Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Методы индикации и идентификации бруцелл с учетом изменчивости возбудителя

На правах рукописи

БРАТЦЕВ Александр Юрьевич

МЕТОДЫ ИНДИКАЦИИ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БРУЦЕЛЛ С УЧЕТОМ ИЗМЕНЧИВОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ

16.00.03-ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Барнаул - 2003

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте бруцеллеза и туберкулеза животных СО РАСХН

Научный руководитель:

кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Гордиеико Любовь Николаевна

Научный консультант:

доктор ветеринарных наук, профессор Ощепков Владимир Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор ветеринарных наук Никифоров Иван Парфирьевич

кандидат ветеринарных наук Корж Галина Сергеевна

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт, г. Казань

*

Защита состоится 10 декабря 2003 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 220.002.02 в Институте ветеринарной медицины Алтайского государственного аграрного университета (656922, г. Барнаул, ул. Попова, 276, тел/факс 8 3482 31-34-21).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института ветеринарной медицины АГАУ:

Автореферат разослан «_»

2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

П.И. Барышников

2ооЗ - А

I 1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Бруцеллез животных до настоящего времени имеет широкое распространение во многих странах мира. Проблема бруцеллезной инфекции, наносящей большой экономический ущерб и имеющей социальное значение, весьма актуальна в связи с напряженной эпизоотической обстановкой в отдельных регионах страны.

При бруцеллезе успех ликвидации болезни и предупреждения распространения инфекции во многом зависит от своевременности и точности поставленного диагноза. Повышенную актуальность этой проблеме придает изменчивость возбудителя. Среди животных довольно часто циркулируют измененные формы возбудителя бруцеллеза.

По данным ВНИИБТЖ и ИЭВСиДВ (И.А. Косилов с соавт., 1976, 1992; В.Г. Ощенков с соавт., 1983, 1990; JI.H. Гордиенко с соавт., 1989, 2001), за последние десятилетия процентная доля измененных форм выросла с 12,9% до 70-80%, от общего количества бруцелл, выделенных от животных в стадах с естественным течением эпизоотии. У полевых L-вариантов отмечались существенные изменения основных биологических свойств, определяющих характер специфических взаимоотношений макро- и микроорганизмов: трансформация антигенной структуры в сторону S-SR-RS-R-RL-LR-Lh значительное понижение вирулентности.

Основываясь на опубликованных данных (П.А. Вершилова, 1972; П.А. Триленко, 1976; И.А. Бакулов, 1980; В.Г. Ощепков, 1983 и др.), можно полагать, что одной из причин длительного сохранения очагов бруцеллеза и возникновения случаев повторных эпизоотических вспышек этой инфекции являются глубоко измененные (L-) формы бруцелл, которые по своим биологическим свойствам существенно отличаются от типичных культур возбудителя и не выявляются имеющимися в настоящее время средствами диагностики.

Сложность диагностирования бруцеллеза вызываемого L-формами бруцелл с помощью традиционных бактериологических и иммунологических методов, в свою очередь, определяет актуальность разработки способов быстрой и четкой идентификации и дифференциации измененных форм бруцелл, доступных как для научно-исследовательских, так и для производственных ветеринарных лабораторий.

Цель и задачи исследования. Целью исследований является разработка нового метода индикации и идентификации L-форм бруцелл, а также изучение условий и закономерностей образования L-вариантов бруцелл 4-го биотипа В. suis (В. rangiferi) и изучение биологических свойств полученных L-форм.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить in vitro L-варианты бруцелл различного происхождения.

2. Выделить L-варианты бруцелл из организма основных хозяев (крупный рогатый скот, северные олени).

3. Изучить условия образования и биологические свойства, полученных L-форм бруцелл видов В. abortus и 4 биотип В. suis (В. rangiferi).

з

4. Получить стабильную L-форму бруцелл, пригодную для изготовления L-диагностикумов.

5. Разработать эффективный метод индикации и идентификации бруцелл с учетом изменчивости возбудителя.

Научная новизна. Подана заявка на изобретение «Способ получения диагностической L-сыворотки», уведомление о положительном результате' формальной экспертизы № 2003121773/13(023123) от 15.07.2003 г.

Получен стабильный Ь-вар^ант бруцелл, обладающий строгой специфичностью и широким диапазоном антигенной активности, пригодный для изготовления L-диагностикумов: L-антиген и L-антисыворотка.

Разработан, апробирован и предложен к применению метод "Комплексной идентификации L-форм бруцелл".

Изучены особенности L-трансформации и биологические свойства L-вариантов бруцелл 4-го биотипа В. suis (В. rangiferi), in vitro и выделенных из организма северных оленей. .

Практическая значимость. Разработаны методические рекомендации «Методы индикации и идентификации L-форм бруцелл», утверждены методической комиссией ВНИИБТЖ, протокол № 3 от 26.09.2003 г.

Предложенный метод комплексной идентификации L-форм бруцелл, позволяющий повысить достоверность лабораторной диагностики бруцеллеза, объективно оценивать эпизоотическое состояние по бруцеллезу стад и, следовательно, своевременно и обоснованно проводить противобруцеллезные мероприятия.

Полученные результаты исследований являются- новыми научными сведениями, которые необходимо учитывать при работе в научно-исследовательских ветеринарных учреждениях, занимающихся проблемами бруцеллеза животных, а также можно использовать в учебном процессе при подготовке ветеринарных специалистов.

Апробация полученных материалов. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на ученых советах ВНИИБТЖ, г. Омск, 1999,2000,2001,2002 гг.; на научных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов института ветеринарной медицины ОмГАУ, 2000, 2001 гг.; на конференции молодых ученых, ВНИИБТЖ, г. Омск, 2000 г.; на Всероссийской научной конференции по проблемам хронических инфекций, ВНИИБТЖ, г. Омск, 2001 г.; на научно-практической конференции факультета ветеринарной медицины НГАУ, г. Новосибирск, 2001 г.; на международном конгрессе по проблемам инфекционной патологии, г. Новосибирск, 2002 г.

Публикация материалов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей.

Внедрение результатов исследований. Результаты научных исследований вошли составной частью в методические рекомендации «Методы индикации и идентификации L-форм бруцелл», утверждены методической комиссией ВНИИБТЖ, протокол № 3 от 26.09.2003 г.

I а* лз^;.»« !

»WH -i • 4

-..» т *г

Получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы на изобретение « Способ получения диагностической L-сыворотки» (№2003121773/13(023123) от 15.07.2003 г.).

Основные теоретические положения и экспериментальные данные, изложенные в диссертационной работе, используются в научно-исследовательских лабораториях ИЭВСиДВ, ЯНИИСХ, НИИВВС, ИркНИВС, ВНИВИ, ВНИИБТЖ; в учебном процессе на кафедрах микробиологии и эпизоотологии ОмГАУ, НГАУ, АГАУ, КГАУ, ДонГАУ и ТСХА.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы, включающий 239 источника, в том числе 70 -иностранных и приложение.

Материалы диссертации иллюстрированы 34 таблицами, 15 рисунками, 2 диаграммами.

Основные положения, выносимые иа защиту;

1. Метод комплексной идентификации L-форм бруцелл, его разработка и апробация диагностической эффективности.

2. Получение стабильной L-формы бруцелл, пригодной для изготовления L-диагностикумов.

3. L-трансформация in vitro и in vivo бруцелл 4-го биотипа В. suis (В. rangiferi), и биологические свойства полученных L-вариантов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в лаборатории экологии и идентификации L-форм бактерий Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных (ВНИИБТЖ, г. Омск) СО РАСХН, в опытном хозяйстве ВНИИБТЖ и в хозяйствах Пуровское и Верхне-Пуровское Ямало-Ненецкого автономного округа в период 1999-2002 гг.

Для получения L-форм бруцелл in vitro были взяты полевой (4-й биотип В. suis - В. rangiferi 1-81), референтный (В. abortus 544) и вакцинный (В. abortusl9) штаммы.

Изучаемые L-варианты также были выделены из лимфатических узлов и внутренних органов коров, экспериментально зараженных вирулентным штаммом В. abortus 54 и из пантов, плодов, лимфатических узлов и органов северных оленей, находящихся в стадах с различной эпизоотической обстановкой.

