Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Моноклональные антитела в разработке и совершенствовании методов диагностики бруцеллеза животных

министерство сельского хозяйства республики казахстан АЛМАТИНСКИЙ ЗООВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ

I- { о 0/1

На правах рукописи

БУЛАШЕВ Айтбай Кабыкешович

МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА В РАЗРАБОТКЕ И СОВЕРШЕНСТВОВАНИИ МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ БРУЦЕЛЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

16.00.03 — Ветеринарная микробиология, иммунология, эпизоотология и инфекционные болезни животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Алматы, 1994

Работа выполнена в проблемной лаборатории по с.-х. биотехнологии Акм< лннского сельскохозяйственного института МСХ Республики Казахстан.

Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор,

член-корреспондент КазАСХН Т. С. Сайдулдин

Ведущая организация'- Казахский научно-исследовательский ветеринарный институт

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук,

профессор Г. И. Лопатников

доктор биологических наук, профессор М. М .Ременцова

доктор медицинских наук, профессор А. Л. Котоьа

Защита состоится « «" » марта 1994 года в 10 часоз на заседании специ; лнзированного совета Д 18.01.02 при Алматинском зооветеринарном институп по адресу: 480013, г. Алматы, пр. Абая, 28.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Алматинского зооветер1 нарного института.

Автореферат разослан « 2. » февраля 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат ветеринарных наук, доцент

Н. Н. Ахметсадыков.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бруцеллез сельскохозяйственных, животных, являясь одной из наиболее распространенных инфекций, причиняет не только большой экономический ущерб животноводству, но имеет и определенное социальное значение. Сложная эпи-зоотолого-эпидемиологическая обстановка по данной инфекции сохраняется в Республике Казахстан, особенно в его северном регионе. Одним из основных звеньев в системе противобруцеллезных мероприятий является диагностика заболевания. Однако недостаточная эффективность бактериологического метода и официальных серологических реакций , не всегда позволяет своевременно выявлять всех животных, зараженных бруцеллезом.

Разработка диагностикумов нового поколения стала возможной на основе использования достижений одного из направлений современной биотехнологии—гибридомной техники (G. Kohler and С. Müstein, 1975), позволившей получить антитела, идентичные по всем параметрам, взаимодействующие с уникальной детерми-нантной возбудителя и доступные в неограниченном количестве. Гибридные клетки (гибридомы), полученные путем слияния аити-.телообразующих и миеломных (раковых) клеток, наследовали способность к неограниченному росту в культуре и в то же время к синтезу гомогенных, т. е. моноклональных антител. Последние, как правило, продуцируются изолированным клоном и, следовательно, представляют собой однородное химическое вещество, а не гетерогенную смесь сывороточных иммуноглобулинов, которая изменяется с каждым иммунизированным животным или с каждой порцией крови одного и того же организма. Указанные свойства моноклональных антител являются хорошей предпосылкой для создания высокоспецифичных и чувствительных методов диагностики инфекционных болезней, в том числе бруцеллеза.

Цель исследования. Повысить эффективность серологической диагностики бруцеллеза на основе использования моноклональных антител.

В соответствии с целью, были поставлены следующие задачи:

— определить антигены бруцелл, которые могут служить нм-мупогеном в гибридомной технике;

— получить штаммы гибридом, вырабатывающие монокло-нальные антитела против полисахаридных и белковых эпитопов бактерий рода Brucella; ,

— разработать н испытать методы экспресс-обнаружения бру-.целлезных антигенов в патмдтерцале, характеризующиеся высокой

L I

специфичностью и чувствительностью;

— разработать диагностическую тест-систему, предназначенную для выявления специфичных к бруцеллам антител в сыворотке крови животных л определить ее объективность в сравнении с общепринятыми серологическими реакциями;

— изучить иммунобиологический статус новорожденных неблагополучных и благополучных по бруцеллезу ферм (отар) и на основе полученных результатов разработать способ диагностики внутриутробного инфицирования особей бруцеллезом.

Научная новизна. Установлена эффективность Поли-Б антигена и белков внешней мембраны бруцелл в стимулировании лимфоцитов (спленоцитов) иммунизированных животных на синтез антител, специфичных к Brucella.

Впервые получены штаммы гибридных культивируемых клеток-продуцентов моноклональных антител к детерминантам «кор» участка полисахаридной цепи и белка внешней мембраны бруцелл, что подтверждено авторскими свидетельствами №№ 1604848, 1604849 и 1752764.

С помощью моноклональных антител установлена локализация в «кор» регионе ЛПС я Поли-Б как уникальных для бруцелл, так и общих с Yersinia enterocolitica 09 мульти- и унивалентных эпитопов. Белок внешней мембраны бруцелл с молекулярной массой 14 КД не участвует в агглютинации клеток в случае использования как моноклональных антител, так и поликлональной сыворотки, но обладает антигенным свойством.

Разработан способ идентификации бруцелл (Положительное решение Национального патентного ведомства Республики Казахстан от 11.11.92).

Разработаны экспресс-методы обнаружения антигенов бруцелл в иммуноферментном анализе, реакциях латекс-агглютинации и пассивной гемагглютинации, а также иммуноферментный диаг-ностикум, позволяющий выявить инфицированных телок и ярок, нереагирующнх на бруцеллез по результатам классических серологических тестов. «Набор для диагностики бруцеллеза методом ИФА на основе моноклональных антител» был удостоен серебряной медали ВДНХ СССР.

Получены новые данные, характеризующие иммунную взаимосвязь- в функциональной системе «мать—плод—новорожденный» при бруцеллезной инфекции. Показано, что у некоторых новорожденных телят н ягнят неблагополучной фермы (отары) до приема "молозива в сыворотке крови могут быть обнаружены противобру-целлезные антитела.

Разработан способ диагностики внутриутробного инфицирования ягнят бруцеллезом (Авт. свид-во № 1813450).

Практическая ценность работы. Штаммы гибридных культи-

вируемых кЛёток с авторскими названиями БАМА, БЙМА ir 1СЗ> продуцирующие моноклональные антитела против бактерий рода Brucella, депонированы во Всесоюзной (ныне Всероссийской) специализированной коллекции перевиваемых клеточных культур (г- Санкт-Петербург) и могут быть основой для создания высокоэффективных диагностических реагентов и производства монокло-нальных антител в промышленных условиях. На основании материалов диссертации разработаны:

— Технические условия «Набор для диагностики бруцеллеза методом ИФА на основе моноклональных антител» (ТУ 10.05.4000. 326-92), утвержденные ГУВ МСХ Республики Казахстан 8.12. 1992 г;

— Временная инструкция по изготовлению и контролю «Набора для диагностики бруцеллеза методом ИФА на основе моноклональных антител», утвержденная ГУВ МСХ Республики Казахстан 8.12.1992 г;

— Наставление по постановке и, учету ИФА для экспресс-обна* ружения бруцелл в латматериале, утвержденное ГУВ МСХ Республики Казахстан 8.12.1992 г.

Способ идентификации бруцелл может найти свое применение в определении принадлежности культур микроорганизмов к роду Brucella.

Использование способа диагностики внутриутробного инфицирования в неблагополучных, а также благополучных по бруцеллезу хозяйствах, где сохраняется опасность заноса инфекции н заражения животных, позволит предотвратить распространение инфекции и сократить сроки оздоровления.

Отдельные фрагменты результатов исследований были использованы автором при подготовке раздела «Инфекция жэне иммунитет» учебного пособия «Микробиология жэне иммунология» для студентов высших учебных заведений по специальности «Ветеринария».

Апробация работы. Результаты исследований доложены на итоговых конференциях ветеринарного факультета Акмолинского сельскохозяйственного института (1988—1992); координационном совете по ветеринарии ВО ВАСХНИЛ, г. Алма-Ата, 1988 г; научной конференции Троицкого ветеринарного института «Актуальные проблемы интенсификации животноводства в исследованиях молодых ученых», г. Троицк, d989; научно-производственной конференции Ставропольского сельскохозяйственного института, г. Ставрополь, 1990; межвузовской научно-практической конференции молодых ученых is специалистов« Вклад молодых ученых и специалистов в научно-технический прогресс сельскохозяйственного производства», г. Ставрополь, 1991; выставках «От фундаментальных исследований до практического внедрения» ВДНХ СССР, г. Моск-

ч -3

ва, 1591 г. и «Достижения народного хозяйства Казахстана», СУАР КНР, 1991 г; научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Научные достижения молодых ученых и специалистов — животноводству», г. Семипалатинск, 199Д; научно-практической конференции молодых ученых Целиноградского, государственного медицинского института, г. Целиноград, 1991; 5 объединенном съезде гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов, паразитологов и инфекционистов Министерства здравоохране^ ния Казахстана, г. Алма-Ата, 199.1; Всесоюзной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии, г. Целиноград, 1991; Всесоюзной научно-теорети;«еской конференции «Использование достижений биотехнологии в животноводстве и ветеринарии», г. Новосибирск, 1991; 44 Национальной конференции США по проблеме бруцеллеза, Иллинойс, штат Чикаго, 1991; Всесоюзных координационных совещаниях по. итогам научных исследований учреждений, занимающихся проблемой бруцеллеза за отчетный год и задачам на будущий период (Новочеркасск, 1989; Махачкала, 1990; Омск, 199.1); заседании секции ветеринарии НТС МСХ Республики Казахстан, г. Алма-Ата, 1992.

Публикации. Основные результаты по теме диссертации отражены в 25 статьях и 4 авторских свидетельствах.

На защиту выносятся:

1. Поли-Б и белки внешней мембраны бруцелл как эффективные антигены в стимулировании спленоцитов иммунизируемых животных на выработку антител, специфичных к Brucella.

2. Штаммы гибридных культивируемых клеток-продуценты моноклональных антител против бруцелл, полученные методом гибридомной техники путем слияния иммунных спленоцитов мышей с миеломой Х63. Ag8. 6. 5.

3. Антигенные свойства «кор» участка полисахарндной цепи ц белка внешней мембраны бруцелл с молекулярной массой 14 КД.

