Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Получение, характеристика и применение моноклональных антител к антигенам BRUCELLA ARORTUS 19 BA

На правах рукописи

РГБ ОД

1 3 СЕН 1990

МИХАЙЛОВ Леонид Михайлович

ПОЛУЧЕНИЕ, ХАРАКТЕРИСТИКА И ПРИМЕНЕНИЕ МОИОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К АНТИГЕНАМ BRUCELLA ABORTUS I" BA

14.00.36 - аллергология и иммунология 0? 60 07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени канлилата мелшшнемп наук

Саратп. 1999 г.

Работа выполнена в Государственном учреждении Иркутский ордена Трудового Краснс Знамени научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Воск Министерства здравоохранения РФ.

Научные руководители - доктор медицинских наук, старший научный сотрудник

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, старший научный сотрудник

Ведущая организация - Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт

Защита состоится 30 июня 1999 г. в 13°° часов на заседании диссертационного совета K074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института "Микроб*. Автореферат разослан_199 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук ЗЛ. Девдариани

Девдариани ЗД;

кандидат биологических наук,

старший научный сотрудникТигенко АЛ!

Елисеев Ю.Ю.,

кандидат медицинских наук, старший научный сотруд ник Адамова Г.В.

!

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Среди зоонозных инфекций бруцеллез в Российской Федерации занимает ведущие позиции. Высокая патогенпость и вирулентность возбудителей {Brucella spp.), особенно В. meliíensis, обусловливают высокую заболеваемость бруцеллезом человека и сельскохозяйственных животных. В связи с этим в раду актуальных задач по изучению инфекционной патологии ваэйгое значение имеет совершенствование методов выявления возбудителя бруцеллеза в окружающей среде, материале от больных животных и людей (Голубинский Е.П. с соавт., 1983, 1991; Заревииа Л.И. с соавт., 1984, 1987, 1988; Каральпик Б.В. с соавт., 1991; Diaz R. et al., 1966; HinstdiU R.D. et al., 1967; Cloeckäert A. et al., 1992; Kiltelberger R. et al„ 1995, 1995; Kiel-sen К., 1995; Debbarh H S. et al., 1996), дифференцирования его от близких по антигенной структуре других микроорганизмов, особенно У. eníerocolitica 0:9 (Булашев А.К. с соавт.,1990; Козловский В.Н. с соавт., J 993; Nielsen К.Н., Henning Н. D., 1983; Bundle D.T. et al., 1984; Quinn R. et al., 1984; Holman P.J. et al.,1985; Dubrey G.L., Limct J., 1987; Douglas J.T., Palmer D.A., 1988; Palmer D.A., Douglas J.T. 1989; Vizcaino N. el al., 1997; Weynants V.C. et al., 1997).

Современная лабораторная диагностика бруцеллеза осуществляется с применением бактериологических, биологических, серологических, аллергологических и молеку-лярно-генетических методов исследования. Эффективность выделения возбудителя из крови заболевших зависит от вида бруцелл и для В. melitensis составляет 62-92, а для В. abortus не превышает 5-15 %. Наибольший процент выделения культур бруцелл регистрируется из миелопроб (56.8-100). Выделение возбудителя из другого материала не имеет существенного практического значения.

Исследование патологического материала с помощью бактериологического и биологического методов является сложным и трудоемким процессом, поэтому результат - положительные или отрицательные - могут быть получены не ранее трех недель,

а, как правило, - через один - два месяца от начала анализа (Вершилова П.А., Дранов-ская Е.А., 1976). В связи с этим широкое распространение получили серологические методы: реакции Хеддльсона, Раита, Кумбса, РИГА, PUAT, РСК и другие. Однако, основанные на использовании поликлональных бруцеллезных иммуноглобулинов, они не могут гарантировать специфичности результатов из-за наличия антител к общим антигенным детерминантам бруцелл и ряда других микроорганизмов, в частности, Francisella íularensis, некоторых представителей рода Salmonella, Vibrio cholerae, Escherichia coli и особенно Y. enterocolitica 0:9 (Г'онтарь ИЛ. с сравт., 1980, 1984; Желудков ММ., 1981, 1983; Драиовская Е.А. с соавт., 1991; Redmond J.W., 1975, 1979; Bundle D.T. et al.,1984; Grieser-Wilke I. et al., 1985; Kocablyoglu О., 1990; Kittelberger R. et al., 1995, 1995). ■

Известно, чго перекрестные реакции между бруцеллами и кишечными иерсиния-ми обусловлены наличием общих антигенных детерминант в О-боковой цепи их лиио-полисахаридов (ЛПС) (Соколова ЕС., 1984; Wilson G.S., Miles А. А., 1932; Bundle D.T. et al., 1984; Wu A.M. et al., 1984; Douglas J.T., Palmer D.A., 1988; Palmer D.A., Douglas J.T., 1988; Weynaiits V. et al , 1996, 1997). Считается, что ЛПС, содержащийся в клеточной стенке бруцелл, является их иммунодомштаигным антигеном (Драиовская Е.А., 1972, 1978; Moreno Е.А. et al., 1979; Bernian D.T., Kurts R.S., 1987). В последнее время уделяется большое внимание изоляции и изучению свойств специфических для возбудителя бруцеллеза белковых антшенов (Драиовская Е А с соавт., 1991; Маликов B.È. с\ соавт., 1991; Чибисова U.A. с соавт., 1992; Cloeckaert A. et al., 1991, 1992, 1995, 1996;

' Denoel P.A. et al., 1997). Актуальность легального исследования антигенной структуры бруцелл определяется необходимостью разработки высокоснецифичкых диагностических препаратов. Однако решить эту проблему с помощью поливалентных сывороток . оказалось невозможным, так как они представляют собой смесь иммуноглобулинов ршшчнон специфичное!и. а способа р.и.телеши н.\ л настоящее время не с\1цесп)\ет.

