Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Молекулярно-генетическая характеристика хламидий и экспресс-диагностика хламидиоза

На правах рукописи

ОБУХОВ ИГОРЬ ЛЕОНИДОВИЧ РГБ ОД

2 8 МАР 20^

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХЛАМИДИЙ И ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКА ХЛАМИДИОЗА

16.00.03,- Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2000

Работа выполнена в отделе вирусных препаратов Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов, лаборатории гибридных клеточных культур научно-исследовательского института вирусных препаратов РАМН, лаборатории молекулярной диагностики Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии МЗ РФ, лаборатории анатомии микроорганизмов научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Научные консультанты:

- доктор ветеринарных наук, профессор, член-корреспондент РАСХН А.Н.Панин;

- доктор биологических наук, профессор, Заслуженный ветеринарный врач РФ К.Н.Груздев

Официальные оппоненты:

- доктор биологических наук, профессор, Заслуженный деятель науки РФ В.В.Гуненков (ВГНКИ);

- доктор ветеринарных наук В.И.Белоусов (Департамент ветеринарии Минсельхозпрода РФ);

- доктор ветеринарных наук, Заслуженный ветеринарный врач РФ В.С.Слугин (ЗАО "Ветзвероцентр").

Ведущее учреждение:

Всероссийский научно-исследовательский институт защиты

животных (г. Владимир).

Защита состоится А/Р2000 г. в час. на заседании специализированного совета Дг120.85.01. при Всероссийском научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов по адресу: 123022, Москва, Звенигородское шоссе 5, ВГНКИ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНКИ.

Автореферат разослан марта 2000 г.

Ученый секретарь )

специализированного совета, -¿^У?

Заслуженный ветеринарный врач РФ, у//' ' / /

кандидат ветеринарных наук ^ Козырев Ю.А.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Хламидиозная инфекция широко распространена среди всех видов млекопитающих и птиц, наносит существенный экономический ущерб различным отраслям животноводства и птицеводства, вызывая гибель животных, патологию их воспроизводительных органов, аборты, рождение мертвого или нежизнеспособного приплода. Больные животные часто становятся источником инфекции работников животноводческих хозяйств. Распространенность возбудителей хламидиоза в природе среди диких животных и особенно птиц представляет постоянную угрозу спорадических заболеваний для людей, профессионально не занятых в сельском хозяйстве (Покровский В.И., 1982; 1983; А.З. Равилов с соавт., 1984; Ю.Д. Караваев, 1987; J.Storz, 1988; ААШаткин, 1990; D.Vanrompay et al„ 1995; А. Meijeret al„ 1998 ).

Особенностью хламидийной инфекции, значительно усложняющей эпизоотологический контроль за ней, является часто хроническое, со стертой клинической картиной или латентное течение. Поэтому, в системе проведения ветеринарно-санитарных мероприятий по своевременной специфической профилактике, а также лечению хламидиоза животных и людей важное значение имеет как можно более раннее и достоверное обнаружение возбудителя при разных формах заболевания. С этой целью на протяжении последних лет был разработан целый ряд лабораторных методов прямой и косвенной диагностики хламидиозов. В настоящее время общепризнанным эталоном для прямых методов выявления хламидий считается выделение возбудителя в культуре клеток. Однако этот метод имеет недостатки, существенно затрудняющие его широкое использование в практической ветеринарии. Прежде всего, это высокий риск инфицирования персонала и необходимость проведения работ по выделению возбудителя в специальной лаборатории. Кроме того, культуральный метод трудоемок и занимает много времени (Вяянанен П., 1987; A.J.Herring, 1993; D.Vanrompay et al., 1995; C.M. Black, 1997; R.S. Stephens, 1999).