4. Иммуноферментные, латексные и эритроцитарные диагнос-тикумы для обнаружения антигенов бруцелл и специфичных к ним антител.

5. Особенности иммунной взаимосвязи между организмами коров или овцематок и нх плодов (новорожденных) при бруцеллезной инфекции.

6. Способ диагностики внутриутробного инфицирования особей бруцеллезом.

Структура диссертации. Диссертация изложена на 319 страницах машинописи, содержит 38 таблиц и б рисунков. Она состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения,' выводов, практических предложений, списка использованной литературы и приложения. Библиография включает 387 наименований источников литературы.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы исследований.

В основу настоящей диссертационной работы положены материалы, полученные п результате выполнения научно-исследовательской тематики биотехнологического центра Акмолинского сельскохозяйственного института с 1986 по 1993 год.

Отдельные фрагменты работы, касающиеся разработки и испытания экспресс-методов обнаружения бруцеллезных антигенов в патматериале или индикации Brucella в бактериальной культуре, проводились с участием сотрудников лаборатории иммунодиагностики (зав. проф. Б. В. Каралышк) и лаборатории бруцеллеза (зав. проф. С. А. Амиреев) НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней Министерства здравоохранения Республики Казахстан; лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики бруцеллеза Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии РАСХН (зав. с. н. с. В. А. Ромахов); лаборатории иммунологии Института биооргапической химии РАН (зав. в. и. с. В. А. Несмеянов).

Бактериальные антигены. В работе использованы: цельные клетки Brucella abortus 19, Escherichia co!i 675 и Micrococcus lysodeicticus 2665; полн-Б антиген Brusella melitensis В115 и белки внешней мембраны (БВМ) Brucella abortus 19, Brucella melitensis 16 M, Brucella suis 1330, Yersinia enterocolitica 09, изолированные соответственно no R. Diaz (1979) и L. Tabaitabai (1979). Кроме того, антигенами служили бактериальные препараты, полученные из других научных учреждений. Цельные клетки: Brucella suis 1330, 1000; Brucella melitensis REAM, Невский, 498; Brucella ovis 428 любезно предоставлены проф. Ивановым Н. П. из КазНИВИ; Brucella aboftus 104М, 16/4; Brucella suis 61, Brucella meltiensis 237, K24; Yersinia enterocolitica 09—ст. научи, сотр. Ромаховым В. А. из Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии; Brucella melitensis 261, 262, 317, 328, 358, 374, 379, 382, 639, 495, Ether, 16М, 255, 256, 378, 326, 496, 484, 501, 307, 248, 291, 487: Brucella abortus 485, Tulya, 870, 19, 54, 99, 544, 493, 86(8), 59, 68, 3/96: Brucella canis 1066; Brucella ovis 63/290; Salmonella wiane 894i/68; Salmonelle odyk !1667; Salmonella donna 271; Salmonella staiofrrad 1549; Salmonella dailassame 594/89; Salmonella pwlcsbere 632; Salmonella urbana 1221; Salmonella sorenga 871'; Salmonella landau 556—проф. Каральником Б. В. из НИИ эпидемиологии, микробиологии и инфекционных болезней МЗ PK. По-дисахаридные антигены: поли-Б Brucella abortus 54; Brucella melitensis 16M; лппополисахариды (ЛПС) Brucella abortus 19, 54, 99; Brucella melitensis 16M; Yersinia enterocoliiTa, а также фраг-

менты поли-Б антигена бруцелл (глюкан, полисахариды и липиды) получены из НИИ эпидемиологии и микробиологии'им. Н Ф. Гамалеи РАМН от ст. «ауч. сотр. Львова В. А. В качестве антигенов использовались и коммерческие диагностикумы: дизентерийные (Shigella sonnei Shigella flexneri, Shigella newcastle), туляремий-ный (Fancisella tularensis), вибриозный (Campylobacíter fetus vene-ralis), а также ультразвуковой дезинтеграт Brucella abortus 19.

Гибридомная техника. Гибридомы получали путем слияния лимфоцитов (спленоцитов) мышей, линии BALB/C, стимулированных различными антигенами бруцелл: цельными клетками Brucella abortus 19, поли-Б Brucella melitensis В115 и БВМ B'rusella melitensis В115, с миеломной линией Х63. Ag8. 6. 5. В качестве сливающего агента использовали 45% раствор полиэтиленглюколя — 4000. Для культивирования клеток использовали среду RPMI-1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки плода. Селекцию гибридом проводили в среде, содержащей гипоксантин, аминопте-рин и тимидин. Клонирование гибридных клеток осуществлялось методом лимитирующих разведений (J. Godig ét al, 1983). Ас-цитную жидкость получали культивированием клеток в брюшной полости сингенных мышей. Активность и специфичность монокло-нальных антител (МКА), продуцируемых гибридомами в культу-ральную среду или асцитную жидкость, определяли в реакции микроагглютинации (МРА), твердофазного иммуноферментного анализа (ТИФА) и методом иммуноблотинга. Константу связывания МКА устанавливали по J. Betity et al. (1987).

Животные, использованные в работе, и общая характеристика опытов. При выполнении работы использованы следующие виды и возрастные группы животных: телки здоровые 1 (неиммунные), вакцинированные и экспериментально инфицированные бруцеллезом в возрасте 4-5 мес.; телки 9-10 мес. возраста, экспериментально зараженные бруцеллезом после иммунизации или в неиммунном состоянии; коровы и овцематки благополучных и неблагополучных по бруцеллезу ферм (отар); телки и ярки в возрате 3-5 мес.; новорожденные телята и ягнята, а также аборт-плоды, полученные от маток благополучных и неблагополучных ферм (отар).

Образцы селезенки, печени и сыворотки крови 25 коров бруцеллезного изолятора исследовались на наличие антигенов возбудителя с помощью непрямого и сэндвич вариантов ТИФА па основе МКА. Сыворотка крови животных, взятая перед убоем, подвергалась серологическому анализу в МРА и непрямом ТИФА.

Эффективность и достоверность непрямого варианта точечного ТИФА при выявлении антигенов бруцелл определялась на пробах паренхиматозных органов и лимфатических узлов 5. коров, реагирующих на »бруцеллез, в сравнен,ни ~с . бактериологическим

методом. _ ______ _. __________

Диагиостичсскуго цспиость сэндвич варианта точечного ТИФА и реакции латекс-агглютинации (РЛА) при экспресс-обнаружении бруцеллезных антигенов в патматериале устанавливали в эксперименте на 15 телках 9-10 мес. возраста. Животные заражались конъюнктивально суспензией 2-х суточной вирулентой культуры Brucella abortus 54 в дозе 15,0—17,0 млн. м. кл. 10 голов из 15 за 6 месяцев до инфицирования вакцинировались Brucella abortus 19. Через 30 дней после заражения телкп были убиты, а их паренхиматозные органы, лимфатические узлы исследованы бактериологическим методом, а также с помощью ТИФА и РЛА на наличие бруцелл или их антигенов. Аналогичным исследованиям подвергали пробы материала, взятые от двух здоровых (контрольных) животных. Упомянутый вариант иммуноферментного анализа был испытан и на образцах содержимого желудка аборт-плодов крупного рогатого скота.

Для определения возможности выявления циркулирующих.антигенов бруцелл в сыворотке крови животных с помощью моно-клональных антител в непрямом точечном ТИФА использовали 15 телок 4-5 мес. возраста. Из них 5 иммунизировали вакциной Brucella abortus 82 в дозе 80 млрд кл., 5 заражали подкожно культурой Brucella abortus 54 в дозе 160 млн. кл. Остальные животные не вакцинировались и не инфицировались (контроль). От подопытных телок брали образцы крови в пробирки с антнкоагулянтом и без него ежедневно, начиная с 3 дня иммунизации или заражения по 7 день, а затем на 10,14 дни эксперимента,1 а далее через каждые 10 дней в течение 4 месяцев для анализа сыворотки крови на бруцеллезный антиген, а также проведения гематологических и серологических исследований.

Эритроциты, сенсибилизированные (сепснтизированные) моно-клоналыгыми антителами, использовались нами в реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) для обнаружения бруцеллезных антигенов в образцах молока и шерсти (выстриженной вокруг ануса), взятых соответственно от 1117 и 73 овцематок неблагополучных хозяйств. Кроме того, исследованию в данном иммунологическом тесте подвергалось содержимое желудка аборт-плодов, а также пробы навоза, отобранные в различных местах кошары.

Сравнительную чувствительность различных вариантов имму-воберментпого анализа и классических серологических реакций (РА, РБП, РСК) изучали на 791 телке благополучных и неблагополучных по бруцеллезу ферм. Из них 431 исследовались в 4-5 мес. возрасте перед вакцинацией и 360 — перед ревакцинацией в возрасте 16-17 мес. Эти же серологические тесты использовались при исследовании ярок 3-4 мес. возраста неблагополучной по бруцеллезу отары в количестве 692 гол.

При изучении иммунобиологического статуса новорожденных

it разработке метода диагностики внутриутробного инфицирования использовались 51 корова бруцеллезного изолятора н 48 коров благополучной фермы вместе с новорожденными телятами; 184 овцематки и их приплод в количестве 188 гол. двух неблагополучных отар; 102 овцематки и 110 ягнят благополучной отары. После родов у матерей и до приема молозива у новорожденных брали образцы крови из яремной вены для проведения серологических и гематологических исследований. У телят и ягнят в предмолозив-ный период были взяты и пробы первородного кала (мекония), которые исследовались на бруцеллезный антиген с помощью имму-ноферментного анализа. В течение первого месяца постнатальной жизни учитывали заболеваемость и падеж молодняка.