Решение этой задачи стало реальным благодаря внедрению в практику научных исследований гибрйдомной технологии получения' моноклойальных антител (МонАТ), впервые предложенной G. Kohler, С. Milstein в 1975 г. Моноклональные антитела, про дуцируемые изолированным клоном, в отличие от поливалентных сывороток представляют собой достаточно чистое химическое вещество, а не неопределенную гетерогенную смесь иммуноглобулинов, которая изменяется с каждым иммунизированным животным и даже с каждой порцией крови одного и того же животного. Культуры гибридных клеток способны продуцировать в неограниченном количестве точно повторяющуюся химическую структуру иммуноглобулинов. Гибридомная технология позволяет получать «чистые» антитела даже к неочищенным антигенам (Кеннет Р.Г., 1983).

" Получение гибридом, продуцирующих бруцеллезные МонАТ, проводили с использованием различных антигенов и схем иммунизации животных (Булашев А.К. с соавт.,1990; Козловский В.Н. с соавт., 1993; Bundle D.T. et al., 1984; Quinn R. et at., 1,984; Greiser-Wilke 1. et al., 1985, 1987; Holmán P.J. et al., 1985; Roop P.M. et al., 1987; Douglas J.T., Palmer DA, 1988; Cloeckaert A. et al., 1990, 1991, 1993, 1996). Полученные

МонАТ использовали для изучения антигенной структуры бруцелл, их протективных

г

свойств, дифференцирования бруцелл от близкородственных по антигенному строению микроорганизмов, для очистки антигенов, а также для определения родовых и видовых признаков бруцелл. Созданные на основе МонАТ диагностические препараты оказались весьма перспективными и имели преимущество перед поликлональнымн аналогами (Боровиков С.Н., Булашев А.К., 1991; Булашев А.К. с соавт., 1991; Караль-ник Б.В. с соавт., 1991; Студенцова 0.К. с соавт., 1991).

Тем не менее, описанный в литературе набор бруцеллезных МонАТ является скорее всего далеко не полным, в связи с чем проблема получения гибридных клонов, обладающих способностью к стабильному синтезу новых, уникальных по своей специфичности бру цсллезны>. МонАТ, не теряет актуальности и в настоящее премя.

с

Цель работы. Получение гибридом - продуцентов моноклональных антител к антигенам В. abortus 19ВА, изучение с их помощью антигенной структуры бруцелл и конструирование на их основе диагностических тест-систем.

Задачи исследования:

1. Подобрать оптимальную схему иммунизации мышей бруцеллезным антигеном для получения максимального, количества специфически стимулированных спленоци-тов. ' .

2. Модифицировать способ улучшения ростовых свойств коммерческой эмбриональной телячьей сыворотки. •

3. Получить {ибридрмы, стабильно продуцирующие бруцеллезные моноклонадь-ные антитела.

4. Изучить иммунологические свойства полученных моноклональных антител.

' I ' ■; .

5. Определить с помощью МонАТ антигенные детерминанты, ответственные за перекрестную реакцию бруцелл а кишечных иерсцний серовара 0:9. -.'..''

6. Сконструировать на основе моноклональных антител бруцеллезную латекс ну ю тест-систему, усовершенствовать иммуноферментный метод и изучить в лабораторных ууловиях их специфичность и чувствительность. ,

Научная новизна Получен оригинальный набор гибридных клонов, синтезирующих моноклональиые антитела различной специфичности в отношении бруцелл и некоторых гетерогенных микроорганизмов. Выделен штамм гибридных клегок со стабильной продукцией моноклональных антител, специфичных к белкам бруцелл с молекулярной массой 18 и 3 8 кД:

Впервые с помощью моноклональных антител получены новые данные об антигенном строении бруцелл, свидетельствующие о том, что перекрестная реакция между бруцеллами и }'. enwrocohtica 0:9.может происходить не только за счет общих антиген-'

ных детерминант, локализованных в О-боковой цепи их ЛПС, но и в области их полипептидов. '

Получен патент Российской Федерации "Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. - продуцент моноклональных антител, специфичных к. препарату белков бруцелл с молскуля;>ым весом 18 и 38 кД", № 2113475 от 20 июня 1998 г. ■■'-...

Впервые установлено, что реакция лейкоцитолнэа может служить объективным критерием эффективности проведенной антигенной стимуляции спленоцитов мышей BALB/c бруцеллезным антигеном, способствующей увеличению частоты гибридизации и выходу стабильных антителопродуцирующих гибридом.

Определена возможная причина невысокой эффективности гибридизации и слабой клонообразуюшей способности гибридом, обусловленная цнтотоксическим действием перитонеальиых макрофагов, добавляемых в среду культивирования в качестве клеток, продуцирующих ростовые факторы.

Практическая ценность работы и внедрение в практик}'.

Создана коллекция гибридом, синтезирующих моноклинальные антитела к ан-г

тигенам В. abortus 19ВА, которые могут быть использованы для изучения антигенной структуры возбудителя бруцеллеза и разработки диагностических препаратов.

- На основе моноклональных антител 2АН10 сконструирована и испытана бруцеллезная латексная тест-система, усовершенствован иммуноферментный анализ для идентификации штаммов В. abortus и В. suis, обладающие высокой чувствительностью и специфичностью.

- Модифицирован способ улучшения качества коммерческой эмбриональной телячьей сыворотки, являющейся одним из основных компонентов культуральных сред Для выращивания клеток миеломных и гибридных линий.

- Подобрана оптимальная схема иммунизации мышей бруцеллезными антигенами, позволяющая с большей эффективностью получать стабильные антителопродуци-рующие гибридомы, и усовершенствованы отдельные этапы гибридомной технологии.

Составлены и утверждены "Методические рекомендации по использованию реакции лейкоцитолиза для определения иммунокомпетеитности лимфоцитов, используемых для получения гибридом к бруцеллезному антигену" (Протокол ученого совета №3 от 26 января 1995 г.).

Моиоклональные антитела 2АН10 использовали в отделе микробиологии чумы с группой подготовки кадров Иркутского противочумного института при выполнении научно-исследовательской работы по теме: "Лабораторный контроль продовольствия на зараженность возбудителями особо опасных инфекций", № ГР 01930009493.

Основные положений, выносимые на защиту

1. Реакция лейкоцитолиза является объективным критерием выбора оптимальной схемы иммунизации мышей бруцеллезным антигеном, дающей макримальный эффект при последующей гибридизации родительских, клеток,

2. Качество отдельных серий коммерческих эмбриональных телячьих сывороток, используемых в гибридомной технологии, можно улучшить обработкой их раствором

пэг-6000. \ . '' ' ; ■

3. Эффект цитотоксичности перитонеальных макрофагов, применяемых в качестве подкормочных кдеток, препятствует успешному проведению работ по получению гибридом. . . .