В связи с этим предпринимаются попытки заменить метод культурального выделения хламидий другими методами их прямого обнаружения. Так, в последние годы большое распространение получил иммунологический метод, основанный на выявлении антигенов хламидий непосредственно в клиническом материале с помощью реакции прямой иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител. Данный метод не требует много времени для исследования, а также наличия живого возбудителя в пробе и позволяет выявлять не только корпускулярные антигены, входящие в состав морфологических структур возбудителя, но и растворимые, содержащиеся во включениях (А..В.Кутлин с соавт.,1990; A.Andersen, 1991; A.J.Herring, 1993; M.Domeika et al., 1994;

H.T.Daugharty et al., 1997; C.M. Black, 1997; R.S. Stephens, 1999). Поэтому, получение методом гибридомной технологии моноклональных антител к C.psittaci и разработка на их основе диагностикума для внедрения в практику - является актуальной задачей отечественной ветеринарии.

Однако общепринятые методы диагностики и типирования хламидий, основанные на фенотипическом выражении биологических свойств, не всегда дают объективную характеристику циркулирующих штаммов (K.D.E. Everett et al„ 1999; F.R. Rurangirwa et al., 1999).

В настоящее время в микробиологии получили широкое применение молекулярно-генетические методы, характеризующие возбудителей инфекционных заболеваний,по особенностям их генетической структуры. Их применение для характеристики хламидий позволяет устанавливать внутривидовые различия между штаммами микроорганизмов по особенностям нуклеотидного состава ДНК, характеризовать штаммовый состав популяции и следить за распространением инфекции (R.G.Hewinson et al., 1991; S.M.Holland et al., 1992; A. Meijeret al., 1997; S.Morre et al., 1998; K.D.EiEverett et al., 1999).

* Одним из наиболее перспективных методов прямой диагностики инфекций следует считать специфическую амплификацию нуклеиновых кислот in vitro и, в частности, наиболее разработанный вариант этой амплификации — метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Уже в первых работах, посвященных применению ПЦР для обнаружения хламидий, отмечены чрезвычайно важные для диагностики хламидиозов особенности этого метода: высокая чувствительность и специфичность, способность идентифицировать виды хламидий (D.R. Pollard et al., 1989; J.D.Corcish, B.J. Bevan, 1991; Rasmussen S.J., Timms P., 1992; B.Kaltenboeck et al., 1992; 1993; T.O.Messmer et al., 1997; K.D.E. Everett et al., 1999; F.R. Rurangirwa et al., 1999). Дополнительная информация о разновидности возбудителя, получаемая методом ПЦР, позволяет проводить эпизоотологический контроль и предотвращать распространение опасных штаммов хламидий. Однако завышенная стоимость импортных ПЦР-наборов не позволяет широко использовать данный метод в практике. Поэтому создание недорогих и качественных отечественных тест-систем для обнаружения хламидий является актуальной задачей.

1.2. Цель и задачи исследований. Цель исследований - изучить биологические свойства хламидий, разработать тест-системы для экспресс-диагностики хламидиоза и определить внутривидовые различия между штаммами хламидий.

Основные задачи исследования:

• Выделить штаммы возбудителей хламидиоза кошек и собак, изучить их биологические свойства;

• Провести электронно-микроскопические исследования ультраструктуры C.psittaci и изучить характер взаимодействия

возбудителя с культурой клеток МсСоу и с развивающимися куриными эмбрионами;

• Получить моноклональные антитела к различным антигенным детерминантам C.psittaci и изучить их биологические свойства;

• Разработать на основе моноклональных антител, меченных флуоресцеинизотиоцианатом экспериментальный диагностический препарат для выявления хламидий методом прямой иммунофлюоресценции;

• Сравнить эффективность полученного диагностикума с аналогичным коммерческим препаратом зарубежного производства;

• Разработать тест-систему методом ПЦР для диагностики хламидиоза у животных;

• Разработать тест-систему методом ПЦР для диагностики и идентифицикации C.psittaci в клиническом материале от разных видов сельскохозяйственных животных и птиц;

• Разработать тест-систему методом ПЦР для диагностики и идентифицикации C.pecorum в клиническом материале от разных видов сельскохозяйственных животных;

• Адаптировать метод генотипирования - рестрикционный анализ и изучить возможности его применения для внутривидовой дифференциации хламидий.

