Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Молекулярно-генетическая идентификация хламидий, выделенных от животных
- Ученая степень
- кандидата ветеринарных наук
- ВАК РФ
- 16.00.03
Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Молекулярно-генетическая идентификация хламидий, выделенных от животных
На правах рукописи
БАКИРОВ ИЛЬЯС ХАСАНОВИЧ
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ ХЛАМИДИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ЖИВОТНЫХ
16 00 03 - ветеринарная микробиология, вирусология,
эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 03 00.07 - микробиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук
ООЗи си I
Казань - 2007
003070709
Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им Н Э Баумана» и ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности» (г Казань)
Научный руководитель доктор ветеринарных наук, профессор Равилов Рустам Хаметович
Научный консультант кандидат биологических наук, Вафин Рамиль Ришадович
Официальные оппоненты доктор ветеринарных наук, профессор
Хазипов Нариман Залилович
доктор ветеринарных наук, профессор Фаизов Тагир Хадиевич
Ведущее учреждение ФГОУ ВПО «Чувашская государственная сельскохозяйственная академия»
Защита состоится 30 мая 2007 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д-220 034 01 при ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им Н Э Баумана» (420074 г Казань, ул Сибирский тракт, 35)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им Н Э Баумана» (420074 г Казань, ул Сибирский тракт, 35)
Автореферат разослан 26 апреля 2007 года
Ученый секретарь диссертационного совета профессор
Ежкова М С
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Хламидиоз - контагиозная болезнь человека и животных, которая характеризуется широким спектром клинических проявлений заболевания - абортами, мертворождениями, рождением нежизнеспособного приплода, пневмониями, конъюнктивитами, энтеритами, артритами, энцефалитами, уретритами и другими клиническими признаками Частое латентное, стертое или хроническое течение инфекционного процесса при хламидиозе, значительно усложняет контроль хламидийных энзоотий Лабораторные методы диагностики хламидиоза, основанные на обнаружении возбудителя путем световой и люминесцентной микроскопии, выделении инфекционного агента на куриных эмбрионах, выявлении в сыворотках крови больных и переболевших животных специфических антител, имеют ряд недостатков, связанных с низкой чувствительностью и специфичностью, а также длительностью получения ответа Кроме того, возбудитепь хламидиоза - внутриклеточный паразит со своеобразным циклом развития, геномика которого в настоящее время является перспективным объектом исследований микробиологов [Rasmussen S J , Timms Р , 1992]
Исходя из этого, ведущим направлением в исследовании хламидиоза является молекулярно-биологические методы индикации и идентификации хла-мидий - ПЦР, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, сек-венирование ДНК и другие [Grayston JT, 1989, Kaltenboeck В et al, 1992, Everett К D et al, 1999, Hartley J С , 2001]
На сегодняшний день таксономия и классификация хламидий постоянно совершенствуется, главным образом благодаря анализу генома микроорганизма [Kaltenboeck В et al, 1992, Everett К D et al, 1999] По мнению некоторых исследователей в настоящее время изучаются штаммы, которые являются кандидатами на регистрацию новых видов хламидий
Современная таксономия хламидий базируется на нуклеотидной последовательности консервативных видоспецифичных генетических маркеров — 16S и 23 S фрагментов РНК, хотя для классификации видов хламидий также пригодны гены, кодирующие белки наружной мембраны (ompl и ошр2) хламидий [Zummerman РА, 1989, Kaltenboeck В et al, 1992, Everett KD et al, 1999, Hartley J С , 2001], что позволяет более точно характеризовать виды хламидий по генетическому признаку
Цель и задачи исследований. Целью работы являлись молекулярно-генетические исследования штаммов хламидий на предмет их таксономической
принадлежности, на основании сравнительного анализа участков генов, кодирующих синтез белков наружной мембраны (ompl и ошр2) возбудителя
В соответствии с целью работы для решения были поставлены следующие задачи
- протестировать протоколы ПЦР-амплификации фрагментов ompl - и отр2-генов хламидий с использованием электрофоретического анализа продуктов реакции, при выделении ДНК возбудителя из клинических образцов,
- определить нуклеотидную последовательность амплифицируемых фрагментов omp 1 - и отр2-генов у хламидий штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93»,
- произвести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей участков генов, кодирующих синтез белков наружной мембраны (ompl и отр2) у разных штаммов хламидий,
- провести филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей участков генома хламидий штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93», изолировать новый штамм хламидий от кошек, изучить его биологические свойства
Научная новизна. Подобран регламент выполнения полимеразной цепной реакции с препаратами ДНК хламидий для праймеров Chi и Ch2,5GPF и 3GPB
Показана возможность дифференциации хламидий внутри вида путем электрофортического разделения продуктов рестрикции амплификатов в ага-розном геле
Впервые определены нуклеотидные последовательности амплифицируемых фрагментов ompl- и отр2-генов у хламидий штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93»
Впервые проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей исследуемых штаммов хламидий («Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93»)
Изолирован новый штамм хламидий от кошек при конъюнктивите, а также изучены его биологические свойства
Практическая ценность. Апробированы молекулярно-генетические методы, позволяющие дифференцировать хламидий как внутри рода, так и внутри вида
Полученные результаты могут быть использованы для определения видовой принадлежности штаммов хламидий в медицинских и ветеринарных лабораториях Данные опубликованы в глобальной электронной базе данных
European Bioinformatics Institute (EMBLE-EBI), Англия, GenBank (NCBI), США, DNA Data Bank of Japan (DDBJ), Япония
Результаты исследований позволили подтвердить хламидийную природу коньюнктивитов среди поголовья кошек в г Казани Изолирований при этом штамм возбудителя хламидиоза обладает выраженными антигенными и имму-ногеными свойствами
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на
- Научно-практической конференции "Ветеринарная медицина домашних животных" (Казань, 2005 и 2006 гг ),
Ежегодных итоговых заседаниях проблемных советов ФГОУ ВПО "Казанская академия ветеринарной медицины им Н Э Баумана" (2004-2006 гг),
- Научно-практической конференции молодых ученых ФГОУ ВПО "Казанская академия ветеринарной медицины им Н Э Баумана" (Казань, 2006 г),
- XIV Московском международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2006 г )
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ
Основные положения, выдвигаемые для защиты:
- протоколы полимеразной цепной реакции со специфичными праймерами для эффективной индикации и идентификации хламидий,
- рестрикционная картина и нуклеотидная последовательность фрагментов генома хламидий штаммов «Ростиново-70», «250», «1111-87» и «КС-93»,
- филограммы хламидий, построенные на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов ompl- и отр2-генов,
- характерные биологические свойства нового штамма хламидий, изолированного от кошек
Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 123 страницах компьютерного текста (текстовый редактор "Microsoft Word 2003", стиль "Times New Roman", размер шрифта 14 пт, интервал полуторный) и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований (4 главы), обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего 220 источников, в том числе 208 иностранных и 12 ссылок на сайты Internet) Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 9 рисунками Прилагаются документы, подтверждающие научно-практическую ценность работы
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводились в 2004-2007 гг на кафедре эпизоотологии с/х животных, кафедре патологии мелких животных и оперативной хирургии ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им Н Э Баумана», лабораториях вирусологии и биохимии ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности»
На отдельных этапах работы исследования проводили совместно со старшим научным сотрудником, к в н. Евстифеевым В В и старшим научным сотрудником, квн Ахмадеевым Р М, за что выражаем им свою искреннюю благодарность
В работе были использованы имеющиеся в нашем распоряжении 4 штамма хламидий «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93», выделенные соответственно от овцы, коровы, песца и собаки Также в нашей работе был использован вновь выделенный нами штамм хламидий от кошки при конъюнктивите — «КК-05» Все штаммы адаптированы к размножению в куриных эмбрионах
В работе в качестве лабораторных моделей были использованы 6-7 дневные развивающиеся куриные эмбрионы - 200 шт, белые мыши массой 10-25 гр - 320 гол , морские свинки массой 150-350 гр - 25 гол , котята 2-3-месячного возраста — 7 гол
Для амплификации фрагмента ошр2-гена хламидий использовали се-мействоспецифичные праймеры, сконструированные Hartley J С с соавт [2001] Для амплификации фрагмента ompl-гена хламидий использовали специфичные праймеры, сконструированные Kaltenboeck В с соавт [1992]
Секвенирование продуктов амплификации ошр2-гена с праймерами Ch 1 и Ch2 и ompl-гена с праймерами 5GPF и 3GPB штаммов хламидий «Ростиново-70», «250» «ПП-87» и «КС-93» выполнено на приборе ABI-300 в лабораториях НПО «СибЭнзим»
Секвенированные последовательности исследованных штаммов хламидий отр2- и ompl генов были проанализированы в сравнении с опубликованными геномами штаммов 6 видов рода Chlamydophila psittaci, abortus, felis, caviae,
pneumoniae и pecorum, используя программу CLUSTAL W (v 1,83) Multiple Sequence Alignments При построении филограмм использовали алгоритм NJ
Код входа в базы данных Генбанка (англ GenBank accession number-A/N) последовательности ompl- гена соответственно - Х56980, М73037, AF269282, NC_000922, М73034, последовательности отр2-гена соответственно - М61116, U76760, AF367407, U41759, U76761, Х53511
Выделение, идентификацию и изучение биологических свойств (патоген-ность, токсичность, антигенность и иммуногенность) нового штамма хламидий проводили общепринятыми методами В качестве серологических тестов использовали РСК, РИФ и ИФА
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.2.1. Индикация хламидий в ПЦР по локусу ompl-rena с праймерами 5GPF и 3GPB и их идентификация путем анализа ПДРФ
После проведения ПЦР, используя праймеры 5GPF и 3GPB, с экстрактами ДНК штаммов хламидий «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» у всех 4 штаммов были зарегистрированы одинаковые результаты в виде одного цельного ампликона длиной 1378 пн При последующем эндонуклеазном расщеплении продуктов амплификации ферментом НаеШ были получены 2 дискретных фрагмента длиной 1070 и 308 пн