4. На основе моноклональных антител 2ÀH10 сконструировала латексная и усовершенствована нммуноферментная тест-системы, способные с высокой специфичностью н чувствительностью дифференцировать В. abortus и В. suis от В. mehtsnsis н Ä rangifori, а также от У. enlerocolitica 0:9. .

5. Серологическая перекрестная реакция между брупеллами и Y. enterocolitica 0:9 обусловлена общими антигенными детерминантами не только в области их липополн-сахаридов, но и белков с молекулярной массой 18 и 38 кД.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на:

- научно-практической конференции "Современные аспекты природной очаговости, эпидемиология и профилактика особо опасных инфекционных заболеваний", Омск, 1993 г.

- научно-практической конференции "Проблемы природно-очаговых и зоонозных инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке", Чита, 1993 г.

- Юбилейной научной конференции "Актуальные проблемы профилактики особо опасных и природно-очаговых болезней", Иркутск, 1994 г.

- Юбилейной научно-практической конференции, посвяшснной 100-летию образования противочумной службы России. Саратов, 1997 г.

- Юбилейной научно - практической конференции, посвященной 75-легшо Государственной санитарно-эпидемиологической службы России. Иркутск, 1997 г.

научных конференциях Иркутского научно-исследовательского противочумного института О'бнри и Дальнего Востока. Иркутск, 1991-1998 гг.

Публикации. Основное содержание материала диссертации отражено в заключительных отчетах о НИР: "Получение моноклональных антител к поверхностным антигенам Brucella abortus 19 ВА", № ГР 01910033784, инв. № 02. 97.0001801. "Лабораторный контроль продовольствия на зараженность- возбудителями особо опасных инфекций", № ГР 01930009493, инв. № 02.98.0005761. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Структура н объем диссертации. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выполов и списка использованных литератур-

ных источников. Работа изложена на 118 страницах машинописного текста, включает 19 таблиц и один рисунок. Список литературных источников содержит 197 наименований, в том числеИЗ зарубежных. .

КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Литературный обзор представлен в первой главе, где рассмотрены и критически обсуждены литературные материалы об антигенной структуре возбудителя бруцеллеза, методах его идентификации, охарактеризовано состояние проблемы получения, значения, научной и практической роли моноклональных антител.

Сведения об использованных материалах и методах исследования представлены во второй главе.

При выполнении работ по получению гибридом и моноклональных антител в целях получения антигенов дЛя иммунизации и определения специфичности использова-

. ; е-

но 22 штамма микроорганизмов: В. abortus 544, 19 ВА, 146, И-195, В. melitensis 16 M, И-297, И-309, В. suis 1330, И-98, И-99, В. rangiferí И-181, И-42, И-64, В. neotomae 5КЗЗ, У. enterocolitica 0:3, 0:9, V. cholerae 152, F. tuîarensis И-205, И-199, И-188, S. typKimu-rium 21, £. coli 0111..

Донорами иммунных лимфоцитов, перитонеаяьных макрофагов и иммуноасцити-ческой жидкости служили мыши линии BALB/c из лаборатории подопытных животных Иркутского противочумного института. Иммунные мышиные спленоциты гнбридизи-ровали с клетками миеломной линии P3-X63-Ag/8 653, любезно предоставленными Алексеевой Людмилой Павловной, Заведующей лабораторией клеточных культур Рос-' TûBÇKoro противочумного института.

Для культивирования миеломных и гибридных клеток использовали в качестве основы сухую среду RPM1-I640 ("Flow", "Serva"). Добавками в питательную среду служили 1-глутамин, пйруват натрия, гипоксантин, тимнднн.аминоптериц, 40% раствор глюкозы, инсулин', антибиотики юшамицин -или бр)ЯамнШй(, эмбриональная телячья

сыворотка. Клетки миеломных и гибридных линии хранили в сосудах Дьюара в жидком азоте.

При изготовления питательных и селективных сред Использовали деионизован-ную воду с сопротивлением 15-18 Мом/см. Деионизацию проводили последовательно на дистилляторе ДЭ-4 и на деионизац-^шных установках фирм "Pirs" H"Elga".

Клетки окрашивали 4% раствором трипанового голубого ("Serva"). Сливающим агентом служил полиэтиленгликоль (ПЭГ) с м.м.! 500 ("Fcrak") или 1550 ("Serva").

Праймирующим агентом при получении от мышей нммуноасщгтнческой жидкости служили "Пристан" и полный адьювант Фрейнда /ПАФ/ ("Serva").

При постановке твердофазного иммуноферментного анализа в качестве коньюга-та использовали антитела диагностические против иммуноглобулинов мыши и антитела диагностические против иммуноглобулинов G (H+L-цепи) мыши, меченные перок-сидазой хрена (производства ИЭМ имени Н.Ф.Гамалеи РАМН).

Для создания диагностического препарата на основе моноклональных антител использовали частицы полиакролеинового латекса (производства института биоорганической химии им. Н.М.Шемякина РАМН). При постановке реакции лейкоцитолиза

г ■

применяли бруцеплин (производства Омского научно-исследовательского института природно-очаговых инфекций).

Иммуноферментный анализ и РПГА проводили в пластиковых 9б-луночных планшетах Ленинградского завода медицинских полимеров, реакцию латексагглюти-нации (РАЛ) - в V-образных 96-луночных планшетах. Работы по гибридизации, стерилизации сред и растворов, культивированию клеток миелом и гибридом осуществляли в бноламинаре с горизонтальным потоком воздуха ("Lee"). Клетки просматривали при помощи инвертированного микроскопа "Diavert" ("Leitz"). Клеточные культуры выращивали в СОг-инкубаторе ("Labomed") при температуре 37°С и содержании СОг от 5 до

>2 ' • ; 7%. Препараты и среды хранили при 6-8"С в бытовых холодильниках при -20°С

("Grünland") или при -70°С ("Sanyo"). .