1.3. Научная новизна работы. Впервые в РФ выделены и идентифицированы штаммы возбудителей хламидиоза кошек и собак (К-1; С-1), изучены их биологические свойства. Новизна исследований подтверждена получением патента "Штамм Chlamydia psittaci, используемый для изготовления инактивированной вакцины против хламидиоза кошек и пушных зверей" № 2122579 от 27.11.1998 г.

Получены лимфоцитарные гибридомы, стабильно секретирующие моноклональные антитела, направленные к родоспецифическим детерминантам C.psittaci, являющиеся основой для создания в РФ современной иммунодиагностики хламидиозов животных.

Выявлены моноклональные антитела, обладающие наибольшей эффективностью при обнаружении хламидийных антигенов в биологическом материале - Хла-К-1 (lgG1), направленные к консервативным эпитопам основного белка внешней мембраны хламидий (МОМР) и обладающие высокой чувствительностью (100 м.к./мл) и 100% специфичностью.

На «Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus L., используемый для получения моноклональных антител к Chlamydia» получено положительное решение о выдаче патента на изобретение № 98123923/13 от 25.01.2000 г.

Впервые в РФ на молекулярно-генетическом уровне изучены и типированы штаммы и изоляты хламидий, выделенные от животных. На

основе анализа 26 последовательностей ДНК гена МОМР хламидий выбраны оригинальные праймеры, позволяющие дифференцировать виды C.psittaci и C.pecorum методом ПЦР. Чувствительность реакции составила 10 геномов бактерий в пробе при фоновой нагрузке ДНК быка, взятой в количестве, эквивалентном 100000 клеток.

Адаптирован метод генотипирования - рестрикционный анализ с применением ПЦР и определены возможности его применения для внутривидовой дифференциации хламидий. Показано, что популяция хламидийной инфекции у животных гетерогенна по генетической структуре.

1.4. Практическая значимость работы. Предложена и внедрена в ветеринарную практику инактивированная культуральная вакцина против хламидиоза кошек, собак и пушных зверей, изготовленная на основе штаммов, выделенных нами от естественно зараженных кошек и собак (ТУ и наст, по применению утв. Департаментом ветеринарии в 1999 г.). Штаммы депонированы во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве "Chlamydia psittaci К-1 ДЕП" № 87/274 от 22.01.1996 г. и "Chlamydia psittaci С-1 ДЕП" № 86/274 от 22.01.1996 г.

Разработан и впервые внедрен в ветеринарную практику отечественный диагностикум для выявления антигенов хламидий методом прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) в патологическом материале от сельскохозяйственных животных и птиц (ТУ и наст, по применению утв. Департаментом ветеринарии в 1999 г.). Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus L. - продуцент моноклональных антител к Chlamydia депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве с присвоением наименования «Штамм гибридомы Хла-К-1-ДЕП» от 15.04.1996 г.

Впервые в РФ разработаны и внедрены в ветеринарную практику ПЦР-тест-системы для диагностики и идентификации разных видов хламидий, обладающие высокой таксономической специфичностью (ТУ и наст, по применению утв. Департаментом ветеринарии в 1999 г.).

Детекция хламидий методом ПЦР в патологическом материале впервые включена в «Наставление по диагностике орнитоза (хламидиоза) у птиц», утвержденное Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года и «Методические указания по лабораторной диагностике хламидийных инфекций у животных», утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 30 июня 1999 года.

Использование методов ПИФ и ПЦР в диагностических ветеринарных лабораториях, дает возможность быстро и надежно установить диагноз на хламидиоз, что приведет к своевременной эффективной терапии и научно обоснованной профилактике этого заболевания.

Метод рестрикционного анализа с применением ПЦР позволяет получать дополнительную информацию о разновидности возбудителя,

проводить эпизоотологический контроль л предотвратить распространение опасных штаммов хламидий на территории РФ.

