Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Биологические основы получения и практического применения субклеточных фракций бактерий на модели бруцелл

Р Го ОД

На правах рукописи

Григорьева Галина Ивановна

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ ПОЛУЧЕНИЯ И ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ СУБКЛЕТОЧНЫХ ФРАКЦИЙ БАКТЕРИЙ НА МОДЕЛИ БРУЦЕЛЛ

16.00.03- ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

03.00.07 - микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург - 1998

Работа выполнена в лаборатории субклеточных структур бактерий Нижегородского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии МЗ РФ , лаборатории бруцеллеза научно-исследовательского ветеринарного института Нечерноземной зоны РФ , на кафедре эпизоотологии и микробиологии Нижегородской государственной сель -скохозяйственной академии , в хозяйствах и ветеринарных лабораториях Рязанской и Архангельской областей.

Научные консультанты:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор, член-корреспондент Российской академии сельскохозяйственных наук

В.В.Сочнев

Доктор биологических наук, профессор Г.К.Дегтева

Официальные оппоненты:

Доктор ветеринарных наук, профессор Зеленский В.П. Доктор медицинских наук, профессор Ценева Г.Я. Доктор биологических наук, профессор Болотников И.А.

Ведущая организация: Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана

Защита состоится « /3 » _1998г. в часов на

заседании Совета по защите диссертаций ДР120.20Л ПРИ Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины ( 196084, Санкт-Петербург, Черниговская, 5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины

Автореферат разослан «_ » с^^ 1998г.

Ученый секретарь совета доктор ветеринарных наук М.В.Шустрова

1.ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность проблемы. Бруцеллез как зоонозное заболевание до настоящего времени представляет «мировую» проблему, несмотря на значительные успехи, достигнутые в различных научных и практических сферах, касающихся этого явления. Исследования отечественных эпидемиологов и эпизоотологов последних лет показывают, что и в нашей стране бруцеллез по-прежнему относится к числу опасных зоонозных заболеваний (Федоров, Горшенко,1989; Губина,Маликов,1989; Малышева, 1995; Авилов,1997). На территории России за последние годы резко проявилась неравномерность распространения это болезни, выделились регионы с выраженной стационарностью бруцеллеза. Большинство ученых и специалистов считают, что бруцеллез является управляемой инфекцией , хотя имеет довольно широкое распространение и в дикой природе, а степень надежности оздоровительных мероприятий во многом зависит от качества эпизоотологического надзора, обуславливающего четкость прогнозирования характера бруцеллезных эпизоотии в конкретных природно-географических и хозяйственно-экономических условиях.

Немаловажное значение для достижения эффективности

противобруцеллезных мер имеет знание особенностей паразитарной системы бруцеллеза на всех уровнях: популяционном, ' организменном, клеточном, молекулярном. Несомненную актуальность представляет дальнейшее совершенствование одного из основных звеньев эпизоотологического надзора - диагностики бруцеллеза , как бактериологической, так и иммунологической. Назрела необходимость внедрения нового истинного комплекса серо-аллергических методов с включением небольшого числа простых высокочувствительных и специфических реакций, обеспечивающих выявление манифестаций основных звеньев иммуногенеза при бруцеллезе: гуморального и клеточного. Очевидно, что требуется совершенствование бактериологической диагностики бруцеллеза- с применением новейших достижений биохимии и молекулярной биологии, обеспечивающих экспресс-идентификацию бактерий, выделяемых в очагах бруцеллеза, на всех уровнях таксономической иерархии: род, вид, штамм. Особенно важна своевременная дифференциация вакцинных от эпизоотически значимых штаммов в случаях применения живых вакцин. Не теряет своего приоритетного значения проблема совершенствования способов

эпизоотологического контроля, среди которых наибольшую важность представляет вакцинопрофилактика в плане создания и применения принципиально новых средств специфической защиты людей и животных от бруцеллеза

Накопленный к настоящему времени значительный научно-практический материал по всестороннему изучению бруцеллеза позволяет разрабатывать и проводить широкие плановые мероприятия по ликвидации этой инфекции, эффективность которых определяется степенью научной обоснованности разрабатываемых систем с учетом как общих тенденций и новейших достижений науки и практики, так и специфических особенностей природно-географического, экономического, хозяйственного характера.

Все вышеизложенное и определило выбор темы и направления наших исследований.

1.2. Цель работы. Определить биологические основы получения и практического применения субклеточных фракций бактерий на модели бруцелл и реализовать разработки в конкретных предложениях , направленных на совершенствование диагностики и профилактики бруцеллеза , способствующих ликвидации этой болезни.

1.3. Основные задачи исследования.

В соответствии с целью работы на разрешение были поставлены следующие задачи:

■ на основании современных достижений микробиологии , молекулярной биологии и биохимии изучить возможность применения новых подходов к бактериологической диагностике бруцеллеза с использованием характеристик субклеточных систем: белковых и липидных;

■ определить биологические основы разборки клетки бруцелл на субклеточные фракции, несущие определенные антигенные функции и пригодные для конструирования на их основе профилактических и диагностических препаратов;

■ разработать технологию получения препарата протективного антигена бруцелл, используемого в качестве основы для создания принципиально новой искусственной вакцины, обладающей свойствами, приближенными к свойствам «идеальной» бруцеллезной вакцины;

■ изучить особенности эпизоотического бруцеллезного процесса у крупного рогатого скота в условиях Нечерноземной зоны России,

разработать на основе полученных данных научно-обоснованную систему противобруцеллезных мероприятий и внедрить в животноводческие хозяйства Нечерноземной зоны РФ.

1.4. Научная новизна. В настоящей работе впервые на модели таксономически отличных групп бактерий (микобактерии, стафилококки, сальмонеллы) изучена значимость электрофоретических характеристик различных белковых систем клеток (экзопродукты, растворимые, суммарные клеточные и мембранные белки) для решения вопросов идентификации и дифференциации бактерий на различных таксономических уровнях: род, вид, штамм (A.c. №1013476). На основании полученных данных впервые разработаны подходы к бактериологической диагностике бруцеллеза с позиций критериев, характеризующих спектры белковых фракций.

Впервые изучен состав жирных кислот бруцелл пяти видов методом сопиролиза и газо-хроматографического анализа , что позволило определить родовые и видовые особенности бактерий по этому признаку. Комплекс нетрадиционных для бактериологии бруцеллеза методов, характеризующих состав жирных кислот и электрофоретические параметры белковых систем, предложен в качестве дополнения к системе традиционных диагностических методов, что позволяет проводить экспресс- идентификацию бактерий в очагах бруцеллеза и дифференцировать вакцинные штаммы от эпизоотически значимых.

Впервые разработана безотходная технология фракционирования бактериальной массы бруцелл на базе представлений о биологических основах строения клетки и механизмах участия отдельных антигенных комплексов в процессе пато- и иммуногенеза (A.c. №1631786). Использованный принцип разборки клетки на субклеточные фракции с сохранением специфических свойств позволил получить антигенные препараты , пригодные для конструирования на их основе серологически и аллергически активных препаратов, хорошо зарекомендовавших себя при испытании в экспериментальных и производственных условиях .

Впервые разработана оригинальная технология получения протективного антигена, биологической основой которой является представление о его ключевых патогенных функциях и экстрацеллюлярном происхождении. Конъюгация данного антигена с полимерным носителем позволила

сконструировать бруцеллезную искусственную вакцину (БИВ), которая обеспечивает достаточно высокую степень защиты от бруцеллезной инфекции и не обладает способностью индуцировать антитслогенез и специфическую сенсибилизацию, препятствующих диагностике бруцеллеза. (A.c. №1518961).

Впервые разработан ускоренный способ серологической диагностики бруцеллеза (Э-РПГА ), превышающий по чувствительности и специфичности другие ускоренные методы, и пригодный для дифференциальной диагностики бруцеллеза и иерсиниоза у лактирующих коров (A.c. №2387661).

Разработана научно-обоснованная система эпизоотологического надзора при бруцеллезе крупного рогатого скота для Нечерноземной зоны России в соответствии с эпизоотической обстановкой и степенью риска возникновения болезни. Апробация и внедрение системы позволило улучшить эпизоотическую ситуацию по бруцеллезу в целом по Нечерноземной зоне РФ.

1.5. Практическая ценность. Биологические основы практического применения субклеточных фракций бруцелл, использованные нами в данной работе, позволили получить и апробировать приближенный до некоторой степени к "идеальному" вариант комплекса профилактических и диагностических приемов и средств, обеспечивающий практически в полном объеме специфическую часть эпизоотологического контроля и надзора при бруцеллезе. Это — специфическая профилактика с применением БИВ, не препятствующая серологической, аллергической и бактериологической диагностике бруцеллеза, плюс истинный диагностический комплекс, состоящий из эффективной экспресс-реакции для массовых скрининговых исследований по сыворотке крови и молоку (Э-РПГА), высокочувствительного иммуноферментного анализа (ИФА), как метода выявления манифестаций гуморального звена иммунитета, и непрямой реакции лизиса лейкоцитов (НРЛЛ), как метода регистрации показателей клеточного звена иммунитета, а также эффективного дополнения к комплексу традиционных бактериологических методов в форме газохроматографического анализа жирных кислот и электрофоретического анализа белковых систем (экзопродуктов, суммарных белков клетки), позволяющих проводить идентификацию выделяемых культур на уровне рода, вида и штамма. Внедрение и строгое соблюдение рекомендаций, предложенных производству в научно-обоснованной системе противобруцеллезных мероприятий для

Нечерноземной зоны России, позволяет поддерживать в целом по зоне уровень стабильного благополучия по этой инфекции.

Полученные на основании многолетних исследований результаты включены в практические рекомендации и учебные пособия, среди которых: «Методы выделения субклеточных структур микроорганизмов. Электрофоретическое фракционирование из белковой части», одобренные МЗ РСФСР (1980); «Физико-химические методы анализа макромолекул в биологических исследованиях» (1979); «Рекомендации по профилактике и ликвидации бруцеллеза крупного рогатого скота в хозяйствах Рязанской области» , одобренные НТС Агропрома Рязанского облисполкома (1985); «Научно-обоснованная система противобруцеллезных мероприятий в Нечерноземной зоне РСФСР», одобренная НТС Минсельхозпрода России(1987, 1991); «Методика лабораторного получения протективного антигена бруцелл», утвержденная ГУВ Госагропрома СССР (1988); «Методика проверки бруцеллезной искусственной вакцины на морских свинках», утвержденная ГУВ Госагропрома СССР (1988); «Методика проверки иммуногенности бруцеллезной искусственной вакцины на крупном рогатом скоте», утвержденная ГУВ Госагропрома СССР (1988); «Методика производственного испытания экспресс-РПГА при диагностике бруцеллеза», утвержденная ГУВ Госагропрома СССР (1989); «Методика дифференциальной диагностики бруцеллеза и иерсиниоза», утвержденная ГУВ Госагропрома СССР (1989); «Дифференциальная диагностика бруцеллеза и иерсиниоза и меры по их профилактике», одобренные НТС Госагропрома НЗ РФ (1991); «Организация ветеринарного дела в условиях экономической реформы Российской Федерации», рекомендации, одобренные НТС Минсельхозпрода (1997); «Нетрадиционные методы исследования при дифференциальной диагностике бруцеллеза животных», одобренные Минсельхозпродом России (1997).

1.6. Основные положения дессертационной работы, выносимые на защиту:

• Биологической основой разборки клетки бруцелл на субклеточные фракции, состоящие из отдельных антигенных комплексов, пригодных для конструирования вакцинных и диагностических препаратов, являются конкретные научные знания об их структуре и участии в процессах пато- и иммуногенеза.

• Комплексная характеристика газо-хроматографических спектров жирных кислот и электрофореграмм белковых систем является существенным признаком в идентификации и дифференциации бруцелл на разных уровнях таксономической иерархии.

• Научно-обоснованная система противобруцеллезных мероприятий, разработанная для хозяйств Нечерноземной зоны России, позволяет поддерживать в ней стойкое благополучие по бруцеллезу крупного рогатого скота.

1.7. Пути реализации. Результаты исследования могут быть использованы в работе практических и научно-исследовательских лабораторий, осуществляющих бактериологическую и серологическую диагностику бруцеллеза; в производстве бруцеллезных профилактических и диагностических препаратов; в работе эпидемиологических и эпизоотологических служб при разработке противобруцеллезных мероприятий, а также в учебном процессе при подготовке специалистов - микробиологов общебиологического, медицинского и ветеринарного профиля.

1.8. Апробация работы. Материалы диссертации доложены на итоговых научных конференциях Нижегородского государственного университета им. Н. И. Лобачевского (Нижний Новгород, 1977, 1979, 1980 г. г.); конференциях молодых ученых Нижегородского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии (Нижний Новгород, 1975, 1978, 1981 г. г.); симпозиуме молодых ученых "Медико-биологические аспекты патологии человека" (Нижний Новгород, 1979); заседании Московского отделения Всесоюзного биохимического общества (Москва, 1979); на межлабораторном совете Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (г. Пущино-на-Оке, 1980); заседании ученого совета ННИИЭМ (1980); IV Всесоюзном биохимическом съезде (Санкт-Петербург, 1979); I Всесоюзной конференции "Хроматография в биологии и медицине" (Москва, 1983); научно-практических конференциях по актуальным вопросам ветеринарии (Нижний Новгород, 1984, 1985, 1988, 1992 г. г.); Всероссийском совещании "Интенсификация животноводства и кормопроизводства в Нечерноземной зоне РСФСР (г. Йошкар-Ола, 1986); Всесоюзной научно-технической конференции "Совершенствование ветеринарного обслуживания животноводства в условиях интенсификации" (г. Махачкала, 1987); Всесоюзной конференции "Актуальные

вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным" (г. Новосибирск, 1989); I Всесоюзном иммунологическом съезде (г. Сочи, 1989); Всесоюзной конференции "Теория и практика хроматографии" (г. Нижний Новгород, 1990); Всесоюзном совещании "О перспективах развития животноводства и ветеринарии в XIII пятилетке" (Ленинград-Пушкин, 1990); координационных совещаниях по проблеме бруцеллеза и туберкулеза (г. Москва, ВИЭВ, 1985; г. Омск - ВНИИБТЖ, 1986, 1987, 1991 г.г.); заседаниях ученого совета НИВИ НЗ РСФСР (г. Нижний Новгород, 1984—1991 г.г.); заседании профессорско-преподавательского состава кафедры эпизоотологии и микробиологии Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии (г. Нижний Новгород, 1997).

Материалы диссертации опубликованы в 72 научных статьях, отчетах, рекомендациях, приоритетность результатов исследований подтверждена 4 авторскими свидетельствами на изобретение.

1.9. Внедрение. Результаты исследований внедрены в работу лаборатории субклеточных структур микроорганизмов Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии, городской СЭС Нижнего Новгорода, в учебный процесс кафедры молекулярной биологии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского, в практику НИР лаборатории бруцеллеза НИВИ НЗ РСФСР, в учебный процесс кафедры эпизоотологии и микробиологии Нижегородской сельскохозяйственной академии.