Для иммунизации животных использовали целые клетки В. abortus и полученные из них растворимые субклеточные компоненты.

Бруцеллы выращивали на эритрит-агаре pH 7.2 в течение 48 ч при температуре 37°С. Бактериальную массу смывали ЗФР pH 7.2 и инактивировали на водяной бане при температуре 100"С в течение 60 мин, разливали в ампулы (которые запаивали) и хранйлн ^замороженном виде. •

Липополисахарид из штамма В. abortus 19 ВА получали водно-фенолыюй экстракцией бруцелл (Адаме Г.А., 1975), белково-полисахаридный антиген - по методу Буавена (Драновская Е.А., 1978) совместно с Молевой В.А. из лаборатории диагностических сывороток. Препараты лиофильно высушивали и хранили в темной посуде с притертой крышкой при температуре 6-8°С.

Белковый бруцеллезный препарат с молекулярной массой 18 и 38 кД, полученный методом генной инженерии, любезно предоставлен Токаревой Л.Е. из лаборатории бруцеллеза Иркутского противочумного института. . .-

Все работы, связанные с культивированием микроорганизмов, выполняли в соответствии с требованиями Санитарных правил СП 1.2.0)1 - 94 "Безопасность работы с микроорганизмами 1-Г1 i-pyim патогенности".

Контроль специфической стерильности бруцеллезных антигенов проводили в соответствии с "Методическими рекомендациями по контролю специфической стериль-моеги биолошческих препаратов, приготовленных из бруцелл" (Петухова О.С. с соавт., 1987).

. Мышей'иммунизировали убитыми клетками В. abortus и полученным н) них ЛИС внугрнбрюшшшым (в/б) и нетрадиционным - внутриселезеночным способом

n

(в/с). Внутриселезеномиую иммунизацию осуществляли в соответствии с методикой, описанной M.Spitz et al. (1984).

Подготовку культуральиых и селективных сред, криоконсервирующих растворов, культивирование клеток миеломной и гибридных линий, их подсчет, гибридизацию,. клонирование, накопление клеточной Лассы гибридом, приготовление подкормочных (фидерных) клеток и другие операции проводили в соответствии с методическими рекомендациями по получению гибридом - продуцентов моноклональпых антител к бактериальным антигенам (Свиридов В.В. с соавт., 1986; Hybridoma Techniques, 1980).

Скрининг МонАТ, секретируемьгх гибридомами, определение специфичности и класса продуцируемых иммуноглобулинов, а также активности МонАТ в ЮК и ИАЖ проводили с помощью иммуноферментного анализа в соответствии с методикой, предложенной Н.С. Умновой (1988), с модификациями.

Реакцию пассивной гемагтлютинации ставили микрометодом с использованием аппарата Такачи в соответствии с "Наставлением по применению бруцеллезного эрит-роцитарного диагностикума антигенного сухого" (Одесса, 1982).

При определении класса моноклональпых иммуноглобулинов использовали мето-t

дику, основанную на разрушении иммуноглобулинов М-класса 1-цистеином. ,

Реакцию кммунодиффузип в геле (РИД) и постановку латексной тест-системы на основе МонАТ проводили по методикам, описанным Г. Фримелем (1988).

Статистическую обработку результатов опытов осуществляли по И.П.Ашмари-ну, А.А.Воробьеву (1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Совершенствование технологии получения антнтелопродуцпрующнх гибридом

При получении гибридом одним из ключевых моментов является подбор оптимальной схемы иммунизации животных, обеспечивающей пролиферацию максимальною количесша иммунокомистентных сплсноцитов, вследствие чего повышается ве-

И

роятность выделения гибридомы, продуцирующей специфические МонАТ, и стимулируется процесс дифференциации B-клеток, которые в свою очередь более активно участвуют в гибридизации (Goding Y.W., 1980), Выбор способа введения антигена определяется исследователями, которые используют как традиционные - внутрибрюшинный, внутримышечный, внутривенный (Goding Y.W,, 1980; Bundle D.T. et al., 1984; Hoiman PJ. et al., 1985; Greiser -Wilke I'. et al., 1987; Douglas J.T., Palmer D.A., 1988), - так и не традиционные - виутряселезеиочный - пути (Spitz М. et al., 1984). Об иммунокомпе-тентноспг лимфоцитов при получении гибридом судят по величине титров специфических антител в сыворотке крови мышей к антигену иммунизации (Булашев А.К. с со-авт., 1990; Козловский В.Н. с сОавт., 1993).

В нашей работе количество участвующих в гибридизации иммунокомпетентных спленоцитов определяли с помощью аллергической тест-реакции - лейкоциголиза (РЛ) -непосредственно в селезенке, являющейся их донором. Животных иммунизировали целыми клетками В. abortus 19 ВА. Мышей первой группы иммунизировали в/м, второй- в/б по схеме: 5 ТО8, 2109, 3 (0' и 5.10е микробных клеток (м.к.) с интервалом двое суток между инъекциями. Животным третьей и четвертой групп вводили по 5 ТО8 м.к. в/м или в/б однократно. Животные пятой группы получали антиген однократно в/с в дозе 5 10е м.к. Контрольным животным вводили ЗФР pH 7.2 по соответствующей для каждой группы схеме. Через 10 сут животным первых четырех групп делали бустерлую прививку антигена в дозе 1010 м.к. Селезенки отбирали на третьи сутки после последнего введения антигеяа и ставили РЛ, сопоставляя полученные результаты с уровнем титра специфических сывороточных антител.

Достоверно установлено, что наибольшее количество иммунокомпетентных лимфоцитов получено при в/с иммунизации: Однократные в/б и в/м инъекции антигена с последующим введением бустерной ирнанвкн была менее эффективны, чем в'с епо- . соб, xoT"f н предиочпиельнсе. чем при чешрехкращон (и пиле цикла) нчм> ни lamm.

• _ . 15

При этом коэффициент лейкоцитояша не коррелировал с титрами сывороточных антител, которые, наоборот, были максимальными при цикловой иммунизации мышей и не обнаружены при в/с инъекции антигена.