Результаты анализа ПДРФ ПЦР-продуктов (с праймерами 5GPF и 3GPB) имеющихся в нашем распоряжении штаммов хламидий показывают, что они отличаются от других микроорганизмов рода Chlamydophila (таблица 1)
1 Результаты ПЦР участка отр! -гена представителей рода СЫатусЬрШа и анализа ПДРФ после обработки ампликонов ферментом НаеШ
шт Ростиново-70 С abortus шт В577 С psittaci шт 6ВС С felis шт FEPN С caviae шт GPIC
- НаеШ - НаеШ - НаеШ - НаеШ - НаеШ
1378 1070 308 1372 1372 1411 987 424 1381 1073 257 51 1372 642 302 201 197 30
2.2.2. Индикация хламидий в ПЦР по локусу отр2-гена с праймерами Chi и Ch2 и их идентификация методом анализа ПДРФ
После проведения ПЦР, используя праймеры Chi и Ch2, с экстрактами ДНК штаммов хламидий «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» у всех 4 штаммов были зарегистрированы одинаковые результаты в виде одного цельного ампликона длиной 587 пн При последующем эндонуклеазном расщеплении продуктов амплификации ферментом Alul были получены 4 дискретных фрагмента длиной 192, 160, 140 и 95 пн
Результаты анализа ПДРФ ПЦР-лродуктов (с праймерами Chi и Ch2) имеющихся в нашем распоряжении штаммов хламидий показали, что они отличаются от представленных референтных штаммов микроорганизмов рода Chlamydophila (таблица 2)
2 Результаты ПЦР участка ошр2-гена представителей рода СЫатусЗорЬИа и анализа ПДРФ после обработки ампликонов ферментом А1и1
шт Ростиново-70 С abortus шт S26/3 С psittaci шт 6BC С felis шт FEPN С caviae шт GPIC С pneumoniae шт IOL207 С pecorum шт W73
- Alui - Alul - Alul - Alul - Alul - Alul - Alul
587 192 160 140 95 587 352 235 587 227 220 140 590 225 140 95 85 45 590 355 140 95 584 457 127 587 394 193
2.2.3. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей секвенированных штаммов
Нуклеотидные последовательности амплифицированных участков отр1-и отр1 -генов штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» имели между собой 100% гомологию Поэтому при филогенетическом анализе были использованы полученные нами данные по сиквенированию фрагментов ДНК штамма хламидий «Ростиново-70»
Гетерогенность указанного штамма хламидий с официально зарегистрированным видам рода СЫатус1орЬ11а по нуклеотидной последовательности фрагментов отр2- и отр1-генов представлены в таблице 3 Филогенетический анализ выравненных последовательностей фрагментов отр1- и отр2-генов штамма «Ростиново-70» с некоторыми штаммами официально зарегистрированных видов хламидий позволил определить его гетерогенность, которая в
сравнении с ближайшим аналогом — Chlamydophila abortus - составляет соответственно 14 и 1,36%
3 Гетерогенность изучаемых штаммов хламидий с представленными микроорганизмами рода Chlamydophila
Штамм Ген С abortus С psittaci С felis С caviae С pneumoniae С pecorum
Ростиново-70 отр2 1,36% 3,58% 10,17% 10% 22,09% 27,77%
ompl 14% 21% 21% 22% 30% 32%
С использованием алгоритма NJ программы CLUSTAL W (v 1,83) Multiple Sequence Alignments [http //align genome jp] нами были построены фи-лограммы, которые дали родословные дендрограммы анализируемых видов рода Chlamydophila по амплифицированным фрагментам отр2- и ompl -генов (рисунок 1)
отр2 ompl
. г situ ■ I-psiHxi
I-I SllUh I
r<ib'ii|ui 1— С sp
sp Roslmovo-70
ft'lb avki-
I- ¡41Hjlb II! if
- dl>Oit is
— С sp Rostmovo-70
• ?е!ь -ca</iae
-pneumuni i>-
I-,ч!>л>гит I-pec dim
Рис 1 Филограммы представителей рода Chlamydophila, построенные по сравнительному анализу нуклеотидных последовательностей амплифицированным фрагментов отр2- и ompl-генов
Последовательности ompl - и ошр2-генов ДНК штамма хламидий «Рости-ново-70» опубликованы на сайте NCBI (GenBank, США) [http // nebí nlm nih gov], в системе EMBLE-EBI (European Bioinformatics Institute, Англия) [http //srs ebi ac uk/srsbin/cgi-bin/wgetz], а также DDBJ (DNA Data Bank of Japan, Япония) [http //srs ddbj nig ac jp/cgi-bin/wgetz]
2.2.4. Выделение нового штамма хламидий от кошек
В качестве клинического материала для выделения возбудителя хлами-диоза были использованы смывы с конъюнктивы у кошки с признаками острого конъюнктивита Хламидии были выделены на развивающихся куриных эмбрионах в первом же пассаже, штамм был назван «КК-05» («Казанский коша-
чий - 2005 года выделения»), специфическая гибель в первом пассаже наступала на 8-12 сутки после заражения
Для идентификации хламидий из очищенной культуры изолята готовили комплементсвязывающий антиген, который испытывали в РСК в параллельных реакциях с иммунной сывороткой, полученной путем гиперимунизации морской свинки штаммом «КК-05», а также стандартными антигенами и позитивными сыворотками, изготовленными из возбудителя хламидиоза овец (штамм «Ростиново-70») и орнитоза (штамм «Лори») (таблица 4)
4 Результаты идентификации штамма хламидий «КК-05» в РСК
Гипериммунные сыворотки, полученные к штаммам хламидий Антигены
«КК-05» «Ростиново-70» «Лори»
«КК-05» 160" 320 20
«Ростиново-70» 160 640 40
«Лори» 10 80 20
Обозначение х - обратная величина титров антител
Приведенные в таблице 4 данные свидетельствуют о принадлежности штамма микроорганизмов «КК-05» к хламидиям В настоящее время штамм адаптирован к размножению в развивающихся куриных эмбрионах, прошел 15 пассажей, для длительного хранения хламидиосодержащий материал указанного штамма был подвергнут лиофилизации Инфекционный титр нативного материала штамма «КК-05» составил Ю"55ЭЛД50/0,3 мл
2.2.5. Биологические свойства вновь выделенного штамма хламидий
Патогенность штамма, выделенного от кошки, для лабораторных животных изучали на белых мышах и морских свинках
Изолят показал наибольшую вирулентность для белых мышей, при ин-трацеребральном, внутривенном и интраназальном заражениях При этом гибель 100% инфицированных лабораторных животных наступала при всех трех методах введения хламидиосодержащей суспензии При сравнительном изучении чувствительность белых мышей к разным способам введения хламидиосо-
держащего материала наименьшая патогенность хламидий была выявлена при подкожной инъекции При этом способе инфицирования у белых мышей реакция на введение суспензий хламидий составляла 40% от общего числа зараженных (таблица 5)
5 Патогенность штамма «КК-05» для лабораторных животных
Вид животных Кол-во животных Способ заражения Доза заражения Процент летальности
4 и/н 0,1 0
Морские 4 и/ц 0,05 0
свинки 4 в/б 2,0 0
4 п/к 2,0 0
10 в/в I 0 100
10 и/н 0,05 100
Белые мыши 10 и/ц 0,03 100
10 в/б 0,5 50
10 п/к 0,5 40
Клиническая картина у белых мышей при внутривенном заражении характеризовалась взьерошеностью шерстного покрова, нарушением координации движения (динамическая и статическая атаксия), снижением подвижности на вторые, а затем гибелью на 3-6 сутки после заражения При вскрытии у павших обнаруживали увеличение и полнокровие печени и селезенки При интра-назальном инфицировании белые мыши заболевали на 5-9 день У них развивалась вялость, отсутствие пищевой возбудимости, шерсть теряла блеск, наблюдался конъюнктивит Гибель зараженных животных наступала на 12-15 сутки после введения возбудителя При вскрытии трупов наблюдали очаговое или ге-нерализованое поражение легких При интрацеребральном инфицировании заболевание наступало на 3-4 сутки и характеризовалось резким угнетением, атаксией как статической, так и динамической в начальной стадии и параличами в терминальной Белые мыши погибали на 5-8 сутки при бурном нарастании нервных явлений У некоторых лабораторных животных отмечали конъюнктивит При вскрытии трупов отмечали отек мозга, яркое проявление рисунка сосудов мозга, увеличение печении и селезенки После внутривенного введения хламидиосодержащей суспензии у подопытных лабораторных животных разви-
валась типичная картина хламидиоза генерализованного характера, смерть в таком случае наступала на 3-4 сутки
При внутрибрюшинном и подкожном инфицировании у подопытных белых мышей на 4-7 сутки отмечали развитие слабых признаков заболевания в виде угнетения, отсутствия пищевой возбудимости и других неспецифических симптомов У некоторых животных (соответственно у 50 и 40% из числа зараженных) болезнь приобретала злокачественный характер и они погибали на 1520 сутки При вскрытии у павших обнаруживали скопление жидкости в брюшной полости и увеличение селезенки (при внутрибрюшинном инфицировании) В мазках-отпечатках, приготовленных из головного мозга и паренхиматозных органов (легкие, печень, селезенка и почки) белых мышей, при световой и люминесцентной микроскопии обнаружены морфологические структуры хламидий Из патологического материала от павших белых мышей во всех случаях хламидии были реизолированы и идентифицированы
При внутрибрюшинном и интранозальном введении 10%-ной хламидио-содержащей суспензий у морских свинок наблюдалась слабо выраженная реакция повышение температуры тела до 39,4-39,6°С, угнетенное состояние, снижение пищевой возбудимости, развитие конъюнктивита на 2-3 сутки после инфицирования, однако на 4-5 сутки клиника заболевания исчезала и гибели этих лабораторных животных мы не наблюдали Подкожное и интрацеребральное введение инфекционного материала также не вызывало гибель подопытных лабораторных животных
Оставшиеся в живых после инфицирования морские свинки были убиты через месяц после заражения Перед этим у них из сердца брали кровь для выявления в сыворотке специфических антител в РСК и ИФА При внутрибрюшинном инфицировании титры антител составили 1 5-1 40 и 1 100-1 200, при подкожном инфицировании 1 5-1 20 и 1 100 соответственно
В мазках-отпечатках, приготовленных из головного мозга и паренхиматозных органов (легкие, печень, селезенка и почки) убитых морских свинок, при световой и люминесцентной микроскопии были обнаружены соответственно мор-
фологические структуры и специфическое свечение скопления антигена хлами-дий в клетках
Возбудитель был реизолирован из тканей и органов инфицированных морских свинок Установлено, что при интрацеребральном инфицировании возбудитель, в основном, локализовался в головном мозге и селезенке, при подкожном - в печени, селезенке и почках
С целью изучения патогенности штамма "КК-05" для кошек были заражены шесть месячных котят, 3 из них подкожно, 3 - внутрибрюшинно При этом у инфицированных животных наблюдали повышение температуры тела на 1-1,5°С, нарушение пищевой возбудимости и угнетенное состояние
У двух котят (по одному зараженному подкожно и внутрибрюшинно) были зарегистрированы признаки одностороннего конъюнктивита
Путем исследования в РСК и ИФА установлено накопление специфических антител в сыворотках крови зараженных котят в титрах 1 5-1 80 и 1 1001 400 соответственно При вскрытии вынужденно убитых животных были обнаружены увеличение и дистрофия печени, кровоизлияния под капсулой почек и увеличение поджелудочной железы При помощи световой и люминесцентной микроскопии были обнаружены соответственно морфологические структуры и антиген хламидий в патологическом материале
