий A.n., Рронмиков B.C., Петрова М.И. Изыскание новый средств специфической профилактики бруцеллеза»// Роль науки в интенсификации сельского хЬяяйства: Материалы комф. /ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние. СибНИИСХ.- Новосибирск, 1990.- ч.З.-C.67-6S.

4.Новицкий A.A., Бронников B.C. Возможность создания противобруцеллезного иммунитета мимически модифицированной вакциной.// Актуальньш вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным* Материалы всесоюзной конф. /АМН СССР. ВАСХНИЛ.- Москва, 1989,- С.199-200.

З.Бронииков B.C., Петрова М.И. Испытание химически модифицированных вакцин против бруцеллеза в эксперименте на крупном рогатом скоте.// Пути совершенствования профилактики и диагностики бруцеллеза сельскохозяйственных живо+ных: Сб. Науч. тр. /ВАСКНИЛ. ВНИИБТЖ.- Омск, 1990.- С.62-67.

6.Бронников B.C. Зависимость иммуногенности антигенов от структуры липосом.// Тай же.— С. 68-71.

7.Бронников B.C.,Кассал Б.Ю. Совершенствование противо— бруцеллезные мероприятий в Томской области.// Эпизоотология, диагностика и про<! ллактика Туберкулеза и бруцеллеза '

. животных: Сб. науч. тр. /ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние. ИЭВСиДВ.-. Новосибирск, 1990.- С.89-95.

8.Бронников B.C., Попова Т.Г. Получение липосомной про— тивобруцеллезной вакцины.// Там «е.— С.104-107.

9.Бронников В.С., Новицкий A.A., Драновская Е.А.Иммуно— химическая характеристика антигенных комплексов бруцелл.// Методы профилактики и диагностики бруцеллеза сельскохозяйственны;: животных: Сб. науч. тр. /ВАСХНИЛ. ВНИИБТЖ.-Новосибирск, 1991,- С.46-50.

10.Бронников B.C., Ноницкий A.A., Дрзновская Е.А.Повышение иммуногенности i шактивированной npoTi tаеллезной вакцины.// Там же.-С.50-54.

11.Бронников B.C., Новицкий A.A. Изучение специфических и неспецифических иммуностимуляторов На разных видах животных при экспериментальном бруцеллеае.//Научное обеспечение мероприятий по профилактике и ликвидации туберкулеза и бруцеллеза сельскохозяйственных животных: Сб. науч. тр.

/РАСХН. Сив.отд-пие. ИЭВСиДВ.- Новосибирск, 1991.- С.94-98. ,

12.Бронников B.C., Маликов Б.Е., Новицкий A.A.,Дранов-скдя Е.А.- Сенсибилизация макроорганизмз химическими противо— бруцеллезными вакцинами-// Там же.— С;104—109.

13.Бронников B.C., Новицкий A.A. Использование химических вакцин для специфической профилактики бруцеллеза.// (Тезисы докладов 2>-ей Всесоюзной конференции по эпизоотологии.

/ВАСХНИЛ. РАСХН. ИЭВСиДВ.- Новосибирск, 1991.— С.165-166.

14.Бронников B.C., Новицкий A.A., Драноеская Е.А.Инфракрасные спектры антигенных комплексов бруцелл-// Современные методы борьбы с бруцеллезом и туберкулезом сельскохозяйственных животных: Сб. науч. тр. /РАСКН.Сиб.отд—ние. ВНИИБТЖ.— Новосибирск, 1992.- С.22-26.

15.Бронников B.C., Новицкий A.A., Циммерман В.А.Особенности иммунного ответа на введение противобруцеллеаных химических вакцин.// Там же.— С.27-33.

16.Бронников B.C., Новицкий A.A. Химические противобру-цвллезныв вакцины при экспериментальном бруцеллезе.// Основные научные исследовании по проблеме туберкулеза и бруцеллеза сельскохозяйственных животных, профилактика и ( организация мероприятий па ликвидации болезней а регионе Сибири./Тез.науч.-практ.конф.- Новосибирск,1995.- С. 99-100.