Для обработки полученных результатов использовались стандартные классические методы анализа проверки статистических гипотез: оценка достоверности по методу Стьюдента и оценка связи между признаками. Статистический анализ результатов серологических исследований проводили по методу, описанному Т. С. Сайдулдиным (1981). Достоверными считали различия при

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Характеристика моноклональиых антител

Всего проведено 5 гибридизаций (слияний) лимфоцитов иммунизированных мышей с миеломной линией клеток. В первом и втором слияний в качестве иммуногена служили цельные клетки Brucella abortus 19, в последующих двух — поли-Б Brucells meli-tensis В115 и в последнем — БВМ Brucella melitensis 16М. Из числа выросших клонов (штаммов) гибридом от 0,9% до 17,1% обладали антительной активностью против использованных антигенов. Для изучения отбирались штаммы гибридных клеток, которые, с одной стороны, лучше росли в условиях in vitro, а с другой — проявляли относительно высокую активность в иммунофермент-иом анализе.

МКА 8 штаммов гибридом, полученные в результтае I и II слияний, проверялись на активность по отношению к ЛПС Brucella abortus 19 в ТИФА. Антитела штаммов, обозначенные как 1Д8, 1В8, ЗА4, ЗС4, не взаимодействовали с ЛПС и цельными клетками соответственно в ТИФА и МРА. МКА остальных 4 гибридом: 2Е, 2С4, 5А8 и 7В2 хорошо связывались с ЛПС, хотя антитела последних двух штаммов не характеризовались агглюти-набельным свойством. Отметим, что ни один из испытанных видов МКА не показал специфичность к бруцеллам, так как вступали п перекрестную реакцию с аналогичными антигенами Yersinia еп-terocolih'ca 09, Escherichia coli 675 и Salmonella urbana 1221.

Из числа штаммов клеток, полученных путем слияния миело-

Мы со сплепоцитамн Мышей, иммунизированных поли-В антигеном бруцелл, для дальнейшей работы были отобраны 6 гибридом с авторскими названиями БАМА, БИМА (Ш-е слияние), 5А9, 5Д2, 7G10, 7F10 (IV-oe слияние). В непрямом варианте ТИФА антитела, продуцируемые штаммом БИМА, довольно хорошо связывались со всеми использованными антигенами бруцелл, в том числе с ЛИС и цельными клетками йерсинии серовара 09—1:204800— 1:819200. МКА культуральной среды этой гибридомы не взаимодействовали с цельными клетками гетерологичных бактерий, тогда как антитела асцитной жидкости связывались с ними только в исходном разведении 1:100.

Антитела культуральной среды штамма БАМА вступали в реакцию с цельными клетками 3 основных видов бруцелл и <не реагировали с аналогичным антигеном использованных грамотрицатель-ных бактерий в ТИФА. Титры антител асцитной жидкости против клеток Brucella suis и Brucella abortus были равны 1:800 и 1:1600 соответственно. Отмечалось слабое взаимодействие с клетками йерсинии (1:200). Активность МКА БАМА была высока против поли-Б Brucella abortus B115—1:12800, ЛПС Brucella abortus 19, 54, 99—1:6400 и низка по отношению к одноименным антигенам Brucella melitensis 16М (1:100) Yersinia enterocolitica 09 (1:200). Следует подчеркнуть, что антитела обоих штаммов реагировали с антителами как R-.так и S-форм бруцелл. ,

МКА БИМА показали активность в МРА против клеток бруцелл и йерсинии, но не агглютинировали гетерологнчные бактерии даже в исходном разведении асцитной жидкости. МКА БАМА оказались менее активными, но более специфичными, и позволяли дифференцировать бруцелл от йерсинии. Антитела последнего штамма слабо агглютинировали Brucella melitensis 237, хотя они показали высокую активность в МРА против Brucella melitensis REV-1.

Иммуноферментный анализ, поставленный по схеме МКА БАМА+ангиген+меченые ферментом МКА БИМА, >не улавливал ЛПС пли клетки Brucella melitensis 16М, Yersinia enterocolitica 09 в исходной концентрации 1 10 3 мг^мл или 1^<1010 кл/мл, но обнаруживал аналогичные антигены Brucella abortus 19, 54 в количестве не менее 3^10 6 мг/мл и 106 кл/мл. МКА БИМА, использованные в качестве как первых, так и вторых антител в ТИФА, также придавали анализу высокую чувствительность. Так, антитела этой гибридомы в сэндвич варианте иммуноферментного "анализа также не выявляли полисахаридные или корпускулярные антигены Brucella melitensis 16М и Yersinia enterocolitica 09, хотя, как было отмечено выше, реагировали с ними в непрямом ТИФА. Другие грамотрицательные бактерии, такие как сальмонеллы, ки-

точная палочка, шигсллЫ не опрёделялись в сэндвич ТИФА в исходной-концентрации, равной08 кл/мл.

Антитела, продуцируемые штаммами 5А9 и 7F10, характеризовались относительно высокой активностью в непрямом иммуио-ферментном анализе. Так, титры МКА упомянутых гибридных клеток против поли-Б Brucella meiitensis В115 и ЛИС Brucella abortus 19, 54, 99 в асцитной жидкости достигали 1:204800. Антитела этих же штаммов хорошо связывались с клетками трех основных видов бруцелл — 1:12800—1:204800. Оба типа МКА слабо взаимодействовали с антигенами йерсинии серовара 09—1:800—1:1600. Интересно отметить, что антитела как 5А9; 7^10, так и БАМА; БИМА не реагировали с поли-Б антигеном Brucella abortus 54, хотя они проявляли высокую активность против ЛИС этого штамма бруцелл. Установлена относительно слабая активность названных типов антител по отношению к поли-Б Brucella meiitensis 16М. МКА 5Д2 и 7010 показали меньшие титры и по специфичности к использованным видам (штаммам) бруцелл существенно не отличались между собой. Как следовало ожидать, антитела, вырабатываемые гибридами 5Д2, 5А9, 7С10 и 7F10, обладали способностью агглютинировать клетки S- и R- форм бруцелл — 1:6400—1:51200 при отрицательных результатах МРА в случае использования ге-терологичных микроорганизмов, хотя вступали в перекрестную реакцию йерсиниями в титрах 1:400—1:1600.

Активность МКА против определенного корпускулярного антигена проявлялась по-разному в зависимости от вида использованного иммунологического теста- Например, если в иммунофер-ментном анализе МКА 5Д2 и 7С10 выявили Brucella abortus, 19, 54 в более низких титрах—4:1600—1:3200, чем МКА 5А9 и 7F10— 1:104200—1:204800, то в МРА они агглютировали эти же клетки в близких разведениях (5Д2—1:6400, 7С10—1:12800, 5А9—1:12800, . 7F10—1:51200). ,

Гибридома с авторским названием 1СЗ, изолированная из числа штаммов клеток последнего, т. е- V слияния, продуцировала антитела, не обладающие агглютинабельным свойством, но связывающиеся с белками внешней мембраны в иммуноферментном анализе в титрах 1:800—Brucella meiitensis 16М, 1:3200—Brucella suis 1330. 1:6400—Brucella abortus 19.

Результаты иммуноблотинга показали, что МКА БАМА и БИМА. взаимодействуют с полисахаридными эпитопамн «кор» участка поли-Б Brucella meiitensis В115, а также Brucella abortus 19 и 54. Антитела штамма 1СЗ оказались специфичными к детерминанте, расположенной в составе белка внешней мембраны с молекулярной массой 14КД.

Приведенная характеристика МКА, продуцируемых штаммами гибридом III, IV и V слияний, свидетельствует о возможности

использования их в совершенствовании существующих . й разработке новых методов серодиагностики бруцеллеза.

2. Использование моноклональиых антител „

в идентификации бруцелл

Способ идентификации бруцелл, разработанный нами в ходе выполнения настоящей работы, заключался в использовании эритроцитов, сенсибилизированных МКА БАМА, в РПГА. Данный способ испытан в определении принадлежности культур микроорганизмов к роду Brucella в сравнении с известным, который основан па использовании поликлональной сыворотки в РА на стекле. В работе было использовано 40 культур бруцелл различных видов и биоваров, а также 9 культур Salmonella группы N.

Эритроцитарный диагностикум и известный способ из 26 типичных культур в S-форме идентифицировали 25. Единственная культура Brucella abortus 870 не агглютинировалась при обоих способах. Клетки Brucella ovis 63/290 и Brucella canis 1066 в R-форме не определялись известным способом. В то же время обе культуры бруцелл склеивались и могли быть идентифицированы при использовании антительного эритроцитарного диагностикума. Все 9 испытанных культур сальмонелл не агглютинировались эритроцитами, сенсибилизироваными МКА, хотя 7 из них склеивались поликлональной бруцеллезной сывороткой и могли быть неправильно идентифицированы.

Из 49 исследованных культур идентификация по известному способу оказалась невозможной или ошибочной в 10 случаях (20,4+5,8%), а по результатам эритроцитарного диагностикума —. только в одном случае (2,0+2,0%), т. е. предлагаемый нами способ достоверно (0,01 >Р>0,001) снизил частоту ложных результатов идентификации в 10 раз.

Таким образом, эритроцитарный диагностикум на основе МКА позволяет повысить точность идентификации выделенных культур бруцелл, благодаря предотвращению ложноположительной агглютинации пз-за родственных антигенов между ними и другими грам-' негативными бактериями, а также исключению ложноотрица-тельпых результатов.

3. Экспресс-методы обнаружения бруцеллезных антигенов в патматериале

Экспресс-методы определения антигенов бруцелл в образнах патматериала явились предметом разработки в рамках диссертационной работы. Для этой цели нами определялись оптимальные условия и техника постановки различных вариантов иммунофер-ментного анализа, реакции латекс-агглютинации и реакции иас-

сивной гёмагглкзтинации с использованием МКА БАМА, и] БИМА, позволяющие получить объективные данные при исследовании биологического объекта. Результаты этих опытов легли в основу разработанных нами иммунологических тестов, предназначенных для экспресс-индикации бруцеллезных антигенов.

3.1. Диагностическая ценность ТИФА при экспресс-обнаружении антигенов бруцелл в патматериале.