В работе использовали жидкие, полужидкие и плотные питательные среды (Ml 11 Lb, Ml 11 LI 1 А), МППА с добавлением осмотических стабилизаторов (сахароза, сернокислая магнезия, хлорид натрия) и 20% нормальной лошадиной сыворотки. В -качестве индуцирующего фактора применяли натриевую соль бензилпенициллина, дозу и кратность которого устанавливали по методике ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (H.H. Островская с соавт., 1972), по данным В.Г. Ощепкова и

S

З.С. Калининой (1976, 1977), а также с учетом результатов собственных исследований.

Биологические свойства исходных бактериальных культур, полученных L-форм и культур-ревертангов изучали общепринятыми для бруцелл методами, рекомендованными Объединенным Комитетом экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу (6-й доклад, 1986 г.).

Изучение свойств бактериальных культур бруцелл, L-форм бруцелл различной этиологии и культур-ревертантов полученных от них проводили в сравнительном аспекте. Исследования проводили по следующей схеме: изучение морфологии и ультраструктуры, тинкториальных, культуральных, биохимических, (

агглютинабельных, антигенных и вирулентных свойств.

Морфологические свойства бруцелл изучали на препаратах окрашенных по методам Козловского и Грама. Культуральные свойства определяли по характеру роста микробов на МППБ и МППГГА. Электронно-микроскопические исследования проводили методом позитивного сканирования.

При изучении биохимических свойств учитывали способность бруцелл продуцировать сероводород, потребность в углекислом газе, чувствительность к анилиновым красителям, пробу с трипафлавином, реакцию термоагглютинации, каталазную активность.

Агглютинабельные свойства исходных культур, полученных L-вариантов и культур-ревертантов изучали в пластинчатой реакции агглютинации с использованием бруцеллезных сывороток.

В качестве диагностических бруцеллезных S- и R-анписыворогок использовали стандартные сыворотки из наборов.

Диагностическая L-бруцеллезная ..ангисыворотка была изготовлена из стабильной L-формы штамма В. abortus 19, полученного in vitro под действием пенициллина. L-культура состояла из клеток гигантской эллипсоидной формы длиной 5,0-6,0 мкм и шириной 2,0-3,0 мкм. У полученной L-формы были утеряны S- и отсутствовали R-антигенные детерминанты клеточной стенки, но при этом проявлял активность цитоплазматический L-антигенный комплекс.

L-сыворотку получали путем гипериммунизации кроликов. Для этого из двухсуточной агаровой L-культуры готовили взвесь, которую инактивировали теплом на водяной бане при температуре 85-90°С. Готовую взвесь вводили кроликам внутривенно трехкратно в дозах 60, 90, 120 млрд. м.к. с интервалом 72 часа. Забор крови с целью получения сыворотки производили на 4, 7, 14, 28 и 40 сутки.

Специфичность полученных L-сывороток определяли в пластинчатой РА. При постановке реакции использовали корпускулярные антигены приготовленные из культур бруцелл, йерсиний, ешерихий, стафилококков, стрептококков и клебсиелл собственного изготовления. Для определения активности L-сывороток, в пластинчатой РА, в качестве антигенов использовали L-варианты различных гетерологичных штаммов бруцелл.

При изучении вирулентных свойств исходных бактериальных культур бруцелл, полученных L-вариантов и культур-ревертантов морским свинкам вводили испытуемые культуры подкожно в паховую область в дозе 100 м.к. Через

б

30-35 суток животных подвергали диагностическому убою. При оценке вирулентности исследуемых культур бруцелл уяитьтали результаты бактериологических (индекс инфицированности) и гистологических (морфометрическая оценка) исследований.

В качестве биоматериала от лабораторных животных для бактериологического исследования использовали лимфатические узлы (паховый, заглоточный, , подчелюстной), селезенку, печень,- мочу, семенники, костный мозг. Для

гистологического исследования от опытных и контрольных животных отбирали регионарные (паховые) лимфатические узлы и паренхиматозные органы (печень, селезенка).

« Индекс инфицированности определяли по формуле: ИИ = А/В х 100%, где А-

количество выделенных культур бруцелл, В-количество исследованных объектов.

Индикацию и идентификацию L-форм бруцелл проводили с использованием метода последовательных пересевов на искусственных питательных средах, пассирования через организм лабораторных животных, с использованием L-диагностической сыворотки, а также разработанного нами метода комплексной идентификации L-форм бруцелл.

Многократные пересевы L-форм' на искусственных питательных средах проводили с целью их реверсии в типичную бактериальную форму. Для этого использовали питательные среды без индуцирующего фактора, богатые белково-содержащими компонентами (20% нормальной лошадиной сыворотки).

Возможность реверсии L-вариантов бруцелл in vivo устанавливали путем пассирования L-вариантов через организм морских свинок.

Для идентификации выделенных культур к L-формам бруцелл с использованием L-антисыворотки производили постановку пластинчатой реакции агглютинации.

Комплексную идентификацию L-форм бруцелл проводили с учетом морфологических, культуральных, тинкториальных, биохимических и агглютинабельных свойств изучаемых культур бруцелл. При этом учитывали следующие признаки: форма и размер клеток, их окраска, характер роста на питательных средах, образование сероводорода, редукция тионина и фуксина, проба с трипафлавином, реакция термоагглютинации, агглютинабельность в гомологичных (S-; R-; L-) антисыворотках.

За период проведения работы бактериологическому исследованию было i подвергнуто 1090 объектов от 109 морских свинок, 370 объектов от 20 голов

крупного рогатого скота, 2725 объектов от 756 северных оленей и соответственно выделено 69,47 и 237 культур бруцелл.

Всего за рабочий период было изучено 425 субкультур бруцелл, из которых 48 субкультур составляли экспериментально полученные in vitro L-варианты и 203 субкультуры L-вариантов бруцелл, выделенных от животных.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Условия и закономерности образования L-форм бруцелл видов В. abortus и 4-го биотипа В. suis (В. rangiferi) in vitro

При первичном посеве на чашке Петри адаптированных культур бруцелл, когда концентрация антибиотика в среде составляла 1; 2,5; 5 ЕД/мл, рост у всех трех изучаемых штаммов бруцелл появлялся при концентрации пенициллина 5 ЕД/мл. Отобранные колонии {«суспендировали в физиологическом растворе, доводили концентрацию до 1 млрд. микробных клеток в 1 мл и засевали по 0,5 мл на чашки Петри со средой с тремя взаимоувеличивающимися дозами антибиотика: 5; 10; 20 ЕД/мл. \

Концентрация бензилпенициллина натриевой соли для индукции L-форм бруцелл зависела от индивидуальных особенностей штамма. Так, вакцинный штамм В. abortus 19 сравнительно легко и с большим постоянством образовывал L- варианты. Культуры полевого В. rangiferi 181 (4-й биотип В. suis) и референтного В. abortus 544 штаммов проявляли значительную чувствительность к увеличению дозы антибиотика, при этом наблюдали замедление их роста или гибель.

Так, 4-й пассаж изучаемых культур проводили на средах, содержащих 20; 40; 80 ЕД'мл антибиотика. Рост культуры вакцинного штамма В. abortus 19 появлялся уже на вторые сутки на питательной среде, содержащей 20 ЕД/мл пенициллина. Полученные культуры на скошенном агаре образовывали выпуклые, округлые, матовые, правильно контурированные формы колоний. Они хорошо эмульгировались- в физиологическом растворе, по Граму и Козловскому окрашивались в розово-красный цвет и были представлены клетками овоидно -кокковидной формы размером 0,9 - 1,6 мкм. На питательной среде, содержащей 40 ЕД'мл антибиотика, рост культур проявлялся на 4-5 день. В нативных мазках. наряд>' с коккоподобными клетками отмечались удлиненные палочки размером до 1,5 - 2,0 мкм, шаровидные клетки с различной плотностью цитоплазмы.

С повышением дозы добавляемого в питательную среду антибиотика (80 ЕД/мл) рост культур становился скудным и появлялся в более поздние сроки культивирования 7-10 суток. Изменялась и форма колоний: они становились уплощенными, округлыми, часто с неровными краями, приобретали слизистую консистенцию, плохо эмульгировались в физиологическом растворе и состояли из полиморфных клеток разной величины и формы. При пересевах такие колонии давали рост только на питательных средах с той же или меньшей концентрацией антибиотика. Культуры референтного В. abortus 544 и полевого В. rangiferi 181 (4-й биотип В. suis) штаммов на средах с концентрацией антибиотика 80 ЕД/мл погибали. Рост их в виде нежных, мелких, прозрачно-маслянистых колоний на 5-7 сутки появлялся на питательных средах, содержащих 40 ЕД/мл пенициллина.