Подбор рабочей серии эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС) является важным этапом в технологии получения гибридом. Поступающие в пролажу ЭТС зачастую не соответствуют показателям качества, указанным в сопроводительных документах, что делает их не пригодными для культивирования миеломных и гибридных клеток. Так, при определении ростовых свойств ЭТС 18 серий отечественного и зарубежного производства по индексу пролиферации (ИП) и клонирующей способности клеток миеломной линии Р3-Х63-А^8-653 только одна сыворотка отвечала необходимым требованиям. Обработкой ЭТС раствором ПЭГ-6000 нам удалось значительно улучшить их качество и таким образом сделать пригодными для проведения работ по получению гибридом и МонАТ.

В доступной литературе отсутствуют сведения об угнетающем действии на гибридные и миеломные клетки перитонеальных макрофагов. Наоборот, большинство исследователей рекомендует использовать последние для стимуляции роста гибридных клеток и утилизации остатков разрушенных и погибших клеток (Фукс Б.В. с соавт., 1982; Свиридов В.В. с соавт., 1986; НуЬпс1отпа ТесЬшчиез,1980).

При гибридизации и клонировании клеток мы заметили, что в ряде случаев пери-тонеальные макрофаги мышей ВАЬВ/с вместо стимулирующего действия угнетают рост гибридных клеток.

В связи с этим проведено исследование цитотоксического действия неритонеалъ' ных макрофагов на модели клеток миеломной линии Р3-Х63-А^8-653. Наиболее отчетливо ингибируюшее действие мак(юфагов проявлялось на восьмые сутки от момента посева миеломных клеток Аналогичные результаты получены и в том случае, если вместо перитонеальных чакрифаюв исшиыоналн кульгурздьнук» аклкость (КЖ), ■

16 • . которой они выращивались. Отменено, что проявление угнетающего Действия перито-

неальных макрофагов, получаемых от одной и той же партии мышей, на миеломные

клетки самопроизвольно прекратилось спустя 9 месяцев.

Получение гибридом - продуцентов моноклоиальных антител к ■ антигенам В. аЬоШ1$ 19ВЛ.

С целью получения гибридом, продуцирующих бруцеллезные МонАТ, проведено 11 гибридизаций клеток мышиной миеломы Р3-Х63-А^8-653 со спленоцитами мышей ВА1-В/с, иммунизированных различными способами и по различным схемам.

Рост гибридных клеток отмечен в 482 лунках из 2112 засеянных, что составило 22.8±0.9 %, причем , в первичном скрининге в ТИФА с бруцеллезным антигеном положительно реагировали 112 проб, или 5.3±0.5 %. Данные об эффективности образования бруцеллезных гибридом в зависимости от схемы иммунизации, способа введения и антигена иммунизации представлены в таблице 1.

Результаты опыта свидетельствуют о том, что наиболее оптимальными являются однократные в/б и в/с инъекции антигена или дополненные бустерной прививкой. Процент образования гибридных клонов при обоих этих способах иммунизации был наи-

Таблица 1. Эффективность образования бруцеллезных гибридом в зависимости от антигена, способа его введения и схемы иммунизации

Антиген для иммунизации Способ введения антигена Схема иммунизации Кол-во гибридизаций Кол-во засеянных лунок Кол-во полученных гибридом Кол-во AT-лродуиирую-щих гибридом Кол-во стабильных гибридом

в 6с. % абс. % ■бс.

ЛИС в/с Однократно" 1 192 32 16.7±2.7 17 8.912.0 12 6.311.7

м.к. в/с Однократно" 4 768 225 29.311.6 72 9.411.0 37 4.810.7

лпс в/б Однократно" 1 192 35 18.3±2.8 3 1.610.9 3 1.610.9

м.к. в/б Однократно 2 384 ¡07 27.912.3 6 1.610.6 4 1.010.7

Л11С в/6 1 цикл 0 • - - - - - -

ч к. в/б 1 цикл 1 192 33 17.212.7 5 2.611.2 1 0.5+0 5

41 к; р/'б 3 цикла 0 - - - - -

V к в/б 3 никла 2 384 50 13.011.7 9 2 310.8 4 1 010.5

i 1мечаиие: м.к - микробные клетки В. abortus 19ВА; *. с бустером или бет него

П

большим, составив 27.9±2.3 и 29.3±1.6 соответственно. Однако количество атпитело-. продуцирующих гибридом наиболее высоким - 8.9±2.0-9.4±1.0% - было при в/с иммунизации, в то иремя как при в/б введении антигена не превышало 1.б±0.9%, а при многократных инъекциях - 2,б±1.2 (один цикл) - 2.3±0,8% (гри цикла).

Полученные данные коррелировали с результатами РЛ и свидетельствуют о том, что последняя является объективным критерием выбора оптимальной схемы иммунизации мышей бруцеллезным антигеном, позволяющей добиться максимальной частоты гибридизации родительских клеток и выхода стабильных антителопродупирующих гибридом.

Характеристика моноклональных анппел к антигенам В. аЬоПм* 19ВА.

Полученные моноклональные антитела по признаку специфичности подразделены нами на 10 групп (табл. 2):

Таблица 2. Групповая специфичность гибридом, сит езирующих моноклональные антитела к бруцеллезному антигену, в ТИФА

Штаммы микроорганизмов

MM fin Кол-во кло- В. melinensis В. abortus B. sais Я. rangiferi i ! 2 С 4 1 , о £ ¿>" a о S -ï г ■S r. « -i; fi. r-i E 3 12 z.

нов 16М И- 297 и- 309 19 BA 544 146 H- 185 1330 И-98 1199 И-42 И- 64 И-181 - s bi 5 i-a

i 1 + + + + + +

2 3 - - - + + -t 4 - - - - - - - + - -

3 1 + J: + 4 + 4 + 4 4 t- 4 t- 4 4 4 - - - -

4 1 + . 4- -i ^ + t 4 1 4 + f 4- 4 4 - - t

5 2 - - - + -t- + - - - 4 +• 4 " 4 4 - - -

6 2

7 24 + 4- 4 i 4 + + 4- 4 4 4 4 f + 4 + 4

8 3 -t 4- t- + + + 4 4 4 4 4 t 4 4 4 » f ' ;

9 2 + 4 + + + 4 4 4 4 t 4 4 4 4 4 • f 4

10 2

Примечание: о первой ко.или-е - грипп» тбрн.юч, (•») - пи.юи/пелышй, (-) ■ отучи и ел lui 1й. 11 > - сомните н,нын реч> н.тл i i

1. Реагирующие только с В. melilensis и В. rangiferi (один клоп);

' 2. Реагирующие В. abortus и У. enterocolitica 0:9 (три клона);

3. Реагирующие с бруцеллами всех взятых в опыт видов (за исключением

■ В. melilensis И-297) и У. enterocolitica 0;9 (одни клон);

4. Реагирующие с бруцеллами всех видов, У. enierocolilica 0:9 и F. tularensis (один клон);

5. Реагирующие с В. abortus, В. rangiferi, У. enterocolitica 0:9, V. cholerae(два клона).