1.5. Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на: Всероссийской научной конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 1996); Всероссийской научной конференции "Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных" (Москва, 1996); VIII Международном симпозиуме по ветеринарной лабораторной диагностике (Иерусалим, 1996); 2-ой Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции" (Москва, 1997); Всероссийской научной конференции "Актуальные вопросы ветеринарно-санитарного обеспечения в мясной отрасли" (Москва, 1997); Всероссийской научной конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных" (С.-Петербург, 1997); 2-ой Всероссийской конференции "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний" (Москва, 1998); 2-ой Международной конференции "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" (С.-Петербург, 1998); Методических советах по вирусологии ВГНКИ (Москва, 1993-1998); Межлабораторном совещании сотрудников ВГНКИ (Москва, 1999); 3-ей Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика в современной медицине" (Москва, 2000)

Диагностические препараты экспонировались в павильонах "Ветеринария" и "Микробиология" ВДНХ РФ и отмечены золотыми медалями.

1.6. Публикации по теме работы. По теме диссертации опубликовано 47 статей, в том числе монография "Хламидиоз кошек" (Москва, 1994, 5,4 п.л.). Получены один патент и одно положительное решение о выдаче патента на изобретение. Разработаны 5 наставлений по применению, 5 технических условий, 8 методических указаний, наставление по диагностике орнитоза и правила по профилактике и борьбе с орнитозом.

1.7. Основные положения диссертации, выдвигаемые на защиту;

1. Выделение штаммов возбудителей хламидиоза кошек и собак в куриных эмбрионах и культуре клеток;

2. Получение гибридомы - продуцента моноклональных антител к антигенам C.psittaci и разработка диагностического набора методом прямой иммунофлюоресценции;

3. Разработка тест-систем для диагностики хламидиоза и идентификации C.psittaci и C.pecorum у разных видов сельскохозяйственных животных и птиц;

4. Внутривидовое генотипирование хламидий с помощью рестрикционного анализа.

1.8. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 351 странице машинописного текста, включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, указатель литературы (всего 375 источников, в том числе 298 иностранных). Диссертация иллюстрирована 34 таблицами и 32 рисунками. В приложении представлено 22 документа, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую значимость.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы Работа выполнена в отделе вирусных препаратов Всероссийского научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов, лаборатории гибридных клеточных культур научно-исследовательского института вирусных препаратов РАМН, лаборатории молекулярной диагностики Центрального научно-исследовательского института эпидемиологии МЗ РФ, лаборатории анатомии микроорганизмов научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

При проведении исследований были использованы следующие штаммы разных видов хламидий из коллекции клеточных культур ВГНКИ, ВНИВИ (г.Казань), ВИЭВ им. Я.Р.Коваленко, НИИЭиМ им. Н.Ф.Гамалеи, НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского, а также ДНК от разных штаммов хламидий любезно предоставленная B.Kaltenboeck (США). Штаммы C.psittaci:

1. Штамм - К-1 (возбудитель хламидиозного конъюнктивита кошек);

2. Штамм - С-1 (возбудитель хламидиозного конъюнктивита собак);

3. Штамм - Storz (возбудитель хламидиозного аборта овец);

4. Штамм - К-8 (возбудитель хламидиозного аборта овец);

5. Штамм - Калининский (возбудитель хламидиозного аборта овец);

6. Штамм - Урманаево-70 (возбудитель хламидиозного аборта овец);

7. Штамм - ПП-87 (возбудитель хламидиозного аборта песцов);

8. Штамм - КС-93 (возбудитель хламидиоза собак);

9. Штамм - БЛ-84 (возбудитель хламидиоза лисиц);

10. Штамм - Ростиново-70 (возбудитель хламидиозного аборта овец);

11. Штамм - Лори (возбудитель орнитоза птиц).

Штаммы C.trachomatis:

1. S45 (возбудитель хламидиоза свиней);

2. L-2 (возбудитель венерической лимфогранулемы);

3. MOPN (хламидийная пневмония мышей)

ДНК штаммов C.psittaci:

1. Avian 2b, 1978 (возбудитель хламидиозного аборта овец);

2. Avian 2b, 1981 (возбудитель хламидиозного аборта овец);

3. В 577 (возбудитель хламидиоза к.р.с.);

4. ММ (возбудитель орнитоза птиц);

5. 6ВС (возбудитель орнитоза птиц);

6. Рерп (возбудитель хламидиозного конъюнктивита кошек).