Бруцеллезный антиген был обнаружен с помощью непрямого и сэндвич вариантов ТИФА у 14 гол. или 56% коров фермы изолятора. Чувствительность иммуноферментного анализа была выше в случае использования МКА в его сэндвич варианте. Так, в непрямом ТИФА антигены бруцелл определялись в селезенке или печени 8 животных, тогда как сэндвич-анализ позволил выявлять полисахаридные компоненты возбудителя в экстрактах паренхиматозных органов 13 коров. Важно подчеркнуть, что в сэндвич ТИФА бруцеллезный антиген был найден в патматериале 3 гол., которые не реагировали на бруцеллез серологически.

Экстракты печени и селезенки животных исследовались на антигены бруцелл и в точечном ТИФА. Как следовало ожидать, непрямой и сэндвнч варианты иммуноферментного анализа, где в качестве твердой фазы была использована ннтроцеллюлознаи мембрана, полностью подтвердили результаты панельного ТИФА, выполненного на полистироловом носителе. Следует отметить простоту постановки и учета результатов точечного ТИФА. Так, при проведении иммуноферментного анализа на нитроцеллюлозной мембране не требуются промывочное и считывающее устройства, а его положительная реакция видна па поверхности носителя в виде цветных точек.

Непрямой точечный ТИФА показал высокую достоверность при исследовании патматернала серопозитивных коров (п = 5). Так, бруцеллез после убоя подтвержден как по результатам бактериологического метода, так и иммуноферментного анализа. Однако эффективность обнаружения бруцелл (или их антигенов) в патматериале у сравниваемых методов была различной. Например, культура бруцелл была выделена из 10 проб, что составляет 28,5%. от общего количества исследованных, тогда как испытуемым тестом не только подтверждены данные бактериологического метода, но и дополнительно выявлено наличие бруцеллезного антигена в дру-■гих образцах патматернала (17 проб или 48,6%)- В двух случаях, несмотря на положительные результаты баканализа, не удалось обнаружить бруцеллезный антиген в ТИФА.

В группе телок, экспериментально зараженных бруцеллезом через 6 мес. после иммунизации и использованных для определе-

ния диагностической ценности сэндвич варианта точечного' ТИФА (Н" 10), культура бруцелл выделена только у одной головы, а по результатам испытуемого метода искомый антиген установлен в паренхиматозных органах и лимфатических узлах 9 телок. Всего антигены бруцелл были найдены в 35 образцах патматериала из 100 исследованных. Исходная культура бруцелл изолирована из паренхиматозных органов или лимфатических узлов всех 5 телок, не подвергнутых вакцинации перед заражением. Сэндвич ТИФА также обнаружил бруцеллезный антиген в экстрактах патматериала этих же животных. Всего исследовано 54 пробы патматериала, из числа которых 14 (25,9%) показали положительный результат по бактериологическому анализу, тогда как антиген возбудителя в ТИФА определялся в 27 (50%) образцах органов или лимфатических узлов. Отметим, что в 14 пробах патматериала, из которых была изолирована культура бруцелл, специфический антиген в иммуноферментном анализе обнаруживался в 11 (78,6%) случаях. Однако ТИФА выявил бруцеллезный антиген в 16 (29,6%) пробах с отрицательными результатами бактериологического метода. Иммуноферментный анализ и бактериологический метод показали отрицательный результат при исследовании экстрактов материала двух контрольных телок, одна из которых вакцинировалась за 3 месяца до убоя, а другая была ннтактной.

Эффективность сэндвич варианта точечного ТИФА была апробирована и па патматериале от абортированных плодов крупного рогатого скота. При этом бруцеллезный антиген обнаружен имму-ноферментным анализом в содержимом желудка и паренхиматозных органах всех аборт-плодов, из которых в дальнейшем бактериологическим методом была изолирована культура Brucella abortus.

Таким образом, твердофазный иммуноферментный анализ, выполняемый ira полистироловой панели или нитроцеллюлозной мембране в непрямом и сэндвич вариантах с использованием мо-ноклональных антител штаммов гибридом БАМА и БИМА, является эффективным диагностическим тестом, позволяющим за короткое время (3—3,5 ч) определить наличие или отсутствие бруцеллезного антигена в патматериале. Сэндвич ТИФА на нитроцеллюлозной мембране имеет существенное преимущество перед другими вариантами постановки этого теста, которое заключается •s его высокой чувствительности, специфичности, простоте выполнения анализа п учета результатов реакций.

3.2. Определение антигенов бруцелл в реакциях латекс-агглютинацин и пассивной гемагглютинации

Датешше частицы, сенсибилизированные антителами гнбри-

домы БИМА, испытывались нами в реакции латекс-агглютинацип для экспресс-обнаружения бруцеллезных антигенов. Чувствительность латексного диагностикума в PJIA находилась в зависимости от исследуемого вида бруцелл. Так, например клетки Brucella abortus определялись в концентрации от 51,2±7,4—144,0+9,6 тыс. м. кл./мл, тогда как минимальное количество клеток Brucella melitensis, выявляемое в РЛА, находилось в пределах от 2400,0+ 160,0 до 9800,0+240,0 тыс. м. кл./мл. Необходимо отметить, что чувствительность латексного диагностикума была также высокой по отношению к бруцеллам, находящимся в R-форме — Brucella ovis 428 и Brucella suis 1000 (140,0—155,0 тыс. м. кл./мл). Растворимый антиген бруцелл — поли-Б Brucella melitensis обнаруживался в РЛА с помощью латексного диагностикума в концентрации 2>Ц10"9 г/мл и выше.

Показателем специфичности серологических реакций, основанных на феномене агглютинации, является соотношение минимальной концентрации гетерологичных (близкородственных) и гомологичных бактерий, вызывающих агглютинацию носителя (латекс-ных частиц, эритроцитов и т. др.). Чем больше это соотношение, тем выше специфичность. Латексный диагностикум, изготовленный на основе МКА БИМА, давал прекрасную реакцию,только с Yersinia enterocolitica 09 в концентрации 218,7 млн. кл./мл и выше. -Различные виды (штаммы) Salmonella, а также коммерческие дизентерийные антигены в предельно использованной дозе — 875,0 млн. м. кл./мл не могли агглютинировать латексный диагностикум. Показатель специфичности последнего при индикации бруцелл находился в пределах от 4271,5+452,0 до 22,3+0,6.

Латексный диагностикум апробировался на патматериале (селезенка, печень и лимфатические узлы), взятом от экспериментально зараженных бруцеллезом телок, в сравнении с сэндвич вариантом точечного ТИФА и бактериологическим методом. Культура Brucella abortus 54, использованная для заражения телок, была выделена из образцов патматернала всех инфицированных животных. Реакция латекс-агглютинации, как и иммунофермент-нын анализ, также подтвердила инфицированность всех подопытных телок. Из 54 проб патматернала культура бруцелл была изолирована из 14 или 25,9%, в это время бруцеллезный антиген найден с помощью ТИФА и РЛА соответственно в 27 (50%) и 29 (53,7%) образцах. В 14 пробах патматернала, из которых выделена исходная культура бруцелл, искомый антиген выявлен как в РЛА, так и ТИФА в 11 случаях (78,6%), однако реакция латекс-агглютинации установила наличие полисахаридных компонентов возбудителя в 18 образцах с отрицательными результатами .бактериологического анализа. Паренхиматозные органы и лимфатические узлы в KojfAiecTBe 35 проб, взятые от коров благополучного стада, И

нереагирующих на бруцеллез по классическим серологическим реакциям н ТИФА, ни в одном случае не вызывали агглютинацию латексного диагностикума. Все образцы материала, взятые от двух контрольных животных, дали отрицательный результат как по РЛА, так и ТИФА.

Эритроциты, сенсибилизированные МКА штамма гибридных клеток БИМА, лучше агглютинировали в РИГА клеткис Brucella abortus 19 (623,0±25,7 тыс. м. кл/мл) 544 (574,0±38,9 тыс. м. кл/мл) и Brucella suis 4330 (659,0+24,4 тыц м. кл/мл) по сравнению с диагностикумом, изготовленным на основе МКА БАМА, хотя уступали ему в индикации корпускулярных антигенов Brucella abortus 99 (476,0+32,9 против 305,0+20,2 тыс. м. кл./мл; Р<0,05). Чувствительность эритроцитарпого диагностикума из коммерческой поликлюнальной сыворотки была ниже, чем у аналогичного препарата из моноклональных антител обоих штаммов гибридом (Р<0,01).

Специфичность РИГА определяли с использованием бактерий, имеющих антигенное сходство с бруцеллами. Установлено, что ни один вид гетерологичных микроорганизмов: нерсинии, сальмонеллы и франциселлы не агглютинируют эритроцитарный днагности-кум из обоих типов МКА в максимально использованной концентрации — 875,0 млн. м. кл./мл. В то же время агглютинирующая активность этих же бактерий в РПГА с применением эритроцитов, сенсибилизированных антителами поликлональпой сыворотки, оказалась достоверно высокой и, следовательно, показатель специфичности — существенно более низким.

Эффективность эритроцитарного диагностикума из МКА гибро-домы БАМА определялась на образцах материала, взятых от овцематок неблагополучных по бруцеллезу отар, в сравнении с бактериологическим методом. Из 1117 проб молока культура возбудителя была выделена в 10 (0,9%) случаях, а бруцеллезный антиген з РПГА с эритроцитарным диагностикумом найден чаще в 87 (7,8%). образцах. Специфичность индикации антигена подтвердилась его находками во всех пробах, из которых в дальнейшем изолирован возбудитель. Антигены бруцслл обнаружены в 25 из 73 исследованных образцов шерсти (34,2%), при отрицательном результате бак-анализа. Культура не выделена и из 30 проб навоза, хотя РПГА была положительной в 22,9% случаях. Диагностическая цсшюсть эритроцитарного диагностикума была выше, чем у бактериологического метода, и при исследовании содержимого желудка аборт-плодов.

Таким образом, моноклональные антитела штаммов гибридом БАМА и БИМА являются ценными иммунореагентами, которые могут быть использованы при изготовлении высокочувствительных и специфичных латексных или эритроцитарных диагносгикумов. Пол*

следние в РЛА и РПГА позволяют за короткое время (2,5—3 ч) установить наличие или отсутствие бруцелл или их антигенов в исследуемом материале.