6. Реагирующие только с У. enterocolitica 0:9 (два клона).

7. Реагирующие с бактериями всех взятых в опыт видов (24 клопа).

8. Реагирующие с Brucella spp., У. enterocolitica 0:9, V. choleras и F. tularensis (три клона).

9. Реагирующие с Brucella spp., К enterocolitica, V. cholerae, F. tularensis Я E. coli (два клона).

10. Реагирующие только с В. abortus 19ВА (два клона).

В большинстве случаев полученные гибридомы продуцировали МонАТ, по специфичности не отличающиеся от антител гипериммуиной поливалентной мышиной сыворотки. Однако от них выгодно отличаются пять гибридом со стабильной способностью синтезировать МонАТ. При внутрибрюшинном введении этих гибридом мышам BALB/c получены препараты иммуноасцитической жидкости (ИАЖ), содержащие п значительном количестве моноклональные иммуноглобулины, отнесенные нами к иммуноглобулинам G-класса (IgG).

Известно, что перекрестная реакция между бруцеллами и У. enterocolitica 0:9 происходит за счет наличия в О-боковой цепи их ЛПС повторяющегося элемента - альфа-1,2-связанного перозамина, что подтверждено иммунохимическимн исследованиями (Wu A.M. et al., 1984), а также исследованиями с применением МонАТ (Bundle D.T. et

■ • 19

al.. 1984; Palmer D.A., Douglas J.T., 1989). Определение общих антигенных детерминант

бруцелл и кишечных иерснний с помощью МонАТ 2АН10 в наших опытах проводили п

' ТИФА и РИД (табл. 3).

Таблица 3. Взаимодействие МонАТ 2АН10 с В. abortus 19, У. entcrocohtica 09 и растворимыми антигенами в ТИФА и РИД

Исследуемый материал Метод Антигены

В. abortus 19ВА ЛПС (водная фаза) ЛПС (фекальная фаза) БПА Белковый препарат 18и38кД К enterо-cvUtica 0:9 L. coli OUI

КЖ(1:Ш) ТИФА + + - - + + -

ИАЖ гибридомы 2АН10(1:100) + + - - + + -

Поливалентная мышиная сыворотка (1:100) + +- + + + + +

АЖ ыиеломи РЗ-Х63-А^-б53 (1:100) - - - - - - -

ИАЖ2Н10 РИД + ' + - - ' + -

Коммерческая поли-валет-ная бруцеллезная сыворотка + + + + + + +

Примечание: (+) - реакция положительная, (-) - реакция отрицательная

Данные таблицы свидетельствуют о том, что МонАТ 2АН10, используемые в виде препаратов КЖ и ИАЖ, специфически взаимодействовали в ТИФА с целыми клет-• ками В. abortus 19ВА, У. entewcoliticci 0:9 и растворимыми антигенами бруцелл: ЛПС (водная фаза), ББП 18 и 38 кД, не вступая при этом н реакцию с Е. coli 0111, ЛПС (фе-нольная фаза) и БПА.

Аналогичные результаты получены в РИД, где МонАТ 2АН10 образовывали одну полосу преципитации с В. abortus 19 DA, У. enterocolitica 0:9, J111C (водная фаза), ББП 18 и 38 кД, не взаимодейств)* при этом с F.. coli Olli, ЛПС (фенольная фаза) и БПА. - i ■

Поливалентная мышиная сыворотка (положительный контроль) в ТИФА прореагировала со «семи ашыми в работу антшенами, а аснитическая жидкость (A5Ü) мие-ломы P3-X63-Ag'8-<>53 (отрицательный кот роль.) не взаимодействовала с используемыми анпн снами H РИД поливалентная fipwtc.'i te имя юммерчл:» j» cUKopoiM р«-

20 . гировалз со всеми используемыми антигенами с образованием от трех до пяти полос

преципитации.

Таким образом, установлено, что МонАТ специфически реагируют с эпитопами ВБГ1 18 и 38 кД и являются индикатором наличия аналогичных антигенных детерминант у бруцелл и У. enterocolitica 0:9, что свидетельствует о том, что перекрестные реакции между бруцеллами и кишечными иерсиниями серовара 0:9 могут Происходить не только за счет общих эпигонов в О-боковой цепи их ЛПС, но и в области полипептидов.

Конструирование диагностических тест-систем па основе моноклинальных антител

Моноклональные антитела 2АН10 взаимодействовали в ТИФА с бруцеллами всех видов, но не взаимодействовали с гетерогенными микроорганизмами, за исключением }'. enterocolitica 0:9. Относительно высокая специфичность этих антител послужила основанием для конструирования и усовершенствования на их основе диагностических тест-систем, прежде всего иммуноферментного метода и реакции латекс-агглютинации.