Разработанные научно-обоснованные системы противобруцеллезных мероприятий внедрены в хозяйствах Нечерноземной зоны России. Экономический эффект от внедрения в неблагополучных хозяйствах Касимовского района Рязанской области в 1986 г. составил 4,5 рубля на 1 рубль затрат. Система дифференциальной диагностики бруцеллеза и иерсиниоза внедрена в хозяйствах Архангельской области и Удмуртии. Общий экономический эффект от внедрения разработки составил на 1 января 1992 г. около 1 млн. рублей.

1.10. Структура и объем диссертации. Дессертационная работа представлена в одном томе, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов и практических предложений. Диссертация изложена на 459 страницах

машинописного текста, иллюстрирована 72 таблицами и 100 рисунками. Список использованной литературы включает 546 наименований, из них 248 иностранных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы, методы и объемы исследований

В соответствии с планами НИР работа выполнялась с 1973 по 1997 г. г. в лаборатории субклеточных структур бактерий Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РФ, лаборатории бруцеллеза научно-исследовательского ветеринарного института Нечерноземной зоны РФ, на кафедре эпизоотологии и микробиологии Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии, а также на базе лаборатории по изучению бруцеллеза Северо-Кавказского зонального научно-исследовательского ветеринарного института (г. Новочеркасск), Института иммунологии МЗ РФ (г. Москва), в хозяйствах и ветеринарных лабораториях Рязанской и Архангельской областей.

Эпизоотологические исследования. При изучении эпизоотологии бруцеллеза крупного рогатого скота в Нечерноземной зоне РФ были проанализированы:

• данные, полученные лабораторией бруцеллеза НИВИ НЗ РФ во время эпизоотологических исследований на территории Рязанской и Архангельской областей;

• статистические отчеты отделов ветеринарии при администрация указанных областей, а также районов, областных и районных ветеринарных лабораторий:

• экспертизы лабораторных бактериологических исследований на бруцеллез патматериала от животных различных видов, а также результаты диагностических (иммунологических) исследований различных видов сельскохозяйственных животных, проведенных в ветлабораториях Рязанской, Архангельской областей и лаборатории бруцеллеза СКЗ НИВИ.

Характеристика изучаемых культур бактерий и условия их выращивания. При выполнении задачи по изучению белковых систем бактерий в плане их идентификации были использованы в качестве модели следующие группы микроорганизмов:

• микобактерии :9 штаммов ( музейные и производственные), из которых'8 относились к виду Mycobacterium tuberculosis, 3 - М. bovis, 8 штаммов являлись атипичными ( I-IV группа по классификации Runyon ,1959). Культуры выращивали на синтетической среде Линникова-Могилевского 8-12 недель при 38°С, бактериальную массу отделяли фильтрованием и высушивали ацетоном;

• сальмонеллы: 32 штамма вида Salmonella typhimurium , в том числе 11 штаммов, выделенных при внутрибольничных вспышках («госпитальные»), 8 -при спорадических заболеваниях людей и 13 штаммов - от животных и из внешней среды. Культуры выращивали на мясо-пептонном агаре в течение 18 часов при 37°С, а при получении экзопродуктов - в течение 18 и 5 часов;

• стафилококки: 451 культура разных видов , из которых 48 - музейные, полученные из ГИСК им. Л.А. Тарасевича; 391 культура выделена от больных в стационарах Нижнего Новгорода; 18 культур коагулазоотрицательных стафилококков разных видов (референтные) были получены из НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Бактериальную массу культур наращивали на мясо-пептонном агаре в течение 18 часов при 37°С;

• бруцеллы: 39 культур 5 видов: abortus, melitensis, suis, ovis, canis , из которых 4 являлись референтными, 10 - музейных и вакцинных (получены из ВНИВИ, г. Казань, и СКЗ НИВИ), 25 культур выделены при бактериологических исследованиях патматериала от сельскохозяйственных животных в районах зоны Северного Кавказа. Культуры выращивали на МППГГА, на эритрит-агаре.

Все использованные в работе культуры микроорганизмы были охарактеризованы по основным фенотипическим признакам в соответствии с действующими на сегодняшний день методиками.

Методы фракционирования бактерий. Экзопродукты бактерий получали выращиванием культур на твердой питательной среде, покрытой целлофановой мембраной. Бактериальную массу (бакмассу) смывали физиологическим раствором, отделяли центрифугированием, а надосадочную жидкость (НОЖ), содержащую экзопродукты (внеклеточные белки) использовали для исследования.

Для выделения суммарных растворимых белков (СРВ) бактерий, а также для получения фракций мембран бакмассу дезинтегрировали на прессе или ультразвуком (УЗДН-1). Фракцию СРБ получали экстракцией клеточного

дез и нте грата цитрат-фосфатным буфером (pH 7,4) с последующим центрифугированием.

Для получения суммарных белков клетки (СБК) сальмонелл бакмассу экстрагировали фосфатным буфером, содержащим 3% додецилсульфата Na, 5% ß -меркаптоэтанола и 9,5М мочевины (О' Farrell, 1975). СБК бруцелл получали экстрагированием бакмассы трис-НС1-буфером с 2% додецилсульфата Na при 10-минутном кипячении с последующим центрифугированием.

Мембранные фракции сальмонелл и стафилококков получали путем последовательного фракционирования клеточного дезинтеграта с применением ультрацентрифугирования (145000 д). Фракции белков наружной мембраны бруцелл для аналитических исследований получали по методу D. Verstreate et. al. (1982) в нашей модификации или экстракцией фосфатным буфером с 1% додецилсульфата Na , 1% J5 -меркаптоэтанола и 8М мочевины.

Аналитические методы. Содержание белка в препаратах определяли общепринятым методом Лоури . Сахара (пентозы, гексозы) определяли по методу М. Dubois et. al. (1956). Чистоту и нативность мембранных фракций определяли по активности ферментов дыхательной цепи (Блохина с соавт., 1979). Количественное определение КДО, как маркера бактериального ЛПС, проводили по методу, описанному И. Я. Захаровой и Л. В. Косенко (1982). Качественный и количественный анализ аминокислот проводили на анализаторе «Hitachi» модели KLA-5.

Электрофоретические методы. Для получения белковых спектров бактерий использовали несколько различных модификаций электрофореза в полиакриламидном геле (ЭФ-ПААГ). Экзопродукты стафилококков, сальмонелл и СРБ микобактерий разделяли в системе щелочного ПААГ при концентрации акриламида 7,5%. СБК и мембранные белки разделяли с помощью ЭФ-ПААГ в присутствии додецилсульфата Na (ПААГ-SDS) при концентрации акриламида 10% (Weber, Osborn, 1969) и 5-15% (Laemmli, 1973). Электрофорез проводили в приборах трубчатого типа («Reanal», Венгрия) и пластинчатого типа («Хийу Калур», Эстония). Денситометрирование электрофореграмм осуществляли на автоанализаторе «Электрофорез» (ННИИЭМ) и с помощью регистрирующего микрофотометра МФ-4 с электронным потенциометром ЭПП-0,9 МЗ. Полученные белковые спектры характеризовали по относительным электрофоретическим подвижностям фракций (Rf) и коэффициентам подобия

(К) (Блохина, Дегтева, 1972). Молекулярные массы белков определяли по методу К. Weber и М. Osborn (1969).

Хроматографические методы. Газо-жидкостную хроматографию жирных кислот бруцелл осуществляли методом сопиролиза (Пинчук, Лазовская, ' 1989) на газовом хроматографе «Цвет» с пламенно-ионизационным детектором. Препараты протективного антигена бруцелл анализировали методами адсорбционной хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе и силохроме С-80, гельпроникающей хроматографией на сефадексе G-75 с использованием прибора «Увикорд» (Швеция). Высокоэффективную жидкостную хроматографию проводили на приборе фирмы «Brukler» с регистрацией на волне 206 и 254 нм. Тонкослойную хроматографию выполняли на пластинах «Sifufol».

Методы диагностических исследований. Бактериологические исследования патологического материала на бруцеллез проводили в соответствии с «Наставлением по диагностике бруцеллеза» (1982), для выделения энтеробактерий (эшерихий, сальмонелл, иерсиний) - согласно руководству «Энтеробактерий» (1985 г.).

Серологические исследования на бруцеллез проводили с применением методов РА, РСК, РБП, KP в соответствии с «Наставлением по диагностике бруцеллеза» (1982 г.). Постановку РПГА осуществляли согласно наставления по применению дианостикума бруцеллезного эритроцитарного (Одесский Завод бакпрепаратов), а также с применением разработанных нами диагностикумов и методов. Для обнаружения противобруцеллезных антител в отпечатках крови на фильтровальной бумаге использовали разработанную нами методику (Сочнев с соавт., 1986). РБП с молоком ставили по методике Карагандинской НИВС. Постановку РПГА с кишечно-иерсиниозными и сальмонеллезными антигенными диагностикумами осуществляли в соответствии с наставлениями, прилагаемым к препаратам. Иммуно-ферментный анализ (ИФА) проводили в непрямом варианте, взяв за основу метод V. Lamb et al. (1979), с разработанными нами тест-системами.

Аллергические исследования на бруцеллез проводили путем постановки внутрикожной пробы с бруцеллином ВИЭВ и аллергенами, приготовленными нами. Непрямую реакцию лизиса лейкоцитов (НРЛЛ), как аллерготест in vitro, ставили по методике М. И. Чернышевой и Р. А. Рахимбаевой (1981) в нашей модификации. Результаты выражали в показателях специфического лизиса (ПСЛ), оцененных в процентах.

Методы изучения иммуногенной активности препаратов.

Иммуногенную активность препаратов изучали с помощью оценки формирования под воздействием испытуемых веществ специфической невосприимчивости экспериментально зараженных бруцеллезом животных. Для заражения использовали 2-суточную культуру бруцелл вирулентного штамма Вг. abortus 54 в необходимой дозе. Морских свинок через 1 месяц после иммунизации заражали подкожным введением культуры, крупный рогатый скот - нанесением суспензии бруцелл на конъюктиву глаза. Через 1 месяц после заражения животных убивали и исследовали бактериологически. Рост бруцелл хотя бы в одном посеве расценивался как прорыв иммунитета, и животное считалось заразившимся. Рассчитывали индекс инфицированности (ИИ) как отношение числа посевов с ростом бруцелл к общему числу посевов для каждой опытной группы. Иммуногенность препаратов (протективный эффект) определяли как отношение числа иммунных (незаразившихся) к общему числу животных в группе и выражали в процентах. Проверку иммуногенности препаратов проводили также по ускоренному методу В. И. Мельниченко и А. Н. Касьянова (1985) на белых мышах линии NFR/NFS.

Расчет экономической эффективности. Экономическую эффективность от внедрения противобруцеллезных мероприятий рассчитывали по «Методике определения экономической эффективости ветеринарных мероприятий» (1982).

Статистическая обработка результатов. Полученные результаты обрабатывали статистически общепринятыми методами (Плохинский, 1970), а также по методике, предложенной для биологических исследований (Добротина, Ежова, 1986).

При планировании, мотодическом обеспечении и реализации научных экспериментов участвовали и оказывали помощь академик РАМН, доктор медицинских наук И. Н. Блохина, член-корреспондент Россельхозакадемии, доктор ветеринарных наук В. В.Сочнев, профессор, доктор биологических наук Г. К. Деггева, доктор ветеринарных наук /1. А. Малышева, доктор биологических наук П. Е. Игнатов, которым автор считает своим долгом выразить искреннюю признательность и благодарность.

Результаты исследований

Субклеточные структуры бактерий в приложении к решению вопросов таксономии, идентификации и дифференциации

Сравнительный анализ белковых спектров бактерий

В последнее время, как показал анализ литературы, в целях идентификации и дифференциации микроорганизмов, наряду с изучением генома и множества фенотипических признаков, довольно широкое применение получило изучение белковых систем различной структурной организации в клетке, особенно с применением таких характеристик, как электрофореграммы, получаемые при фракционировании белков электрофорезом в полиакриламидном геле. Представляло значительный интерес применить этот подход для идентификации бруцелл и особенно внутривидовой дифференциации этой группы бактерий, тем более, что конкретных данных об изучении бруцелл в этом аспекте в научной литературе явно недостаточно.

Предварительно был проведен ряд исследований на других группах микроорганизмов, с отработкой серии методических приемов и подходов.

Изучение растворимых белков микобактерий. Всего было изучено 19 штаммов микобактерий, среди которых 8 штаммов относились к виду М.tuberculosis, 3 штамма — М.bovis, а остальные 8 штаммов — к четырем группам по классификации Е. Runyon. Протеинограммы всех изученных культур, полученные с помощью электрофореза в системе щелочного полиакриламидного геля (pH 8,3), сравнивали' по показателям подобия, рассчитываемым для каждой пары культур. На основании проведенных расчетов была построена схема взаимосвязи изученных культур с учетом наиболее высоких показателей подобия между штаммами (К > 60%). При этом штаммы вида М. tuberculosis объединились в одну группу . Белковые спектры микобактерий бычьего типа (bovis) также были схожи друг с другом. А расположение штаммов атипичных микобактерий в схеме совпадало с данными других авторов, полученными как по белковым спектрам (Haas et al., 1972), так и по результатам изучения антигенной структуры этой группы бактерий (Лазовская, Белоусова, 1973). Установлены белковые фракции, общие для всех

изученных культур как типовые для рода, характерные для отдельных видов и специфические для группы атипичных культур.

Белковые системы стафилококков.

Сопоставление спектров мембранных белков стафилококков. Следующим этапом исследований явилось сравнительное изучение стафилококков, многие вопросы систематики которых и дифференциации патогенных от апатогенных форм представляют серьезную проблему. Анализ литературных данных показал, что одной из наиболее консервативных субклеточных структур бактерий является мембрана, в связи с чем мембранные белки представляют особый интерес как объект сравнительного изучения микроорганизмов.

Для сравнительного изучения белковых спектров мембран были использованы 26 штаммов стафилококков разных видов, отличавшихся по свойствам, происхождению и хорошо охарактеризованных по основным фенотипическим признакам , нуклеотидному составу ДНК и спектрам растворимых клеточных белков

Поскольку в литературе имелись противоречивые данные о влиянии на электрофореграмы мембранных белков бактерий возраста культуры, мы провели эксперимент по изучению зависимости профиля белкового спектра мембран от времени культивирования бактерий. При этом установлено, что спектр мембранных белков не менялся во все время ростового цикла стафилококков от 10 до 26 часов, то есть в пределах фазы экспоненциального роста.

В результате выполненного исследования установлено, что каждый штамм стафилококков обладал уникальным белковым спектром мембран. В электрофореграммах белков насчитывалось 26—34 фракции, образованных полипептидными цепями с молекулярными массами от 11 до 150 кД. Сопоставление белковых спектров мембран по показателям подобия и характеру денситограм позволило провести группирование изученных культур, которое согласовывалось с разделением культур по фенотипическим признакам и данным геносистематики. Составлена условная схема, отражающая степень сходства изученных культур стафилококков. В итоге установлено, что сопоставление спектров мембранных белков может способствовать более точному определению родственных взаимоотношений стафилококков. При этом были отмечены видоспецифические фракции спектра, общие для всех культур и характерные для каждого штамма.

Таким образом, использование характеристик спектров белков, связанных в клетке в мембранные структуры, для таксономических и других исследований сравнительного характера показало их определенную перспективность.