4. Динамика циркулирующих бруцеллезных антигенов в ходе инфекционного и вакцинного процессов

Бруцеллезный антиген в сыворотке крови телок, инфицированных вирулентным штаммом Brucella abortus 54 (п = 5), обнаруживался в непрямом варианте точечного ТИФА уже на 3 сутки после заражения (п. з.) у двух животных, а в последующие два дня выявлен у остального поголовья. Циркулирующие антигены определялись и на 6, 7 сутки п. з., однако образцы крови всех 5 гол., взятые на 10 сутки эксперимента, показали отрицательный результат в иммуноферментном анализе. Повторная индикация искомого антигена стала возможной на 14 сут. п. з. Сыворотка крови телок на 24 сут. опыта, по данным использованного теста, вновь не содержала бруцеллезного антигена. Третье и последнее появление циркулирующих антигенов животных в течение эксперимента отмечено на '34 сут. п. з. Далее антигенемия наблюдалась у всех телок пои исследовании на 44,54 дни опыта, а к 64 определялась; только у 3 гол. С 74 сут. до конца наблюдения (144 сут.) специфический антиген не тестировался в пробах сыворотки крови зараженных животных.

У телок, вакцинированных Brucella abortus 82 in=5), бруцеллезный антиген в крови также был выявлен на 3—5 сут. после иммунизации, хотя через два дня, т. е. на 7 сут., не определялся в сыворотке крови всех животных. В дальнейших исследованиях антигенемия установлена у 3 гол. на 10 сут.. а у других 2 телок антигены бруцелл обнаруживались на 14 и 34 дни иммунизации. Далее до конца опыта результаты ТИФА при исследовании сывороток крови вакцинированных телок на искомый антиген были отрицательными.

Таким образом, бруцеллезный антиген в крови экспериментально зараженных телок по данным иммуноферментного анализа может циркулировать с 3 до 64 сут. после инфицирования. У животных, вакцинированных Brucella abortus 82, антигены перснсти-руют в крови в течение месяца после иммунизации. Динамика анти-генемии как у инфицированных, так и вакцинированных телок в указанные периоды характеризовалась волнообразпостыо, т. е. бруцеллезный антиген обнаруживался в крови только в определенные сроки после заражения или иммунизации животных.

5. Сравнительная оценка иммуноферментной тест-системы при определении противобруцеллезных антител в сыворотке крови

В процессе выполнения одной из задач настоящей работы нами

разработана иммуноферментная тест-система (ИФА-тест), предназначенная для определения противобруцеллезных антител в сыворотке крови животных. Принцип предлагаемого теста основан на использовании МКА и ультразвукового дезннтеграта клеток бру-целл в сэндвич варианте иммуноферментного анализа.

Сыворотка крови 431 телки и 69? ярок, нереагирующих на бруцеллез по РА, РСК и РБП перёд вакцинацией, подвергалась исследованию на наличие антител в иммунофермеитной тест-системе, а также в непрямом ТИФА, где в качестве антигенов использовались единый антиген для РА, РСК и РДСК или ультразвуковой дезинтеграг Brucella abortus 19.

Противобруцеллезные антитела не были найдены в сыворотке крови телок 4-5 мес. возраста благополучной фермы (п=32) и по данным обоих вариантов иммуноферментного анализа. Среди телок этого же возраста другой благополучной фермы (п=52) 5,7% животных показали положительный результат только в непрямом ТИФА. При исследовании сывороток крови телок двух неблагополучных по бруцеллезу ферм (n=277i антитела против бруцелл выявлялись как в непрямом ТИФА — 2,9%—5,8%, так и иммунофермеитной тест-системе — 2,9% —10,2% в среднем титре 1:170 (+3,5%, —3,3%). Положительные результаты только по ИФА-тесту получены у 2,0%—5,0% телок (п = 70) двух других неблагополучных хозяйств. Чувствительность непрямого ТИФА была выше в случае применения планшетов, сенсибилизированных ультразвуковым дезинтегратом бруцелл. Наибольшее количество телок, реагирующих на'бруцеллез по ИФА-тесту, выявлено при! использовании в качестве первых антител МКА 7F10. Более высокая эффективность этого диагностикума по сравнению с официальными методами была установлена и при серологическом исследовании молодняка неблагополучной отары. Так, только испытуемая тест-система показала положительный результат в среднем титре 1:250 (+4,3%, —4,0%) при исследовании сывороток крови 8,9% ярок.

Между титрами антител, установленными в непрямом ТИФА с использованием единого бруцеллезного антигена и ультразвукового дезинтегоата клеток, существовала тесная положительная связь с коэффициентом корреляции 0.79 (Р<0,0011. Результаты непрямого ТИФА с единым бруцеллезным антигеном и ИФА-теста с МКА 7F10 или 1СЗ такж<* находились межлу собой в прямой зависимости: г = 0,37; Р<0,05 и г = 0.50; Р<0,01, соответственно. Коэффициент корреляции между титлами антител в ИФА-тесте с МКА 7F10 и 1СЗ был равен 0,76 (Р<0.01).

Объективность иммунофермеитной тест-системы в выявлении нифнцироваиных животных определялась на основе бактериологического и иммуноферментного анализов перенхнматозных орга-

нов или лимфатических узлов, взятых от молодняка овец, реаги рующего на бруцеллез по комплексу серологических реакций (п=3) пли только по ИФА-тесту (п = 2).

Культура бруцелл была выделена из образцов патматернала всех 3 животных, показавших положительные результаты одновременно по РА, РСК, РБП и ИФА-тесту. Инфицированность этих животных подтверждена и по данным сэндвич варианта точечного ТИФА с МКА БИМА. Результаты последнего теста были положительными и при исследовании проб патматернала обеих ярок, у которых противобруцеллезные антитела обнаруживались только по иммуноферментной тест-системе, хотя культуру возбудителя удалось изолировать только из печени одной из них.

Таким образом, предлагаемая нами иммуноферментная тест-система обладает высокой чувствительностью при исследовании животных на бруцеллез и позволяет более эффективно выявлять инфицированный молодняк, чем классические серологические реакции.

6. Иммунобиологический статус новорожденных животных неблагополучных по бруцеллезу ферм (отар)

6.1. Определение преколостральных антител у новорожденных животных при бруцеллезной инфекции

В сыворотке крови некоторых телят, полученных от коров фермы-изолятора (п=51), до приема молозива установлено наличие антител, взаимодействующих с антигенами бруцелл. Так, агглютинины в среднем титре 1:36,8 (+94,5%, —48,5%) были выявлены в сыворотке крови 9,8% новорожденных. Среди них комплемент-связывающие антитела в титре 1:32,5 (+98,6%, —49,6%) обнаруживались у 5,9% телят, которые показали положительные результаты и по РБП. Наибольшее количество животных, имеющих антитела в сыворотке крови до приема молозива, установлено в имму-ноферментном анализе. Последний подтвердил результаты классических серологических реакций и позволил выявить антитела дополнительно у 15,7% новорожденных.

Сыворотки крови телят, у которых были обнаружены антитела, взаимодействующие с Brucella abortus, исследовались на активность против других гетсрологичсских микроорганизмов и эритроцитов кролика в МРА, ТИФА ,и реакции гетерогемагглютинации (РГГА). Образцы сыворотки крови 3,9% новорожденных, агглютинирующие бруцеллы в титре 1:8, показали положительные результаты в МРА как с кишечной палочкой — 1:8 — 1:16, так и микрококками — 1:4 — 1:8. Кроме того, антитела этих телят склеивали эритроциты в РГГА в титре 1:1.6 и в одинаковой степени связывались с использованными бактериальными антигенами в иммуно-ферментном анализе. Эти неспецифические антитела, найденные 18 i

у животных в относительно низких титрах, определены нами как естественные или нормальные антитела. Последние, по всей вероятности, в виде неполных антител содержались в преколостральной крови новорожденных, у которых антитела, перекрестнореагирую-щие с другими микроорганизмами, обнаруживались только в ТИФА. В целом, нормальные антитела выявлялись у 19,6 телят.

Антитела 5,9% новорожденных обладали специфичностью по зтношению к Brucella abortus, хотя вступали в слабую перекрестную реакцию с кншечной палочкой, микрококками и гетерологичными эритроцитами. Например, противобруцеллезные антитела, обнаруженные у этих телят в титрах 1:64 — 1:256, агглютинировали гете-рологичные корпускулярные антигены в начальных разведениях сыворотки крови (1:8 — 1:16). Специфичность преколостральных антител по отношению к бруцеллам установлена и по ТИФА. Так, титры противобруцеллезных антител в иммуноферментном анализе были равны 1:3200 — 1:6400, в то время перекрестная реакция с кишечной палочкой и микрококками отмечалась до разведения сыворотки крови 1:50 — 1:100. Здесь уместно подчеркнуть, что именно эти новорожденные показали положительный результат как по РБП, так и по РСК.

У телят благополучной фермы (п —48) антитела, специфичные х брупеллам. не обнаружены. Естественные антитела в МРА — 1:2,4'(+26,6%. —21,1%). РГГА — 1:26,0 (+26,6%, —21,1%) и ТИФА — 1:315,2 (+60,2%, —37,5%) определялись у 6,3% ново-эожденных. У 8,3% телят антитела не обнаружены в МРА, но выявлены в ТИФА — 1:40 (+95,-9%, —48,8%) и РГГА — 1:13 (+17,3%, — 14,7%). Только по результатам нммуноферментного анализа наличие антител установлено у 4,2% телят. В целом, гстественные антитела по результатам всех использованных реакций определены в преколостральной сыворотке крови 18,8% исследованных животных. Необходимо подчеркнуть, что все новорожденные благополучной фермы показали отрицательный результат ю РБП.