На 4-5 пассаже, когда доза антибиотика составляла 40; 80; 160 ЕД/мл, гетероморфизм изучаемых культур становился более выраженным. В мазках препаратах преобладали шаровидные клетки размером 0,9-1,5 мкм различной оптической плотности, удлиненные палочки размером 1,5-2,0 мкм с четкими или расплывчатыми контурами и гранулярными включениями.

При пересевах L-культур иногда вырастали два типа колоний: крупные - 0,51,0 мм (гип В) и более мелкие - менее 0,5 лш (тип А), при микроскопическом исследовании оба типа колоний имели идентичную морфологию структурных элементов, однако колонии типа В оказались более жизнеспособными, а колонии 1 типа А росли только группами, а одиночные колонии при пересевах погибали.

С целью получения наиболее стабилизированных L-культур нами проводилась > селекционная работа по отбору различного типа колонии. При проведении данной

работы предпочтение отдавали отбору и последующему культивированию ' колоний типа В, а также единичных L-колоний, выросших на средах с

максимальной для изучаемой культуры и данного пассажа бактериостатической ■ дозой антибиотика.

В результате, нам удалось получить стабильную L-форму вакцинного штамма В. abortus 19, полученную после 18-20 пассажей, на питательной среде с концентрацией антибиотика 15-20 тыс. ЕД/мл. Полученная L-форма представлена гигантскими вакуолизированными или с мелкой зернистостью клетками. Она успешно закрепила свои свойства, полученные в процессе L-трансформации и при длительном культивировании на питательных средах без индуцирующего фактора сохраняла хорошую энергию роста и не реверсировала в бактериальную форму.

В заключении, анализируя все выше перечисленное, можно утверждать, что процесс трансформации бруцелл происходит однотипно не зависимо от видовой принадлежности.

2.2.2. L-трансформация бруиелл видов В. abortus и 4-го биотипа В. suis (В. rangiferi) in vivo

2.2.2.1. Образование L-форм В. abortus

L-трансформация В. abortus была прослежена в опыте на крупном рогатом скоте. Из опытных животных были сформированы по принципу аналогов четыре группы по пять голов в каждой.

Животных первой группы в 6-ти месячном возрасте вакцинировали живой вакциной из штамма В. abortus 82 с последующей ревакцинацией через год. Через 12 месяцев животных этой группы вакцинировали химической вакциной НАК-1. Животных второй группы не вакцинировали, они служили контролем (интактные). Животных третьей группы вакцинировали, трехкратно начиная с 6-ти месячного возраста с интервалом 12 месяцев живой вакциной из штамма В. abortus 82. Животных четвертой группы вакцинировали трижды в том же возрасте химической вакциной НАК-1.

Живую вакцину из штамма В. abortus 82 вводили подкожно в дозе 100 млрд. м.к. Химическую вакцину НАК-1 вводили подкожно в дозе 5 мл. По истечении 10-ти месяцев после вакцинации всем коровам конъюнктивально вводили взвесь клеток культуры вирулентного штамма В. abortus 54. Животных заражали в дозе 200 млн. м.к. По истечении срока наблюдения (35 суток) опытных животных подвергали контрольному убою с последующим бактериологическим

исследованием общепринятыми методами и индикацией изолированных культур с учетом измененных форм бруцелл.

В результате бактериологического исследования лимфатических узлов и внутренних органов опытных коров, у 55% из них были выделены культуры с признаками, характерными для типичных бруцелл и дополнительно у 25% коров было установлено бруцеллоносительство с персистенцией глубоко измененных форм бруцелл. Следует также отметить, что у 15% исследованных животных наблюдали персистенцию одновременно типичных и измененных форм бруцелл (диаф. 1).

Диаграмма 1.

Выявление животных-бруцеллоносителей с персистенцией типичных и измененных форм бруцелл

При индикации 138 культур, изолированных от опытных коров, бруцеллы составили 34% (47 культур). При этом из 47 вылеченных культур бруцелл 37 имели признаки типичных бруцелл и 10 измененных форм бруцелл.

Морфологически выделенные L-культуры были представлены преимущественно клетками сферопластного типа размером от 0,8 до 1,2 мкм. Две культуры были представлены крупными палочками 0,4-0,6 х 1,5-4,0 мкм. При окраске по Граму только одна, а по Козловскому три культуры имели окраску, характерную для типичных бруцелл (розово-красную), в то время как клетки остальных культур воспринимали окраску, окрашиваясь в сиреневый и фиолетовый цвет по Граму, а по Козловскому в серый, коричневый и бордовый.

Таким образом, в иммуном организме крепного рогатого скота бруцеллы способны трансформироваться и в измененном состоянии персистировать в органах и тканях, не выявляясь стандартными методами диагностики.

Использование методов индикации и идентификации L-форм бруцелл, позволило дополнительно выявить 25% животных-бруцеллоносителей и 21% культур бруцелл, находящихся в измененном состоянии.

2.2.2.2. Образование L-форм 4 биотипа В. suis - В. rangiferi

В результате бактериологических исследований биоматериала от северных оленей на бруцеллез из 756 голов 199 были бруцеллоносителями, что составляет

не заразившиеся 20%

измененные 25'..

55% типичные

ю

27%. От 199 оленей бруцеллоносителей было выделено 237 культур бруцелл, что составляет 21% от числа исследованных проб (табл. 1).

Изолированные ' культуры бруцелл характеризовались широкой вариабельностью морфологических, агглютинабельных и т инкториальных свойств. По морфологии культуры бруцелл в большинстве своем (из 237) были представлены клетками сферического типа (116) и овоидной формы (45), превышающие размеры типичных брупелл в 3-5 и более раз. Из 237 выделенных культур бруцелл 110 проявляли Ь-антигенную активность в различном сочетании. Лишь половина культур бруцелл сохраняли способность екрашиваться в розово-красный цвет по Граму и Козловскому, в то время как остальные культуры воспринимали окраску не характерную для типичных бруцелл, окрашиваясь в сиреневый, бордовый и фиолетовый цвета по Граму и в серый, коричневый и зеленый - по Козловскому.

Таблица 1

Результаты бактериологических исследований биоматериала ____от северных оленей на бруцеллез___

Дата иссле дова ния Выделено культур бруцелл ВСЕГО Лп пютинабельность Морфологи* * Специфич ность окраски

S SR R SL ] RL SRL L тип Гм Сп Го гр К

1998 34 15 2 3 0 2 3 9 4 0 28 2 6 9

1999 47 5 9 6 1 6 16 4 8 0 30 9 18 21

2000 57 0 0 1 0 4 1 51 0 0 25 32 5 7

2001 99 34 25 28 1 4 4 3 23 41 33 2 93 63

итого 237 54 36 3S 2 16 24 67 35 41 116 45 122 100

В результате из всех выделенных культур бруцелл бруцеллы с признаками L-трансформации в среднем составили 86%.

Анализируя результаты экспериментов по изучению L-трансформации бруцелл in vivo, а также по исследованию культур, выделенных в производственных условиях, мы пришли к убеждению, что это очень широко распространенное закономерное явление. И происходит оно во всех без исключения популяциях бруцелл (В. abortus, 4-й биотип В. suis - В. rangiferi).

2.2.3. Морфологические, культуральные, тинкториальные, биохимические, агтлютинабельные и вирулентные

' свойства L-фенотипов бруцелл, полученных in vitro

*

В результате воздействия различных концентраций пенициллина получены L-варианты из трех штаммов (В. abortus 19 и 544; В. rangiferi 181), первоначально i состоящих из S-форм бруцелл.

' Полученные L-варианты заметно отличались от исходных культур по

культуральным свойствам. L-варианты референтного (В. abortus 544) и полевого (В. rangiferi 181) штаммов отличались слабым ростом. Лишь на 14-е сутки отмечался их слабый рост. Колонии становились плоскими, мелкими (размером менее 1,0 мм), со значительным матовым оттенком.

ti

Относительно энергии и характера роста исключение составлял ь-вариант, полученный из вакцинного штамма В. abortus 19. Он проявлял хорошие ростовые свойства уже на 2-4 сутки. Колонии его были крупными (3,0-4,0), уплощенными, бело-матового цвета.