Сопоставление спектров внеклеточных белков в дифференциации культур стафилококков. Следующей задачей нашего исследования было определение уровня значимости характеристик принципиально отличной фракции белков —растворимых, экскретируемых клеткой во внешнюю среду в процессе жизнедеятельности, в дифференциации стафилококков. Для изучения были взяты 45 музейных и 391 свежевыделенная культура стафилококков, среди последних 245 культур были коагулазоположительные, остальные не проявляли активность катапазы. Белки экзопродуктов фракционировали с применением электрофореза в системе щелочного ПААГ (рН 8,3). Установлено, что в период роста культур стафилококков от 8 до 24 часов (экспоненциальная фаза), спектр внеклеточных белков, как и в случае мембранных белков, оставался неизменным, однако состав питательной среды оказывал влияние на качественные и количественные показатели протеинограммы. В связи с этим все исследования сравнительного характера выполняли в стандартных, унифицированных условиях выращивания культур и получения белковых спектров.

Электрофореграммы внеклеточных белков всех изученных культур показали значительную гетерогенность спектров, насчитывающих 8—19 фракций. Показатели подобия спектров были крайне низкими (50—58%). При построении схемы группирования стафилококков по этому признаку не было установлено какой-либо корреляции с разделением по видовым признакам, фаготипам, по спектрам других белковых систем, гомологии нукпеотидных последовательностей ДНК. Эти результаты позволили нам сделать вывод об индивидуальности спектров внеклеточных белков на уровне штамма и предложить способ идентификации стафилококков по спектрам внеклеточных белков, на который получено авторское свидетельство (А. с. №1013476). Показано, что по данному способу можно проводить идентификацию определенного штамма в наборе культур, что весьма ценно при эпидемиологических исследованиях, в частности, — для прослеживания циркуляции штамма во внешней среде и выявления источника инфекции и путей передачи.

Характеристика белковых систем сальмонелл. Следующим объектом исследований послужили представители другой классификационной группы грамотрицательных бактерий — культуры Salmonella typhimurlum . Цель работы состояла в дифференциации так называемого "госпитального" биовара, обуславливающего возникновение внутрибольничных вспышек сальмонеллеза, от штаммов биовара, являющегося наиболее частым этиологическим агентом вспышек пищевых токсикоинфекций, спорадических заболеваний и выделяемого из пищевых продуктов, от животных и из внешней среды.

В работе было использовано 32 штамма S.typhlmurium, из которых 11 штаммов "госпитального" биовара были отнесены нами к I группе, а остальные — ко II группе культур, среди последних 8 культур были выделены при спорадических заболеваниях и 13 — от животных и из внешней среды. Для исследования были получены внеклеточные белки (экзопродукты), суммарные белки клетки (СБК), выделяемые экстракцией клетки жесткими химическими реагентами, и белки, связанные с мембранной фракцией (наружной и цитоплазматической). Электрофоретическое фракционирование экзобелков проводили в щелочном ПААГ и в ПААГ-SDS, последний метод использовали и для разделения СБК и мембранных белков.

В результате проведенных экспериментов установили, что все штаммы изученной коллекции сальмонелл, разделенные на две группы, отличающиеся по происхождению и набору фенотипических признаков, включающих чувствительность к антибиотикам, ряду ферментативых свойств и фаговую формулу, вместе с тем обладают близкими по характеристикам электрофореграммами экзобелков, суммарных клеточных и мембранных белков. Причем наибольшую идентичность этих признаков показали "госпитальные" штаммы, а культуры, выделенные при спорадических заболеваниях , из внешней среды и от животных, проявляли в большей степени штаммовые различия. Наибольшей информативностью в отношении штаммовой специфичности обладали протеинограмы экзобелков, полученные с использованием электрофореза в системе ПААГ-SDS. Эти данные коррелируют с результатами изучения данных культур сальмонелл по другим хемотаксономическим характеристикам, в частности — газо-хроматографическим спектрам высших жирных кислот, где показано, что "госпитальные" штаммы значительно менее вариабельны по составу жирных кислот, чем культуры II группы (Пинчук, Шевлягина, 1981).

Таким образом, результаты наших исследований, проведенные на таких таксономически далеких друг от друга группах микроорганизмов как микобактерии, стафилококки и сальмонеллы, показали что характеристики электрофореграмм определенных белковых систем клетки могут быть использованы в качестве дополнительного критерия при исследованиях бактерий в плане таксономии, идентификации и дифференциации на различном уровне. Решение методических вопросов позволило нам разработать схемы фракционирования бактериальных клеток для выделения субклеточных структур, а также модифицировать методические приемы фракционирования белков, которые нашли свое отражение в рекомендациях "Методы выделения субклеточных структур микроорганизмов. Электрофоретическое фракционирование их белковой части" (1980), а также в учебном пособии для студентов ВУЗов "Физико-химические методы анализа макромолекул о биологических исследованиях" (1979).

Белковые системы бруцелл в сравнительном аспекте

Накопленный опыт работы по изучению белковых систем бактериальных клеток в сравнительном аспекте позволил нам подойти к проблеме идентификации и дифференциации возбудителей такой важной в плане экологического благополучия зоонозной инфекции, как бруцеллез, с качественно новой стороны. Анализ данных литературы показал, что в отношении бруцелл в вопросах таксономии, происхождения, видовой и внутривидовой дифференциации еще много не решенных вопросов. Особенно остро стоит проблема выявления источников заражения, путей передачи инфекции и прослеживания всей эпизоотической бруцеллезной цепочки в целом, а также дифференциации проявлений эпизоотических процессов от вакцинных при проведении специфической профилактики живыми вакцинами в качестве эпизоотического контроля.

В связи с этим, на разрешение была поставлена задача изучить возможности характеристик белковых систем бруцелл по аналогии с другими бактериями для возможного применения их в целях идентификации и дифференциации как на уровне вида, так и на штаммовом уровне.

В качестве объекта исследования использовали 10 референтных и музейных культур бруцелл 5 видов: Br. abortus, Br. melitensis, Br. ovis, Br. suis и Br. canis, а также 17 культур, выделенных из патологического материала от сельхозживотных неблагополучных по бруцеллезу хозяйств зоны Северного

Кавказа, любезно предоставленных для исследования доктором ветеринарных наук Л. А. Малышевой.

Анализ экзобелков бруцелл. Результаты предыдущих экспериментов показали значение исследований экзобелков бактерий в вопросах штаммовой идентификации. Экзопродукты бруцелл фракционировали с помощью электрофореза в системе ПААГ-SDS. В результате установили, что белковый спектр экзопродукгов бруцелл, как и в случае стафилококков, имел уникальный характер для каждого штамма. Вместе с тем определялись и общие для отдельных видов признаки по наличию характерных фракций. Таким образом, сравнительное изучение электрофореграмм внеклеточных белков бруцелл может быть использовано для дифференциации этих бактерий на уровне штамма.

Белки наружной мембраны бруцелл. По данным литературы известно, что в случае грамотрицательных бактерий часто единственной белковой системой, электрофоретические показатели которой позволяют проводить дифференциацию культур, являются белки наружной мембраны. Для выделения белков наружной мембраны (БНМ) бруцелл мы испытали несколько методов, хорошо зарекомендоваваших себя при работе с другими родами грамотрицательных бактерий, например, псевдомонад и сальмонелл (Волчкевич, 1990, Conlton, Wan, 1983), однако в случае бруцелл они оказались неэффективными. Это обусловлено, по-видимому, особенностями строения клеточной оболочки бруцелл и более прочными соединениями ее компонентов. В связи с этим мы разработали схему фракционирования клетки бруцелл с выделением фракции мембран, взяв за основу метод, предложенный именно для работы с бруцеллами (Verstreat et al., 1982).

Белковые спектры наружных мембран бруцелл, полученные электрофорезом в системе ПААГ-SDS, показали типичные характеристики: присутствие трех основных групп белков с М.м. 88-94 кД (I группа), 30—34 кД (II группа) и 25—30 кД (III группа), общих для всех видов бруцелл (Verstreat et al., 1982, Verstreat, Winter, 1984, Winter, 1987). Кроме этих основных групп, протеинограммы содержали ряд дополнительных фракций различной молекулярной массы, характерные для отдельных видов. По этому признаку нам удалось отдифференцировать культуры, выделенные из патологического материала, на две группы: близкие по спектрам БНМ к виду Br. abortus (2 культуры) и близкие к виду Br. melitensis (3 культуры). Эта дифференциация

совпадала с видовой идентификацией полевых изолятов на основании культурально-биохимических признаков. Причем культуры, отнесенные к виду Br. abortus, показали очень близкое сходство по спектру БНМ с вакцинным штаммом Br. abortus 82, который применялся ■ в хозяйствах, откуда были выделены эти культуры.

Интересные результаты получены с неидентифицированной по культурально-биохимическим свойствам культурой 42/88, выделенной при диагностическом убое положительно реагирующей в серологических реакциях на бруцеллез овцематки из неблагополучного хозяйства. По нашим данным на основании характеристик белкового спектра наружной мембраны эта культура относилась к виду Br. melitensis и представляла собой эпизоотический штамм.

Полученные данные свидетельствовали о том, что спектры БНМ бруцелл несут определенные видоспецифические признаки, однако широкое применение этого метода для видовой идентификации бруцелл ограничено довольно значительной трудоемкостью выполнения этих анализов, связанных с получением фракции наружных мембран.

Анализ суммарных белков клетки. Для целей экспресс-идентификации бактерий наиболее привлекательными всегда были методы, не требующие сложных методических приемов. В этой связи мы использовали для проведения электрофоретического анализа экстракты белков из цельных клеток бруцелл, выделенных с помощью жестких химических реагентов, позволяющих практически лизировать бакгериальную клетку. При этом получали фракцию суммарных белков клетки (СБК), в которую входили как растворимые белки, так и связанные в клетке в определенные структуры. Анализ показал достаточную информативность данного методического подхода для видовой идентификации бруцелл, особенно интересным оказался результат изучения 17 культур, выделенных из патологического материала. Все эти культуры показали практически полностью идентичные спектры СБК между собой и вакцинным штаммом Br. abortus 82, который применялся в данных хозяйствах в качестве вакцинирующего препарата.

В целом установлено, что электрофоретические спектры различных белковых систем бруцелл несут определенную информацию, которая может быть использована при видовой идентификации культур, а также внутривидовой дифференциации. Штаммовую уникальность особенно отчетливо демонстрируют спектры внеклеточных белков, по этому признаку можно

отдифференцировать вакцинные штаммы от полевых изолятов при исследовании эпизоотических процессов. Наиболее приемлемым для широкого применения является анализ суммарных белков клетки бруцелл как наиболее простой в исполнении и не требующий большого количества бактериальной массы. Таким образом, характеристики протеинограмм могут являться существенным дополнением в общем комплексе бактериологической диагностики бруцеллеза.

Перспективные подходы к сравнительному изучению белковых спектров бактерий на основе многомерного статистического анализа На наш взгляд, наиболее перспективным развитием работ по сопоставлению белковых спектров бактерий в сравнительном аспекте является получение референс-спектров белковых систем отдельных групп микроорганизмов, по которым можно идентифицировать свежевыделенные культуры. Для этих целей нами предложено проведение взаимно-корреляционного анализа денситометрических кривых с использованием ЭВМ, что обеспечивает получение более точных результатов, поскольку, при этом учитываются не только координатные признаки белковых фракций, но и амплитудные, отражающие относительное содержание белка в фракциях.

Сравнительный анализ жирных кислот бруцелл с применением метода газо-хроматографического анализа К экспресс-методам бактериологической диагностики относится и газо-хроматографический анализ жирных кислот. Мы применили технику сопиролиза, позволяющую значительно сократить время проведения анализов, для изучения состава жирных кислот бруцелл. Всего было изучено 26 культур, из которых 16 были музейные, в том числе и референтные, и 10 выделенные из патологического материала от КРС и овец, полученные из лаборатории бруцеллеза СКЗ НИВИ. В результате установили, что использованный метод дает более тонкое разделение жирных кислот, чем приемы, использованные для этих целей другими авторами (Васюренко с соавт., 1977; Dees et. al., 1984; Zanaka, Soto, 1977). Видимо применение различных методов анализа состава жирных кислот бруцелл разными авторами и привело к некоторым противоречивым результатам, судя по данным литературы.

Нами подтверждено мнение о том, что все виды бруцелл имеют однотипный качественный состав жирных кислот (ЖК). Для рода Brucella в целом характерен сдвиг состава ЖК в сторону длинноцепочечных кислот: с

числом атомов углерода от 17 до 19 (58—80%). Различия между видами носят количественный характер, но вполне определенный. Особенно отличался вид Br. ovis, как по специфическому соотношению насыщенные ЖК : ненасыщенные : циклопропановые (57,2:21,7:18,0), так и по наибольшему коэффициенту отношения насыщенных к ненасыщенным ЖК (3,1). Кроме того, культуры этого вида показали характерное присутствие в спектрах ЖК двойного пика кислоты с 15-ю атомами кислорода в сравнительно высоком количестве (13,2% + 1,3).

Свои видовые особенности проявил и спектр ЖК культур Br. suis, который характеризовался наименьшим коэффициентом соотношения насыщенных и ненасыщенных ЖК (0,9). Различия между видами abortus и melitensis практически не определялись, а в комплексе они четко дифференцировались от других видов.

Корреляция характеристик ЖК с состоянием диссоциации, патогенностью, принадлежностью к различным биоварам не установлена.

Анализ культур, выделенных из патологического материала, по газо-хроматографическим спектрам ЖК позволил их идентифицировать как бруцеллы видов Br. abortus — Br. melitensis, за исключением культуры 121/89, которая по данным признакам не являлась представителем рода Brucella, а могла относиться к одному из видов рода Pasterella, скорее всего Pasterella haemolytica.

Таким образом, полученные результаты показали, что анализ жирных кислот методом газо-жидкостной хроматографии в условиях сопиролиза является надежным критерием идентификации рода Brucella, а также позволяет достоверно идентифицировать виды abortus — melitensis от ovis и suis. Особенно метод представляет интерес для экспресс-идентификации свежевыделенных культур в очагах бруцеллеза.

В целом, на основании проведенных исследований можно утверждать, что использованные нами нетрадиционные для бактериологии бруцеллеза приемы, включающие газо-хроматографический анализ жирных кислот (сопиролиз) и электрофоретическое фракционирование бактериальных белков, являются весьма информативными и могут являться эффективным дополнением к комплексу традиционных методов бактериологической диагностики. Считаем целесообразным при идентификации выделенных культур на первом этапе проводить анализ ЖК для определения рода и вида, а затем для уточнения видовой идентификации и штаммовой дифференциации изучать

культуры с помощью электрофоретического анализа суммарных белков клетки и внеклеточных белков. В этих целях весьма полезным может явиться формирование банка данных по референс-культурам разных видов и родов о форме "картотеки", "атласа", которые позволят с достаточной степенью точности путем сравнительного анализа решать сложные вопросы идентификации, дифференциации вакцинных и эпизоотических культур, и этим способствовать более эффективному проведению эпизоотологического надзора. На основании полученных нами данных было составлено учебно-методическое пособие "Нетрадиционные методы исследований при дифференциальной диагностике бруцеллеза животных" (1997 г.).