Антитела, связывающиеся с бруцеллезным антигеном, обнаруживались и у определенного количества ягнят до приема молозива. Например, в РА и РБП агглютинины выявлены соответственно у 18,1% п 4,8%, а комплементсвязывающие антитела — 21,7% новорожденных неблагополучной отары (п —83). ТИФА установил присутствие преколостральных антител, реагирующих с Brucella ibortus, в сыворотке крови 34,9% ягнят. Причем, пммунофермент-ный анализ во всех случаях подтвердил положительные результаты РА, РСК и РБП. Антитела обнаружены по данным всех серологических тестов у 4 новорожденных, в РА+РСК+ТИФА — у 5, РСК+ТП.ФА — у 8 п только ТИФА — у 6. Средние титры антител з сыворотке крови ягнят до приема молозива были равны 1:8.5

- (+11,7%, -10,4%) в PA, 1:3,4 (+7,9%, -7,3%) в РСК й 1:224,? . (+11,7%, —10,4%) в ТИФА, Аналогичные результаты были полу ■ чены при анализе сыворотки крови ягнят другой неблагополучно!': отары (п=105). В благополучной по бруцеллезу отаре агглюти-, нины и комплементсвязывающпё антитела определялись у 5,5% и 4,5% ягнят соответственно. Важно подчеркнуть, что по РБП всс новорожденные этой отары (п = 110) не реагировали на бруцеллез , Антитела против единого бруцеллезного антигена в ТИФА установлены у всех животных с положительными результатами РА, РСК и дополнительно выявлены у 3,6% ягнят в среднем титре . 1:73,4 (+23,1%,-18,7%).

Для определения специфичности преколостральных антител пс отношению к бруцеллам сыворотки крови ягнят исследовались серологически, (МРА, РСК и ТИФА) с использованием в ка/честве антигенов кишечной палочки и микрококков. Антитела, родственные к Brucella, обнаружены только у 7,4% молодняка двух неблагополучных отар (п = 188). Антитела, найденные у 25,4% и 9,1% ягнят соответственно неблагополучной и благополучной отар, характеризовались свойствами нормальных иммуноглобулинов. Последние у 8,4% новорожденных неблагополучной и 3,6% благополучной по бруцеллезу отар выявлялись только в иммуноферментном анализе.

Специфические антитела в МРА и ТИФА установлены именно у тех новорожденных, которые реагировали на бруцеллез по РБП. Среди них большая часть (64,3%) показала диагностические титры по РСК. У ягнят благополучной отары, как было указано выше, агглютинины в РБП не определялись, хотя комплементсвязываю-щие антитела в титре 1:8 и выше выявлены у 30% животных, у которых преколостральные антитела обладали свойством естественных антител.

Антитела новорожденных неблагополучных по бруцеллезу отар были представлены как IgG или IgM, так и одновременно IgG-f- IgM. Следует подчеркнуть, что антитела ягнят благополучной отары относились только к классу IgG. Отметим, что пз общего числа ягнят, в сыворотке крови которых обнаружены Brucella — специфичные антитела, 78,6% были найдены среди новорожденных с иммуноглобулинами обоих классов.

Ягнята, имевшие антитела до приема молозива, достоверно превосходили своих аналогов по количеству общего белка (69,44:2,8 мг/мл против 60,94:1,4 мг/мл; Р<0,01), причем за счет его гамма-глобулпновой фракции. Последняя, как следовало ожидать, не определялась в сыворотке крови новорожденных, у которых в пред-молозивный период отсутствовали естественные и специфические антитела.

Таким образом, определенная часть телят и ягнят как неблагополучных, так и благополучных по бруцеллезу ферм (отзр) рож-

ДкЬтся с естественными (нормальными) антителами.- Антитела, бладающне сродством" к бруцеллам, ' обнаруживаются только в реколостральной сыворотке крови новорожденных неблагополуч-ых ферм. РБП оказалась наиболее объективным серологическим естом, позволяющим выявить наличие противобруцеллезных анти-ел в сыворотке крови молодняка в предмолознвный период.

6.2. Диагностика внутриутробного инфицирования бруцеллезом новорожденных животных Внутриутробное заражение новорожденных телят и ягнят ¡руцеллезом диагностировалось на основе обнаружения антигенов юзбудителя в образцах первородного кала (мекония) с помощью юноклональных антител, используемых в сэндвич варианте точеч-юго ТИФА. Последний позволил определить наличие антигенов »руцелл в первородном кале; 19 (37,3%) телят, полученных от коров |зермы-изолятора, и 37 (19,7%) ягнят неблагополучной отары. Тробы мекония, взятые от новорожденных телят и ягнят благопо-гучных ферм (отар), по данным иммуноферментного анализа не ¡одержали бруцеллезный антиген.

У всех 37 ягнят, у которых обнаружен искомый антиген, были определены и антитела в непрямом ТИФА. Причем, у 11 гол. анти-гела обладали специфичностью по отношению к бруцеллам, а у остальных новорожденных они вступали в перекрестную реакцию : гетерологичными бактериями. Среди 23 ягнят с отрицательными эезультатамн на бруцеллезный антиген 20 гол. имели естественные 1нтитела. У оставшихся 3 животных антитела характеризовались специфичностью к Brucella. Антигены возбудителя не были найдены в первородном кале ягнят, у которых отсутствовали естественные или специфические антитела.

Результаты использованных вариантов ТИФА были положительными при исследовании сыворотки крови и первородного кала [соответственно 13 (25,5%) и 19 (32,3%) телят. У 9 (17,6%) новорожденных выявлено наличие как антител, так и бруцеллезного антигена. Среди них 7 гол. имели естественные и 2 гол. протнво-бруцеллезные антитела. У 4 телят определялись только антитела, причем у одного из них они проявляли специфичность по отношению к бруцеллам. Искомый антиген обнаружен в пробах мекония 10 новорожденных, у которых антитела не содержались в преколо-стральной сыворотке крови.

Анализ результатов исследований сыворотки крови и первородного кала показал, что в большинстве случаев бруцеллезный антиген выявляется у новорожденных с более высокими титрами преколостральных антител. Например, средний титр нормальных и специфических антител в непрямом ТИФА в сыворотке крови ягнят, у которых найдены антигены возбудителя, был существенно выше, чем у непнфнцированного молодняка (1:222,2 против 1:45,9;

Р.<6,601)-. Между случаями обнаружения прёколостральных.анти-тел-в сыворотке крови телят или ягнят и антйг-енов в первородном кале установлена прямая связь с коэффициентами корреляции соответственно 0,93 (Р<0,001) или 0,75 (Р<0,01).

Преколостральные иммуноглобулины и антигены бруцелл в первородном кале чаще обнаруживались у молодняка, полученного от коров фермы-изолятора с высокими титрами противобруцел-лезных антител. Установлена тесная прямая корреляционная связь между титрами комплементсвязывающих антител коров-матерей и агглютининов телят (г=0,87; Р<0,01). Агглютинины новорожденных находились в положительной корреляции и с материнскими антителами, выявляемыми иммуноферментным анализом (г=0,90; Р<0,01). Аналогичная связь с коэффициентом корреляции 0,53 (Р<0,05) отмечена между показателями ТИФА коров и их телят. Антитела, проявляющие активность в РА и РСК, выявлялись чаще у ягнят, полученных от овцематок с более высокими титрами про-тивобруцеллезных антител в РСК, РБП и ТИФА (Р<0,05). Однако, между результатами РБП, ТИФА ягнят и серологическими реакциями овцематок достоверная связь не установлена. Показано, что чем выше титр материнских антител, тем больше возможность обнаружения антигенов бруцелл в первородном кале ягнят и телят. Так, искомый антиген с наибольшей вероятностью выявлялся у ягнят, рожденных от овцематок с высокими титрами комплементсвязывающих антител (Р<0,01) и положительными результатами иммуноферментного анализа (Р<0,01).Коэффициенты корреляции между показателями сэндвич варианта точечного иммуноферментного анализа телят и РА, РСК, РБП коров составили соответственно: 0,84; 0,89; 0,80 (Р<0,01). Количество лимфоцитов в 1 мм3 крови телят находилось в прямой корреляции с титрами противобру--целлезных антител матери, определяемых в РСК (г=0,43; Р<0,01), РБП (г=0,38; Р<0,05) и ТИФА (г=0,37; Р<0,05). Однако между титрами агглютининов коров в РА и содержанием па-лочкоядерных нейтрофилов новорожденных отмечена отрицательная связь (г=0,30; Р<0,05). Подобная связь регистрирована между результатами РСК, РБП матерей и количеством сегментоядер-ных нейтрофилов в крови потомства. Гамма-глобулиновая фракция общего белка сыворотки крови телят находилась в прямой зависимости от титров антител коров, определяемых в иммуноферментном анализе в предмолозивный период.

Телята и ягнята, имевшие до приема молозива как антитела в сыворотке крови, так и антигены бруцелл в первородном кале, а также новорожденные только с антителами или антигеном были условно определены в первую группу, а их сверстники, показавшие отрицательные результаты по использованным серологическим ре-

ккцйт it сэнД!'щч варианту точечного ТИФА, — во вторую группу.

Всего за период' наблюдения среди телят первой группы-заболело 59,1% и пало 34,87о, тогда как эти показатели у молодняка второй •руппы были значительно ниже: соответственно 21,4% и 7,1%. По-1обное различие по заболеваемости и падежу наблюдалось и меж-iy группами ягнят. Так, среди ягнят первой группы из 32,9% за-Золевших пало 21,4%), что намного выше заболеваемости и отхода, регистрированных у животных второй группы — 4,8% и 2,6%.

Таким образом, разработанный нами сэндвич вариант тачеч-того ТИФА на основе моноклональпых антител позволяет обнару-«ить наличие бруцеллезного антигена в образцах первородного ката телят, ягнят и может быть использован для экспресс-обнаруже-1ия новорожденных, зараженных внутриутробно. Такие новорожденные проявляют слабую устойчивость к неблагоприятным факто-эам внешней среды, о чем свидетельствует их высокая заболеваемость и значительный отход в раннем периоде посгнатальной жизни.