При определении токсичности штамма изолированного от кошек на белых мышах, путем внутривенного введения 10%-ной свежеприготовленной хламидиосодержащей суспензии, было установлено, что изолят хламидий от кошек не обладает токсичностью, т е не наблюдается гибели белых мышей в течение первых 24 часов после введения им указанного инфекционного материала
Результаты изучения антигенной активности штамма хламидий «КК-05» представлены в таблице 6 Данные таблицы 6 показывают, что из трех штаммов выделенных от плотоядных, наибольшую антигенную активность в перекрестных исследованиях имеют штаммы «ПП-87» и «КК-05» По этим свойствам они сравнимы с производственным штаммом «Ростиново-70», использующимся
при изготовлении специфических антигенов и сывороток для диагностики хла-мидиозов сельскохозяйственных животных в РСК
6 Характеристика антигенных свойств штаммов хламидий
Гипериммунные сыворотки, полученные к штаммам Титр антител при исследовании сывороток в РСК с антигеном из штамма
«КК-05» «Ростиново-70» «250» «ПП-87» «КС-93»
«КК-05» 320х 320 40 320 160
«Ростиново-70» 320 640 160 320 160
«250» 320 512 160 - -
«ПП-87» 320 640 40 640 160
«КС-93» 20 320 - 160 160
Примечание приведена обратная величина титров антител
Для изучения иммуногенных свойств штамма хламидий «КС-05» были получены очищенные и сконцентрированные культуры хламидий по схеме, описанной в предыдущих главах Затем хламидии были инактивированы 0,4%-ным (в конечной концентрации) формалином в течение 5 суток при 37°С Взвесь, содержащую белок в количестве 30 мг/мл, вводили белым мышам внутрибрюшинно в дозе 0,5 мл
Через 20 дней опытных и контрольных (интактных) белых мышей заражали 10%-ной взвесью желточных оболочек КЭ, инфицированных штаммом хламидий «КК-05», имеющей инфекционный титр 10'5 5 ЭЛДз0/0,3 мл, в дозе 0,5 мл Было проведено три серии опытов по 20 мышей в каждом Полученные результаты представлены в таблице 7
7 Характеристика иммуногенных свойств штамма хламидий «КК-05»
Группы белых мышей Количество белых мышей в опыте Количество павших животных Эффективность иммунизации (%)
опытные 30 4 86,7
контрольные 30 30 -
Проведенные исследования показывают, что однократное внутрибрюш-ное введение инактивированных формалином хламидий штамма «КК-05» защищает от заражения через 20 дней этим же штаммом 86,7 % белых мышей
2.2.6. Молекулярно-генетические исследования нового штамма хламидий
Учитывая тот факт, что видоспецифические праймеры 5GPF и 3GPB, сконструированные Kaltenboeck В с соавт [1993], эффективно инициируют амплификацию локуса ompl-гена ДНК хламидий рода Chlamydophila, в том числе и Chlamydophila felis, мы использовали эти праймеры для идентификации указанного штамма хламидий
При исследовании нового штамма «КК-05» методом ПНР по фрагменту ompl-гена, с использованием праймеров 5GPF и 3GPB, нами был получен 1 ам-пликон размером от 1370-1390 пн
Представленные данные указывают на его принадлежность к виду Chi psittaci по признанной в нашей стране классификации микроорганизмов семейства Chlamydiaceae в 1992 году [Ма J J et al, 1987]
Более точные размеры полученного ампликона и сайты его рестрикции различными ферментами можно установить путем прямого секвенирования Исследования в этом направлении будут продолжены
3. ВЫВОДЫ
1 Полимеразная цепная реакция с видоспецифичными и семейственно-специфичными искусственно синтезированными олигонуклеотидными праймерами 5GPF/3GPB и Chl/Ch2 соответственно является эффективным средством индикации и идентификации хламидий
- ПЦР с экстрактами ДНК хламидий штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93», используя праймеры 5GPF и 3GPB, дает одинаковые результаты в виде одного цельного ампликона длиной 1378 пн, при последующей рестрикции которого ферментом НаеШ образуется 2 дискретных фрагмента длиной 1070 и 308 пн,
- ПЦР с экстрактами ДНК указанных штаммов хламидий, используя прай-
меры Chi и Ch2, также дает одинаковые результаты в виде одного цельного ампликона длиной 587 пн, при последующей рестрикции которого ферментом Alul образуется 4 дискретных фрагмента длиной 192, 160, 140 и 95 пн
2 Анализ нуклеотидных последовательностей амплифицируемых фрагментов ompl- и ошр2-генов свидетельствует об их высокой внутривидовой консервативности у штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» со 100% гомологией
3 Охарактеризованные нами штаммы «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» могут быть соотнесены в новый оригинальный вид хламидий, ранее системно не изученный молекулярно-биологическими методами и, соответственно, не рассмотренный юридической комиссией Международной ассоциации Микробиологических обществ
- филогенетический анализ выравненных нуклеотидных последовательностей фрагмента ompl-гена штамма «Ростиново-70» с некоторыми штаммами официально зарегистрированных видов хламидий позволил определить его гетерогенность, которая в сравнении с ближайшим аналогом -видом Chlamydophila abortus - составляет 14%,
- филогенетический анализ выравненных нуклеотидных последовательностей фрагмента отр2-гена позволил определить его гетерогенность, которая в сравнении с ближайшим аналогом - видом Chlamydophila abortus -составляет 1,36%
4 Филограммы на основе выравнивания нуклеотидных последовательностей ompl- и отр2-генов изучаемых штаммов и некоторых представителей официально зарегистрированных видов хламидий свидетельствуют, что по генетическому критерию первые занимают промежуточное положение между видами Chlamydophila abortus и Chlamydophila psittaci
5 Изолирован новый штамм хламидий («КК-05») от кошек при конъюнктивите, который обладает характерными биологическими свойствами
- инфекционный титр штамма для куриных эмбрионов составляет 10"55ЭЛД50/0,3 мл,
- при интрацеребральном, внутривенном и интраназальном инфицировании белых мышей штамм вызывает гибель 100%, а при внутрибрюшном и подкожном - 50 и 40% зараженных животных,
- заражение штаммом морских свинок и котят не вызывает их гибели,
- инфицирование штаммом белых мышей, морских свинок и котят вызывает образование специфических антител, выявляемых в РСК и ИФА в диагностических титрах,
- штамм не обладает токсичностью,
- по антигенной активности штамм хламидий «КК-05» сравним с производственным штаммом «Ростиново-70»,
- однократное внутрибрюшное введение инактивированных формалином хламидий штамма «КК-05» защищает от заражения через 20 дней этим же штаммом 86,7 % иммунизированных белых мышей
4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1 Полученные данные позволят повысить уровень знаний о природе хламидий и эффективно использовать полученную информацию при научных исследованиях и в практической деятельности ветеринарных специалистов
2 Протестированы протоколы проведения ПЦР с использованием видо- и се-мействоспецифичных праймеров 5GPF/3GPB и Chl/Ch2 соответственно, которые позволяют проводить эффективную индикацию и идентификацию хламидий как в клиническом, так и в патологическом материале.
3 Материалы исследований опубликованы на интернет-сайтах GenBank (NCBI), США, European Bioinformatics Institute (EMBLE-EBI), Англия, DNA Data Bank of Japan (DDBJ), Япония
4 Полученные данные используются в учебном процессе на кафедре эпизоотологии, кафедре патологии мелких животных и оперативной хирургии ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им Н Э Баумана»
5. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1 Бакиров, И X Индикация и идентификация хламидий в ПЦР со специфическими праймерами / Бакиров И X , Вафин Р Р , Равилов Р X , Исхаков Г М // Материалы научно-практической конференции «Ветеринарная медицина домашних животных», Казань, 2005 - С 26-30
2 Бакиров, И X Результаты секвенирования штаммов хламидий, выделенных от сельскохозяйственных и мелких животных / Вафин Р Р , Равилов Р X , Гафаров X 3 , Равилов А 3 , Исхаков Г М , Бакиров И X , Вафин Р Р // Материалы научно-практической конференции «Ветеринарная медицина домашних животных», Казань,2005 -С 34-37
3 Бакиров, И X Новый штамм хламидий, изолированный от кошек при конъюнктивите/ Евстифеев В В , Хусаинов Ф М, Бакиров И X, Равилов Р X , Кашов В Н, Исхаков Г М // Материалы научно-практической конференции «Ветеринарная медицина домашних животных», Казань,2005 - С 45-47
4 Бакиров, ИХ Анализ результатов секвенирования штаммов хламидий / Бакиров ИХ// Материалы научно-практической конференции «Научно-практическая конференция молодых ученых», Казань, 2006 - С 7
5 Бакиров, И X Полиморфизм длины рестрикционых фрагментов продуктов амплификации хламидий / Бакиров И X , Вафин Р Р // Материалы научно-практической конференции «Научно-практическая конференция молодых ученых», Казань, 2006 - С 8
6 Бакиров, И X Выделение нового штамма хламидий при конъюнктивите у кошек / Евстифеев В В , Хусаинов Ф М , Бакиров И X , Кашов В Н , Исхаков Г М , Равилов Р X // Материалы всероссийского ветеринарного конгресса «Международный Московский конгресс по болезням мелких домашних животных», Москва, 2006 - С 5
7 Бакиров, ИХ Биологические свойства штамма хламидий, выделенного при конъюнктивите у кошек / Бакиров И X, Равилов Р X, Евстифеев В В , Хусаинов Ф М , Кашов В Н, Исхаков Г М // Материалы научно-практической конференции «Ветеринарная медицина домашних животных», Казань, 2006 -С 56-59
8 Бакиров, И X Хламидиоз кошек / Бакиров И X, Равилов Р X, Исхаков Г М , Ев-етифеев В В , Хусаинов Ф М // Ученые записки КГАВМ - Казань 2006 - С 19-26
9 European Bioinformatics Institute, England [Электронный ресурс] / EMBLE-EBI, England, Вафин P P , Равилов P X , Гафаров X 3 , Равилов A 3 , Исхаков Г M , Бакиров И X , Кашов В Н , Вафин Р Р - Электрон дан - European Bioinformatics Institute, England, 2006- - Режим доступа http //srs ebi ас uk/srsbin/cgi-bin/wgetz, свободный
10 DNA Data Bank of Japan [Электронный ресурс]/ DDBJ, Вафин P P , Равилов P X , Гафаров X 3 , Равилов А 3 , Исхаков Г М , Бакиров И X , Кашов В Н , Вафин Р Р - Электрон дан - DNA Data Bank of Japan, 2006- — Режим доступа http //srs ddbj nig ac jp/cgi-bin/wgetz,.свободный
11 GenBank NCBI, ША[Электронный ресурс] /GenBank NCBI, Вафин P P , Равилов P X , Гафаров X 3 , Равилов А 3 , Исхаков Г М, Бакиров И X, Кашов В Н , Вафин Р Р - Электрон дан - GenBank NCBI, USA, 2006- -Режим доступа ttp //www ncbi nlm nih gov/entrez/viewer fcgi9db=nucleotide&val=74423036, http //www ncbi nlm nih gov/entrez/viewer fcgi9db=nucleotide&val=74423038, код входа DQ177459, DQ177460 -Загл с экрана
Отпечатано е ООО «Печатный двор» г Каншь, J17 Журналистов, J/J6, оф 207
Ten 272-74-59, 541-76-41, 541-76-51 Лицензия ПД №7-0215 от 01 11 2001 г Выдана Пово imckiui межрегиональны м территориальным ¿правчениеи МПТР РФ Подписано в печать 25 04 2007г Ус i п 7 1,19 Заказ № К-6377 Тираж 100 jkj Формат 60x84 1/16 Б) мага офсетная Печать - ризография
Оглавление диссертации Бакиров, Ильяс Хасанович :: 2007 :: Казань
ВВЕДЕНИЕ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
1.1. Таксономическое положение хламидий.