Разработка и оптимизация технологической схемы

получения из клетки бруцелл субклеточных фракций различной функциональной направленности

Оптимизация технологии получения протективного антигена бруцелл и его применение в составе бруцеллезой искусственной

вакцины (БИВ)

Анализ литературных данных показал, что бруцеллез относится к таким инфекциям, при которых важным звеном эпизоотологического контроля является вакцинопрофилактика. Применяемые в настоящее время на практике живые и инактивированные вакцины, наряду с положительными свойствами, обладают рядом существенных недостатков, что заставляет продолжать научные поиски в этом направлении.

Нами в течение ряда лет проводились исследования по отработке лабораторно-производственной технологии получения протективного антигена (ПА) бруцелл, способ получения которого был предложен П. Е. Игнатовым (1984 г.), с целью последующего использования его в качестве вакцины. Сущность способа выделения ПА заключается в том, что бруцеллы, обладающие вирулентными свойствами, помещаются в условия, приближенно моделирующие условия пребывания патогена внутри макрофага, где он проявляет одно из основных своих патогенных действий — выделяет фактор (экстрацеллюлярный антиген), ингибирующий слияние фагосом с лизосомами и этим противостоит иммунному действию макроорганизма. Наша задача была отработать режимы максимального накопления этого антигена в культурапьной

среде, выделения этой фракции, очистки ее от примесей, а также анализировать получаемые препараты протективного антигена по основным биохимическим и иммунологическим параметрам.

Изучение структурных и функциональных особенностей экстрацеллюлярного антигена бруцелл. Предварительно были изучены структурные особенности экстрацеллюлярного антигена (ЭА) с применением различных хроматографических методов, которые позволили установить, что ЭА неоднороден по составу и состоит из нескольких компонентов с различным электрическим зарядом, а протективная активность связана с низкомолекулярными компонентами (М.м. ниже 10 кД), представляющими собой, по всей видимости, гликопептиды (5—7% пептидов и 25—30% Сахаров). При проверке иммуногенных свойств этой фракции низкомолекулярных компонентов на морских свинках, зараженных вирулентной культурой бруцелл (10 ИД), установлена ее высокая иммуногенная активность (62,5%) при выраженном отсутствии свойства индуцировать антителогенез. Эту фракцию и обозначили как протективный антиген (ПА). Полученные данные по основным характеристикам ПА бруцелл позволили нам определить условия получения протективного антигена в количествах, достаточных для анализа и последующего применения в качестве основы при создании искусственной вакцины.

Получение протектионого антигена бруцелл и его характеристика.

В результате многочисленных экспериментов нами была разработана технологическая схема получения ПА бруцелл, включающая несколько этапов от наращивания бактериальной массы бруцелл до получения лиофильно высушенного препарата ПА.

В качестве матричной культуры использовали штамм Br. abortus 19М, селекционированный нами из вакцинного Br. abortus 19 путем адаптации его к росту в жестких условиях (при повышенном содержании эритритола, Н2О2 и кислом значении рН), необходимых для продукции протективного антигена.

Принципиальным моментом технологии получения ПА являлся этап ультрафильтрации, позволяющий отделить фракцию, содержащую компонент с М.м. ниже 10 кД. Всего нами было получено более 50 серий препарата ПА бруцелл, которые были охарактеризованы по химическому составу, спектрам поглощения в УФ-области и имели типичные свойства для установленных нами критериев ПА. Все полученные серии ПА изучали в отношении протективной

активности в опытах на белых линейных мышах с использованием в качестве заражающей культуры Br. abortus 19М, для которой была рассчитана доза заражения, обеспечивающая 100% гибель неиммунных животных.

В результате установили, что некоторые серии препарата ПА создавали 100%-ную защиту мышей от заражения, некоторые обладали меньшей иммуногенностью, что свидетельствовало о необходимости дальнейшего совершенствования технологии получения антигена. Для дальнейшей работы использовали только те серии препарата ПА, которые показали достаточно высокую иммуногенность.

Получение искусственной бруцеллезной вакцины (БИВ) на основе протективного антигена. Работу по созданию бруцеллезной искусственной вакцины и изучению ее иммуногенных свойств проводили совместно с Институтом иммунологии МЗ РФ, часть исследований, в основном по экспериментальной проверке иммуногенности вакцины на лабораторных животных и КРС, выполняли на базе и с участием лаборатории бруцеллеза СКЗ НИВИ.

Для создания БИВ были использованы подходы, сформулированные в работах Р. В. Петрова с соавт. (1981, 1983, 1986 г. г.), базирующиеся на принципе конъюгации специфического антигена и иммуностимулирующего высокомолекулярного компонента, обеспечивающего усиление иммунного ответа на вводимый антиген. Были изучены два типа конъюгатов: с использованием природного полимера на основе декстранов (градекса) и синтетического сополимера винилпирролидона и акриловой кислотой (NA). Установлено, что наибольшую иммуногенность (89,0 ±12,9%) в экспериментах на морских свинках проявил конъюгат ПА с градексом, который и был назван "бруцеллезная искусственная вакцина" (БИВ).

Изучение иммуногенных свойств БИВ в условиях эксперимента. Последующие эксперименты с БИВ позволили отработать оптимальные дозировки вакцинирующего препарата, схему его применения при двукратной иммунизации и определить, что даже при массированном многократном его введении лабораторным животным не наблюдается синтеза противобруцеллезных антител и специфической сенсибилизации, определяемых стандартными методами диагностики.

Сравнение БИВ с другими наиболее распространенными противобруцеллезными вакцинами из штаммов 19, 82 и 45/20 ("Abortox") на

модели морских свинок показало, что по иммуногенности БИВ (87,5 ± 0,5%) не уступает живым вакцинам (86,7 ± 1,3% - шт. 19; 75,0 + 0,1% - шт. 82) и инактивированной (70,0 ± 0,9%), но в отличие от них не индуцирует положительных серологических реакций (РА, РСК, РПГА) ни в один из сроков исследования.

Результаты применения БИВ в эксперименте на КРС (коровы и телки, 28 голов) показали, что она иммуногенна и для этих животных, причем отмечена выраженная дозозависимость: снижение эффекта протективности при повышенных дозах вакцины. Наилучший результат (100%-я иммуногенность) был получен при использовании БИВ при двукратной иммунизации в суммарной дозе 7 мг. В течение поствакцинального периода ни одно животное также не реагировало в стандартных серологических реакциях с бруцеллезными диагностикумами и в аллергической пробе с бруцеллином.

Полученные результаты работы с БИВ позволили предположить, что созданная нами искусственная вакцина представляет весьма перспективный профилактирующий препарат и необходимы дальнейшие исследования для его совершенствования. На способ получения БИВ получено авторское свидетельство (А. с. N91518961), а разработанные методики проверки иммуногенных свойств БИВ на КРС и морских свинках утверждены ГУВ Госагропрома СССР (№438-3 от 28 апреля 1988 г.).

Последующие испытания БИВ в производственных условиях в качестве эпизоотологического эксперимента в Волгоградской области, самой неблагополучной по бруцеллезу КРС в России, показали, что применение БИВ в общем комплексе противобруцеллезных мероприятий позволяет резко ослабить напряженность эпизоотического процесса и в течение 12—18 месяцев добиться ликвидации эпизоотических очагов бруцеллеза (Авилов, 1997).

Фракционирование клетки бруцелл с целью получения антигенных

препаратов

Анализ данных литературы по строению клетки бруцелл, способах связи субклеточных структур и компонентов, участию различных антигенных комплексов в процессах пато- и иммуногенеза, а также накопленные сведения по выделению отдельных субклеточных фракций и их практическому применению при конструировании биологических препаратов позволили нам определить основные подходы к оптимальному фракционированию клетки

бруцелл с целью разработки безотходной технологии получения антигенных препаратов различной функциональной направленности, пригодных для создания на их основе различных диагностикумов. Тем более, что проблема совершенствования средств и способов диагностики бруцеллеза остается по-прежнему актуальной. Принципиальными моментами для разработки такой технологии являлись следующие посылки:

— первыми во взаимодействие с элементами иммунитета вступают поверхностные структуры клетки бруцелл, которые стимулируют антителогенез, главными из них являются полисахариды ЛПС и поверхностные белки клеточной стенки (наружной мембраны). Таким образом, именно эти компоненты должны являться биологической основой конструирования серологически активных диагностикумов;

— из современных методов серологической диагностики наибольшей чувствительностью при выявлении специфических антител обладают непрямые реакции с использованием носителей, позволяющих детектировать результаты взаимодействия антиген-антитело в очень небольших количествах. К таким реакциям относятся реакция пассивной гемагглютинации (РПГА) и иммуноферментный анализ (ИФА) и следует обратить внимание на создание тест-систем именно для этих методов;

— в диагностике инфекционных заболеваний животных , в том числе при бруцеллезе, при массовых, скрининговых исследованиях большое значение имеют экспресс-методы, позволяющие быстро и просто провести серологическую диагностику. При этом наблюдается сложная взаимосвязь между основными показателями методов : чувствительностью и специфичностью , зависящая от природы используемых при этом специфических антигенов и условий проведения реакций. Существует определенная потребность в совершенствовании данного направления;

— структура О-полисахарида ЛПС бруцелл несет определенные антигенные детерминанты, общие с таковыми других грамотрицательных бактерий, и в первую очередь — Yersinia enterocolytica. Диагностикумы, изготовленные на основе бруцеллезного ЛПС всегда будут обуславливать в ряде случаев ложноположительные результаты реакций, усложняющие диагностику бруцеллеза . Необходимо иметь в арсенале диагностических методов дифференциально-диагностические тесты, позволяющие преодолеть

эту проблему, возможно за счет применения диагностикумов, содержащих не ЛПС бруцелл, а другие специфические антигены, в частности — белки;

— для выявления клеточного звена противобруцеллезного иммунитета наиболее пригодны аллерготесты с включением в состав тест-системы аллергенов белковой природы, в основном это глубинные белки клетки с М.м. 30—80 кД. Необходимо выделить из клетки бруцелл такую белковую фракцию, которая была бы активна в качестве специфического аллергена в тестах in vivo и in vitro. В последнем случае наиболее привлекательна непрямая реакция лизиса лейкоцитов (НРЛЛ), основанная на исследовании клеточных реакций опосредованно через сыворотки крови сенсибилизированных животных;

— в технологии получения протективного антигена бруцелл в некоторой степени "побочным" продуктом является нативная бактериальная масса в достаточно большом количестве. Необходимо разработать безотходную технологию ее переработки на биологически активные препараты по принципу разборки клетки бруцелл по субклеточным фракциям с максимальным сохранением специфических свойств.

В конечном итоге, перечисленные выше теоретические посылки послужили биологической основой разработки технологии получения антигенов из клетки бруцелл.

Выделение серологически активных фракций и их использование

Получение и испытание эритроцитарных антигенных бруцеллезных диагностикумов на основе S- и RS-антигенов бруцелл. К одному из наиболее специфических и высокочувствительных методов диагностики инфекционных болезней относится реакция пассивной гемагглютинации (РПГА). По мнению ряда авторов, для максимального выявления инфицированных животных при бруцеллезе целесообразно применть РПГА с диагностикумами, изготовленными на основе как S- так и RS- и R-антигенов, поскольку эпизоотическая роль диссоциированных форм бруцелл в настоящее время установлена вполне определенно (Ощепков, 1991). В этих целях нами были получены препараты клеточных стенок (КС) культур Br. abortus 19М (S) и Вг. abortus 82 (RS) методом дифференциального центрифугирования клеточных дезинтегратов после ультразвуковой обработки бактериальной массы с последующей очисткой с применением нуклеаз, детергентов и лиофильного

высушивания. Препараты КС с типичными для этой субклеточной фракции спектрофотометрическими характеристиками использовали далее для получения зритроцитарных диагностикумов. Диагностикумы изготавливали по разработанной нами схеме, в основе которой лежали методы, описанные Б. В. Коральником (1976).

Полученные диагностикумы с S- антигеном и RS-антигеном показали достаточную специфичность и чувствительность, соответствующие уровню коммерческого диагностикума (Одесское предприятие по производству бакпрепаратов) при исследовании экспериментально зараженных морских свинок, а также сывороток крови КРС из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств Рязанской области. При этом установлено, что противобруцеллезные антитела выявляются с помощью РПГА во всех случаях, когдав сыворотки были положительными по другим серологическим реакциям (РА, РСК, РБП). Отмечено, что диагностикум, приготовленный на основе RS-антигена, выявлял • присутствие противобруцеллезных антител в 7,7% случаев, не подтвержденных другими реакциями. Это связано, очевидно, с тем, что данные животные могли быть инфицированы диссоциированными формами бруцелл. Следует отметить, что диагностикум, в основу которого был взят препарат КС, полученный из бактериальной массы штамма Br. abortus 19М после использования ее для продукции ПА, не уступал по своей разрешающей способности коммерческому диагностикуму.

Разработка и применение метода экспресс-РПГА (Э-РПГА). В связи с тем, что РПГА является одной из наиболее чувствительных в серологической диагностике бруцеллеза и в то же время конструкция диагностикума обеспечивает и высокую специфичность, мы попытались использовать этот принцип регистрации гемагглютининов для разработки нового ускоренного способа обнаружения противобруцеллезных антител в сыворотке крови и молоке, названного нами Э-РПГА.

В основу метода Э-РПГА было положено повышение температуры реакционной смеси с целью ускорения образования гемагглютината и введение детергента для устранения неспецифических реакций при взаимодействии концентрированных реагентов (неразведенные сыворотки крови и молоко). Способ испытан в различных условиях параллельно с другими серологическими реакциями. При этом установлено, что разрешающая способность Э-РПГА в условиях экспериментального заражения морских свинок на 20,9% выше, чем у

другого экспресс-метода — РБП В производственном эксперименте на КРС (720 голов) из различных по эпизоотическому состоянию хозяйств Э-РПГА оказалась наиболее чувствительной среди всех испытанных серологических реакций (РА, РБП, РСК, РПГА). Так, в целом, из 466 животных из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств у 12% обнаружены противобруцеллезные антитела методом Э-РПГА, что больше в 2,3 раза, чем РСК (5,2%), в 2,1 раза, чем РБП (5,4%), в 2 раза, чем РА (6%) и в 1,3 раза больше, чем развернутой РПГА (9%).

Испытание Э-РПГА с молоком от коров из неблагополучных хозяйств показало ее значительно большую специфичность, чем у стандартной кольцевой реакции (КР) и модифицированной РБП (РБПМ), а по чувствительности она в 2,5 раза превышала КР и в 5 раз — РБПМ. При проверке Э-РПГА в условиях благополучного хозяйства, где обнаружены неспецифические реакции с бруцеллезными диагностикумами, обусловленные инфицированием КРС иерсиниями (Архангельская область), Э-РПГА с сывороткой крови оказалась наиболее чувствительной к выявлению антител, перекрестно реагирующих с бруцеллезными антигенами, но в то же время при исследовании молока этим методом получены только отрицательные результаты при имеющихся положительных результатах КР.