Все полученные L-варианты, культивируемые. на мясо-пептонном бульоне, также не образовывали характерного для типичных бруцелл пристеночного кольца, образуя рыхлый осадок на дне пробирки матового и матово-белого цвета, при этом просветление среды происходило не всегда.

Представленные L-варианты по морфологии значительно отличались от исходных штаммов бруцелл. В их культурах преобладали шаровидные клетки диаметром 1,0-1,5 мкм и более. Крупные сферопласты (2,0-4,0 мкм) и гигантские эллипсоидные клетки (3,0 х 6,0 мкм) неравномерно окрашивались. Почти треть популяции L-варианта, полевого штамма В. rangiferi 181, представляла собой округлившиеся клетки диаметром 0,7-0,8 мкм близкие по размерам с типичными бруцелл ами.

Так при окраске по Граму и Козловскому сохраняли характерный для типичных бруцелл розово-красный цвет лишь мелкие сферопласты размером 0,71,2 мкм. Более крупные клетки, Такие как сферопласты 1,5-4,0 мкм и гигантские овоиды 3,0 х 6,0 мкм при окраске по Граму приобретали соответственно сиреневый и фиолетовый цвета, а при окраске по Козловскому серый, коричневый и зеленый.

У L-варианта референтного штамма В. abortus 544 значительно уменьшилась способность образования сероводорода, а у вакцинного штамма В. abortus 19 вообще исчезла. Все .полученные in vitro L-фенотипы бруцелл стали менее восприимчивы к действию анилиновых красителей при посевах на среды с их содержанием: О глубоких изменениях в клетках L-вариантов, произошедших в процессе L-трансформации, свидетельствуют и положительные результаты реакции термоагглютинации и пробы с трипафлавин.ом.

L-варианты штаммов В. abortus 544 и В. rangiferi 181 в значительной степени сохраняли исходные антигенные структуры. Вместе с этим было отмечено, что L-варианты проявляли L-антигеную активность. У всех L-вариантов не отмечалось антигенного родства с R-антисывороткой, как и у исходных штаммов. Отдельно стоит подчеркнуть агглютинабельные свойства L-варианта вакцинного штамма В. abortus 19. Полученный L-вариант полностью утратил S-детерминанты исходного штамма, давал отрицательные результаты с R-антисывороткой и при этом проявлял достаточно высокую активность с L-антисывороткой (диагностический титр 1:320).

Результаты серологических исследований показали, что данный L-вариант вызывал образование только гомологичных (L-) антител, которые в пластинчатой реакции агглютинации можно было выявить в диагностических титрах уже на 10-е сутки.

Экспериментально полученный L-вариант имел несколько меньшую степень патогенности, чем исходный S-штамм. Об этом свидетельствуют данные индекса инфицированности. Так, в группе морских свинок зараженных исходным штаммом В. abortus 19 индекс инфицированности составил 10%, а в группе

опытных животных зараженных его L-формой 8%. Вместе с тем, полученная L-форма обладала довольно высокой заразительностью, она способна была длительное время персистировать у 80% морских свинок и при этом у 56% заразившихся животных вызывать генерализованную форму инфекции. При этом исходный S-штамм вызывал заражение у 85% морских свинок и менее чем у половины генерализованную форму инфекции.

Таким образом, результаты изучения биологических свойств L-вариантов, полученных in vitro из брунелл видов В. abortus и В. rangiferi (4-й биотип В. suis), показали, что L-формы обладают л значительной степени отличительными свойствами относительно типичных бруцелл. Однако, относительно друг друга L-фенотипы В. abortus и 4-го биотипа В. suis (В. rangiferi) принципиальных различий не имеют. Они сходны по культурально-морфологическим и биологическим свойствам.

L-формы бруцелл способны приживаться и длительное время персистировать в организме лабораторных животных, вызывая синтез гомологичных L-антител,

улавливаемых в диагностических титрах серологическими реакциями.

#

2.2.4. Морфологические, культуряльные, тинкториальные, биохимические, агглютииабельные н вирулентные свойства L-фенотипов бруцелл, выделенных от животных

Для изучения фенотипических и биологических свойств L-форм бруцелл видов В. abortus и В. rangiferi, изолированных от животных, были отобраны несколько культур. При выборе L-культур предпочтение отдавали относительно стабильным L-формам бруцелл. С этой целью были выбраны пять субкультур.

L-вариант В. abortus 54 (1313), изолированный из селезенки опытной ковы был представлен мелкими колониями (1,0-1,5 мм) матового цвета, округлой формы, с уплощенной поверхностью и ровными краями. При посеве на бульон давал рост с образованием рыхлого осадка матового цвета с одновременным просветлением среды. Изолированные от северных оленей субкультуры L-вариантов № 834 и 853 на агаре росли в виде крупных (3,0-4,0 мм) колоний бело-матового цвета, округлой уплощенной формы с ровными краями. На бульоне эти L-варианты образовывали обильный рыхлый осадок белого цвета. L-варианты № 1715 и 1726, также выделенные от оленей образовывали на агаре колонии серовато-белого цвета со слизистым налетом по периферии, неправильно контурированные, размером 2,0-3,0 мм. На бульоне они росли с образованием серо-белого осадка.

Морфологически изучаемые L-варианты бруцелл были представлены коккоподобными клетками, клетками сферопластного типа и гигантскими эллипсоидными клетками, рамеры которых варьировали от 1,0 до 4,0 мкм.

Относительно тинкториапьных свойств изучаемые L-варианты бруцелл окрашивались в цвета не характерные для типичных форм бруцелл. Так по Граму они окрашивались в сиреневый и фиолетовый цвет, а по Козловскому в коричневый и зеленый.

При и (учении биохимических свойств выделенных L-вариантов было установлено, что они хорошо растут на средах с анилиновыми 1фасками, не продуцируют сероводород, менее чувствительны к действию антибиотиков. Также получены положительные результаты в пробе с трипафлавином и в реакции термоагглютинации.

В результаты серологических исследований проб сывороток крови, полученных от морских свинок, зараженных изучаемыми L-вапиантами бруцелл, установлено, что изучаемые L-варианты вызывали образование гомологичных иммуноглобулинов, которые улавливались в реакции агглютинации и реакции связывания комплемента

Индекс инфицированности в группе морских свинок зараженных L-вариантом № 1313, референтного штамма В. abortus 54 составил 17%. В группах морских свинок зараженных L-формами, выделенными от северных оленей индекс инфицированности был значительно ниже, варьировал от 4% до 10% и в среднем составил 7%. L-варианты бруцелл способны длительное время персистировать в органах и тканях лабораторных животных и в большинстве случаев (75%) вызывать генерализованную форму инфекции.

Таким образом, при сравнительном изучении биологических свойств L-' вариантов бруцелл видов В. abortus и В. rangiferi (4-й биотип В. suis), выделенных от основных хозяев, существенных их отличий не отмечалось. Вместе с тем • выделенные L-варианты принципиально оличались от типичных бактериальных форм бруцелл по комплексу основных признаков.

В заключении следует отметить, что при взаимодействии бруцелл с факторами иммунного организма основного хозяина происходила регуляция паразитохозяинных отношений.

Полевые L-варианты бруцелл проявляли относительно стабильные свойства и были способны в измененном состоянии персистировать в иммунном организме животного в течение длительного времени.

L-варианты бруцелл, выделенные от животных, проявляли способность адаптироваться к условиям искусственных питательных сред и при многократных пересевах сохранять основные признаки.

2.2.5.. Электронно-микроскопическое исследование L-вариантов бруцелл

. Для изучения были отобраны два L-варианта бруцелл: L-вариант, полученный in vitro под действием антибиотиков из вакцинного штамма В. abortus 19 и L-вариант, выделенный из селезенки коровы, экспериментально зараженной вирулентным штаммом В. abortus 54.

При электронно-микроскопическом исследовании L- вариант штамма В. abortus 54 был представлен шаровидными клетками, рисунок цитоплазмы которых на ультратонких срезах был несколько сглажен. Клетки этого L-варианта имели растянутую клеточную стенку. Цитоплазматическая 'мембрана по сравнению с таковой у бактериальных форм бруцелл была истончена. У L-варианта В. abortus 54 отмечали также интенсивный рост клеток. Так нередко можно было наблюдать их бинарное равновеликое и неравновеликое деление или

почкование. На более крупных шаровидных клетках можно было увидеть впадины-лунки. У более мелких элементов отмечалось слипание в конгломераты.