1.2. Биологические свойства хламидий.
1.2.1. Фенотипическая характеристика.
1.2.2. Геномика хламидий.
1.3. Бактериоскопические, вирусологические и иммунологические методы диагностики хламидиоза.
1.4. Молекулярно-генетическая диагностика хламидиоза.
1.4.1. ПЦР-диагностика хламидийных инфекций.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Штаммы хламидий, подопытные животные и клинический материал.
2.2. Очистка и концентрирование хламидий, выделение ДНК.
2.3. Полимеразная цепная реакция.
2.4. Анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов продуктов амплификации фрагментов ДНК хламидий.
2.5. Секвенирование участков генома хламидий и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей.
2.6. Выделение и идентификация нового штамма хламидий.
2.7. Изучение биологических свойств изолированного штамма хламидий.
2.7.1. Патогенность.
2.7.2. Токсичность.
2.7.3. Антигенность.
2.7.4. Иммуногенность.
2.8. Серологические реакции.
2.9. Статистическая обработка результатов исследований.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1. Молекулярно-генетические исследования штаммов хламидий.
3.1.1. Индикация хламидий в ПЦР по локусу отр1-гена с праймерами 5вРР и ЗвРВ и их идентификация путем анализа ПДРФ.
3.1.2. Индикация хламидий в ПЦР по локусу отр2-гена с праймерами
СЫ и СЬ2 и их идентификация методом анализа ПДРФ.
3.2. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей секвенированных штаммов.
3.3. Выделение нового штамма хламидий от кошек.
3.4. Биологические свойства вновь выделенного штамма хламидий.
3.4.1. Патогенность изолята хламидий для куриных эмбрионов, лабораторных животных и кошек.
3.4.2. Токсичность штамма хламидий изолированного от кошек.
3.4.3. Антигенные свойства изолята хламидий.
3.4.4. Иммуногенные свойства изолята хламидий.
3.5. Молекулярно-генетические исследования нового штамма хламидий.
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.
5. ВЫВОДЫ.
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Бакиров, Ильяс Хасанович, автореферат
Актуальность темы. Хламидиоз - контагиозная болезнь человека и животных, которая характеризуется широким спектром клинических проявлений заболевания - абортами, мертворождениями, рождением нежизнеспособного приплода, пневмониями, конъюнктивитами, энтеритами, артритами, энцефалитами, уретритами и другими клиническими признаками. Частое латентное, стертое или хроническое течение инфекционного процесса при хламидиозе, значительно усложняет контроль хламидийных энзоотий. Лабораторные методы диагностики хламидиоза, основанные на обнаружении возбудителя путем световой и люминесцентной микроскопии, выделении инфекционного агента на куриных эмбрионах, выявлении в сыворотках крови больных и переболевших животных специфических антител, имеют ряд недостатков, связанных с низкой чувствительностью и специфичностью, а также длительностью получения ответа. Кроме того, возбудитель хламидиоза -внутриклеточный паразит со своеобразным циклом развития, геномика которого в настоящее время является перспективным объектом исследований микробиологов [187].
Исходя из этого, ведущим направлением в исследовании хламидиоза является молекулярно-биологические методы индикации и идентификации хламидий - ПЦР, анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов, секвенирование ДНК и другие [117,135,147, 148,149,150,151, 152].
На сегодняшний день таксономия и классификация хламидий постоянно совершенствуется, главным образом благодаря анализу генома микроорганизма [117, 135, 147]. По мнению некоторых исследователей в настоящее время изучаются штаммы, которые являются кандидатами на регистрацию новых видов хламидий.
Современная таксономия хламидий базируется на нуклеотидной последовательности консервативных видоспецифичных генетических маркеров - 16S и 23 S фрагментов РНК, хотя для классификации видов хламидий также пригодны гены, кодирующие белки наружной мембраны (ompl и отр2) хламидий[117, 135, 147, 151, 208], что позволяет более точно характеризовать виды хламидий по генетическому признаку.
Цель и задачи исследований. Целью работы являлись молекулярно-генетические исследования штаммов хламидий на предмет их таксономической принадлежности, на основании сравнительного анализа участков генов, кодирующих синтез белков наружной мембраны (ompl и ошр2) возбудителя.
В соответствии с целью работы для решения были поставлены следующие задачи:
- протестировать протоколы ПЦР-амплификации фрагментов ompl - и отр2-генов хламидий с использованием электрофоретического анализа продуктов реакции, при выделении ДНК возбудителя из клинических образцов;
- определить нуклеотидную последовательность амплифицируемых фрагментов ompl - и отр2-генов у хламидий штаммов: «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93»;
- произвести сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей участков генов, кодирующих синтез белков наружной мембраны (ompl и отр2) у разных штаммов хламидий;
- провести филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей участков генома хламидий штаммов: «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93»;
- изолировать новый штамм хламидий от кошек, изучить его биологические свойства.
Научная новизна. Подобран регламент выполнения полимеразной цепной реакции с препаратами ДНК хламидий для праймеров: Chi и Ch2, 5GPF и 3GPB.
Показана возможность дифференциации хламидий внутри вида путем электрофоретического разделения продуктов рестрикции амплификатов в агарозном геле.
Впервые определены нуклеотидные последовательности амплифицируемых фрагментов ompl- и отр2-генов у хламидий штаммов: «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93».
Впервые проведен филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей исследуемых штаммов хламидий («Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93»).
Изолирован новый штамм хламидий от кошек при конъюнктивите, а также изучены его биологические свойства.
Практическая ценность. Апробированы молекулярно-генетические методы, позволяющие дифференцировать хламидий как внутри рода, так и внутри вида.
Полученные результаты могут быть использованы для определения видовой принадлежности штаммов хламидий в медицинских и ветеринарных лабораториях. Данные опубликованы в глобальной электронной базе данных European Bioinformatics Institute (EMBLE-EBI), Англия; GenBank (NCBI), США; DNA Data Bank of Japan (DDBJ), Япония.
Результаты исследований позволили подтвердить хламидийную природу коньюнктивитов среди поголовья кошек в г. Казани. Изолированый при этом штамм возбудителя хламидиоза обладает выраженными антигенными и иммуногеными свойствами.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на: Научно-практической конференции "Ветеринарная медицина домашних животных" (Казань, 2005 и 2006 гг.); - Ежегодных итоговых заседаниях проблемных советов ФГОУ ВПО "Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана" (20042006 гг.);
- Научно-практической конференции молодых ученых ФГОУ ВПО "Казанская академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана" (Казань, 2006 г.);
- XIV Московском международном ветеринарном конгрессе (Москва, 2006 г.).
Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ.
Основные положения, выдвигаемые для защиты;
- протоколы полимеразной цепной реакции со специфичными праймерами для эффективной индикации и идентификации хламидий;
- рестрикционная картина и нуклеотидная последовательность фрагментов генома хламидий штаммов: «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93»; филограммы хламидий, построенные на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов ompl- и ошр2-генов; характерные биологические свойства нового штамма хламидий, изолированного от кошек.
Объем и структура диссертационной работы. Диссертация изложена на 123 страницах компьютерного текста (текстовый редактор "Microsoft Word 2003", стиль "Times New Roman", размер шрифта 14 пт, интервал полуторный) и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований (4 главы), обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения и указатель литературы (всего 220 источников, в том числе 118 иностранных и 12 ссылок на сайты Internet). Диссертация иллюстрирована 10 таблицами и 9 рисунками. Прилагаются документы, подтверждающие научно-практическую ценность работы.
Заключение диссертационного исследования на тему "Молекулярно-генетическая идентификация хламидий, выделенных от животных"
5. ВЫВОДЫ
1. Полимеразная цепная реакция с видоспецифичными и семейственно-специфичными искусственно синтезированными олигонуклеотидными праймерами 5GPF/3GPB и Chl/Ch2 соответственно является эффективным средством индикации и идентификации хламидий:
- ПЦР с экстрактами ДНК хламидий штаммов: «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93», используя праймеры 5GPF и 3GPB, дает одинаковые результаты в виде одного цельного ампликона длиной 1378 пн, при последующей рестрикции которого ферментом НаеШ образуется 2 дискретных фрагмента длиной 1070 и 308 пн;
- ПЦР с экстрактами ДНК указанных штаммов хламидий, используя праймеры Chi и Ch2, также дает одинаковые результаты в виде одного цельного ампликона длиной 587 пн, при последующей рестрикции которого ферментом Alul образуется 4 дискретных фрагмента длиной 192,160, 140 и 95 пн.
2. Анализ нуклеотидных последовательностей амплифицируемых фрагментов ompl- и ошр2-генов свидетельствует об их высокой внутривидовой консервативности у штаммов «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» со 100% гомологией.
3. Охарактеризованные нами штаммы: «Ростиново-70», «250», «ПП-87» и «КС-93» могут быть соотнесены в новый оригинальный вид хламидий, ранее системно не изученный молекулярно-биологическими методами и, соответственно, не рассмотренный юридической комиссией Международной ассоциации Микробиологических обществ:
- филогенетический анализ выравненных нуклеотидных последовательностей фрагмента ompl-гена штамма «Ростиново-70» с некоторыми штаммами официально зарегистрированных видов хламидий позволил определить его гетерогенность, которая в сравнении с ближайшим аналогом - видом Chlamydophila abortus - составляет 14%;
- филогенетический анализ выравненных нуклеотидных последовательностей фрагмента отр2-гена позволил определить его гетерогенность, которая в сравнении с ближайшим аналогом - видом Chlamydophila abortus - составляет 1,36%.
4. Филограммы на основе выравнивания нуклеотидных последовательностей ompl- и отр2-генов изучаемых штаммов и некоторых представителей официально зарегистрированных видов хламидий свидетельствуют, что по генетическому критерию первые занимают промежуточное положение между видами Chlamydophila abortus и Chlamydophila psittaci.
5. Изолирован новый штамм хламидий («КК-05») от кошек при конъюнктивите, который обладает характерными биологическими свойствами:
- инфекционный титр штамма для куриных эмбрионов составляет 10"5'5 ЭЛД5о/0,3 мл;
- при интрацеребральном, внутривенном и интраназальном инфицировании белых мышей штамм вызывает гибель 100%, а при внутрибрюшном и подкожном - 50 и 40% зараженных животных;
- заражение штаммом морских свинок и котят не вызывает их гибели;
- инфицирование штаммом белых мышей, морских свинок и котят вызывает образование специфических антител, выявляемых в РСК и ИФА в диагностических титрах;
- штамм не обладает токсичностью;
- по антигенной активности штамм хламидий «КК-05» сравним с производственным штаммом «Ростиново-70»;
- однократное внутрибрюшное введение инактивированных формалином хламидий штамма «КК-05» защищает от заражения через 20 дней этим же штаммом 86,7 % иммунизированных белых мышей.
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Полученные данные позволят повысить уровень знаний о природе хламидий и эффективно использовать полученную информацию при научных исследованиях и в практической деятельности ветеринарных специалистов.