В связи с тем, что положительные результаты КР, как установлено, носили неспецифический характер (установлен мастит), предполагаем, что Э-РПГА с молоком может случить дифференциально-диагностическим тестом при постановке диагноза на бруцеллез или иерсиниоз, поскольку, по всей видимости, для иерсиниоза не характерно накопление специфических антител в молоке, как при бруцеллезе. На наш взгляд, этот экспресс-метод серологической диагностики бруцеллеза — Э-РПГА, на который получено авторское свидетельство (А. с. №1387661), заслуживает дальнейшего более широкого испытания как весьма перспективный для включения в систему диагностических мероприятий при бруцеллезе.

Применение выделенных антигенных фракций в иммуноферментном анализе (ИФА). Как показал анализ литературы, одним из наиболее чувствительных методов при диагностике инфекционных болезней является ИФА, способный выявлять полные и неполные антитела в малых количествах, и, таким образом, детектировать бруцеллезную инфекцию как на ранней, так и в хронической стадии болезни, заменяя сразу несколько

диагностических серологических реакций (Желудков, 1989; Stemshorn, 1985). Очевидно, что чувствительность и специфичность тест-систем для ИФА в значительной мере зависит от используемых бруцеллезных антигенов. Для выделения бруцеллезных антигенов мы использовали бактериальную массу культуры Br. abortus 19М, полученную в процессе производства протективного антигена. Были получены следующие антигены: 1) ЛПС-Ф липополисахаридный антиген, выделенный из фенольной фазы при фенол-водной экстракции; 2) В-АГ - водорастворимый антиген, выделенный из водной фазы при фенол-водной экстракции; 3) ЛПС-ЭДТА - липополисахаридный антиген, полученный путем экстракции клеток бруцелл ЭДТА (Live, Morrison, 1972); 4) Б-АГ - белковый антиген, выделенный солевой экстракцией клеток бруцелл (Tabatabai, Deyoe, 1984). Биохимический анализ препаратов показал присутствие в них белков и полисахаридов в различных соотношениях.

При создании тест-систем для ИФА с полученными нами антигенами отрабатывались следующие режимы: условия сенсибилизации полистироловых планшет антигенами, подбор оптимальных доз антигенов и разведений конъюгата (анти-1дС-быка + пероксидаза хрена), определение диагностического титра , определение чувствительности тест-систем, а также определение разрешающей способности сконструированных тест-систем в сравнении с другими серологическими методами.

В результате выполненных исследований мы остановили свой выбор на ЛПС-ЭДТА и Б-АГ, поскольку ИФА с этими антигенами регистрировал антитела в гипериммунной бруцеллезной сыворотке с наивысшим титром (1:25600 и 1:12800, соответственно). Применение данных антигенных препаратов обеспечивало наибольшую чувствительность ИФА, с помощью которого удалось выявить дополнительно 2,2% животных, в крови которых содержались противобруцеллезные антитела, не обнаруживаемые комплексом стандартных реакций (РА, РБП, РСК, РПГА) при обследовании крупного рогатого скота из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств.

Таким образом, в результате проведенных исследований установили, что тест-система для ИФА с включением в качестве специфических антигенов для • иммобилизации планшет липополисахаридной (ЛПС-ЭДТА) и белковой (Б-АГ) 1 фракций бруцелл, оказалась достаточно эффективной для выявления противобруцеллезных антител в сыворотке крови КРС и превышает по " основным параметрам показатели традиционных диагностических

серологических реакций на бруцеллез. Для включения в итоговую схему фракционирования клетки бруцелл мы выбрали технологию получения препарата ЯПС-ЭДТА, как обеспечивающего наибольшую эффективность ИФА. В целом показано, что из общего количества сывороток крови КРС, содержащих противобруцеллезные антитела, 83,3% были положительны в ИФА (с антигеном ЛПС-ЭДТА), в то время как с применением комплекса других серологических реакций (РА, РСК, РБП, РПГА) обнаруживалось лишь 66,7% положительных результатов.

Получение белковой фракции со свойствами аллергена.

Получение белковых фракций и их характеристика. Из данных литературы известно, сто наиболее выраженный сенсибилизирующей активностью обладают клеточные белки бруцелл преимущественно с М.м. 30-80кД, причем, это белки большей частью глубинные, находящиеся внутри клетки (Johnes et al., 1973). Был отработан режим экстрагирования из оставшейся после выделения серологически актвных антигенов бактериальной массы Br. abortus 19М белковых фракций с помощью детергентов, таких как тритон Х-100, который действует на гидрофобные связи, и додецилсульфат Na (SDS), который разрушает практически все связи между молекулами, кроме первичных. Полученные таким способом белковые фракции, как показал анализ электрофорезом в системе ПААГ-SDS, содержали белковые компоненты с М. м. 30—80 кД. Судя по эффективности методов, с помощью которых мы выделяли эти белковые фракции, в их составе находились, в основном, белки, соединенные в клетке с мембранными структурами.

Испытание полученных белковых препаратов в качестве аллергенов. При испытании полученных нами белковых фракций как аллергенных препаратов при постановке внутрикожной пробы на сенсибилизированных лабораторных животных (морских свинках) наибольшую эффективность показал препарат, полученный с применением SDS (SDS-экстракт), превышающую эффективность коммерческого аллергена бруцеллина ВИЭВ при одинаковой специфичности.

Технология получения SDS-экстракта была включена в общую схему фракционирования, а сам аллерген был испытан в тест-системе непрямой реакции лизиса лейкоцитов (НРЛЛ) как аллерготеста in vitro при бруцеллезе.

Применение аллергенных препаратов в непрямой реакции лизиса лейкоцитов как аллерготеста при бруцеллезе. Метод НРЛЛ привлек наше внимание тем, что позволяет использовать для исследования те же сыворотки, с которыми проводятся серологические исследования, и в качестве клеток-мишеней применяются лейкоциты здорового животного-донора. При этом выявляется манифистация принципиально другого звена иммунитета — клеточного, выражающаяся в специфической сенсибилизации организма и наличии в сыворотке крови особого фактора, при взаимодействии которого с аллергеном проявляется цитолитический эффект на лейкоциты.

В процессе работы мы провели некоторую модификацию исходного метода НРЛЛ (Чернышева, Рахимбаева, 1981), позволившую оптимизировать технику постановки реакции, облегчающую учет результатов и сокращающую время выполнения анализов.

В результате установлено, что полученная нами из бакмассы Br. abortus 19М, отработанной на предыдущих этапах фракционирования, белковая фракция, выделяемая с помощью экстракции SDS, оказалась в достаточной степени эффективной в качестве аллергена при использовании в тест-системе НРЛЛ, а сама реакция непрямого лизиса лейкоцитов позволила дополнительно к комплексу серологических реакций выявить 42% животных, специфически реагирующих только на бруцеллезный аллерген при производственном испытании на сыворотках крови КРС из неблагополучного по бруцеллезу хозяйства. Однако следует отметить, что в эту категорию попадают и животные, которые сенсибилизированы за счет ранее проведенной вакцинации живой вакциной (Br. abortus 82). При этом установлено, что одновременно в серологических реакциях и в НРЛЛ реагировало лишь 8% животных и, таким образом, полной корреляции наличия в сыворотке крови специфических антител с ее цитолитической активностью не обнаружено. Эти результаты подтверждаются данными других авторов (Желудков, Чернышева, 1985; Fensterbank, 1984).Кроме того, поскольку реакция НРЛЛ не связана с применением антигенных детерминант бруцеллезного ЛПС, перекрестно реагирующих с гетерологичными антителами к другим видам микроорганизмов (иерсиниям), она является весьма перспективной, на наш взгляд, для применения в качестве дифференциально-диагностического теста при постановке диагноза на бруцеллез и другие инфекции, такие, как иерсиниоз и др. Этот методический подход был с успехом применен нами в последующей

работе при дифференциально-диагностических исследованиях в хозяйствах Архангельской области.

Обобщение способа поэтапного фракционирования клетки бруцелл

Исходя из полученных результатов работы, представленных в данном разделе, нами разработана практически безотходная технология поэтапного фракционирования клетки бруцелл с получением иммунологически активных субклеточных фракций разной функциональной направленности.

Технология включает на первом этапе выделение экзоцеллюлярного антигена, продуцируемого бруцеллами в процессе жизнедеятельности в культуральную среду особого состава. Данный низкомолекулярный антиген - ПА (М. м. < 10 кД) обладает высокой протективной активностью, что показано а экспериментах на лабораторны животных и крупном рогатом скоте. Он не стимулирует поствакцинальных серологических и аллергических реакций.

Следующий этап технологии обеспечивает выделение поверхностных компонентов клетки бруцелл (полисахарид-белкового комплекса). Данная субклеточная фракция показала высокую антигенную активность при конструировании диагностикумов, направленных на выявление противобру-целлезных антител в серологических реакциях (РПГА, ИФА).

Последующая обработка оставшегося после удаления поверхностных клеточных компонентов бактериального материала жесткими методами с применением анионного детергента позволила выделить белковую субклеточную фракцию, проявившую себя как высокоактивный специфический аллерген при постановке аллерготестов in vivo (внутрикожная проба на сенсибилизированных морских свинках) и in vitro (НРЛЛ).

Остаток переработанной бактериальной массы представлял собой, в основном, фракцию пептидогликана, который обладает, судя по данным литературы, иммуностимулирующими (адъювантными) свойствами. Данный препарат может быть использован в качестве стимулирующей иммунитет добавки при конструировании вакцин или иммуномодулирующих лечебных препаратов.

Таким образом, разработанная и апробированная технологическая схема ступенчатой разборки клетки бруцелл на субклеточные компоненты позволяет провести практически безотходную переработку бактериальной массы с получением антигенных препаратов. Такой подход обеспечивает значительную

экономию материальных затрат, в целом повысить эффективность производства бактериальных препаратов, необходимых ветеринарной практике.

На разработанный способ получения антигенов из клетки бруцелл получено авторское свидетельство №125625.

Разработка и применение научно-обоснованных систем противобруцеллезных мероприятий в хозяйствах Нечерноземной зоны России

В течение ряда лет нами проводились исследования по изучению эпизоотического состояния по бруцеллезу в Нечерноземной зоне России с более углубленным изучением неблагополучной до 1987 года по бруцеллезу КРС Рязанской области и благополучной Архангельской, но в которой имела место нарастающая тенденция выявления неспецифических положительных реакций на бруцеллез среди поголовья крупного рогатого скота.

Комплексный подход к диагностике бруцеллеза в неблагополучной зоне как метод эпизоотологического надзора

Изучение эпизоотологии бруцеллеза крупного рогатого скота в Нечерноземной зоне РФ. Изучена динамика опизоотического процесса в Нечерноземной зоне России со времени первой регистрации этого заболевания и до 1995 г. во временном и территориальном аспекте. Установлено, что несмотря на значительное снижение инцидентности бруцеллеза к 1995 г. по ряду областей устойчивого благополучия не было достигнуто. Составлена эпизоотическая карта Нечерноземной зоны по бруцеллезу крупного рогатого скота.

Эпизоотический бруцеллезный процесс в Рязанской области. Изучена динимика эпизоотического процесса при бруцеллезе в Рязанской области по экстенсивным и интенсивным показателям. Выявлены факторы,способствующие длительному сохранению очагов болезни и поддержанию эпизоотического процесса.

Изучение гостальности возбудителя бруцеллеза крупного рогатого скота. Известно, что преимущественным хозяином Br. abortus является крупный рогатый скот. Однако, бруцеллы могут паразитировать и в организме других животных, которые при этом становятся носителями этого возбудителя. В связи с этим мы провели исследования по определению роли других видов

животных в сохранении и распространении Br. abortus. Установлено, что за период с 1973 по 1984 г. г. положительные реакции на бруцеллез по области были зарегистрированы у 0,23% КРС, 0,4% лошадей, 0,03% овец и 0,35% свиней. Культуры бруцелл были выделены из патологического материала в 2,25% случаев (от числа исследованных) от КРС (Br. abortus), 3,77% - овец (не идентифицированы) и 1,6% - от свиней (Br. suis). В 1984-1985 г. г. нами было обследовано серологически на бруцеллез 85 лошадей, 65 овец, 20 свиней, 35 собак, 20 кошек и 130 мышевидных грызунов 8-ми видов из неблагополучных по бруцеллезу районов. В результате установлено, что противобруцеллезные антитела обнаруживались не только у КРС, но и у других видов животных, в том числе и мышевидных грызунов. Однако гостальность Br. abortus при этом не установлена, т. к. бактериологически этот вид бруцелл у других видов животных, кроме КРС, не был обнаружен.

Комплексный подход к серологической диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота.

Сравнительная оценка некоторых серологических реакций при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота. Нами было проведено исследование по сравнительной оценке результатов серологической диагностики бруцеллеза КРС с применением разных методов и в различной эпизоотологической обстановке. Исследования проводили в неблагополучных хозяйствах Касимовского района Рязанской области. Установлено, что в естественном эпизоотическом очаге бруцеллеза наиболее эффективной из числа традиционных серологических реакций является РСК (100% от числа реагирующих животных), а в условиях подавления эпизоотического процесса под действием вакцины из шт. 82 наибольшую разрешающую способность проявила РИГА (100% от числа реагирующих). Однако, максимальную диагностическую эффективность среди всех серологических реакций показала антиглобулиновая проба Кумбса (на основе РИГА), которая из 649 обследованных животных выявила 18,2% положительно реагирующих, в то время как с помощью РПГА обнаружено только 5,7% животных, содержащих в крови противобруцеллезные антитела. Сравнительная разрешающая способность использованных нами серологических реакций показала в итоге, что реакция Кумбса, выполняемая на основе РПГА, обеспечивает максимальную диагностическую эффективность, которая составила 67% от числа

положительных по одной или нескольким реакциям сывороток. Разрешающая -способность РБП, РА, РСК и РПГА при этом была равна 21,4%, 8,3%, 14,0% и 30,0%," соответственно.

- Изучение эффективности РБП с молоком при диагностике бруцеллеза крупного рогатого скота. Нами были проведены исследования по изучению частоты проявления роз-бенгал пробы с молоком (РБПМ) в хозяйствах неблагополучных по бруцеллезу КРС Рязанской и Ростовской 'областей. Установлено при этом, что частота проявления РБПМ колебалась от 0 до 0,43% от числа обследованных лактирующих коров (657 голов). Изучение эффективности РБПМ в сравнении с традиционными серологическими ■ реакциями (РА, РСК, КР) проведены также в 5-ти хозяйствах Рязанской области с различной эпизоотической обстановкой по бруцеллезу КРС. Определили, что диагностическая эффективность РБПМ согласуется с показателями других реакций: в 100% случаев совпадает с показаниями РА и КР, в 50% - с результатами РСК. При анализе молока коров из благополучных хозяйств (649 голов) ни в одном случае не получено положительных результатов РБПМ, в то же время КР в 0,77% случаев показала положительные результаты. Т. о. установлено, что РБП с молоком по чувствительности находится в предалах КР и РА, а по специфичности превышает кольцевую реакцию.