L-вариант вакцинного штамма В. abortus 19 под электронным микроскопом просматривался в виде гигантских клеток шаровидной и неправильной формы. D • Гигантские клетки имели различную оптическую плотность, часто содержали

гранулы и вакуоли. Гигантские клетки неправильной формы в большинстве случаев на поверхности имели глубокие разрывы. В таких разрывах иногда были 1 видны мелкие шаровидные элементы. Последние могли также возникать на

' поверхности клеток путем почкования. Мелкие шаровидные клетки, возникшие

внутри гигантских клеток или на их поверхности, соответствовали так • называемым элементарным телам, то есть минимальным репродуктивным

элементам L-форм.

На ультратонких срезах клеточная стенка исходного штамма была представлена трехслойной мембраной и пептидогликаном, которые обеспечивают ригидную форму бактериальной клетки. Цитоплазма бактериальной клетки содержит включения.

Таким образом, ультраструктура клеток изучаемых L-вариантов и исходных бактериальных штаммов бруцелл отличаются тем, что у L-вариантов отсутствует ригидный слой клеточной стенки, имеется более развитая система внутрицитоплазчатических мембран и имеются более разнообразные способы репродукции. L-вариант В. abortus 54 имеет изменения, характерные для среднего этапа L-трансформации, а L-вариант В. abortus 19 - для позднего этапа L-трансформацин.

L-вариант В. abortus 54 (№ 1313) имеющий цельную клеточную стенку сохранял в своем составе поверхностный Б-ашиген, а также в результате ее растяжения и истончения проявлял L-антигенную активность. L-вариант В. abortus 19 (19L,-58) лишенный в значительной степени клеточной стенки утерял S-антигенные детерминанты и проявлял лишь L-антигенную активность.

В заключении, следует отметить, что на различных этапах L-трансформации культуры бруцелл характеризовались высокой репродуктивной способностью, о чем свидетельствовали бинарное деление, образование элементарных тел внутри и на поверхности L-клеток путем почкования.

Разнообразие способов размножения может служить объяснением способности L-форм бруцелл к длительному персистированию в организме

f -р««—

I* 2.2.6. Морфометрический метод оценки патогенности

L-вариантов бруцелл различного происхождения и культур-ревертантов, полученных от них

В результате гистологического исследования проб селезенки установлено, что у опытных животных, зараженных минимальной дозой (100 м.к.) L-формами бруцелл и S-ревертантами, полученными от них, патологических макро- и микроскопических изменений не было выявлено.

Результаты количественной оценки стромо-паренхимального отношения (СПО) и линейных размеров фолликулов в селезенке показали, что введение в

организм морских свинок минимальной дозы (100 м.к.) L-форм бруцелл i

различной этиологии, а также S-ревергантов, полученных от них вызывало j

различную реакцию морфологических структур. Отмечалось увеличение размеров i

лимфатических фолликулов селезенки и их светлых центров, а также изменение стромо-паренхимального отношения за счет увеличения паренхимы селезенки. *

В результате гистологического исследования проб печени опытных животных j

было отмечено, что реакция со стороны печени проявлялась в виде скопления <

микро- и макрофагальных клеток вокруг центральных вен и сосудистых триад. У ,

контрольных животных каких-либо скоплений клеток отмечено не было. *

При гистологическом исследовании лимфатических узлов морских свинок, зараженных L-формами бруцелл, установлено, что они характеризовались '

умеренным раздражением отдельных фолликулов вследствие их гиперплазии. !

Также отмечалась гиперемия капилляров в корковом слое и переполнение лимфатических сосудов в капсуле.

В результате гистологического исследования лимфатических узлов морских свинок, зараженных полевым S-ревертантом, установлено, что они находились в i

состоянии сильного раздражения, либо в пост реактивном состоянии. Сильное раздражение просматривалось в отсутствии выраженных лимфатических фолликулов. Корковый и мозговой слои были едва различимы, т.к. почти по :

всему периметру плотность расположения и окраска лимфоцитов коркового и мозгового слоев были не различимы. Пост реактивное состояние ,

характеризовалось отсутствием выраженных мякотных тяжей в мозговом слое лимфатического узла и резким выделением фолликулов на фоне лимфатической ткани. Внутри фолликулы -имели большое количество хорошо выраженных синусов. Также отмечалась индурация лимфатического узла. Разрастанию соединительной ткани способствовала длительная гиперемия. i

При морфометрическом исследовании лимфатических узлов установлено, что j

наиболее ярко выраженную реакцию отмечали в регионарных лимфатических J

узлах, которая выражалась в увеличении светлых центров и размеров фолликулов.

Степень увеличения размеров фолликулов и их светлых центров зависела от j

изучаемой культуры. Так при морфометрическом исследовании лимфатических J

узлов морских свинок, зараженных L-формой вакцинного штамма В. abortus 19 в j

минимальной дозе (100 м.к.), средний размер фолликула составлял 96 мкм с |

размером его светлого центра 72 мкм. При заражении опытных животных полевой L-формой бруцелл (853L), выделенной от северного оленя, размер ч

лимфатических фолликулов составил 106 мкм с размером светлого центра 79 мкм.

Размер лимфатических фолликулов и светлых центров лимфатических узлов [

морских свинок, зараженных S-ревертантом вакцинного штамма В. abortus 19L, У

соответственно составили 105 и 79 мкм. Размеры же фолликулов и светлых '

центов регионарных лимфатических узлов морских свинок, зараженных S-ревертантом полевого L-варианта 853L, соответственно составляли 134 и 104 мкм.

Достоверность морфометрического метода оценки патогенности бруцелл различной этиологии и форм существования, подтверждается его сравнительной

оценкой с общепринятыми методами (индекс ннфицпрованности), результаты которой представлены в таблице 2.

Таблица 2

Соотношение показателей индекса иафицированности и линейных •размеров фолликулов регионарных лимфатических узлов морских свинок, заражешшх Ь-париантами бруцелл ра-шгчного происхождения

Ni> п/п Наименование штамма Индекс инфицированности Размер фолликулов (мкм)

1 ! В. abortus 19 10 108

2 j В. abortus 19L 7 96

3 1 В. abortus 19 S-ревертант 10 105

4 : 853L 10 106

5 | 853 S-ревертант 17 134

Таким образом, с помощью морфометрического метода оценки патогенности установлено, что эпизоотические Ь-формы бруцелл характеризующиеся слабой степенью патогенности, вызывали умеренное раздражение отдельных лимфатических фолликулов, в результате реверсии восстанавливали свойства бактериальных форм и способны были вызывать сильное раздражение фолликулов лимфатических узлов, что свидетельствовало об их патогенности.

2.2.7. Сравнительная оценка методов индикации и идентификации бруцелл с учетом изменчивости возбудителя

2.2.7.1. Последовательные пересевы на искусственных питательных средах

При последовательных пересевах на искусственных питательных средах изучаемые [.-варианты бруцелл реверсировали в типичную бактериальную форму неодинаково.

У большинства Ь-культур (пять из восьми) реверсия происходила в результате 5-20 пересевов с полным восстановлением фенотипических и биологических свойств. Клетки ревертанты приобретали кокковидную форму, их размеры составляли 0,3 - 0,5 мкм, грамнегативность и характерную (красную) окраску по Козловскому, а также Б-агтлютинабельность. Однако у остальных трех [.-культур отмечали частичную реверсию с незначительным изменением исходных свойств. Их клетки сохраняли сферическую и эллипсоидную форму, цитоплазматический Ь-антиген и лишь в некоторых случаях приобретали характерную для типичных бруцелл окраску по Козловскому.

В процессе изучения реверсибельных свойств Ь-вариантов установлено, что в условиях искусственной питательной среды при многократных пересевах в течение длительного времени (около 1-2 лет) полное восстановление всех4 признаков, характерных для типичных (Б-) форм бруцелл, наблюдали у 63% .изучаемых культур.

В заключении можно сделать вывод, что идентификацию с использованием метода последовательных пересевов на искусственных питательных средах, целесообразно проводить у Ь-форм бруцелл начального и среднего этапов Ь-трансформации.

2.2.7.2. Пассирование через организм лабораторных животных

Полное или значительное восстановление у L-вариантов свойств, характерных для типичных бруцелл наступало обычно при одном-трех пассажах.