Для получения гнбридомы 2АН10 осуществляли процесс слияния клеГок миеломы P3-X-63Ag/8-653 (концентрация 3-106 клеток/мл) и спленоцитов (3107) мышей BALB/c, иммунизированных двухкратно путем внутрибрюшинной инъекции с интервалом семь суток 5Т09 и Ю10 м.к. В. abortus I9BA в присутствии 50% раствора ПЭГ-1500. Гибридный штамм клонирован методом предельных разведений на слое пе-ритонеальных макрофагов. Процент клонообразования составил 57.0-1:4.9, при этом процент гибридом с продукцией МонАТ одинаковой специфичности ранен 95.0t3.5. Минимальная посевная доза составила 2 ТО5 гибридных клеток/мл, при этом максимальная концентрация - 9 105 клеток/мл - достигалась на седьмые сутки культивирования. Индекс пролиферации при использовании эмбриональной телячьей сыворотки серии 198 (БелНИИЭМ) составил l:2.3-±O.5-l:2.4t0.7. Клон не терял способности продуцировать МонАТ на протяжении 60 пассажей .(срок наблюдения). Жизнеспособность

гибридных клеток при размораживании составляла 65-75 %. Клетки клона 2АН10, введенные в организм мышей BALB/c, вызывали образование ИАЖ на 14-20 сутки. Максимальный титр МонАТ 2АН10 в ТИФА в культуралъной жидкости составил 1:160, в иммуноасцитической жидкости - 1:128000.

При усовершенствовании твердофазного иммуноферментного анализа использовали известный принцип сэндвича: Аг+МонАТ+конъюгат (аитиАТ-пероксидаза).

Планшеты для иммунологических реакций (Ленинградского завода биополимеров) сенсибилизировали живьми (начальная концентрация 108 м.к./мл), инактивиро-ванными (109 м.к./мл) клетками и растворимыми антигенами (0.2 мг/мл) бруцелл. МонАТ использовали в виде КЖ, ИАЖ и MoHlg в рабочем разведении. Все ингредиенты вносили в объеме 25 мкл. Разводящей жидкостью служил 0.02 М фосфатный буфер pH 7.2. Конъюгатом служили антитела против иммуноглобулинов G мыши, меченные пероксидазой, производства ИЭМ имени Н.Ф.Гамалеи РАМН в рабочем разведении. Для выявления реакции использовали орто-фенилендиамин в цнтратно-фосфатном буфере pH 5.0.

При сравнительном изучении активности МонАТ в препаратах КЖ, ИАЖ и очищенных MonIg в отношении бруцелл и У. enterocolitica 0:9 в ТИФА наиболее высокие титры антител зарегистрированы в отношении В. suis й В. abortus (1:160, 1:512001:128000, 1:1600 соответственно). Титры антител при взаимодействии указанных препаратов с В. mchtensis (1:20, 1:400, 1:1600), В rangiferi (1:40, 1:200, 1:3200), а также У. enterocolitica 0:9 (1:40, 1:400, 1:4000) были значительно ниже.

С целью определения влияния на чувствительность ТИФА с МонАТ 2АН10 инактивации антигенов в опытах наравне с живыми использовали бруцеллы, инактивнро-ванные кипячением, формалином и ацетоном. Параллельно исследовали чувствительность ТИФА с применением МонАТ к К enterocolitica 0:9 и некоторым растворимым аш щепам бруцелл. Покачано, чю наибольшая ч>нстьителыюсгь ТИФА гютучсиа при

использовании МонАТ в виле препаратов ИАЖ и MoHlg с бруцеллами видов В. suis и В. abortus, которая составила 1.5 10 М.5-104 м.к./мл. Аналогичные показатели чувствительности для бруцелл видов В. melitensis и В. rangiferi, а также Y. enterocolitica 0:9 составили 4.6 1 05-1.2 1 07 м.к./мл. Чувствительность' ТИФА с использованием МонАТ снижалась при взаимодействии с бруцеллами, инактивированными кипячением, формалином и ацетоном. МонАТ 2АН10, используемые в 'ГЙФА с наибольшей чувствительностью реагировали с ВВП 18 и 38 кД и ЛПС (водная фаза), которая находилась в пределах 0.0012-0.033 мг/мл, а с ЛПС (фенольная фаза) составляла не менее 0.1 мг/мл. Положительный результат ТИФА с ЛПС (фенольная фаза) достигнут лишь при значительном увеличении его концентрации.

Для конструирования бруцеллезной латексной тест-системы использовали MoHlg 2АН10 и полиакролеиновый латекс с диаметром частиц 1.1 и 1.8 мкм. Результаты испытания в лабораторных условиях суммированы в таблице 4.

Результаты реакции агглютинации латекса (РАЛ) свидетельствуют о ее высокой чувствительности при выявлении бруцелл видов В. suis и В. abortus, которая составила м.к./мл. Чувствительность реакции в отношении В. tnelitensis и В. rangiferi, а также Y. enterocolitica 0:9 (1.М08-3 1 09 м.к./мл) была на 2-3 порядка меньшей. С гетерогенными микроорганизмами - V. cholerae, F. tularensis, S. typhimurium, Y. enterocolitica 0:3, E. coli - зарегистрированы отрицательные результаты. Чувствительность РАЛ в зависела от размера частиц латекса - она была выше при использовании частиц диаметром 1.1 мкм, чем 1.8 мкм.

Высокая чувствительность РАЛ в отношении В. abortus й В. suis, низкая - в отношении бруцелл других видов и кишечных иерсиний серовара 0:9, отсутствие взанмо-, действия с гетерогенными микроорганизмами позволяют использовать ее для дифференциации бруцелл двух первых видов от всех других микроорганизмов.

Таблица 4. Чувствительность латексной тест-системы на основе МонАТ 2АН10

Антиген Штамм Ч) гветвитсльноггь в м.к./ил (мг/мл)

Серия 1 Сери« 2 . Серия 3 Сс-рия 4

01,1' 0 1.8 01.1 О 1.1

Д melitensis !6М 3 •la'V отр. отр. oip.

И-29? Ufa н/о отр. огр.

И-309 н/о н/о отр. О-ф. '

В. abortus • 544 н/о н/о 3.7'10" 9.7 Ш'

19В А , 5.6 10' 3.6-10' 1.3-10' 7.8 10"

146 и/о н/о 3.7-10° 4.8-10'

В. suis • 1330 '' 5.610' 3.6 10' 4.0-10' 9.7-10'

И-98 н/о н/о 4.0-10= 9.7 Ю1"

И-?9 н/о н/о 4.0 10' 3.9-10"

В. rangifert И-46 н/о н/о огр. отр.

И-64 н/о к/о отр. отр.

И-181 3.310" oip. отр. отр.

У. enterocolitica 0:3 н/о л/о отр. отр

0:9 1.М0* 3.0 отр. отр.