2. Протестированы протоколы проведения ПЦР с использованием видо- и семействоспецифичных праймеров 5GPF/3GPB и Chl/Ch2 соответственно, которые позволяют проводить эффективную индикацию и идентификацию хламидий как в клиническом, так и в патологическом материале.
3. Материалы исследований опубликованы на интернет-сайтах GenBank (NCBI), США; European Bioinformatics Institute (EMBLE-EBI), Англия; DNA Data Bank of Japan (DDBJ), Япония.
4. Полученные данные используются в учебном процессе на кафедре эпизоотологии, кафедре патологии мелких животных и оперативной хирургии ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана».
Заканчивая работу, выражаю глубокую искреннюю благодарность моим научным руководителям доктору ветеринарных наук, профессору Равилову Рустаму Хамитовичу, кандидату биологических наук Вафину Рамилю Ришадовичу за повседневное руководство и помощь на протяжении всей моей работы над диссертационной темой и при оформлении диссертации.
Выражаю искреннюю благодарность всем сотрудникам кафедры патологии мелких животных и оперативной хирургии, кафедры эпизоотологии сельскохозяйственных животных ФГОУ ВПО «КГАВМ», сотрудникам лаборатории молекулярно-генетических исследований ГНУ «ТатНИИС/Х», сотрудникам лаборатории вирусологии, биохимии ФГУ «ФЦТРБ-ВНИВИ» за чуткое отношение и товарищескую помощь при выполнении экспериментальной части работы.
Приношу свою глубокую благодарность ректорату ФГОУ ВПО «Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э.Баумана», дирекции ФГУ «Федеральный центр токсикологической и радиоционной безопасности» за предоставленную возможность выполнения и оформления работы.
Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2007 года, Бакиров, Ильяс Хасанович
1. Анализ генома. Методы: Пер. с англ. /Под ред. К. Дейвиса. М.: Изд-во Мир, 1990. - 246 с.
2. Алимов A.M. Молекулярная ДНК/ДНК гибридизация для идентификации возбудителей зоонозов /Алимов A.M., Фаизов Т.Х// Тез. докл. Республиканской научно-произв. конференции Казань, 1992. - с.7.
3. Алимов A.M. Молекулярно-гибридизационные тест-системы для идентификации возбудителей инфекционных болезней/ Алимов A.M., Фаизов Т.Х// Мат. научно-произв. конф. по вопросам ветеринарии. -Казань, 1994.-с. 15
4. Аскарова А. Н. ПЦР в анализе генома./Аскарова А. Н. Казань, 2000. - с. 17-33.
5. Багдонас И.И. Изучение экспериментальной пневмонии телят, зараженных возбудителем группы хламидий / Багдонас И.И., Лабутинас А.Б//Труды Литовского НИИВ. Вильнюс,1976. - С.5-14.
6. Байтурина О.Ш. Лечебно-профилактическая эффективность дибиомицина при хламидиозе овец /Байтурина О.Ш//Труды Алма-Атинского зооветинститута, 1976. - Т.34. - С.85-89.
7. Беклешова А.Ю. /Инфекционные болезни животных/ Беклешова А.Ю. -М. 1987. С.141-149.
8. Белоусов В.И. Получение компонентов ИФА для выявления специфических антител к лептоспирам, сальмонеллам, кампилобактериями хламидиям/ Белоусов В.И., Клюкина В.И., Елисеев А.К., Кочиш И.И//Вирусн. болезни с/х животных. Владимир, 1995. - С.74.
9. Белоусов В.И. Разработка набора для иммуноферментной серодиагностики хламидиоза овец/Белоусов В.И., Клюкина В.И., Кочиш И.И//Вирусн. болезни с/х животных. Владимир, 1995. - С.76.
10. Бескина С.Р. Индикация антигенов гальпровий (хламидий) иммунопероксидазным методом/Бескина С.Р., Панкратова В.Н., Попов
11. B.П//С6. науч.тр.: Экология вирусов. Баку, 1976. - С.208-209.
12. Бортничук В.А. Хламидиоз свиней/ Бортничук В.А Киев: Урожай, 1991. - 192с.
13. Бочкарев Е. Г. Хламидиоз. Современные подходы к диагностике и лечению. Пособие для врачей/Бочкарев Е. Г., Сергеев Ю. В., Башмакова М. А., Говорун В. М., Савичева А. М., Парфенова Т. М//М.: ИАКИ, 2000 г.
14. Бутин B.C. Эпизоотология болезней сельскохозяйственных животных/ Бутин B.C., Тарасова Э.К., Сосновская А.И. Новосибирск, 1983.1. C.74-76.
15. Вафин P.P. Индикация и идентификация Chlamydia psittaci с помощью полимеразной цепной реакции: автореф. дис. канд. биол. Наук/ Вафин Р.Р; ВНИВИ. Казань,2003. - 20с.
16. Вишняков И.Ф. Иммуноферментный анализ при диагностике инфекционных болезней сельскохозяйственных животных /Вишняков И.Ф., Цыбанова Л.Я., Молчанова Т.В//Вопр. вет. вирусол., эпиз. и микроб.: Тез. докл. научн. конф. Покров, 1983. - С.66-76.
17. Гаффаров Х.З. Выделение вируса из группы пситтакоза-лимфогранулемы от телят, больных бронхопневмонией / Гаффаров Х.З. Ученые записки КВИ.- 1969.-№ Ю4.-С.47.
18. Гаффаров Х.З. Выделение вируса из группы OJIT при энзоотическом аборте овец/Гаффаров Х.З., Михайлова Л.И., Кривоносое В.С// Ветеринария. -1971. № 7. - С.109-111.
19. Гинцбург А.Л., Романова Ю.М. Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний/Гинцбург
20. A.Л., Романова Ю.М// Клин. лаб. диагн. 1998. - №2. - с.35-39.
21. Говорун В.М. Новые направления в ДНК-диагностике /ПЦР в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний/Говорун
22. B.М//С6. тр. II Всерос. научно-практ. конф. М., 1998. - с.12-13.
23. Горовиц Э.С. Диагностика хламидийных инфекций человека и животных/Горовиц Э.С., Тимашева O.A., Петров В.Ф., Корпунина Т.И// ЖМЭИ. 1998. - №2. - с.72-75.
24. Гринин A.C. Очистка, концентрирование и фракционирование вирусов животных/Гринин A.C., Титов И.Н. М.: Колос. 1971. 240 с.
25. Гусева Е.В. Применение полимеразной цепной реакции (ПЦР) в диагностике инфекционных заболеваний животных/Гусева Е.В., Сатина Т.А/Юбзор литературы. Владимир, 1995. - 44с.
26. Диагностика, лечение и профилактика заболеваний, передаваемых половым путем: Методич. матер. / Под ред. Борисенко К.К. и др. М.: Асс. «Сенам». - 1997.
27. Домейка М.А. Биологическая характеристика хламидий возбудителя энзоотического энтерита телят: автореф. дис. .канд. вет. наук/ Домейка М.А; - Тарту, 1986. - 25с.
28. Дубинина Г.И. Роль метода полимеразной цепной реакции в генодиагностике/Дубинина Г.И., Щербо С.Н//С6.тр.: Новые генетические технологии. 1988. - №1. - С.20-39.
29. Караваев Ю.Д. Сравнительное изучение чувствительности РСК и микроагглютинации при диагностике энзоотического аборта овец/Караваев Ю.Д., Дзиова H.H., Крюков Н.Н// Бюлл. ВИЭВ. -1971. -№11. С.77-78.
30. Караваев Ю.Д. Активность диагностических положительных сывороток, полученных от различных видов животных, гипериммунизированных возбудителем аборта овец/Караваев Ю.Д.// Бюлл. ВИЭВ. 1972. - № 14. -С.60-61.
31. Караваев Ю.Д. Агглютинирующая активность штаммов возбудителя, выделенных при массовых абортах овец/Караваев Ю.Д//Бюлл. ВИЭВ. -1972. -№ 14. С.62-63.
32. Караваев Ю.Д. Хламидиозы меры борьбы и профилактики/Караваев Ю.Д., Налетов Н.И., Калугина И. АII Ветеринарная газета. - 1993. - №26. -С.4.
33. Ковалев B.JI. Исследование сыворотки крови в РСК при диагностике вирусного аборта овец/Ковалев В.Л//Вирусн. болезни с/х животных: Матер.1 Межвузовской ветеринарной вирусол. конф. М., 1970. -С.130-131.
34. Колкова Н.И. К вопросам диагностики хламидийных инфекций/Колкова Н.И., Мартынова В.Р//Клин. лаборат. диагн. 1998. - №2.-С.20-21.
35. Кудрявцева JI.B. Клиника, диагностика и лечение хламидийной инфекции (пособие для врачей)/Кудрявцева JI.B., Мисюрина О.Ю., Генерозов Э.В., Говорун В.М. Москва, 2001. - 56с.
36. Кузьменко В.П. Особенности взаимодействия хламидий с клетками/ Кузьменко В.ШМикробиол.журнал.-1980.-№2.-С.250-259.
37. Кутлин A.B. Иммунодиагностические препараты на основе моноклональных антител к Chi. Trachomatis/Кутлин A.B., Шаткин A.A., Дробышевская Э.И // ЖМЭИ. 1996. - № 6. - С.42-44.
38. Манолов А.Д. Твердофазные радиоиммунные и иммуноферментные методы для количественного экспресс-анализа в микробиологии/ Манолов А.Д//ЖМЭИ 1985. - № 4. - С. 100-107.
39. Мартынова Р.В. Хламидии и хламидиозы: клиника, биология и диагностика/Мартынова Р.В., Колкова Н.И., Шаткин А.А// Рос. мед. вести. 1997. -Т.2. - №3. - С.49-55.
40. Машкиллейсон A.JI. Диагностика урогенитальной хламидийной инфекции прямым иммунофлуоресцентным методом при использовании моноклональных антител/Машкиллейсон A.JL, Гамберг М.А//Хламидийные инфекции. М., 1986. - С.56-60.
41. Милютин В.И. Микрофотография крупных вирусов и риккетсий под люминесцентным микроскопом/ Милютин В.И., Неустроев В.Д., Хандуев Ц.Ц// Вопр. вирусол. 1959. - № 4. - С.502-506.
42. Мошковский Ш.Д. Природа вирусов и их место в системе живого/ Мошковский Ш.Д//Вестн. АМН СССР. 1963. - Т.1. - С.37-39.
43. Николаева A.B. Об энзоотической пневмонии свиней, вызываемой вирусом из группы орнитоза лимфогранулемы- трахомы /Николаева А.В//Вирусн. болезни с/х животных: Матер. I Межвузовской вет. вирусол. конф.-М., 1970. - с.227-228.
44. Новохатский A.C. Иммуноферментный анализ моноклональных антител на твердой фазе инфицированных клеток/Новохатский A.C., Носик Д.Н., Литвинович Н.Е., Малахова И.В//Вопр. вирусол. 1986. - № 4. -С.440-444.
45. Норкина О.В. Конструирование видоспецифичного для Yersenia pestis хромосомального ДНК-зонда/Норкина О.В., Куличенко А.Н., Шоводаева Г.А//Генетика. 1993. - Т.29. - №3. - С.1732-1736.