Так при однократном пассировании через организм лабораторных животных полное восстановление свойств, характерных для типичных бактериальных форм произошло у одной культуры под № 1726L, выделенной от северного оленя.

После двукратного пассирования через организм морских свинок восстановление биологических свойств отмечали у четырех культур под № 834, 853, 1313 и 1715, выделенных от крупного рогатого скота и северного оленя.

От В. abortus 19L, полученной in vitro под действием антибиотиков, культура ревертант была получена после трехкратного пассирования через организм морских свинок.

В итоге от всех шести изучаемых L-вариантов бруцелл различной этиологии путем пассирования через организм лабораторных животных, были получены культуры ревертанты, имеющие признаки характерные для типичных (S-) форм бруцелл.

Таким образом, при пассировании через организм лабораторных животных, реверсия L-форм бруцелл происходит более интенсивно чем на искусственных питательных средах. При этом удается получить культуры ревертанты от L-форм, находящихся на любой стадии изменчивости. Однако культуры ревертанты плохо адаптировались к условиям искусственных питательных сред и при длительном культивировании нередко погибали. Следует также отметить, что при введении в организм морских свинок, культуры-ревертанты были не стабильными и могли переходить обратно в L-форму, что усложняло их идентификацию.

2.8.3. Индикация L-форм бруцелл с применением L-антисыворотки

В результате проведенных исследований было установлено, что L-антисыворотка, полученная к стабильной L-форме В. abortus 19 имеет строгую специфичность, обладает диагностической активностью и в разведениях 1:10 -1:40 может быть использована в пластинчатой реакции агглютинации с диагностической целью.

При идентификации выделенных от северных оленей 1135 культур, 237 из них (20,8%) агглютинировались набором бруцеллезных диагностических (S-, R-, L-) антисывороток в различных вариациях. Из 237 культур бруцелл с помощью диагностической L-антисыворотки было выделено 110 культур, что составило почти половину (46,4%). Причем 67 (28,3%) культур бруцелл агглютинировались только L-антисывороткой.

Таким образом, использование L-антисыворотки в наборе со стандартными (S-и R-) бруцеллезными сыворотками позволило выделить дополнительно 46,4% культур бруцелл. Применение L-антисыворотки позволило дополнительно выявить 98 животных бруцеллоносителей, что составило 77,2% от общего числа животных бруцеллоносителей и 13% от общего числа исследованных.

is

2.8.4. Идентификация Ь-форм бруцелл комплексным методом

При индикации Ь-форм бруцелл комплексным методом учитывали следующие критерии: характер роста на искусственных питательпых средах, условия культивирования, морфологию и размер клеток, окраску анилиновыми ^ красителям;;, агглютинабелььость специфическими 5-; Я-; Ь-бруцеллезньши

аптисыворотками.

4 Ь-формы бруцелл начального этапа трансформации культивируются на

^ питательных средах, как и типичные формы бруцелл. Относительно стабильные

Ь-формы лучше растут на полужидком (0,3%) или полутвердом (1,5%) печеночном глюкозо-глицериновом агаре с добавлением нормальной сыворотки лошади (20%), сахарозы (15-20%), 10-15% сернокислой магнезии (из 2% раствора) и поваренной соли (1%).

На искусственных питательных средах Ь-формы бруцелл, в зависимости от стадии изменчивости, дают различный рост. На этапах начальной трансформации они сохраняют свои основные культуральные свойства характерные для типичных бруцелл, но колонии их становятся более мелкими и матовыми. На более поздних стадиях трансформации Ь-формы приобретают свойства отличные от исходных Б- или Я-культур. На полужидкой среде растут в форме мелких крупинок и полосчатых образований. На поверхности плотных агаровых сред формируют плоские круглые или с неровными краями пигментированные кр; чные колонии, чаще белого, сероватого цвета.

Популяции Ь-форм бруцелл отличаются полиморфизмом. Клетки могут иметь - форму шара различной величины и оптической плотности, крупных (гигантских) вакуолизированных эллипсоидов (овоидов), элементарных тел, бесструктурных диффузных масс и 1.д. Размеры их варьируют от 0,2 до 5,0-6,0 мкм и более.

Гетероморфные формы бруцелл с цельной клеточной стенкой при окраске анилиновыми красителями сохраняют цвет, характерный для типичных форм бруцелл (красный или розовый). Бруцеллы с частичной или полностью утраченной клеточной стенкой изменяют характер окраски анилиновыми красителями. На ранней стадии трансформации часть Ь-вариантов (10-25% и более) сохраняют розовый цвет при окраске по Гриму и красный - по Козловскому. На более глубоких стадиях изменчивости Ь-клетки приобретают различную окраску, окрашиваясь при этом по Граму в темно-красный, сиреневый •■> и бурый, а по Козловскому в коричневый, серый и бордовый цвета. С полной

" утратой клеточной стенки Ь-формы бруцелл приобретают синий и темно-

фиолетовый цвета при окраске по Граму и темно-зеленый - по Козловскому. , Для определения агглютинабельных свойств измененных форм бруцелл

" использовали пластинчатую реакцию агглютинации изучаемых культур со

специфическими (Б-; Я-; Ь-) гипериммунными бруцеллезными антисыворотками. Ь-варианты бруцелл на ранних стадиях трансформации частично сохраняют клеточную стенку и антигенные Б- или Я-детерминанты, которые выявляются в реакции агглютинации Б- и Л-гипериммунными сыворотками. Глубокоизмененные Ь-формы, лишенные в значительной части или полностью

клеточной стенки и специфических Б-, Я-антигенов, проявляют активность только с Ь-бруцеллезными сыворотками.

Если исследуемые гетероморфные культуры имеют указанные особенности роста, формы и окраски клеток и хорошо агглютинируются Э-; Я- или I,-антисыворотками, то их относят к Ь-формам бруцелл.

При бактериологическом исследовании пантов и внутренних органов от 756 северных оленей было выделено 237 культур бруцелл.

Общепринятым методом было идентифицировано 34 культуры (14,3%), а комплексным методом еще дополнительно 203 (&5,7%) культуры бруцелл.

Культуры бруцелл, • выделенные дополнительно комплексным методом находились в измененной (Ь-) форме. При этом из этих 203 Ь-культур бруцелл с использованием только Ь-бруцеллезной антисыворотки было выделено лишь 110 (табл. 3).

С помощью комплексного метола дополнительно к общепринятому и Ь-антисыворотке было выявлено 39,3% (93 культуры) культур бруцелл.

♦ Таблица 3

Диагностическая эффективность комплексного метода

Год исследо вания Исследова но животных (голов) Исследо вапо культур Выделено культур бруцелл

Всего в том числе методами:

общепринятым комплексным в том числе

только Ь-антисывороткой

кол-во % кол-во % кол-во %

1998 151 284 34 4 11.8 30 88,2 14 41,2

1999 161 207 47 7 14,9 40 85,1 27 57,4

2000 124 234 57 0 ,_ 0 57 100 57 100

2001 320 412 99 23 1 23.2 76 76.8 12 12.1

И геи о 756 1135 237 34 1 14,3 | 203 85.7 110 40.4

Таблица 4

Выявление бруцеллоносительства у северных оленей с использованием комплексного метода

Год Исследов Выявлено животных бруцеллоносителей

исслед ано в том числе методами:

оваиня животных Всего общепринятым комплексным в том числе

только Ь-антисывороткой

голов % голов % голов % голов %

1998 151 27 17,9 3 11,1 24 88,9 11 40,7

1999 161 40 24,8 5 12,5 35 87,5 18 45,0

2000 124 49 39,5 0 0 49 100 49 100

2001 320 81 25,3 21 26,0 60 74,0 12 14,8

Итого 756 197 26.0 29 14,7 168 85,3 90 45,7

В результате идентификации 237 культур бруцелл бруцеллоносительство было установлено у 197 (26,0%) северных оленей. Из общего числа оленей-бруцеллоносителей общепринятым методом диагноз был установлен у 14,7% (29

голов) животных. Использование ¡L-антисыворотки позволило дополнительно выявить 45,7% (90 голов), а с помощью комплексного метода 85,3% (168 голов) оленей-бруцеллоносителей (табл. 4).

Таким образом, использование комплексного метода позволило дополнительно к общепринятому методу и L-антисыворотке установить бруцеллоносительство у 39,6% (78 голов) северных оленей.