Выводы

1. Поли-Б антиген, а также белки внешней мембраны бруцелл являются более эффективными иммуногенами, чем цельные клетки, и могут быть использованы в гибридомной технике с целью получения лимфоцитов, стимулированных на синтез Bjrucella — специфичных антител. ,

2. Получены штаммы гибридных культивируемых клеток (гибридом)-продуцентов моноклональпых антител против полисаха-ридных и белковых антигенов бруцелл. С помощью моноклональпых атител установлено:

а) наличие в «кор» участке липополисахаридов и Поли-Б как специфичных для бруцелл, так и общих с Yersinia enterocolitica 09 мульти- и унивалентных детерминант;'

б) антигенность белка внешней мембраны бруцелл с молекулярной массой 14 КД, не участвующего в агглютинации клеток.

3. Эритроциты, сенситизироваиные моноклональными антителами гибридомы БАМА, являются более специфичным иммуно-препаратом при идентификации бруцелл, чем поливалентная сыворотка.

4. Твердофазный иммуноферментный анализ в непрямом и сэндвич вариантах с использованием моноклональных антигет штаммов гибридом БАМА и БИМА позволяет за короткое время (3—3,5 часа) определить наличие или отсутствие антигенов S- или R-форм бруцелл в патматериале. Сэндвич ТИФА на нитроцеллю-лозной мембране имеет существенное преимущество перед другими

вариантами этого теста, которое заключается в его высокой чув ствительноети, простоте постановки анализа и учета результатов исследований.

5. Латексные и эритроцитарные диагностикумы из монокло-нальных антител придают реакциям латекс-агглютинации и пассивной гемагглютинации высокую чувствительность и специфичность при экспресс-индикации бруцеллезных антигенов в патма-териале.

6. Непрямой вариант точечного ТИФА может быть использован для обнаружения полисахаридных антигенов бруцелл в сыворотке крови. Антигенемия у вакцинированных ЦгисеПа abortus 82 (80 млрд. кл.) и экспериментально инфицированных Brucella abortus 54 (160 млн. кл.) телок отмечалась соответственно в течение 1 и 2 месяцев. Динамика антигенемии как у зараженных, так и иммунизированных животных в указанные периоды характеризовалась волнообразностью, т. е. бруцеллезный антиген выявлялся в крови в определенные сроки инфекционного или вакцинного процессов.

7. Иммуноферментная тест-система, основанная на использовании моноклональных антител штаммов гибридных клеток 7F10 или 1СЗ и ультразвукового дезинтеграта бруцелл, позволяет более эффективно выявлять инфицированный молодняк, чем общепринятые серологические реакции и непрямой ТИФА.

8. У определенной части телят и ягнят, рожденной как от, маток благополучных (соответственно 18,8% и 9,1%), так и неблагополучных ло бруцеллезу ферм (19,6% и 25,4%), до приема молозива в сыворотке крови обнаруживаются нормальные антитела, причем у большей половины новорожденных они выявляются только с помощью иммуноферментного анализа.

9. Антитела, специфичные к бруцеллам, могут быть определены в преколостральной сыворотке крови некоторых телят (5,9%) и ягнят (7,4%) неблагополучных ферм. Противобруцеллезные ат-титела новорожденных животных более объективно дифференцируются от нормальных антител с помощью РБП, чем РА, РСК. или ТИФА.

- 10. Нормальные и специфические преколостральные антитела достоверно чаще обнаруживаются у телят и ягнят, рожденных от реагирующих на бруцеллез маток (0,01 <Р<0,05—0,01).

П. Новорожденные телята и ягнята, зараженные бруцеллезом внутриутробно, могут быть выявлены на основе обнаружения искомого антигена в образцах первородного кала с помощью сэндвич варианта точечного ТИФА, где в качестве первых и вторых антител -используются моноклональные антитела, имеющие средство к поли-сахаридным эпитопам Brucella. Бруцеллезный антиген с наиболь-

1ен вероятностью (0,001 <Р<0,01) найден у новорожденных, поученных от реагирующих коров или овцематок- .

12. Между случаями обнаружения антител в преколостральнон ыворотке крови и бруцеллезных антигенов в первородном кале елят или ягнят существует положительная взаимосвязь (Р<0,001 ли Р<0,01 соответствено). Новорожденные, имеющие антитела н нтиген до приема молозива, характеризуются низкой жнзнеспосо-ностью в раннем периоде постнатальиого онтогенеза.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Штаммы гибридом с авторскими названиями БАМА, БИМА 1СЗ, депонированные в специализированной коллекции перевивае-

1ых соматических клеток позвоночных (г. С.-Петербург), предлагаются в качестве дешевого источника антител, которые, в отличие т коммерческой поликлональной сыворотки, обладают более высо-ой активностью и специфичностью как к в-, так и Н-формам бру-;елл.

2. «Набор для диагностики бруцеллеза методом ИФА на осно-е моноклональных антител» (ТУ 10.05.4000.326-92, утв. ГУВ МСХ 'еспублики Казахстан 8 декабря 1992 г.) использовать для эксцесс обнаружения антигенов бруцелл в патматериале, а именно I паренхиматозных органах и лимфатических узлах животных, а акже в содержимом желудка аборт-плодов.

3. Телок и ярок неблагополучных по бруцеллезу ферм (хо-яйств) перед вакцинацией исследовать серологически при помоги иммуноферментной тест-системы, которая более эффективно ыявляет инфицированных животных, чем классические реакции.

4. Способ диагностики внутриутробного инфицирования бруцеллезом (А. с. № 1813450) использовать в неблагополучных, а так-ке в благополучных хозяйствах, где сохраняется опасность заноса шфекции и заражения животных, для предотвращения распрост->анения инфекции и сокращения сроков оздоровления.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Булашев А. К., Дмитриев А. Ф., Шспжаног, К. Т., Ескенднропа С. 3. )иснка состояния плацентарного барьера больных бруцеллезом корои//Рук. Де-онпрована ВНИИТЭИ агропрома. № 177 ВС-89, 23 с. — Опубл., сер. 30, реф. {урн.. «Инф. болезни жив. -х», 1989. № 6, с. 16.

2. Булашев А. К., Львов В. Л., Дмитриев А. Ф., Дмитриев Б. А. Лапи-(а Е. Б.„ Плужникова Г. И., Альжанов С. Ж., Маликов В. Б., Использование 1олн-Б антигена для днфферешшалыгои диагностики бруцеллеза крупного ро-атого скота//Рук. Депонирована КазНИИНТИ, Л» 2554, 10 с. — Опубл. в Библ. наг ВИНИТИ «Депоииров, научи, раб.», 1989, № 7 (213), с. 157.

3. Булашев Л. К., Шеижаиов К. Т., Ескендирова С. 3., Боровиков С. Н. Им-1унологцческая реактивность новорожденных телят в бруцеллезном стаде./Дез.

докл.. зональной нэучно-техническо.й конф. «Актуальные, проблемы интенсификг цни животноводства в исследованиях молодых ученых Южного Урала». -Троицк, 1989, — с. 20—21.

. 4. Шенжанов К -Т., Дмитриев А. Ф., Булашев А. К. Оценка функцнопал1 ной системы мать — новорожденный при бруцеллезной !гафскции//Вестник с.-; пауки Казахстана. — 1990. — № 8. с. 74—77.

5. Ескендирова С. 3., Булашев А К., Боровиков С .Н., Барамова Ш. Р Получение моноклональных антител к бактериям рода Бруцелла//Вестник с.о науки Казахстана, — 1990, № 10, с. 68—71.

6. А. с. 1604848, СССР, МКИ С12№ 5/00. Штамм гибридных культивируе мых клеток животных Mus musculus L-продуцснт моноклональных антител бактериям рода Brucella /Булашев А. К., Несмеянов В. А., Дмитриев А. Ф., М> канов К К.„ Байтубаев Т. Г„ Ромахов В. А., Касьянов А. Н.; Целикоградски СХИ; Всесоюзный НИИ экспериментальной ветеринарии; Институт биоорганнчс ской химии (СССР) — № 4645016/30-13 — Заявлено 30.12.88; Опубл. Б. И .1990, № 41.

7. А. с. 1604849, СССР, МКИ С12Ы 5/00 Штамм гибридных культивируе мых клеток животных Mus musculus L, продуцирующий моноклопальные анти тела к бактериям рода Brusella /Булашев А. К., Несмеянов В. А., Дмитрн ев А. Ф., Муканов К. К, Байтубаев Т. Г., Ромахов В. А., Касьянов А. Н.; Цели ноградский СХИ;Всесоюзный НИИ экспериментальной ветеринарии; Инстнту биоорганической химии (СССР) — № 464681/30-13 — Заявлено 30.12.88; Опуб; Б. И., 1990, № 41.

8. Каральник Б. В., Амиреев С. А., Студепцова В. К-, Грушина Т. А., Джу бангалиев М. У., Булашев А. К. Дмитриев А. Ф., Муканов К. К. Индикация ан тигенов бруцелл // Тез. докл. I болгаро-советского симпозиума по вирусным ни фекциям и 5 национальной конференции по бактериальным инфекциям и имму нологии. — Варна, 1990, с. 286.

9. Булашев А. К., Ескендирова С. 3., Ромахоз В. А., Касьянов А. И, Не смеянов В. А, Использование моноклональных антител в диагностике бруцеллез; животных // Бюлл. Всесоюзный НИИ экспериментальной ветеринарии. — M 1990, В. 73—74, с. 84—89.

10. Ескендирова С. 3., Булашев А. К. Индикация полисахаридных антигено. бруцелл с помощью моноклональных антител // Тез. докл. межвуз. иаучно-лро изв. конф. молодых ученых и специалистов. — Ставрополь, 1991, с. 213.

11. Каральник Б.. В., Студенцова В. К., Булашев А. К., Дмитриев А. Ф. Муканов К. К- Бруцеллезный антительный эрптроцнтарный диагностику»! и моноклональных антител // Жури, мнкробиол., эпидемнол, н н,ммунобнол—1991 № 4, с. 63—65.

12. Булашев А. К., Боровиков С. Н., Ескендирова С. 3., Сабирзянова Ф. Ф Моноклональные антитела в диагностике бруцеллеза животных // Материала Всесоюзной конф. по с.-х. биотехнологии. — Целиноград, 1991, с. 124—126.