46. Обухов И.Л. Хламидиоз кошек, прил. к журн. «Новости звероводства».-М., 1994.-92с.
47. Обухов И.Л. Молекулярно-генетическая характеристика хламидий и экспресс-диагностика хламидиоза: дисс. докт. .биол. наук/ Обухов И.Л; -М., 2000. С.351
48. Обухов И.JI. Обнаружение Chi. psittaci при конъюнктивитах у собак/ Обухов И.Л//С6. науч. тр. Всеросс. гос. НИИ контроля стандартизации и сертификации вет препаратов. 1996. - Т.57. - С.45-51.
49. Обухов И.Л. Использование полимеразной цепной реакции в практических ветеринарных лабораториях/Обухов И.Л, Груздев К.Н., Панин А.Н//Ветеринария. 1997. - №2. - С.24-27.
50. Обухов И.Л. Использование полимеразной цепной реакции для определения видов хламидий/ Обухов И.Л., Шипулин Г.А., Груздев К.Н., Панин А.Н//Докл. РАСХН. 1997. - № 1. - С.44-45.
51. Овчинников М.Н. Ультраструктура возбудителей венерических заболеваний и ее клиническое значение/Овчинников М.Н., Дилекторский B.B М.: Медицина, 1986. - С. 175.
52. Панин А.Н. Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции/Панин А.Н., Обухов И.Л., Шипулин Г.А., Груздев К.Н//Ветеринария. 1997. - №7. - С. 19-21.
53. Першина М.Ю. Анализ геномного полиморфизма лептоспир в полимеразной цепной реакции с произвольными праймерами/Першина М.Ю., Шагинян И.А., Ананьина Ю.В., Прозоровский С.В//Молек. генетика, микробиол. и вирусол. 1998. - №1. - С.29-32.
54. Покровский В.И. Иммуноферментный анализ: современное состояние и тенденции развития/Покровский В.И., Голубинский Е.П., Семина Н.А//Обз. инф. ВНИИ мед. и мед.-техн. инф. 1986. - №3. - 73с.
55. Попов В.Л. Цикл развития и клеточный цикл хламидий / Хламидии (гальпровии) и хламидиозы/ Попов В.Л. М., 1982. - С.16-17.
56. Равилов Р.Х. Хламидиоз плотоядных животных (этиология, диагностика, профилактика и меры борьбы): дисс. .докт. вет. наук/ Равилов Р.Х; ВНИВИ- Казань, 1998. 316с.
57. Равилов Р.Х. Хламидиоз плотоядных животных: автореф. дис. докт. вет. Наук/Равилов Р.Х; ВНИВИ- Казань, 1999. 28с.
58. Равилов Р.Х. Хламидиоз плотоядных животных/Равилов Р.Х. Казань: "Алма-Лит", 2003. - 130с.
59. Садриев А. Р. Иммунохимический анализ и геноидентификация хламидий: дисс. канд. биол. наук/Садриев А. Р; ВНИВИ-Казань, 1999. 137с.
60. Самуйленко А.Я. Инфекционная патология животных/Самуйленко А.Я., Сюрин В.Н., Воронин Е.С//Том V. Хламидиозы. -М.: ВНИИТИБП, 2003. -207с.
61. Серов В.Н. Хламидиоз (клиника, диагностика, лечение)/Серов В.Н., Краснопольский В.И., Делекторский В.В//Методические рекомендации -М.: Патент, 1999. 22с.
62. Улендеев А.И. Материалы по изучению респираторных заболеваний телят/Улендеев А.И., Деханов А.А //Тез. докл. Всесоюзной межвузовской конференции по вет.вирусологии. М., 1971. - 4.2. - С.48-50.
63. Улендеев А.И. О роли микроорганизмов из группы ОЛТ при желудочно-кишечных и респираторных заболеваниях телят/ Улендеев А.И., Деханов А.А//Труды Ульяновского с/х института. -1971. Т. 16. - №4. - С. 166-176.
64. Фаизов Т.Х. ДНК-зонды, полимеразная цепная реакция для выявления зооантропонозов / Фаизов Т.Х., Равилов Р.Х., Гришкевич Н.М., Староверов С.А//Матер. Респ. научно-произв. конф. по акт. проблемам ветер, и зоотехнии. Казань, 1996. - С.49.
65. Фаизов Т.Х. Произвольные праймеры: новые возможности идентификации бактерий/Фаизов Т.Х., Гришкевич Н.М., Алимов А.М//Матер. Междунар. научн. конф. посвящ. 125-летию КГАВМ 4.1. -Казань, 1998.-С.90-91.
66. Хамадеев Р.Х. Изучение энзоотического аборта овец в Татарской АССР и усовершенствование методов лабораторной диагностики этого заболевания: автореф. дис. канд. вет. наук/Хамадеев Р.Х; ВНИВИ1«1. Казань, 1975. 26с.
67. Хамадеев Р.Х. Разработка и испытание полиштаммовой вакцины против хламидиоза крупного рогатого скота /Хамадеев Р.Х., Хусаинов Ф.М., Равилов А.3//Тез. докл. научно-практ. конф. по проблемам ветер, и живодновоства.- Казань, 1994. С.28-29.
68. Хамадеев Р.Х. Разработка инактивированной эмульсионной вакцины против хламидиоза свиней /Хамадеев Р.Х., Хусаинов Ф.М., Равилов
69. A.3//Вирусн. болезни с/хламидиозов животных. Владимир, 1995. -С.151.
70. Хамадеев Р.Х. Хламидиозы меры борьбы и специфической профилактики /Хамадеев Р.Х., Равилов А.3//Материал. Всеросс. научн. конф.: Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных - М„ 1996. - С.36-37.
71. Хамадеев Р.Х. Разработка ассоциированной вакцины против парагриппа -3, ИТР и хламидиоза крупного рогатого скота /Хамадеев Р.Х., Гумеров
72. B.Г., Угрюмова В.С //Тез. докл. Респ. научно-практ. конф. по актуальн. вопр. ветеринарии и зоотехнии. Казань, 1996. - С.53.
73. Хамадеев Р.Х. Возбудители хламидиозов сельскохозяйственных животных и их патогенность для человека /Хамадеев Р.Х., Равилов А.З //Журн. микробиол. 1997. - № 1. - С.99-101.
74. Хламидиоз (клиника, диагностика, лечение): Методические рекомендации /Под ред. Серова В.Н., Краснопольского В.И., Делекторского B.B М.: Патент, 1996. - 22с.
75. Хламидиозы сельскохозяйственных животных. /Под ред. Хазипова Н.З. и Равилова А.З. М.: Колос, 1984. - 223с.
76. Шагинян И.А. Геномный полиморфизм возбудителей бактериальных инфекций /Шагинян И.А., Гинцбург А.Л//Мол. генет., микробиол. и вирус. 1994. -№12.- С.3-9.
77. Шаманек Т.П. Сравнительная оценка чувствительности ПЦР и РИФ при диагностике урогенитальных инфекций /Шаманек Т.П., Новиков Е.А., Гаврюшкин A.B., Ковпак Д.Н., Соков Б.Н // ЖМЭИ 1998. - №1. - С.86-88.
78. Шаткин А.А. Основные принципы лабораторной диагностики гальпровиозов (хламидиозов) / Гальпровиозы (хламидиозы) человека и животных/Шаткин А.А М., 1979. - Вып.1. - С.25-36.
79. Шафикова Р.А. Иммунобиологическая характеристика хламидий, усовершенствование методов и средств лабораторной диагностики хламидиозов: автореф. дис. докт. вет. наук/Шафикова Р.А; ВНИВИ-Казань, 1991.-38с.
80. Щербань Г.П. Энзоотический (вирусный) аборт овец/Щербань Г.П., Щербань Н.Ф //Ветеринария. 1974. - № 8. - С.85-87.
81. Щербань Г.П. Хламидиоз крупного рогатого скота и меры борьбы с ним/Щербань Г.П., Зимина В.П// Ветеринария. 1986. - №9. - С.46-48.
82. Щербо С.Н. ПЦР диагностика заболеваний, передаваемых половым путем/Щербо С.Н., Макаров В.Б//Клин. лаб. диагн. - 1998. - №2. - С.21-24.
83. Эйделынтейн И.А. Современная классификация хламидий/ Эйделыптейн И.А//Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. Т. 1 - № 1. - 1999. - С. 5-11.
84. Ярыгин В.Н. Биология/Ярыгин В.Н., Васильева В.И., Волков И.Н., Синелыцикова В.В -М.: Высш. шк., 2001. с.10-12.
85. Armstrong J. A. Valentine R.C, Filds С. Structure and replication of the trachoma agent in cell cultures, as shown by electromicroscopy // J.Gen. Microbiol. P.25-26.
86. Asso M. et al. La chlamydiose abortiv ovine // Patre -1981. V.284. - P.25-26.
87. Babudieri B. The slide microagglutination tests in the field of Rickettsial and viral serology. Its Advantages and Limitations // Path. Microbiol. -1961. -№24.-P. 11-20.
88. Baehr, W., Y.-X. Zhang, T. Joseph, H. Su, F. E. Nano, K. D. E. Everett, and H. D. Caldwell. 1988. Mapping antigenic domains expressed by Chlamydiatrachomatis major outer membrane protein genes. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:4000-4004.
89. Baghian, A., L. Shaffer, and J. Storz. 1990. Antibody response to epitopes of chlamydial major outer membrane proteins on infectious elementary bodies and of the reduced Polyacrylamide gel electrophoresis-separated form. Infect. Immun. 58:1379-1383.
90. Barron A.L., Collins A.R. Studies on trachoma agent by Double diffusion gel precipitation // Am. J. Ophthal. 1967. - №63. - P.461-465.
91. Barron A.L., Gaste P.G., Paul B., Page L.A. Detection of chlamydiae antibodies in animal sera by double diffusion in gel // Appl. Microbiol. 1972.- V.29. №4. - P.770-774.
92. Beck S., Kleffe T.O., Coull L.M. et al. Chemilumenescent detection for DNA sequensing and hybridization // Nucl. Acids Res. 1989. - V. 17. - №13. -P.5115-5123.
93. Bedson S.P., Bland J.O. Morphological stady of the psittacosis virus, with a description of the developmental cycle // Brit. J. Exp. Path. 1932. - №13. - P. 461-466.
94. Benedict A.A., O'Brien E.A. Antigenic studies on the psittacosis-lymphogranuloma venereum group of viruses. II. Characterization of complement fixing antigens extracted with sodium lauril sulfate // J. Immunol.- 1956. V.76. - №4. - P.293-300.
95. Benedict A.A., O'Brien E.A. Passive hemagglutination reaction for psittacosis // J. Immunol. 1958. - V.80. - №2. - P.94-99.
96. Bergmeyer H.U. Methods of enzymatic analysis // Verlag chemie. 1983. -V.86. -№1. -P.9-12.
97. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucleic Acids Res. 1979. - V.7. - P.1513.