В целом дополнительно к общепринятому методу с помощью комплексного метода удалось выявить 22,2% животных-бруцеллоносителей от числа ,, исследованных животных.

ВЫВОДЫ

1. Установлена возможность L-трансформации бруцелл in vitro из штаммов В. adortus различного происхождения и получены жизнеспособные штаммы этих видов. Определены условия образования L-форм из штамма В. suis - 4 биотип (В. rangiferi) in vitro под действием антибиотиков.

2. В организме основного хозяина: крупный рогатый скот и северные олени бруцеллы способны трансформироваться в L-формы с полной или частичной утратой клеточной- стенки, изменяя фенотипические и дифференциальные признаки, и в таком состоянии длительно персистировать в органах и тканях.

3. L-варианты бруцелл сферопластного типа, видов В. rangiferi и В. abortus, полученные in vitro и выделенные из организма основных хозяев, имели сходные морфологические, культуральные, тинкториальные, антигенные, агглютинабельиые и вирулентные свойства.

4. Под действием антибиотиков in vitro получена стабильная L-форма штамма В. abortus 19, популяция которой состоит из клеток шаровидной и овоидной формы, не агглютинируется S- и R-сыворотками, но имеет в своей структуре активный L-антиген. Полученный штамм пригоден для изготовления I,-диагностикумов.

5. Бруцеллы незавершенного L-цикла могут реверсировать в типичную бактериальную форму in vitro в результате 5-20 генераций и in vivo при 1-2 кратном пассировании через организм лабораторных животных.

6. L-варианты бруцелл, трансформированные in vitro и выделенные из организма основного хозяина, в опытах на лабораторных животных проявляли способность заражать 80% морских свинок, но обладали в меньшей степени, чем

® типичные формы бруцелл вирулентными свойствами с индексом

инфицированности 4-17%. При количественной оценке вирулентных свойств установлено, что культуры-ревертанты, в минимальной дозе заражения, в ( региональных лимфатических узлах морских свинок способны вызывать

г выраженное раздражение фолликулов (до 134 мкм). L-формы бруцелл, в той же

дозе заражения, вызывают умеренные раздражение фолликулов регионарных лимфатических узлов (до 106 мкм).

7. L-антисыворотка, полученная путем гипериммунизации кроликов штаммом В. abortus 19L, обладает строгой специфичностью и диагностической активностью (1:320). Ее применение в комплексе с S- и R-сыворотками позволило выявить и

идентифицировать антигенную специфичность у 110 (46,4%) из 237 полевых культур бруцелл, из которых 67 (61%) агглютинировались только Ь-антисывороткой.

8. Использование метода комплексной идентификации Ь-форм бруцелл, при баетериологической диагностике бруцеллеза позволило дополнительно выявить , 85% культур бруцелл.

9. Комплексный метод позволил дополнительно установить ^ бруцеллоносительство у 22,2% северных оленей в стадах с различной эпизоотической обстановкой по бруцеллезу. <

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Методические рекомендации «Методы индикации и идентификации Ь-форм бруцелл». Утверждены методической комиссией ВНИИБТЖ, протокол № 3 от 26.09.2003г.

2 Оформлена заявка на патент «Способ получения диагностической Ь-антисыворотки» (уведомление о • положительном результате формальной экспертизы № 2003121773/13(023123) от 15.07.2003 г.).

3. Бактериологическую диагностику бруцеллеза животных проводить с обязательным учетом измененных бруцелл. С этой целью рекомендовано дополнительно к общепринятым бактериологическим методам использовать «Метод комплексной идентификации ¿-форм бруцелл», который позволяет идентифицировать бруцеллы на разных стадиях их изменчивости и объективно оценивать процесс изменчивости и стадию трансформации выделенных культур бруцелл.

4. Прижизненную бактериологическою диагностику северных оленей на бруцеллез, проводить пучем исследования кусочков пантов, осуществляя их отбор в период промышленной срезки.

СПИСОК

опубликованных работ по теме диссертации

1. Персистенция и трансформация бруцелл в иммунном организме крупного рогатого скота / Соавт.: JI.H. Гордиенко, B.C. Бронников, Т.Г. Попова // Матер. Всерос. науч. конф. по проблемам хронических инфекций: Сб. науч. тр. , ВНИИБТЖ. - Омск, 2001.-С. 51-57.

2. Степень выраженности реакции организма лабораторных животных в зависимости от.введенной дозы L-культуры бруцелл / Соавт.: Д.В. Булдыгин, JI.H. Гордиенко, В.А. Шестаков // Там же. - Омск, 2001. - С. 86-93. ;

3. Персистенция L-форм бруцелл в организме лабораторных животных / * Соавт.: JI.H. Гордиенко // Там же. - С. 96-98.

4. Морфологическая и антигенная вариабельность культур бруцелл, изолированных из пантов северных оленей / Соавт.: Л.Н. Гордиенко, В.Г. Толстяков // Инфекционная патология животных: Сб. науч. тр. ВНИИБТЖ. -Омск, 2001.-С. 133-137.

5. Характеристика морфологических и тинкториалькых признаков культур-ревертантов, изолированных от морских свинок при однократном пассировании штамма В. abortus 19Lj // Там же-С. 154-156.

6. Свойства культур-ревертантов штамма В. abortus 19Ьз в опыте на лабораторных животных / Соавт.: J1.H. Гордиенко // Проблемы и перспективы развития науки в ветеринарной медицины: Сб. науч. тр. ИВМ ОмГАУ. - Омск, 2002.-С. 34-36.

7. Вариабельность культур бруцелл, изолированных от северных оленей в очагах бруцеллезной инфекции / Соавт.: В.Г. Ощепков, Л.Н. Гордиенко // Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера: Матер. 2й науч.-практ. конф. с Международным участием. - г. Новосибирск, 2002. - С. 141.

Типография ОмГУПСа. 644046, г. Омск, пр. Маркса, 35. Тираж 100 экз. Заказ 861.

» ч

P 1 793 О

Актуальность темы. Бруцеллез животных до настоящего времени имеет довольно широкое распространение в мире. По данным Объединенного комитета экспертов ФАО / ВОЗ по бруцеллезу (шестой доклад, 1986 г.), это заболевание среди крупного рогатого скота, овец, коз, свиней и северных оленей регистрируется в 155 странах.

В России, несмотря на имеющиеся достижения науки и передового опыта по оздоровлению хозяйств от бруцеллеза, эта хроническая инфекция среди сельскохозяйственных животных все еще представляет весьма сложную проблему как с точки зрения экономической, так и социальной значимости.

При бруцеллезе успех ликвидации болезни и предупреждения распространения инфекции во многом зависит от своевременности и точности поставленного диагноза. Повышенную актуальность этой проблеме придает изменчивость возбудителя. Среди животных довольно часто циркулируют измененные формы возбудителя бруцеллеза.

По данным ВНИИБТЖ и ИЭВСиДВ (И.А. Косилов с соавт., 1976, 1992; В.Г. Ощепков с соавт., 1983, 1990; Л.Н. Гордиенко с соавт., 1989, 2001), за последние десятилетия доля измененных форм выросла с 12,9% до 70-80%, от общего количества бруцелл, выделенных от животных в стадах с естественным течением эпизоотии. У полевых Ь-вариантов авторы отмечали существенные изменения основных биологических свойств, определяющих характер специфических взаимоотношений макро- и микроорганизмов: трансформацию антигенной структуры в сторону 8 - 8Я - ЯБ - Я - ЯЬ - ЬЯ - Ь и значительное понижение вирулентности.

Эти изменения определенным образом влияют на проявление патогенеза и в свою очередь обуславливают особенности диагностики бруцеллеза.

Таким образом, в очагах инфекции, где циркулируют Ь-формы возбудителя, значительно реже отмечаются аборты. Реверсия же возбудителя в интактное состояние, как правило, может приводить к рецидивам в оздоровленных стадах.

Для L-форм характерно резкое изменение морфологии бактериальной клетки и снижение уровня метаболизма. L-формы бруцелл могут находиться в организме животных в стабильном и нестабильном состояниях, то есть реверсировать в исходный микробный вид с восстановлением вирулентности.

В хозяйствах на фоне бесконтрольного использования химиотерапии и специфических биопрепаратов создаются благоприятные условия для образования L-форм бруцелл в организме животных. L-формы искажают и сглаживают клинические проявления болезни.