13. Боровиков С. II, Булашев А. К., Лукин 10. В., Несмеянов В. А. Имму нолатекспоадсорбционный метод обнаружения возбудителя бруцеллеза на осно пе использования моноклональных антител // Материалы Всесоюзной научно] конф. по с.-х. биотехнологии. — Целиноград, 1991, с. 127—128.

14. Каральник Б. В., Амиреев С. А., Студенцова В. К., Джубангалиез М. У. Алтухов А. А., Закарян С. Б., Булашев А. К-, Абдрасилова А. А. Обнаружеши антигенов "бруцелл в молоке, шерстн н навозе овец при помощи мопоклонально го эритроцитарного диагностикума. // Материалы Всесоюзной научной конф. ш с.-х. биотехнологии. — Целиноград, 1991, с. 129—130.

15. Студенцова В -К-, Каральник Б. В., Грушина Т. А., Булашев А. К., Бо ровиков С. Н., Адрасилова А. А., Ескендирова С. 3. Сравнительная эксперимен тальная оценка различных сорбированных реагентов из моноклональных антн тел в индикацни антигенов бруцелл // Материалы Всесоюзной научной конф. ш .с.-х. биотехнологии. — Целиноград, 1991, с, 132—133.. . ........____________

16. Дмитриев А. Ф., Булашев А. К-, Боровиков С. Н. Диагностика брудел-юза у новорожденных животных // Материалы Всесоюзной научи, конф. по с.-х. тотехиологии. — Целиноград, 1991, с. 133.

17. Шенжанов К. Т., Булашев А. К. Изучение проницаемости плаценты у шец // Вестник с.-х. науки Казахстана. — 1991, № 9, с. 97—98.

18. Боровиков С Н., Булашев А. К. Имнуиофермеитпая тест-система для шагностнки бруцеллеза животных // Вестник с.-х. науки Казахстана. — 1991, Г° 10, с. 94—97.

19. Булашев А. К-, Боровиков С. Н„ Лукин 10. В., Зубов В. П., Несмея-юв В. А., Ромахов В. А. Латексиый бруцеллезный диагиостикум из монокло-гальных антител // Вестник с.-х. науки Казахстана. — 1991, № 4, с. 76—79.

20. Студенцова В. К., Каральник Б. В., Джубангалиев М. У., Амиреев С: А:, Алтухов А. А„ Закарян С. Б., Абраснлов А. А., Акашева Р. Б., Булашев А. К, 5ыявленне антигенов бруцелл в молоке, шерсти и навозе как интегральный по-¡азатель интенсивности эпизоотического процесса // Материалы V объедннец-(ого съезда гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов, паразитологов и инфек-июнистов Казахстана. — Алма-Ата, 1991, т. 4, с. 80—82.

21. Булашев А. К-, Ахметшцн Р. 3., Боровиков С. Н. Ескенднроза С. 3. Ионоклоналыше антитела в диагностике антропозоонозов // Материалы V объединенного съезда гигиенистов, эпидемиологов, микробиологов, паразитологов I инфекционистов Казахстана. — Алма-Ата, 1991, т. 6, с. 19—20.

22. Каральник Б. В., Еркинбекова Б., Денисова Т. Г„ Абдрахманова Л., <узьмин Ю. А., Студенцова В. К., Булашев А К- Концептуальные вопросы иммунодиагностики, заразных болезней по индикации антигенов возбудителей // Латериалы V объединенного съезда гигиенистов, эпидемиологов, мнкробиоло-ов, паразитологов и инфекционистов Казахстана. — Алма-Ата, 1991, т. 6, . 35—38. .

23. Булашев А. К-, Боровиков С. Н., Ромахзз D Л ' > веяной В. А. Набор 1ля диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота // Бнотехнолбгня. При-.оженле к экспресс-информации «Новости науки Казахстана». — Алма-Ата, 991, с. 103—104.

24. Ескепдирова С. 3., Булашев А. К., Шенжанов К. Т., Новое диагностп-еское средство лрн бруцеллезе животных // Биотехнология. Приложение к эк-пресс-информацнн «Новости науки Казахстана». — Алма-Ата, 1991, с. 107—108.

25. Шенжанов К. Т., Дмитриев А. Ф., Булашев А. К. Иммунологическая реактивность овцематок н ягнят при бруцеллезной инфекции / Сб. научи, тр. Диагностика, лечение, профилактика инвазионных и инфекционных заболева-[нн с.-х. животных. — Ставрополь, 1991, с. 41—48.

26. Булашев А. К., Боровиков С. Н., Каральник Б В., Студенцова В. К. Ис-юльзование методов иммунобиотехнологни в экспресс-диагносгнке бруцеллеза кивотных // Вестник с.-х. науки Казахстана. — 1992, ЛЬ 1/2, с. 79—84.

27. А. с. 1752764, СССР, МКИ C12N 5/00. Штамм гибридных культивируешь клеток животных Mus musculus L-продуцснт моиоклональных ангнтел к ¡акгерням' рода Brucella / Булашев А. К., Есксндирова С. 3., Дмитриев А. Ф„ )оровнков С. Н., Шенжанов К. Т.; Целиноградским СХИ (СССР) — VI 4882330/13. — Заявлено 16.11.90; Опубл. Б. И., 1992, № 29.

28. А. с. 1813450, СССР, МКИ А61Л39/00. Способ определения внутриутроб-юго инфицирования ягнят бруцеллезом / Булашев А. К„ Дмитриев А. Ф., Бо-ювиков С. Н., Ескендирова С. 3.; Целиноградский СХИ (СССР) — \Ъ 4862905/13. — Заявлено 06.09.90; Опубл. Б. И., 1993, № 17.

29. Булашев-А. К„ Шенжанов К. Т. Иммунная взаимосвязь в системе мать— 1лод—новорожденный при бруцеллезной инфекции // Тез. докл. I междуцарод-I о fi научно-практической конференции по аграрным проблемам. — Ал.маты, 1993.

ТУЙ IНI

БУЛАШЕВ А. К.

«Моноклональдык; антиденелер1 колдану аркылы бруделлезд! балау эдктерш жет1'лД1ру

Диссертациялык. жумыстыц максаты — бруцеллез ауруынын бадауын, атап айтканда серологиялык эд1сш, моноклональдык антиденелерд! колдана отыра жаца сатыра катеру.

Гибридомалык техниканыц кемепмен Бруцелла тукымдаста-рына жататын бактериялардыц эпнтоптарына барытталган моноклональдык антиденелерд! (МКА) тузетш буданды торшалардын 6ipHeuie турлер! алынган. БАМА жэне БИМА деген атаулары бар гибридомалардыц МКА-лер1 бруцеллезге шалдыккан жануарлар-дан алынран материалдардары ауру коздырушысыньщ антигендерп! тез арада (3—3,5 caparra) аныктай алатын иммунды фермент тэ-сшнде, латекс-агглютинация реакциясында жэне жанама (пассив-tí) агглютинация реакциясында колданылран.

IC3 жэне17Р10 деп белпленген гибридомалардыц МКА-лер! иммунд1 фермент тэсшнщ «сэндвич» койылымында 3—5 айлык бузаулардыц козылардьщ кан сарсуын бруцеллез ауруына зерттеу кезшде сыналган. Бул тэсш Ka3ipri кезде ирактикада кещнен кол-данып журген агглютинация реакциясына (АР), комплеменгп бай-ланыстыру реакциясына (КБР) жэне роз- бенгал сынауына (РБС) Караганда 6ipuiaMa жорары сез1'мталдык кэрсеткен.

Жорарыда аталган жаца серологиялык тзалдер жэне АР, КБР, сонымен катар РБС бруцеллезге шалдыккан табындардагы (отар-лардагы) жаца туран бузаулардыц, козылардыц иммундык кушн зерттеу жумыстарында колданылран. Kefióip телдердщ уызбен ко-ректенер алдында алынран кан сарсуында ауру коздырушысына карсы багытталган антиденелер табылган. Осы телдердщ Keñ6ipey-лершщ тоцрарында бруцелла антигсндершщ кездесетидап иммунд1 фермент тэсшмен дэлелденген. Зерттеу нэтижелер! курсак; 1Ш1нде бруцеллезге шалдыккан телдер! аныктау тэсшнщ neri3ih калаган. Аталган. серологиялык тоалдердщ практ^када колданылуы шдет-Т1Ц таралуына тоскауыл болып, бруцеллезге шалдыккан табындар-ды (отарларды) бул аурудан тез1*рек айыгуына себепкер болады,

2S .

btjlashev a.k.

"Developing brucellosis* diagnostic methods on the base of monoclonal antibodies'*.

SUMMARY

The purpose of the dissertation was to improve effeciency of the brucellosis* diagnostic tests on the base of using monoclonal antibodies (Mab).

Several strains of Mab-producers were obtained with the help of hybridomic technique. Mab were directed against epitopes of "cor" region of poly-B and LPS or outer membrane proteins. Mab BAMA and BYMA were used in developing ELISA, latex agglutination test and erythrocyte haemagglutination test for the express detection of Brucella antigens in the samples obtained from infected animals.

The diagnostic value of Mab of hybridomas designated 1C3 and 7F10 in "sandwich" ELISA was tested as compared with agglutination test (AT), complement fixation test (CFT) and rose bengal test (RBT). ELISA was considerably more sensitive that conventional serological methods for detection Brucella-specific antibodies in calve's and lamb's sera at the age of 3-5 months.

With the help of ELISA and AT, CFT, RBT immune status of newborn calves and lambs from brucellosis affected herds (flocks) before a-colostrum feed were studied. Anti-Brucella antibodies were detected in the precolostral sera of some calves and lambs. Some of these neonate contained Brucella-antigens in the samples of feces according to the results of "dot" ELISA. The method for detecting newborn infected with Brucella in utero was developed. Application of the suggesting diagnostic tests into practice will prevent spreading infection among animals of affected herds (flocks) therefore speed up the therms of National brucellosis eradication programme.