98. Blanco L.A., Barrera P.J., Macrotequi M.A. Ultrastructura de una chlamydia de origen bovino // An. Inst. Nac. Investig. Agr. Ser.: Hig. Sanid anim. 1975. -№2. - P.37-55.
99. Caldwell H.D., Kromhout J., Schachter J. Purification and partial characterization of the major outer membrane protein of Chi. trachomatis // Infect. Immunol. 1981. - №31. - P. 1161 -1176.
100. Caldwell H.D., Judd R.C. Structural analysis of chlamydial major outer membrane proteins // Infect. Immunol. 1982. - №38. - P.960-968.
101. Calisto M.L., Marino D., Picerno J. et. al. Studio complrativo tra il test di amplificazione del DNA (PCR) elacoltura cellulare nella diagnosi dell infeczioni da Chi. trachomatis in ginecología ./ Riv. Ital. Ig. 1996 - V.56. -№3-4. -P.47-54.
102. Campbell L.A., Kuo C.C., Grayston J.T. DNA analisis of a new chlamydial agent (TWAR) associated with acute respiratory disease / Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microbiol.: 87th Annu Meet. Atlanta, Ga, 1987.
103. Charton A. Chlamydioses des ruminants (bovine, ovine, caprine): etudes experimentales. 2. Composition polypeptidique des corps elementaires de soches de diverses origines // Bull. Acad. Vet. Fr. 1976. - V.49. - №4. -P.401-408.
104. Christiansen G., Ostergaard L., Birkelund S. Molecular biology of the Chi. pneumoniae surface // Scand. J. Infect Dis. 1997. Suppl. №104. - P.5-10.
105. Collins A.R., Barron A.L. Demonstration of Group- and Species-specific antigens of chlamydial agents by gel diffusion // J. Infect. Dis. 1970. - V.121. -№1. -P.l-8.
106. Colon J.I. The role of folic acid in the metabolism of members of the psittacosis group of microorganisms // Ann. N.Y. Acad. Sc. 1962. -№98. -P.243.
107. Corcish J.D., Bevan B.J. Diagnosis of psittacosis. Vet. Rec. 1991. - №12. P.42-43.
108. Don R.H., Cox P.T., Wainwright B.J., Baker K., and Mattick J.S.-"Touchdown" PCR to circumvent spurious priming during gene amplification -Nucl. Acids. Res. (1991) v.19, p.4008.
109. Dixit S.N., Kalra D.S., Sadana J.R., Purohi V.D. Neo on seroprevalenie of chlamydiosis in sheep and goats // Indian J. Anim. Sci. 1980. - V.50. -P.786-787.
110. Eissenberg L.G., Wyrick P.B., Davis C.H., Rumpp J.W. Chl.psittaci elementary body envelopes: Ingestion and inhibition of phagolysosome fusion // Infect.and Immunol. 1983. - V.40. - №2. - P.741-751.
111. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA): Quantitative assay for immunoglobulin G // Immunochem. 1971. - №8. -P.871-874.
112. Engvall E., Carlsson H.E. Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA: First International Symposium on Immunoenzymatic Techniques INSERM, Symposium N2 / Feldman et al., eds. North Holland Publishing Complny. -Amsterdam, 1976.
113. Enzyme immunoassay // Ishikawa E., Kawai T., Miyai K., eds. Tokyo: Igaku-Scoin, 1981.
114. Enzyme-mediated immunoassay / Ngo T.T., Lenhoff H.M., eds. N.Y.: Plenum Press, 1985.
115. Erlandson R.A., Allen E.G. The ultrastructura of meningopneumonitis // Virology. 1964. - №22. - P.410-418.
116. Erlich H.A. PCR technology: principles and applications for DNA amplification N.Y Academic Press. - 1989.
117. Fitts R., Diamond M., Hamilton C., Nery M. DNA-DNA hubrydization assay for detection of Salmonell spp. in foods // Appl. and Envizon.Microbiol. -1983.-№ 5.-P. 1146-1151.
118. Frazier M.E., Samuel J.'E., Baca O. et al. Detection of Coxiella burnetti by DNA probes // Abstr. Annu. Meet. Amer. Soc. Microb. 87 th. Atlanta. 1987. -P.356.
119. Friis R.R. Infection of L cells and Chi. psittaci, entry of the parasite and host responses to its development // J. Bacteriol. 1972. - V.l 10. - P.706-721.
120. Fukushi H., Hirai K. Proposal of Chlamydia pecorum sp. nov. for Chlamydia strains derived from ruminants// Int. J. Syst. Bact. 1992. - V.42. - P.306-308.
121. Fukuchi H., Ogawa H., Ninamoto N. et al. Seroepidemiological surveillance of Chi. psittaci in cats and dogs in Japan // Vet.Res. 1985. - V.l 17. - №19. -P.503-504.
122. Gafford L.G., Randall C.C. // J. Molecular Biol. 1967. - №26. - P.303.
123. Geally J.F. Monoclonal antibodies and their potential in medicine // Irish Med. J. 1987. - V.80. - №6. - P.161-162.
124. Gonsales S.J. Chi. psittaci varieded TWAR. Un nueve patogeno a considerar // Enferm. Infect. V Microbiol. Clin. 1987. - №5. - P.319-321.
125. Grayston J.T., Wang S.P., Kuo C.C., Campbell L.A. Current knowledge on Chi. pneumoniae, strain TWAR, an important cause of pneumonia and otheracute respiratory diseases //Eur. J. Clin. Microbiol, and Infect. Dis. 1989. -V.8. -№3. -P.191-202.
126. Hackstandt T. Identification and properties of chlamydial polypeptides that bind eucaryotic cell surface components // J. Bacteriol. 1986. - №165. -P. 13-20.
127. Hartley J.C., S. Kaye, S. Stevenson, J. Bennett, and G Ridgway. PCR Detection and Molecular Identification of Chlamydiaceae Species. Journal of Clinical Microbiology, Sept. 2001, p. 3072-3079. Vol. 39, No. 9.
128. Hartmann B., Schuh E., Stary A. Amplifizierungs-methoden in der Chlamydien-diagnostic // MTA. 1997. - V.12. - №7. - P.476-480.
129. Haskizume S. Diagnosis of chlamydial infection // Asian Med. J. 1988. -V.31. - №2. - P.83-86.
130. Hewinson R.G., Griffiths P.C., Bevan B.J. et al. Detection of Chi. psittaci DNA in avian clinical samples by polymerase chain reaction // Vet. Microbiol. -1997. V.54. - №2. - P. 155-166.
131. Hewinson R.G., Griffiths P.C., Rankin S.E.S. Towards a differential polymerase chain reaction test for Chlamydia psittaci // Vet. Tec.-1991.-V.128. P.381-382.
132. Higachi N. Electron microscopic studies on the trachoma virus and psittacosis virus in cellcultures // Ex. Mol. Pathol. 1965. - №4. - P.24-29.
133. Holland S.M., Gaydes C.A., Quinn T.C. Detection and differention of Chlamydia trachomatis, Chlamydia psittaci and Chlamydia pneumoniae by DNA amplification. J. Infect Dis. 1990. - V.162. - P.984-987.
134. Ibrahim A., Uesach W., Stuchebrand E. Polymerase chain reaction gene probe detection system specific for pathogenic of Yersinia enterocolitica // J. Clin. Microbiol. - 1991. -V.30. - №8. - P. 1942-1947.
135. Isobe K., Aoki K., Itoh N. et al. Serotyping of Chi. trachomatis from inclusion conjunctivitis by PCR and restriction fragment length polymorphism analysis // Jap. J. Ophtal. 1996. - V.40. -№2. - P.279-285.
136. Ito J.I., Harrison H.R., Alexander E. et al. Establishment of genital tract infection in the CF-1 mouse by intravaginal inoculation of a human oculogenital isolate of Chi. trachomatis // J. Infect. Dis. 1984. - V.150. - №4. -P.577-582.
137. Jenkin H.M. Preparation and properties of cell walls of agent of meningopneumonitis // J. Bacteriol. 1960. - V.80. - P.639-647.
138. Jenkin H.M., Ross H.R., Moulder J.W. Spacies-specifie antigens from the cell walls of the agents of meningopneumonitis and foline pneumonitis //J.Immunol. -1961. V.86. - P. 123-127.
139. Kaltenboeck B., K.G. Kousoulas, and J. Storz. Detection and Strain Differentiation of Chlamydia psittaci Mediated by a Two-Step Polymerase Chain Reaction. Journal of Clinical Microbiology, Sept. 1991, p. 1969-1975 Vol. 29, No. 9.
140. Kaltenboeck B., K.G. Kousoulas, and J. Storz. Structures of and Allelic Diversity and Relationships among the Major Outer Membrane Protein (ompl) Genes of the Four Chlamydial Species. Journal of Bacteriology, Jan. 1993, p. 487-502. Vol. 175, No. 2.
141. Kaltenboeck B., Storz J. Biological properties and genetic analysis of the ompl locus in chlamidiae isolated from swine // Am. J. Vet. Res. 1992. - №9 -P.1482-1487.
142. Kaltenboeck B., Kousoulas K.G., Storz J. Detection and strain differentiation of Chlamydia psittaci mediated by a two-step polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. -1991 V.29. - P.1969-1975.
143. Kaltenboeck B., Kousoulas K.G., Storz J. Two-step polymerase chain reactions and restriction endonuclease analyses detect and differentiate ompl DNA of Chlamydia spp // J. Clin. Microbiol. 1992. - V.30. - P.1098-1104.
144. Kaltenboeck B. Structures of and allelic diversity and relationships among the major outer membrane protein (ompl) genes of the chlamidial species. J. Bact. 1993-V. 175.-P.478-502.
145. Kingsbery D.T., Weiss E. Lack of DNA homology between species of the genus Chlamydia // J. Bacteriol. 1968. - V.96. - №4. - P. 1421-1423.
146. Lebar W.D., Herschman B., Jemal C. et al. Complrison of DNA probe, monoclonal antibody enzyme immunoassay and cell culture for detection Chi. trachomatis // J. Clin. Microbiol. 1989. - V.27. - №5. - P.826-828.
147. Lepinay A., Robineaux R., Orfilla J. Ultrastructura et cytochimie ultrastructurale des membranes de Chi. psittaci // Arch. Des. Virus forsch. -1971. V.33. -P.261-270.
148. Lincoln S., Kwapien R.P., Reed D. E. et al. Epizootic bovine abortion // Am. J. Vet. Res. 1969. - V.30. - №12. - P.2105-2113.
149. Lipine P., Sautter A. // Bull. Acad. Nat. Med. 1951. - V.332 - P. 19-20.
150. Litwin J. The growth cycle of the psittacosis group of microorganisms // J. Infect. Dis.- 1959.-V.105.-P.129-161.
151. Longhofer S.L. Chemotherapy of ricketsial, protosoal and chlamydial diseases // Veter. Clin. N. Amer.: Small. Anim. Pract. 1989. - V.18. - №6. - P.1183-1196.
152. Ma J.J., Stephens R.S., Kuo C.C. The heterogenic composition of the outer membrane protein of Chi. trachomatis //Abstr. An. Meet Am. Soc. Microbiol. -Waschington, D.C. 1987. - P.98-100.