Основываясь на опубликованных данных (П.А. Вершилова, 1972; В.Д. Тимаков, 1973; П.А. Триленко, 1976; И.А. Бакулов, 1980; C.B. Прозоровский, 1981; В.Г. Ощепков, 1983 и др.), можно полагать, что одной из причин длительного сохранения очагов бруцеллеза и возникновения случаев повторных эпизоотических вспышек этой инфекции являются глубоко измененные (L-) формы бруцелл, которые по своим биологическим свойствам существенно отличаются от типичных культур возбудителя и не выявляются имеющимися в настоящее время средствами диагностики.

Сложность диагностирования бруцеллеза вызываемого L-формами бруцелл с помощью традиционных бактериологических и иммунологических методов, в свою очередь, определяет актуальность разработки способов быстрой и четкой идентификации и дифференциации измененных форм бруцелл, доступных как для научно-исследовательских, так и для производственных ветеринарных лабораторий.

Цель и задачи исследования. Целью исследований является разработка нового метода индикации и идентификации L-форм бруцелл, а также изучение условий и закономерностей образования L-вариантов бруцелл 4-го биотипа В. suis (В. rangiferi) и изучение биологических свойств полученных L-форм.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Получить in vitro L-варианты бруцелл различного происхождения.

2. Выделить L-варианты бруцелл из организма основных хозяев (крупный рогатый скот, северные олени).

3. Изучить условия образования и биологические свойства, полученных L-форм бруцелл видов В. abortus и В. rangiferi.

4. Получить стабильную L-форму бруцелл, пригодную для изготовления L-диагностикумов.

5. Разработать эффективный метод индикации и идентификации бруцелл с учетом изменчивости возбудителя.

Научная новизна. Поданную на изобретение заявку «Способ получения диагностической L-сыворотки» получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы (№ 2003121773/13(023123) от 15.07.2003 г.).

Получен стабильный L-вариант бруцелл, обладающий строгой специфичностью и широким диапазоном антигенной активности, пригодный для изготовления L-диагностикумов: L-антиген и L-антисыворотка.

Разработан, апробирован и предложен к применению метод "Комплексной идентификации L-форм бруцелл".

Изучены особенности L-трансформации и биологические свойства L-вариантов бруцелл 4-го биотипа В. suis (В. rangiferi), in vitro и в организме северных оленей.

Практическая значимость. Разработаны методические рекомендации «Методы индикации и идентификации L-форм бруцелл», утверждены методической комиссией ВНИИБТЖ, протокол № 3, от 26.09.2003 г.

Предложенный метод комплексной идентификации L-форм бруцелл позволит повысить достоверность лабораторной диагностики бруцеллеза, а значит объективно оценивать эпизоотическое состояние по бруцеллезу стад и, следовательно, своевременно и обоснованно грамотно проводить противобруцеллез-ные мероприятия.

Полученные результаты исследований являются новыми научными сведениями, которые необходимо учитывать при работе в научно-исследовательских ветеринарных учреждениях, занимающихся проблемами бруцеллеза животных, а также можно использовать в учебном процессе при подготовке ветеринарных специалистов.

Апробация полученных материалов. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на ученых советах ВНИИБТЖ, г. Омск, 1999, 2000, 2001, 2002 гг.; шестой научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов института ветеринарной медицины ОмГАУ, 2000 г.; на конференции молодых ученых, ВНИИБТЖ, г. Омск, 2000 г.; седьмой научной конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов института ветеринарной медицины ОмГАУ, 2001 г.; Всероссийской научной конференции по проблемам хронических инфекций, ВНИИБТЖ, г. Омск, 2001 г.; научно-практической конференции факультета ветеринарной медицины НГАУ, г. Новосибирск, 2001 г.; и международном конгрессе по проблемам инфекционной патологии, г. Новосибирск, 2002 г.

Публикация материалов исследований. По материалам диссертации опубликовано 7 научных статей и подана 1 заявка на изобретение.

Внедрение результатов исследований. Получено уведомление о положительном результате формальной экспертизы на изобретение « Способ получения диагностической Ь-сыворотки» (№2003121773/13(023123) от 15.07.2003 г.).

Полученные результаты научных исследований вошли составной частью в методические рекомендации «Методы индикации и идентификации Ь-форм бруцелл», утверждены методической комиссией ВНИИБТЖ, протокол № 3 от 26.09.2003 г.

Основные теоретические положения и экспериментальные данные, изложенные в диссертационной работе, используются в научно-исследовательских лабораториях ИЭВСиДВ, ЯНИИСХ, НИИВВС, ИркНИВС, ВНИВИ, ВНИИБТЖ; в учебном процессе на кафедрах микробиологии и эпизоотологии ОмГАУ, НГАУ, АГАУ, КГАУ, ДонГАУ и ТСХА.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 156 страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список литературы, включающий 239 источника, в том числе 70 -иностранных и приложение.

ВЫВОДЫ

1. Установлена возможность и определены in vitro условия образования L-форм у штаммов В. suis 4-го биотипа (В. rangiferi) под действием антибиотиков.

2. Бруцеллы 4-го биотипа В. suis (В. rangiferi) в организме основного хозяина (северные олени) способны трансформироваться в L-формы с полной или частичной утратой клеточной стенки, изменяя при этом фенотипические дифференциальные признаки и в таком состоянии, могут длительно персистировать в органах и тканях.

3. L-варианты бруцелл сферопластного типа видов В. rangiferi и В. abortus, v' полученные in vitro и выделенные из организма основных хозяев, имели сходные морфологические, культуральные, тинкториальные, антигенные, агглютинабельные и вирулентные свойства. tí.

4. Под действием антибиотиков in vitro получена стабильная L-форма штамма В. abortus 19, популяция которой состоит из клеток шаровидной и овоидной формы, не агглютинируется S- и R-сыворотками, но имеет в своей структуре активный L-антиген. Полученный штамм пригоден для изготовления L-диагностикумов.

5. Бруцеллы незавершенного L-цикла могут реверсировать в типичную бактериальную форму in vitro в результате 5-20 генераций и in vivo при 1-2 кратном пассировании через организм лабораторных животных.

6. L-варианты бруцелл, трансформированные in vitro и выделенные из организма основного хозяина, в опытах на лабораторных животных проявляли способность заражать 80% морских свинок с индексом инфицированности 417%.

7. Культуры-ревертанты в минимальной дозе заражения, в региональных лимфатических узлах морских свинок способны вызывать выраженное раздражение фолликулов (до 134 мкм). L-формы бруцелл, в той же дозе заражения, вызывают умеренные раздражение фолликулов регионарных

•VI лимфатических узлов (до 106 мкм).

8. L-антисыворотка, полученная путем гипериммунизации кроликов штаммом В. abortus 19L, обладает требуемой специфичностью и диагностической активностью (1:320). Ее применение в комплексе с S- и R-сыворотками позволило выявить и идентифицировать антигенную специфичность у 110 (46,4%) из 237 полевых культур бруцелл, из которых 67 (61%) агглютинировались только L-антисывороткой.

9. Метод комплексной идентификации L-форм бруцелл превосходит по информативности другие использованные методы (многократные пересевы, пассирование через организм морских свинок, агглютинабельность L-сывороткой) и позволяет дополнительно выявить 85% культур бруцелл и установить бруцеллоносительство у 22,2% северных оленей в стадах с i Iразличной эпизоотической обстановкой по бруцеллезу.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Методические рекомендации «Методы индикации и идентификации Ь-форм бруцелл». Утверждены методической комиссией ВНИИБТЖ, протокол № 3 от 26.09.2003г.

2 Оформлена заявка на патент «Способ получения диагностической Ь-антисыворотки» (уведомление о положительном результате формальной экспертизы № 2003121773/13(023123) от 15.07.2003 г.).

3. Бактериологическую диагностику бруцеллеза животных проводить с обязательным учетом измененных бруцелл. С этой целью рекомендовано дополнительно к общепринятым бактериологическим методам использовать «Метод комплексной идентификации Ь-форм бруцелл», котбрый позволяет идентифицировать бруцеллы на разных стадиях их изменчивости и объективно оценивать процесс изменчивости и стадию трансформации выделенных культур бруцелл.

4. Прижизненную бактериологическую диагностику северных оленей на бруцеллез, проводить путем исследования кусочков пантов, осуществляя их отбор в период промышленной срезки.