ЛПС (йодна» фаза) н'о н/о 0.1 0.<«45

ЛПС (фенольная фаза) lifo н/о отр, 0.725

ША н/о . в/о отр. 0-5 отр

У cholerae 152 огр. отр. отр.

5. typhimurium . 21 Оф. отр. отр. О 1р.

F. tularensis ■ И-205 отр. oip. - 01р. Оф.

E. coli 0111 отр. отр. отр. Оф.

Примечание: н/о - не определяли

РАЛ способна выявлять не только корпускулярные, но и растворимые антигены бруцелл. При этом чувствительноегь этой реакции, как и ТИФА, значительно выше в отношении ЛПС (водная фаза) (0.1-0.0045 мг/мл) чем ЬПА и ЛИС (фенольная фаза)(0.5 -0.725 мг/мл). Несомненно, большим Достоинством и преимуществом латексной тсст-снстемы на основе МонАГ является возможность стандартизации компонентов реакции, в частности иммуноглобулинов, н получения их и необходимых количествах.

ИЫПОДЫ ;

1. Получен набор из 41 клона гнбрилом. проецирующих чоноюонхи.нис антитела к бруие.плм и некоторым нлери/енныи »<дм, рлде.тожт по тс-

цифиччости на 10 групп. Выделено 5 клонов гибридных клеток со стабильной продукцией моноклональных иммуноглобулинов, специфически реагирующих с бруцел-пами.

2. С помощью моноклональных антител 2АН10 получены новые данные об антигенном строении бруцелл, свидетельствующие о наличии общих антигенных детерминант у бруцелл и Y. enterocolitica 0:9, которые располагаются не только в О-боковой цепи ЛПС, но и в области белковых структур. . ..

3. Модифицирован с применением моноклональных антител 2АН10 иммунофер-уентный анализ, показана его высокая чувствительность и специфичность при определении антигенов бруцелл.

4. На основе моноклональных антител 2АН10 сконструирована и успешно испытана в лабораторных условиях латексная тест-система для идентификации бруцелл. .

5. Реакция лейкоцитолиза является объективным прогностическим критерием эффективности антигенной стимуляции спленоцитов мышей бруцеллезным антигеном и пероягности получения стабильных антителопродуцирующих гибридом. Определена оптимальная схема иммунизации животных бруцеллезным антигеном - однократная ппу гриселезеночная инъекция или дополненная бустерной прививкой.

6. Перитонеальные макрофаги, используемые в гибридомной технологии в качестве подкормочных клеток, могут обладать цитотоксическим действием на гибридные клегки in vitro, в связи с чем рекомендуется перед гибридизацией убедиться в отсутствии их токсического действия на миеломные клетки.

7. Ростовые свойства коммерческих эмбриональных телячьих сывороток, не отвечающих требованиям, необходимым для культивирования клеток миеломных и гибридных линий, можно улучшить путем обработки сывороток раствором полиэгиленг-ликоля-6000. .

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Михайлов Л.М., Коионенко Е.В. Применение реакции лейкоцнтолнза для оценки сенсибилизации лимфоцитов, Используемых для получения гибридом / Иркутский n.-и. противочум. ин-г Сибири и ДВ. - Иркутск, 1990 - 7 с. - Ден. в ВИНИТИ. 11.06.90,-№3298 В 90.

2. Михайлов Л.М., Титенко A.M., Медведева Н.Н. Реакция лейкогштошпа как метод выбора схемы иммунизации при получении гибридом к антигенам бруцелл П Пробл. природно-очаговых и зоонозных инфекций в Сибири и на Дальнем Востоке: Тез. конф. - Чита, 1993. - С. 107-109.

3. Михайлов Л.М., Титенко A.M., Захлебная О Д. Получение гибридом к антигенам бруцелл и их специфичность // Актуал. пробл. профйп. особо опас. и природно-очаговых болезней:.Тез. конф. - Иркутск, 1994,- С.111.

4. Титенко A.M., Михайлов Л.М., Рудник М.П., Грнднева Л.Г. Суспензионная тест-система на основе моноклональных антител для определения антигенов бруцс-лл // Актуал. пробл. профил. особо опас. и нриродно-очаювих болезней: Тез конф. - Иркутск, 1994. - С. 153.

5. Михайлов Л.М.,.Титенко A.M., Тюменцев С.Н., Захлебная О.Д., Рудник M.II., Токарева Л.Е., Лаукнер И В. Получение моноклональных антител к поверхностным ап-тигенам В. abortus 19 ВА.: Отчет о НИР (заключит.). Иркутский н -и. противочум. ин-т Сибири и ДВ, 1994. : 57 с Ден. в ВИНИТИ иив. К» 02. 97 00018.01.

6. Михайлов ЛМ., Титенко А М. К «опросу получения и использования моноклональных анттпел к анпненам бруцелл // Матер, науч.-практ. конф., поев. 100-летию оГфазования ирошвоч\м. службы России. Тез конф. - С а раю к, 1997,- С. 196-197.

7. Михайлов II М., Рудник М II, Гитенко А М Исгюлыогыние моноклональных анттел и дифференциальной ли.нносчп.е возбудителя бруцеллеза И Кйил науч.-

26 ■

прякт. колф., поев. 75-яети'ю Гос. санитарно-эпидемиол. службы России, Итога, проблемы, перспективы: Тез. конф. - Иркутск, 1997. - С149-150.

8. Вейде A.A., Рудник М П., Михайлов Л.М., Тайкова Т.С., Гриднева Л.Г. Лабораторный контроль продовольствия па зараженность возбудителями особо опасных инфекций: Отчет о НИР (заключит.). Иркутский н.-и. противочум. нн-т Сибири и ДВ, 1998. - с. 38. Дси. в ВИНИТИ, нив. № 02980005761.

9. Патент РФ №2113475 Cl., С 12 N 5/12, 5/18, С 12 Р 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L.- продуцент моноклоналъных антител, специфичных к препарату белков бруцелл с молекулярным весом 18 и 38 кД/Л.М.Михайлов, А.М.Титснко, О.Д.Захлебная, И.В.Лаукнер (Россия) - № 96109343; Заявлено 6.05.96; Опубл. 20 06.98 Бюл. № 17; Приоритет 6.05.96.