153. Maclean I.W., Peelino R.W., Brunham R.C. Characterization of Chi. trachomatis antigens with monoclonal antibodies // Can. J. Microbiol. 1988. - V.34.-P.141-147.
154. Manire C.P., Tamura A. Preparation and chemical composition of the cell walls of nature infections dense forms of meningopneumonitis organisms // J. Bacterid. 1967. - V.94. - №4. - P. 1178-1183.
155. Marmur J. A procedure for isolation of DNA from microorganisms // J. Mol. Biol. 1961. - V.3. - P.208-218.
156. Medrano, J.F. and E. Aguilar-Cordova. 1990. Genotyping of bovine kappa-casein loci following DNA sequence amplification. Bio/Technology. 8:144146.
157. Meyer K.F., Eddie В., Schachter J. Возбудители пситтакоза и венерической лимфогранулемы // Лаб. диагн. вирус, и риккетсиозных забол. М.: Медицина. - 1974. -С.708-739.
158. Melgosa, М. P., С.-С. Kuo, and L.A. Campbell. 1991. Sequence analysis of the major outer membrane protein gene of Chlamydia pneumoniae. Infect. Immun. 59:2195-2199.
159. Mygind, P., G. Christiansen, K. Persson, and S. Birkelund. 1998. Analysis of the humoral immune response to Chlamydia outer membrane protein 2. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 5:313-318.
160. Moulder J.W. Биохимия внутриклеточного паразитизма. M.: Мир. - 1965. - 197с.
161. Moulder J.W. Metabolic capabilities and deficiencies of rickettsiae and psittacosis group // Int. J. Leprosy. 1965. - V.33. - P.494.
162. Moulder J. W., Grissa D.L., Cho H.J. Endogenous metabolism of protein and ribonucleic acid in a member of the psittacosis group // J. Infect. Dis. 1965. -V.115.-№3.-P.254.
163. Moulder J. W. The contribution of model system to the studying of infections disease // Persp. Biol. Med. 1971. - V. 14. - P.486-502.
164. Murrey E.S. Guinea pig inclusion conjunctivitis virus. I. Isolation and identification as a member of the PLV group // J. Infect. Dis. 1964. V. 114. -P.l-12.
165. Oehme A., Berlau J., Groh A. et al. Complrison of two immunoassays for detection of Chi. trachomatis and evaluation of discrepant results by means of cell culture, PCR and serology // Clin. Lab. 1996. - V.42. - №10. - P.843-846.
166. Oellerich M., Haeckel R., Haindl H. Evaluation of EMIT adapted to the Bio centrifugal analyzer (Cobas) // J. Clin. Biochem. 1982. - V.20. - P.765-772.
167. Oriel J.P. Treatment of nongonococcal urethritis / Charman's report and discussion: Nongonococcal urethritis and relat. infect. Washington, D.C. -1977. - P.38-48.
168. Page L.A. Stimulation of cell mediated immunity to Chlamydiosis in Turkeys by inoculation of Chlamydial Bacterin // Am. J. Vet. Res. 1978. - V,39. -P.473-480.
169. Perez-Martinez J.A., Storz I. Chlamydial infection in cattle. P. 1 // Mod. Vet. Pract. 1985. - V.66. - N8. - P.517-522.
170. Petersen E.E. Chlamydien infektionen // MTA. 1996. - V. 11. - №5. - P.354-362.
171. Poffenroth L., Costerton J.W., Kordova N., Wilt J.C. Ultrastructural studies of Chi. psittaci 6BC strains // Can. J. Microbiol. 1973. - V.19. - №8. - P.887-894.
172. Pollard D.R., Tyler S.D., N g C. W. e.a. A polymerase chain reaction (PCR) protocol for the specific detection of Chlamydia spp.// Mol. Cel. Probes. -1989. -№3. -P.383-389.
173. Popov G., Martinov S. Electronmicroscopic diagnostics of the chlamydial abortion in ewes // Abstracts. 1986. - P.925-928.
174. Pudjiatmoko H., Ochiai Y., Yamaquchi T. et al. Diversity of feline Chi. psittaci revealed by random amplification of polymorphic DNA // Vet. Microbiol. -1997. V.54. -№ 1.-P.73-83.
175. Rake G. Viral and rickettsial diseases of the skin, eye and mucous membranes of man// Ann. N.Y. Acad. Sc. 1953. - V.56. -№3. -P.557-560.
176. Rappolee D.A. Optimizing the sensitivity of RT PCR // A forum for PCR users: Issue U. - 1990. - P.23.
177. Rasmussen S.J., Douglas P.P., Timms P. PCR detection and differentiation of Chlamydia pneumoniae, Chlamydia psittaci and Chlamydia trachomatis. Mol. Cel. Probes. 1992. - №6. - P.389-394.
178. Rasmussen S.J., Timms P. Detection Chlamydia psittaci using DNA probes and the polymerase chain reaction. PEMS Microbiol. Lett. 1992. - V.77. -P. 169-174.
179. Raulston Jane E. Chlamydial envelope components and pathogen host cell interactions // Mol. microbiol. - 1995. - V.15. - P.4.
180. Reed L.F., Muench H. A simple method of counting 50% end-point // Am. J. Higiene. 1938. - V.27. - P.493-497.
181. Saiki, R., D. H. Gelfand, S. Stoffel, S. J. Scharf, R. Higuchi, G. T. Horn, K. B. Mullis, and H. A. Erlich. 1988. Primerdirected enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239:487-494.
182. Sheehy, N., B. Markey, M. Gleeson, and P. J. Quinn. 1996. Differentiation of Chlamydia psittaci and C. pecorum strains by species-specific PCR. J. Clin. Microbiol. 34:3175-3179.
183. Stephens, R. S., R. Sanchez-Pescador, E. A. Wagar, C. Inouye, and M. S. Urdea. 1987. Diversity of Chlamydia trachomatis major outer membrane protein genes. J. Bacteriol. 169:3879-3885.
184. Storz, J. 1988. Overview of animal diseases induced by chlamydial infections, p. 167-192. In A. L. Barron (ed.), Microbiology of chlamydia. CRC Press, Inc., Boca Raton, Fla.
185. Samoilovich S.R., Dugan C.B., Macario A.J.L Hybridoma technology: new developments of practical interest // J. Immunol. Meth. 1987. - V. 101. - №2. -P. 153-170.
186. Schachter J. DNA, EIA, PCR, LCR and other technologies: What tests should be used for diagnosis of chlamydial infections? // Immunol. Invest. 1997. -V.26. -№1-2. -P.157-161.
187. Schlossberger H., Kolle W., Hetsch H. Experimentelle Bakteriologie und Infektionskrankheiten. München, 1952.
188. Seki C., Takashima I., Arikawa J., Hashimoto N. Monoclonal antibodies to Chi. psittaci: characteristics and antigenic analysis // Jap. Vet. Sc. 1988. -V.50. -№2. -P.383-393.
189. Stephens R.S., Kuo C.C. Chi. trachomatis species-specific epitope detected on mouse biovar outer membrane protein // Infect. Immunol. 1984. - V.45. -P.790-791
190. Storz J. Chlamydia and chlamydia-included diseases. Illinois, USA, 1971.
191. Telenius H., Clark J., Maraus E. et al. Minisatellite DNA profiles: rapid simple identification in Imlage analysis // Human Herdity. 1990. - V.40. - P.77-80.
192. Tsang V.C.W., Peralta J.M., Simons A.R. Enzyme-linked immunoelectrotransfer blot techniques (EITB) for studying the specificities of antigens and antibodies seperated by gel electrophoresis // Meth. Enzymol. -1983. V.92. -P.377-391.
193. Tuffrey M., Folder P., Thomas B., Taylor-Robinson D. The distribution and effect of Chi trachomatis in CBA mice inoculated genitally, intraarticularly or intravenoualy // Med. Microbiol, and Immunol. 1984. - V. 173. - №1. - P.29-35.
194. Van Zaane D., Ijzerman J. Monoclonal antibodies against bovine immunoglobulins and their use in isotype-specific ELISAs for rotavirus antibody // J. Immunol. 1984. - V.72. - №2. - P.421-441.
195. Watson, M. W., P. R. Lambden, and I. N. Clarke. 1991. Genetic diversity and identification of human infection by amplification of chlamydial 60-kilodalton cysteine-rich outer membrane protein gene. J. Clin. Microbiol. 29:1188-1193.
196. Wang S.P., Kuo C.C., Barnes R.C. et al. Immunotyping of Chi. trachomatis with monoclonal antibodies // J. Infect. Dis. 1985. - V.152. - №4. - P.791-800.
197. Wehr J. Zu einign Characteristika non Rinderchlamydia-enstammen // Wiss. Z. Humbold-Univ. Berlin Math. Naturwiss. R. 1980. - V.29. - №1. - S.25-32.
198. Wiedmann M., Wilson W.J., Crajka J. et al. // PCR Methods and Applications. 1994. - V.3. - № 4. - P.551-564.
199. Zummerman P.A., Lang-Unnasch N., Cullis A. Polymorphic regions in plant genomes detected by an M13 probe // Genome. 1989. - №32. - P.824-828.1. Ссылки на сайты Internet
200. База данных по молекулярной биологии Электронный ресурс./-2005 Режим доступа: http://www.ddbj.nig.ac.jp, свободный. Загл. с экрана.
201. Nucleotide Sequence Database Электронный ресурс./-2000 -. Режим доступа: http://www.ebi.ac.uk, свободный. Загл. с экрана.
202. Geneservice Электронный ресурс./-2006 -. Режим доступа: http://www.hgmp.mrc.ac.uk, свободный. Загл. с экрана.
203. Поисковая система SRS Электронный ресурс./-2003 Режим доступа: http://iaci.ru./b/chooa.htm, свободный. Загл. с экрана.
204. Поисковая система SRS Электронный ресурс./-2004 -. Режим доступа: http://www.per.ru.Bibliogr, свободный. Загл. с экрана.
205. LYTECH Электронный ресурс./-2005 -. Режим доступа: http://www.lytech.ru/lekcia/lekcial.htm, свободный. Загл. с экрана.
206. Хламидиоз животных Электронный ресурс./-2006 -. Режим доступа: http://chlamydiosis.narod.ru, свободный. Загл. с экрана.
207. BLAST Frequently Asked Questions Электронный ресурс./-2006 -. Режим доступа: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/, свободный. Загл. с экрана.
208. Поисковая система SRS Электронный ресурс./-2004 -. Режим дocтyпa:http://srs.ebi.ac.uk/srsbin/cgi-bin/wgetz, свободный. Загл. с экрана.
209. Поисковая система SRS Электронный ресурс./-2004 -. Режим доступа: http://srs.ddbj.nig.ac.jp/cgi-bin/wgetz, свободный. Загл. с экрана.
210. National Center for Biotechnology Information (NCBI) Электронный pecypc./-2006 -. Режим доступа: http://.ncbi.nlm.nih.gov, свободный. Загл. с экрана.
211. Multiple Sequence Aligment by CLUSTALW Электронный pecypc./-2006 -. Режим доступа: http://align.genome.jp/,свободный. Загл. с экрана.