Изучение влияния гетерогенных вакцин на показатели серологической диагностики бруцеллеза у коров, иммунизированных против бруцеллеза. С целью изучения влияния гетерогенных вакцин на показатели диагностических исследований на бруцеллез в одном из хозяйств Рязанской области проведен эксперимент на поголовье взрослого КРС, общим количеством 102 головы. Опытные животные были иммунизированы вакциной из шт. 82, а через 9 месяцев после исчезновения поствакцинальных серологических реакций на бруцеллез, им вводили вакцины против инфекционных болезней: лептоспироза, эмкара, сибирской язвы и ящура соответственно по группам. Затем животных исследовали на бруцеллез серологически в течение 60-ти дней. Проведенные исследования показали, что у КРС, иммунизированного вакциной Br. abortus 82, в течение одного года сохраняются ретроспективные показатели вакцинного процесса, которые в конце этого периода уже не выявляются в диагностических титрах, но могут быть зарегистрированы после неспецифического влияния на иммунную систему, в частности - введения гетерогенных вакцин. При этом происходит

стимулирование антителогенеза, утрата проявлений которого (противобруцеллезные антитела) происходит через 30-60 дней после введения этих вакцин.

Вопросы дифференциальной диагностики бруцеллеза в благополучной зоне

Анализ эпизоотической ситуации по бруцеллезу в хозяйствах Архангельской области. Анализ эпизоотической ситуации в хозяйствах Архангельской области показал, что область длительное время являлась благополучной по бруцеллезу животных. Однако, начиная с 1983 г., в хозяйствах некоторых районов при проведении плановых серологических исследований крови КРС наблюдались случаи положительных и сомнительных результатов в реакциях с бруцеллезными антигенами, причем, если в 1985 г. они составляли 0,016% от числа обследованных, то в 1990 г. - 0,108%, т. е. увеличились в 6,75 раза. При более подробном эпизоотологическом изучении установлено, что наибольшее и наиболее постоянное выявление животных, реагирующих на бруцеллез, наблюдалось в хозяйствах Холмогорского района.

Дифференциальные диагностические исследования КРС Холмогорского района Архангельской области. Нами были исследованы 36 коров из ОПХ «Мати горе кое», реагирующих положительно в РА с бруцеллезным антигеном. При этом установлено, что у трех из этих коров в крови имелись антитела, выявляемые также РБП, а у трех других коров отмечена положительная КР с молоком. При обследовании этих животных с помощью аллерготестов специфическая сенсибилизация к бруцеллезному аллергену не обнаружена. Вместе с тем, в 10-ти случаях установлено присутствии антител к Yersinia enterocolitica 09. При бактериологическом исследовании ректальных мазков этих коров были выделены различные микроорганизмы, в том числе иерсинии кишечные. Кроме того, иерсинии были выделены при диагностическом убое одной из 7-ми коров, обнаруживших присутствие лротивоиерсиниозных антител в крови, а также из проб кормовых корнеплодов (турнепс). Таким образом установлено, что положительные реакции на бруцеллез у КРС обусловлены инфицированием иерсиниями, которые, как известно, имеют общие антигенные детерминанты с бруцеллами.

Изучение эпизоотической взаимосвязи инфицированности крупного рогатого скота и свободно живущих мелких млекопитающих. С

учетом степени значимости инфекционных болезней для животноводческих хозяйств области, взятых под наблюдение, изучали инфицированность сельскохозяйственных и диких животных возбудителями бруцеллеза, иерсиниоза, сальмонеллеза и туляремии с помощью серологических и бактериологических методов. Проведенными исследованиями наличие бруцеллезной, туляремийной и сапьмонеллезной инфекций не установлено. В то же время, из 46 обследованных коров у 29 обнаружено в крови присутствие антител к возбудителям иерсиниоза серовара 09 и у 28 животных - серовара 03. Из ректальных смывов двух коров и из содержимого кишечника одной убитой с диагностической целью коровы выделены культуры Yersinia enterocolitica. Из 247 мелких млекопитающих в РПГА с бруцеллезным диагностикумом реагировали 38 животных (15,4%), но бактериологически бруцеллы выделены не были. С кишечно-иерсиниозным диагностикумом 09 реагировало при этом 6 (2,41%), причем в сочетании с реакцией на бруцеллез. Среди другой группы мелких млекопитающих из 186 голов у 18 обнаружены антитела к Yersinia enterocolitica 03 (9,3%). Бактериологически культуры Yersinia enterocolitica выделены у одной полевой мыши и из образца кормовых корнеплодов. У 6 мелких млекопитающих обнаружены сальмонеллы сероваров В и D в мазках - отпечатках селезенки, а у 5 грызунов обнаружен возбудитель туляремии этим же методом.

Таким образом, в обследованном животноводческом комплексе установлена инфицированность КРС и мышевидных грызунов и насекомоядных, обитающих в стациях, прилегающих к территории животноводческого комплекса, возбудителями кишечного иерсиниоза сероваров 03 и 09 и, следовательно, имеется эпизоотическая взаимосвязь между инфицированностью иерсиниями свободно живущих мелких млекопитающих и КРС.

Эпизоотологический надзор в конкретных схемах противобруцеллезных

мероприятий для зон с различной степенью благополучия по

бруцеллезу

На основании результатов наших исследований по изучению бруцеллеза в Нечерноземной зоне РФ, а также с учетом комплекса профилактических и

оздоровительных мероприятий, предусмотренных действующей инструкцией, нами была разработана система ветеринарных противобруцеллезных мероприятий для хозяйств НЗ. При этом принимались во внимание конкретные условия и особенности ведения животноводства, эпизоотологическая ситуация в различных экономических районах зоны, специализация и концентрация молочного скотоводства в хозяйствах.

Разработка и внедрение системы противобруцеллезных мероприятий в хозяйствах Рязанской области. Для хозяйств Рязанской области система мероприятий была предложена в форме конкретных методических рекомендаций в 1985 г. В течение 2-х лет под авторским надзором проведена их апробация в хозяйствах Касимовскиго и Пителинского районов. Систама мероприятий включала: дифференцированный подход в оценке эпизоотической ситуации, своевременную диагностику болезни, определение степени распространения болезни в стадах, обнаружение скрытых форм болезни методом провокации, иммунизацию молодняка вакциной из шт. 82, соблюдение сроков исследований на бруцеллез после вакцинации гетерогенными вакцинами и др. Весь разработанный комплекс мер по оздоровлению хозяйств Рязанской области от бруцеллеза КРС отражен в конкретных схемах, предназначенных для различных эпизоотических ситуаций. Внедрение системы в хозяйствах Рязанской области, проводимое совместное ветслужбой привело к снижению напряженности эпизоотического бруцеллезного процесса и, в конечном итоге, к благополучию Рязанской области по бруцеллезу КРС с 1987 г. Экономическая эффективность от внедрения этой системы противобруцеллезных мероприятий в неблагополучных хозяйствах Касимовского района в 1986 г. составила 4,5 рубля на 1 рубль затрат.

Разработка и внедрение системы пртивобруцеллезных мероприятий в хозяйствах Нечерноземной зоны РФ. В 1987 г. система противобруцеллезных мероприятий была нами расширена для всей Нечерноземной зоны РФ с учетом опыта внедрения в хозяйствах Рязанской области. По результатам эпизоотологических исследований уточнена карта эпизоотического состояния НЗ с выделением подзон: благополучной, неустойчивого благополучия и повышенного риска по бруцеллезу. Для каждой подзоны были составлны конкретные схемы противобруцеллезных мероприятий. В настоящее время 19 регионов НЗ РФ (61,3%) более 10 лет

остаются благополучными, за этот период в них не были зарегистрированы эпизоотические очаги бруцеллеза. Подзону среднего риска по бруцеллезу в данный момент составляют 9 национальных и территориальных образований, в них отмечались лишь единичные эпизоотические очаги бруцеллеза КРС. Однако, зона повышенного риска несколько расширила свои территориальные границы за последние 10 лет: к Рязанской и Свердловской областям добавилась Нижегородская область.

Разработка системы дифференциальной диагностики бруцеллеза и иерсиниоза и мер по их профилактике. Результаты исследований, проведенных в хозяйствах Архангельской области показали, что довольно серьезной проблемой для благополучных по бруцеллезу зон является дифференциальная диагностика бруцеллеза от ряда инфекций, вызывающих перекрестные реакции с бруцеллезным антигеном. Особенно существенным оказалось влияние заболеваемости КРС кишечным иерсиниозом. В связи с этим, нами в 1991 г. разработана система дифференциально-диагностических Исследований на бруцеллез и иерсиниоз и мер по их профилактике, оформленная в виде рекомендаций. Предлагаемая система включает методики устранения неспецифических показаний серологических реакций, уточнения диагноза на бруцеллез, дифференциации серологических реакций, обусловленных носительством кишечных иерсиний и диагностики иерсиниоза у животных. Система дифференциальной диагностики бруцеллеза и иерсиниоза ¿пробирована в хозяйствах Архангельской области и Удмуртии. Это позволило исключить наличие бруцеллезной инфекции, что способствовало сохранению поголовья от неоправданного убоя, а также своевременному решению вопроса о продаже племенного скота. Общий экономический эффект от внедрения разработки составил на 1 января 1992 г. около 1 млн. рублей.

ВЫВОДЫ

1. На основе общебиологических представлений о роли постоянства белкового и липидного состава бактерий, как фенотипического проявления их генотипа, разработаны подходы к практическому применению характеристик данных субклеточных фракций в сравнительных исследованиях бактерий на различных уровнях таксономической иерархии.

1.1. Сравнительное изучение спектров растворимых белков микобактерий способствует уточнению классификационных схем данной группы бактерий.

1.2. На модели стафилококков установлено, что электрофоретические характеристики спектров мембранных белков имеют значение для видовой идентификации этих бактерий, а спектры внеклеточных белков (экзопродуктов) позволяют проводить внутривидовую дифференциацию и идентифицировать бактерии на уровне штамма.

1.3. На модели вида Salmonella typhimurium не выявлено существенного значения характеристик электрофореграмм различных белковых систем для внутривидовой дифференциации этих представителей группы грамотрицательных бактерий.

1.4. Анализ белковых систем бруцелл с применением различных модификаций электрофореза в полиакриламидном геле позволил установить как видовые особенности белковых спектров наружных мембран и фракций суммарных белков клетки, так и обнаружить штаммовую специфичность, особенно характерную для спектров внеклеточных белков.

1.5. Газо-хроматографический анализ жирных кислот бруцелл показал, что для рода Brucella в целом характерно преобладание в спектре длинноцепочечных жирных кислот, что отличает его от представителей других бактериальных родов. Все изученные культуры бруцелл обладают одинаковым качественным составом жирных кислот. Видовые особенности спектров ЖК носят количественный характер и позволяют четко дифференцировать виды Вг. abortus — Br. melitensis от Br. ovis и Br. suis.

1.6. Комплекс диагностических приемов, включающий газо-хроматографический анализ жирных кислот и электрофоретический анализ белковых систем бруцелл, является существенным дополнением к системе традиционных методов бактериологической диагностики бруцеллеза и

позволяет уточнять идентификацию свежевыделенных культур в очагах бруцеллеза на всех таксономических уровнях: род — вид — штамм.

2. Принцип подхода к поиску протективного антигена бруцелл путем анализа механизмов патогенеза и выявления материальной основы ключевых факторов патогенности позволил разработать технологию получения искомого протективного антигена, являющегося экзопродуктом синтеза клетки бруцелл. Технология включает несколько основных этапов:

2.1. Культивирование бруцелл в условиях, принципиально моделирующих условия внутрифагоцитарного персистирования бруцелл;

2.2. Выделение фракции, содержащей протективный антиген, из среды накопления;

2.3. Очистка фракции протективного антигена.

г-• 2.4. Биохимическая и иммунологическая характеристика протективного антигена, который представляет собой комплекс низкомолекулярных компонентов (М. м. < 10 ООО Д) гликопротеидной природы.

-3: На основе химической конъюгации протективного антигена бруцелл и полимерного носителя (градекса) сконструирована бруцеллезная искусственная вакцина (БИВ), не уступающая по протективным свойствам коммерческим вакцинам и обладающая существенным преимуществом в форме отсутствия способности индуцировать синтез специфических антител и специфической сенсибилизации

4. Принцип подхода к фракционированию клетки брцелл с позиций знания ее химической и антигенной структуры и участия определенных антигенных комплексов в процессах иммуно- и патогенеза позволил определить биологические основы разработки безотходной технологии разборки клетки на биологически активные субклеточные фракции, реализованные в изготовлении диагностических препаратов.

4.1. Получены препараты фракции клеточных стенок бруцелл, на основе которых сконструированы эритроцитарные диагностикумы для реакции пассивной гемагглютинации.

4.2. Получены препараты поверхностных антигенов клетки бруцелл (липополисахарид-белковые), на основе которых сконструированы тест-системы для иммуноферментного анализа.

4.3. Получены препараты фракции глубинных белков клетки бруцелл со свойствами аллергенов при применении их в аллерготестах: внутрикожной пробе и непрямой реакции лизиса лейкоцитов.

5. В целях совершенствования средств и способов эпизоотологического надзора при бруцеллезе разработаны и испытаны новые методы и подходы в этом направлении.

5.1. Разработан ускоренный способ (экспресс-РПГА, Э-РПГА) обнаружения противобруцеллезных антител в биологических жидкостях (сыворотка крови, молоко), обладающий высокой разрешающей способностью и более специфичный, чем другие экспресс-методы (РБП, РБПМ, КР).

5.2. Разработана тест-система для иммуноферментного анализа, обеспечивающая его наибольшую чувствительность среди других испытанных методов серологической диагностики (РБП, РА, РСК, РПГА).

5.3. Непрямая реакция лизиса лейкоцитов в модифицированном варианте является эффективным аллерготестом in vitro и включение его в общий комплекс диагностических исследований на бруцеллез целесообразно и весьма перспективно.

5.4. Для прижизненной дифференциальной диагностики бруцеллезной и иерсиниозной инфекции крупного рогатого скота целесообразно использовать в общем комплексе диагностических приемов Э-РПГА с молоком, коюрая не дает положительных результатов при иерсиниозе, и непрямую реакцию лизиса лейкоцитов (НРЛ/1) с бруцеллезным белковым аллергеном, которая также положительна только в случае бруцеллеза.

6. В неблагополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах в бруцеллезный эпизоотический процесс могут вовлекаться и другие виды животных, в том числе и синантропные, но доля их участия в развитии эпизоотии невелика.

7. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах у крупного рогатого скота могут появляться положительные реакции на бруцеллез при серологических исследованиях, обусловленные наличием иерсиниозной инфекции. При этом установлено также присутствие иерсиний в кормах (овощных), где они способны накапливаться, а также в организме мелких свободно живущих

млекопитающих, обитающих на пограничных с животноводческими территориях.

8. У крупного рогатого скота неблагополучных по бруцеллезу хозяйств, в которых проводится как средство эпизоотологического контроля специфическая профилактика с применением живых вакцин (Br. abortus 82), могут появляться положительные реакции на бруцеллез под воздействием введенных гетерогенных по отношению к бруцеллезу вакцин, неспецифически стимулирующих подъем противобруцеллезного поствакцинального антигелогенеэа.

9. Разработанная и внедренная в хозяйствах Нечерноземной зоны России - научно-обоснованная система противобруцеллезных мероприятий, основанная

на комплексе общих и специальных мероприятий по эпизоотологическому Надзору (комплексной эпизоотологической диагностике, дифференцированной оценке степени риска для отдельных подзон и прогнозировании развития бруцелезного эпизоотического процесса) и эпизоотологическому контролю (соответствующей ситуации системе профилактических мер, в том числе и специфической профилактики с применением различных вакцин), является высокоэффективной и позволяет поддерживать стойкое благополучие по этой инфекции на всей территории Нечерноземной зоны РФ

Рекомендации по производству

1.» Рекомендации по профилактике и ликвидации бруцеллеза крупного рогатого скота в хозяйствах Рязанской области» , одобренные НТС Агропрома Рязанского облисполкома (1985);

2.«Методика проверки иммуногенности бруцеллезной искусственной вакцины на крупном рогатом скоте», утвержденная ГУВ Госагропрома СССР (1988);

3.«Методика производственного испытания экспресс-РПГА при диагностике бруцеллеза», утвержденная ГУВ Госагропрома СССР (1989);

4.«Методика дифференциальной диагностики бруцеллеза и иерсиниоза», утвержденная ГУВ Госагропрома СССР (1989);

5.«Научно-обоснованная система противобруцеллезных мероприятий в Нечерноземной зоне РСФСР», одобренная НТС Минсельхозпрода России(1987, 1991);

6. «Дифференциальная диагностика бруцеллеза и иерсиниоза и меры по их профилактике» - рекомендации, одобренные НТС Госагропрома РФ (1991);

7.«Оог1нмзпччя вет^пчнарного дела в условиях экономической реформы Российской Федерации» - рекомендации, одобренные НТС Минсельхозпрода (1997);

8.«Нетрздиционные методы исследования при дифференциальной диагностике бруцеллеза животных» - рекомендации, одобренные Минсельхозпродом России (1997).

СПИСОК

опубликованных работ, отражающих основное содержание диссертации

1. Дегтева Г. К., Голубева С. А. .Григорьева Г.И. Сопоставление белковых спектров типичных и атипичных микобактерий методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле //ЖМЭИ. - 1975. - N23. - С. 23-26.

2. Григорьева Г.И., Дегтева Г. К. Характеристика белков Salmonella typhimurlum разного происхождения // Сальмонеллезы. - Горький, 1981. - С. 67-70.

3. Дегтева Г. К., Носова Т. В., Кондратьева С.И., Григорьева Г.И. Способ идентификации стафилококков // Art. св. №1013476. СССР. Опубл. 21.12.82.

4. Богословский С. Н., Григорьева- Г.И. Применение многомерного статистического анализа для сравнительного изучения белковых спектров бактерий // Биохим. и биофиз. микроорг. - Горький, 1982. - С. 116-119.

5. Дегтева Г. К., Беляева Е. В., Григорьева Г.И. и др. Применение методов хроматографии и электрофореза для изучения белковых систем клетки бактерий // Тез. I Всес. конф. «Хроматогр. в биол. и медиц.».- М.,1983.-С.50-51.

6. Дегтева Г. К., Носова Т. В., Григорьева. Г.И. Сопоставление спектров внеклеточных белков в дифференциации культур стафилококков // ЖМЭИ. -1983. - №7. - С. 43-47.

7. Дегтева Г. К., Григорьева Г.И., Акатов А. К. Сопоставление спектров мембранных белков в дифференциации коагулазоотрицательных стафилококков // ЖМЭИ. - 1984. - №2. - С. 40-42.

8. Демина Т. А., Сочнев В. В., Григорьева Г.И. и др. Изучение гостальности возбудителя бруцеллеза крупного рогатого скота // Тез. докл. науч.-практ. конфер. «Профил. и лечен, заболев, с.-хоз. животных в НЗ РСФСР». -Горький, 1985. - С. 13-14.

9. Сочнев В. В., Демина Т. А., Григорьева Г.И. и др. Серологические показатели у иммунизированных против бруцеллеза коров после введения гетерогенных вакцин // Там же. - С. 15-17.

10. Сочнев В.В., Григорьева Г.И., Петешев В.М. Определение противо -бруцеллезных антител в высушенных образцах крови с применением РПГА // Инф. листок. - Нижний Новгород: ЦНТИ. - 1986. - Сер. 64. - №47-86.

11. Сочнев В. В., Демина Т. А., Григорьева Г.И. и др. Протиообруцеллезные мероприятия // Тез. докл. н.-пр. конф. «Интенсификация животноводства и кормопроизводства в НЗ РСФСР». - Йошкар-Ола, 1986. - С. 133.

12. Сочнев В. В., Григорьева Г.И., Тихомирова Е. А., Игнатов П.Е. Способ определения противобруцеллезных антител в биологических жидкостях // Авт. св. №1387661. СССР. - Опубл. 08.12.87.

13. Григорьева Г.И. Игнатов П. Е. Факторы патогенности как протективные антигены при конструировании вакцин // С.-хоз. биология. - 1987. - №12. -С. 100-10*.

14. Григорьева Г.И. Игнатов П. Е. Инактивированные вакцины в профилактике бруцеллеза животных // Профилактика и леч. инфекц. и инваз. заболев, с.-хоз. животных в Нечерноземье». - Горький, 1988. - С. 16-21.

15. Сочнев В. В., Григорьева Г.И. Получение эритроцитарного бруцеллезного диагностикума на основе RS-антигенов бруцелл // Там же. - С. 11-13.

- 16. Петров Р. В., Хаитов Р. М ., Игнатов П.Е., Григорьева Г.И. и др. Изучение иммуногенной активности искусственных бруцеллезных антигенов // ЖМЭИ. - 1988. - №7. - С. 39-42.

17. Петров Р. В., Хаитов Р. М ., Игнатов П.Е., Григорьева Г.И. и др Способ получения вакцины против бруцеллеза // Авт. св. №1518961. - СССР. -Опубл. 01.07.89.

18. Григорьева Г.И., Сочнев В.В., Игнатов П. Е. и др. Оптимизация биотехнологии получения антигенов бруцелл // Тез. докл. I Всесоюзн. иммунол. съезда, Сочи, 15-17 ноября 1989 г. - М., 1989. - Т. 1. - С. 147.

19. Григорьева Г.И., Сочнев В. В., Капкан(цикова Ю. М. и др. Непрямая реакция лизиса лейкоцитов как аллерготест при бруцеллезе // Бактер. и вирусн. болезни с.-хоз. животных и птиц в хоз-вах Сев. Кавказа. - Новочеркасск,

1989. - С. 53-59.

20. Рачкова О. Ф., Григорьева Г.И., Лазовская А. Л. И др. Экспресс-идентификация бруцелл методом газо-жидкостной хроматографии жирных кислот /Дез. докл. Всес. конф. «Акт. вопр. профил. бруцел. и организац.мед. помощи больным», Новосибирск, 24-25 окт. 1989. - М., 1989. - С. 129-130.

21.'-Григорьева Г.И., Игнатов П. Е., Федоров А. И. и др. Способ получения антигенов из бактерий рода Brucella // Авт. св. №1631786. СССР. - Опубл. 01.11.90.

22. Григорьева Г.И., Улицкая А. А. Применение имммуноферментного анализа для определения противобруцеллезных антител в сыворотке крови крупного рогатого скота // Вестник сельхоз. науки. - 1990. - №2. - С. 86-91.

23. Рачкова О. Ф., Григорьева Г.И., Сочнев В. В. и др. Применение метода газо-жидкостной хроматографии для ускоренной идентификации бруцелл // Тез. докл. Всесоюз. конф. «Теория и практика хроматографии», 2-7 окт.

1990. - Горький, 1990. - С. 77-78.

24. Сочнев В. В., Тебекин А. Б., Григорьева Г.И. и др. Дифференциальная диагностика бруцеллеза и иерсиниоза крупного рогатого скота // Тез. докл. совещ. «О перпект. развит, животноводства и ветеринарии в ХШ пятилетке», Ленинград-Пушкин, 23-24 окт.1990. - Ленинград, 1990. -^7-8.

25. Григорьева Г.И., Игнатов П. Е. Антигенная структура бруцелл // Успехи соврем, биологии. - 1991. - Т. 111. - Вып. 6. - С. 890-904.

26. Григорьева Г.И., Горчакова Н. Г. Фракционирование клеток бруцелл // Тез. докл. науч.-пр. конфер. «Профил. и лечен, заболев, сельхоз. животных в НЗ РФ». - Н. Новгород, 1992. - С.14.

27. Григорьева Г.И., Горчакова Н. Г..Сочнев В.В. и др. Бактериологическая экспресс-диагностика как фактор экологического благополучия при зоонозных инфекциях // Ветеринарн. и биологич. наука сельскохоз. произ-ву: по матер. Всерос. н.-np. коифер., Н. Новгород, 24-25 июля1995, Волгоград, 2-3 июля 1996. - Н. Новгород, 1997. - С. 277-280.

Бруцеллез как зоонозное заболевание по-прежнему является "мировой" проблемой, несмотря на значительные успехи, достигнутые в различных научных и практических сферах, касающихся этого явления. Много ценных работ было сделано отечественными и зарубежными учеными по изучению эпидемиологии, эпизоотологии, профилактики и диагностики бруцеллезной инфекции. К настоящему времени накоплен значительный научно-практический материал по всестороннему изучению бруцеллеза, на основании которого систематически проводятся широкие плановые мероприятия по борьбе с этой инфекцией человека и животных. Практические работники располагают довольно обширным комплексом научно-обоснованных данных о бруцеллезе, его эпизоото-логических, микробиологических, иммунологических особенностях, с учетом которых разрабатываются системы противобруцеллезных мероприятий, реализация которых направлена на ликвидацию этого заболевания. Однако эта задача по-прежнему представляет достаточно серьезную проблему для решения.

Большинство исследователей считают, что результаты оздоровительных мероприятий во многом определяются качеством эпизоотологического надзора за развитием бруцеллезного процесса в конкретных природно-географических й хозяйственно-экономических условиях (3, 170, 237). Немаловажное значение для достижения эффективности противобруцеллезных мер имеет знание особенностей паразитарной системы бруцеллеза на всех уровнях ее существования: популяционном, организменном, клеточном, молекулярном. Не теряют своей актуальности вопросы эпизоотологического контроля в его специфической части: разработки и применения "идеальной" бруцеллезной вакцины, способной обеспечивать высокий уровень защиты от бруцеллезной инфекции и в то же время не препятствовать диагностике этой болезни. Много нерешенных моментов в вопросах диагностики бруцеллеза. Назрела необходимость создания принципиально нового комплекса серо-аллергических методов с включением небольшого числа простых высокочувствительных и специфичных реакций, обеспечивающих выявление манифестаций всех звеньев иммуногенеза при бруцеллезе как гуморального, так и клеточного, очевидно, что требуется совершенствование бактериологической диагностики бруцеллеза с применением новейших достижений биохимии и молекулярной биологии, обеспечивающих экспресс-идентификацию и дифференциацию бактерий, выделяемых в очагах бруцеллеза, на всех таксономических уровнях: род, вид, штамм.

Все вышеизложенное и определило выбор темы и направление наших исследований. •

Цель работы — определить биологические основы получения и практического применения субклеточных фракций бактерий на модели бруцелл, и реализовать разработки в конкретных предложениях, направленных на совершенствование диагностики и профилактики бруцеллеза, способствующих ликвидации этой болезни .

В задачи наших исследований входило:

1. На основании современных достижений микробиологии, молекулярно-ной биологии и биохимии изучить возможность применения новых подходов к бактериологической диагностике бруцеллеза с использованием характеристик субклеточных систем: белковых и липидных.

2. Определить биологические основы разборки клетки бруцелл на субклеточные фракции, несущие определенные антигенные функции и пригодные для конструирования на их основе профилактических и диагностических препаратов.

3. Разработать технологию получения препарата протективного антигена бруцелл, использумого в качестве основы для создания принципиально новой

• искусственной вакцины, обладающей свойствами, приближенными к свойствам "идеальной" бруцеллезной вакцины.

4. Изучить особенности эпизоотического бруцеллезного процесса у крупного рогатого скота в условиях Нечерноземной зоны России, разработать на основе полученных данных научно-обоснованную систему противобруцеллезных мероприятий и внедрить в животноводческие хозяйства Нечерноземной зоны РФ.

Научная новизна

В настоящей работе впервые на модели таксономически отличных групп бактерий (микобактерии, стафилококки, сальмонеллы) изучена значимость электрофоретических характеристик различных белковых систем клеток (экзопродукты, растворимые, суммарные клеточные и мембранные белки) для решения вопросов идентификации и дифференциации бактерий на различных таксономических уровнях: род, вид, штамм (А. с. №1013476). На основании полученных данных впервые разработаны подходы к бактериологической диагностике бруцеллеза с позиций критериев, характеризующих спектры белковых фракций.

Впервые изучен состав жирных кислот пяти видов бруцелл методом со-пиролиза и газо-хроматографического анализа, что позволило определить родовые и видовые особенности бактерий по этому признаку. Комплекс нетрадиционных для бактериологии бруцеллеза методов, характеризующих состав жирных кислот и электрофоретические параметры белковых систем предложен в качестве дополнения к системе традиционных диагностических методов, что позволяет проводить экспресс-идентификацию бактерий в очагах бруцеллеза и дифференцировать вакцинные штаммы от эпизоотически значимых.

Впервые разработана безотходная технология фракционирования бактериальной массы бруцелл на базе представлений о биологических основах строения клетки и механизмах участия антигенных комплексов в процессах па-то- и иммуногенеза (A.c. №1631786). Использованный принцип разборки клетки на субклеточные фракции с сохранением специфических свойств позволил получить антигенные препараты, пригодные для конструирования на их основе серологически и аллергически активных препаратов, хорошо зарекомендовавших себя при испытании в экспериментальных и производственных условиях.

Впервые разработана оригинальная технология получения протективного антигена бруцелл, биологической основой принципа получения которого является представление о его ключевых патогенных функциях и экзоцеллюлярном происхождении. Конъюгация даного антигена с полимерным носителем позволила сконструировать бруцеллезную искусственную вакцину (БИВ), которая обеспечивает достаточно высокую степень защиты от бруцеллезной инфекции и не обладает способностью индуцировать антителогенез и специфическую сенсибилизацию, препятствующих диагностике бруцеллеза (A.c. №1518961).

Впервые разработан ускоренный способ серологической диагностики бруцелеза (Э-РПГА), превышающий по чувствительности и специфичности другие ускоренные методы, и пригодный для дифференциальной диагностики бруцеллеза и иерсиниоза у лактирующих коров (A.c. №32387661).

Разработана научно-обоснованная система эпизоотологического надзора и контроля при бруцеллезе крупного рогатого скота для Нечерноземной зоны

России в соответствии с эпизоотической обстановкой и степенью риска болезни. Апробация и внедрение системы позволило улучшить эпизоотическую ситуацию по бруцеллезу в целом по Нечерноземной зоне РФ.

Практическая иенность

Биологические основы практического применения субклеточных фракций бруцелл, использованные нами в данной работе, позволили получить и апробировать приближенный до некоторой степени к "идеальному" вариант комплекса профилактических и диагностических приемов и средств, обеспечивающий практически в полом объеме специфическую часть эпизоотологического контроля и надзора при бруцеллезе. Это — специфическая профилактика с применением БИВ, не препятствующая серологической, аллергической и бактериологической диагностике бруцеллеза, плюс истинный диагностический комплекс, состоящий из эффективной экспресс-реакции для массовых скрининговых исследований по сыворотке кров и молоку (Э-РПГА), высокочувствительного им-муноферментного анализа (ИФА), как метода выявления манифестаций гуморального звена иммунитета, и непрямой реакции лизиса лейкоцитов (НРЛЛ), как метода регистрации показателей клеточного звена иммунитета, а также эффективного дополнения к комплексу традиционных бактериологических методов в форме газохроматографического анализа жирных кислот и электрофо-ретического анализа белковых систем (экзопродукты, суммарные белки клетки), позволяющих проводить идентификацию выделяемых культур на уровне рода, вида и штамма. Внедрение и строгое соблюдение рекомендаций, предложенных производству в научно-обоснованной системе противобруцеллезных мероприятий для Нечерноземной зоны России, позволяет поддерживать в целом по зоне уровень стабильного благополучия по этой инфекции.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Биологической основой разборки клетки бруцелл на субклеточные фракции, состоящие из отдельных антигенных комплексов, пргодных для конструирования вакцинных и диагностических препаратов, являются конкретные научные знания об их структуре и участии в процессах пато- и иммуногенеза.

• Комплексная характеристика газо-хроматографических спектров жирных кислот и электрофореграмм белковых систем является существенным признаком в идентификации и дифференциации бруцелл на разных уровнях таксономической иерархии.

• Научно-обоснованная система противобруцеллезных мероприятий, разработанная для хозяйств Нечерноземной зоны России, позволяет поддерживать в ней стойкое благополучие по бруцеллезу крупного рогатого скота.

Пути реализации Результаты исследования могут быть использованы в работе практических и научно-исследовательских лабораторий, осуществляющих бактериологическую и серологическую диагностику бруцеллеза; в производстве бруцеллезных профилактических и диагностических препаратов; в работе эпидемиологических и эпизоотологических служб при разработке противобруцеллезных мероприятий, а также в учебном процессе при подготовке специалистов- микробиологов общебиологического, медицинского и ветеринарного профиля.

Апробация работы Материалы диссертации доложены на итоговых научных конференциях Нижегородского государственного университета имени Н. И. Лобачевского (Нижний Новгород, 1977, 1979, 1980 г. г.); конференциях молодых ученых Нижегородского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии (Нижний Новгород, 1975, 1978, 1981 г. г.); симпозиуме молодых ученых "Медико-биологические аспекты патологии человека" (Нижний Новгород, 1979); Московском отделении Всесоюзного биохимического общества (Москва, 1979); межлабораторном совете Института биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР (г. Пущино-на-Оке, 1980); заседании ученого совета НИИИЭМ (1980); IV Всесоюзном биохимическом съезде (Санкт-Петербург, 1979); I Всесоюзной конференции "Хроматография в биологии и медицине" (Москва, 1983); научно-практических конференциях по актуальным вопросам ветеринарии (Нижний Новгород, 1984, 1985, 1988, 1992 г. г.); Всероссийском совещании "Интенсификация животноводства и кормопроизводства в Нечерноземной зоне РСФСР (г. Йошкар-Ола, 1986); Всесоюзной научно-технической конференции "Совершенствование ветеринарного обслуживания животноводства в условиях интенсификации" (г. Махачкала, 1987); Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным" (г. Новосибирск, 1989); I Всесоюзном иммунологическом съезде (г. Сочи, 1989); Всесоюзной конференции "Теория и практика хроматографии" (г.Нижний Новгород, 1990); Всесоюзном совещании "О перспективах развития животноводства и ветеринарии в XIII пятилетке" (Ленинград-Пушкин, 1990); координационных совещаниях по проблеме бруцеллеза и туберкулеза (г. Москва, ВИЭВ, 1985; г. Омск — ВНИИБТЖ, 1986, 1987, 1991 г.г.); заседани-ях ученого совета НИВИ ИЗ РСФСР (г. Нижний Новгород, 1984—1991 г.г.); заседании профессорско-преподавательского состава кафедры эпизоотологии и микробиологии Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии (г. Нижний Новгород, 1997).

Материалы диссертации опубликованы в 72 научных статьях, отчетах, ре-комендациях, приоритетность результатов исследований подтверждена 4 авторскими свидетельствами на изобретение.

ВНЕДРЕНИЕ

Результаты исследований внедрены в работу лаборатории субклеточных структур микроорганизмов Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии, городской СЭС Нижнего Новгорода, в учебный процесс кафедры молекулярной биологии Нижегородского государственного университета имени Н. И. Лобачевского. Результаты исследований 1983—1997 г. г. под авторским надзором внедрены с положительным эффектом в хозяйствах Рязанской и Архангельской областей, в практику НИР лабораторий бруцеллеза НИВИ НЗ РСФСР,

• в учебный процесс кафедры эпизоотологии и микробиологии Нижегородской сельскохозяйственной академии.

Подготовлены и утверждены методические рекомендации "Методы выделения субклеточных структур микроорганизмов. Электрофоретическое фракционирование из белковой части" (1980); Физико-химические методы анализа макромолекул в биологических исследованиях " (1979); "Рекомендации по профилактике и ликвидации бруцеллеза крупного рогатого скота в хозяйства Рязанской области" (1985); "Научно-обоснованная система противобруцеллезных мероприятий в Нечерноземной зоне РСФСР" (1987, 1991 г. г.); "Дифференциальная диагностика бруцеллеза и иерсиниоза и меры по их профилактике" (1991); "Нетрадиционные методы исследования при дифференциальной диагностике бруцеллеза животных" (1997); "Организации ветеринарного дела в условиях экономической реформы Российской Федерации" (1997).

Обзор литературы

408 ВЫВОДЫ

1. На основе общебиологических представлений о роли постоянства белкового и липидного состава бактерий, как фенотипического проявления их генотипа, разработаны подходы к практическому применению характеристик данных субклеточных фракций в сравнительных исследованиях бактерий на различных уровнях таксономической иерархии.

1.1. Сравнительное изучение спектров растворимых белков микобактерий способствует уточнению классификационных схем данной группы бактерий.

1.2. На модели стафилококков установлено, что электрофоретические характеристики спектров мембранных белков имеют значение для видовой идентификации этих бактерий, а спектры внеклеточных белков (экзопродуктов) позволяют проводить внутривидовую дифференциацию и идентифицировать бактерии на уровне штамма.

1.3. На модели вида Salmonella typhimurium не выявлено существенного значения характеристик электрофореграмм различных белковых систем для внутривидовой дифференциации этих представителей группы грамотрицатель-ных бактерий.

1.4. Анализ белковых систем бруцелл с применением различных модификаций электрофореза в полиакриламидном геле позволил установить, как видовые особенности белковых спектров наружных мембран и фракций суммарных белков клетки, так и обнаружить штаммовую специфичность, особенно характерную для спектров внеклеточных белков.

1.5. Газо-хроматографический анализ жирных кислот бруцелл показал, что для роза Brucella в целом характерно преобладание в спектре длинноцепо-чечных жирных кислот, что отличает его от представителей других бактериальных родов. Все изученные культуры бруцелл обладают одинаковым качественным составом жирных кислот. Видовые особенности спектров ЖК носят количественный характер и позволяют четко дифференцировать виды Br. abortus — Br. melitensis от Br. ovis и Br. suis.

1.6. Комплекс диагностических приемов, включающий газо-хроматографический анализ жирных кислот и электрофоретический анализ белковых систем бруцелл, является существенным дополнением к системе традиционных методов бактериологической диагностики бруцеллеза и позволяет уточнять идентификацию свежевыделенных культур в очагах бруцеллеза на всех таксономических уровнях: род — вид — штамм.

2. Принцип подхода к поиску протективного антигена бруцелл путем анализа механизмов патогенеза и выявления материальной основы ключевых факторов патогенности позволил разработать технологию получения искомого протективного антигена, являющегося экзопродуктом синтеза клетки бруцелл. Технология включает несколько основных этапов:

2.1. культивирование бруцелл в условиях принципиально моделирующих условия внутрифагоцитарного персистирования бруцелл;

2.2. выделение фракции, содержащей протективный антиген, из среды накопления;

2.3. очистка фракции протективного антигена.

2.4. биохимическая и иммунологическая характеристика протективного антигена, который представляет собой комплекс низкомолекулярных компонентов (М. м. < 10 ООО Д) гликопротеидной природы.

3. На основе химической конъюгации протективного антигена бруцелл и полимерного носителя (градекса) сконструирована бруцеллезная искусственная вакцина (БИВ), не уступающая по протективным свойствам коммерческим вакцинам и обладающая существенным преимуществом в форме отсутствия способности индуцировать синтез специфических антител и специфической сенсибилизации.

4. Принцип подхода к фракционированию клетки брцелл с позиций знания ее химической и антигенной структуры и участия определенных антигенных комплексов в процессах иммуно- и патогенеза позволил определить биологические основы разработки безотходной технологии разборки клетки на биологически активные субклеточные фракции, реализованные в изготовлении диагностических препаратов.

4.1. Получены препараты фракции клеточных стенок бруцелл, на основе которых сконструированы эритроцитарные диагностикумы для реакции пассивной гемагглютинации.

4.2. Получены препараты поверхностных антигенов клетки бруцелл (липополисахарид-белковые), на основе которых сконструированы тест-системы для иммуноферментного анализа.

4.3. Получены препараты фракции глубинных белков клетки бруцелл со свойствами аллергенов при применении их в аллерготестах: внутрикожной пробе и непрямой реакции лизиса лейкоцитов.

5. В целях совершенствования средств и способов эпизоотологического надзора при бруцеллезе разработаны и испытаны новые методы и подходы в этом направлении.

5.1. Разработан ускоренный способ (экспресс-РПГА, Э-РПГА) обнаружения противобруцеллезных антител в биологических жидкостях (сыворотка крови, молоко), обладающий высокой разрешающей способностью и более специфичный, чем другие экспресс-методы (РБП, РБПМ, КР).

5.2. Разработана тест-система для иммуноферментного анализа , обеспечивающая его наибольшую чувствительность среди других испытанных методов серологической диагностики (РБП, РА, РСК, РПГА).

5.3. Непрямая реакция лизиса лейкоцитов в модифицированном варианте является эффективным аллерготестом in vitro и включение его в общий комплекс диагностических исследований на бруцеллез целесообразно и весьма перспективно.

5.4. Для прижизненной дифференциальной диагностики бруцеллезной и иерсиниозной инфекции крупного рогатого скота целесообразно использовать в общем комплексе диагностических приемов Э-РПГА с молоком, которая не дает положительных результатов при иерсиниозе, и непрямую реакцию лизиса лейкоцитов (НРЛЛ) с бруцеллезным белковым аллергеном, которая также положительна только в случае бруцеллеза.

6. В неблагополучных по бруцеллезу крупного рогатого скота хозяйствах в бруцеллезный эпизоотический процесс могут вовлекаться и другие виды животных, в том числе и синантропные, но доля их участия в развитии эпизоотии невелика.

7. В благополучных по бруцеллезу хозяйствах у крупного рогатого скота могут появляться положительные реакции на бруцеллез при серологических исследованиях, обусловленные наличием иерсиниозной инфекции. При этом установлено также присутствие иерсиний в кормах (овощных), где они способны накапливаться, а также в организме мелких свободно живущих млекопитающих, обитающих на пограничных с животноводческими территориях.

8. У крупного огатого скота неблагополучных по бруцеллезу хозяйств, в которых проводится как средство эпизоотологического контроля специфическая профилактика с применением живых вакцин (Br. abortus 82), могут появляться положительные реакции на бруцеллез под воздйствием введенных гетерогенных по отношению к бруцеллезу вакцин, неспецифически стимулирующих подъем противобруцеллезного поствакцинального антителогенеза.

9. Разработанная и внедренная в хозяйствах Нечерноземной зоны России научно-обоснованная система противобруцеллезных мероприятий, основанная на комплексе общих и специальных мероприятий по эпизоотологическому надзору (комплексный эпизоотологической диагностике, дифференцированной оценке степени риска для отдельных подзон и прогнозировании развития бру-целезного эпизоотического процесса) и эпизоотологическому контролю (соответствующей ситуации системе профилактических мер, в том числе и специфической профилактики с применением различных вакцин), является высокоэффективной и позволяет поддерживать стойкое благополучие по этой инфекции на всей территории Нечерноземной зоны РФ.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1.Методы выделения субклеточных структур микроорганизмов. Электро-форетическое фракционирование из белковой части. (Методические рекомендации, утвержденные МЗ РСФСР, Горький, 1980, 24 е.).

2. Физико-химические методы анализа макромолекул в биологических исследованиях (Учебное пособие, Горький, изд. ГГУ имени Н. И. Лобачевского, 1979. 23 е.).

3. Способ идентификации стафилококков (А. с. №1013476, СССР, опубликовано 21.12.1982).

4. Рекомендации по профилактике и ликвидации бруцеллеза крупного рогатого скота в хозяйствах Рязанской области (утверждено НТС Агропрома Рязанского облисполкома, Горький, 1985, 37 е.).

5. Определение противобруцеллезных антител в высушенных образцах крови с применением РИГА (Методика, ЦНТИ, 1986, сер. 64, информационный листок № 47—86).

6. Способ определения противобруцеллезных антител в биологических жидкостях (А. с. № 4102882, СССР, опубликовано 08.12.1987).

7. Научно-обоснованная система противобруцеллезных мероприятий в Нечерноземной зоне РСФСР (Рекомендации, утвержденные Президиумом ВАСХНИЛ НЗ РСФСР, Горький, 1987).

8. Методика проверки бруцеллезной искусственной вакцины на морских свинках (утверждена ГУВ Госагропрома СССР № 433-3 от 23.04. 1988).

9. Методика проверки иммуногенности бруцеллезной искусственной вакцины на крупном рогатом скоте (утверждена ГУВ Госагропрома СССР № 438-3 от 28.04.1988).

10. Методика производственного испытания экспресс-РПГА при диагностике бруцеллеза (утверждена ГУВ Госагропрома СССР от 14.03.1989).

11. Методика дифференциальной диагностики бруцеллеза и иерсиниоза (утверждена ГУВ Госагропрома СССР от 14.03.1989).

12. Способ получения вакцины против бруцеллеза (А. с. № 1518961, СССР, опубликовано 01.07.1989).

13. Способ получения антигенов из бактерий рода Brucella (А. с. № 1631786, СССР, опубликовано 01.11.1990).

14. Научно-обоснованная система противобруцеллезных мероприятий в Нечерноземной зоне РСФСР (Рекомендации, Москва, 1991, 27 е.).

15. Дифференциальная диагностика бруцеллеза и персиниоза и меры по их профилактике (Рекомендации, утверждены НТС Госагропрома ИЗ РСФСР, Москова, Росагропромиздат, 1991, 32 с).

16. Нетрадиционные методы исследования при дифференциальной диагностике бруцеллеза животных (Учебно-методическое пособие, Нижний Новгород, 1997).

17. Организация ветеринарного дела в условиях экономической реформы Российской Федерации (Нижний Новгород, 1997, 126 е.).