ДНК штаммов С.ресогит: 1. 66Р130 (возбудитель хламидиоза к.р.с.); 2.1.\Л/613 (возбудитель хламидиоза к.р.с.); 3. 1710Э (возбудитель хламидиоза свиней); 4.1.71 (возбудитель хламидиоза свиней).

Исследования проводили с помощью вирусологических (инфицирование КЭ, культур клеток, животных), иммунологических (ПИФ, НРИФ), морфологических (окраска по Романовскому-Гимзе), серологических (РСК, ИФА), физических (центрифугирование, электронная микроскопия) и молекулярно-биологических (полимеразная цепная реакция, рестрикционный анализ) методов, согласно методическим указаниям по лабораторной диагностике хламидийных инфекций у животных №13-7-2/643, утвержденными Департаментом Ветеринарии 30.06.1999 г.

Расчет инфекционного титра хламидий производили по методу Рида и Менча (1938).

Работа проводилась совместно: с сотр. НИИ Вирусных препаратов: зав. лабораторией гибридных клеточных культур д.м.н. Ф. Г. Нагиевой, в.н.с. к.б.н. Е. П. Барковой; с сотр. ЦНИИЭ: н.с. Г.А. Шипулиным, н.с. О.Ю.Шипулиной; с сотр. НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи: зав. лабораторией анатомии микроорганизмов к.б.н. Л.В. Диденко, ст.н.с. к.б.н. Н.Д. Константиновой.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1.Выделение хламидий в развивающихся куриных эмбрионах

Для выделения хламидий в развивающихся куриных эмбрионах от больных кошек и собак в качестве первичного инфекционного материала использовали соскобы с конъюнктивы. Каждым материалом, отдельно, заражали по 6-8, 6-7-дневных куриных эмбрионов в желточный мешок.

Для получения мазков-отпечатков желточной оболочки куриные эмбрионы с признаками их малой подвижности или гибели не ранее, чем через 3 суток после заражения, вскрывали, извлекали желточный мешок и готовили препараты для окраски по Романовскому-Гимзе. Также делали мазки-отпечатки с желточной оболочки отдельных живых, подвижных эмбрионов, вскрытых в более поздние сроки после заражения (10-12 сутки). При отсутствии признаков наличия хламидий проводили слепые пассажи желточного материала, в которых повторяли данную процедуру. При выявлении морфологических структур хламидий, наличие которых обычно сочеталось с летальностью куриных эмбрионов, устанавливался положительный результат диагностического выделения. При отсутствии этих показателей на протяжении 2-3 слепых пассажей, опыт прекращали и результаты оценивали, как отрицательные.

В положительных случаях морфологические структуры хламидий определялись в мазках-отпечатках преимущественно в виде темно-синих и розовых микроколоний на фоне голубой цитоплазмы клеток. На стадии элементарных телец включения хламидий окрашивались в розовый цвет, на стадии ретикулярных телец, соответственно, в синий.

Отмеченные выше показатели в мазках-отпечатках желточных мешков незараженных куриных эмбрионов не определялись. Инфекционный титр штаммов хламидий достигал 105-107ЭЛД5о/0,3 мл.

В "положительных" случаях, регулярная специфическая летальность куриных эмбрионов, определялась лишь в 5 опытах при первичном заражении куриных эмбрионов и 11 опытах - на 1-2 пассаже. В остальных 4 опытах положительного диагностического выделения по морфологическому критерию гибель зараженных эмбрионов оставалась нерегулярной в пределах 2-3 пассажей.

Среди контрольных незараженных куриных эмбрионов, которые находились вместе с опытными партиями, иногда наблюдалась неконтролируемая единичная летальность, не сопровождающаяся ни в одном случае положительными данными определения морфологических структур хламидий в мазках-отпечатках желточных оболочек этих эмбрионов.

Положительные результаты диагностического выделения хламидий от больных кошек и собак отражают частоту безусловной инфицированности конъюнктивы активным жизнеспособным патогенным агентом.

Было интересно, сравнить показатели, получаемые параллельно испытанными диагностическими тестами: выявлением в соскобных препаратах морфологических структур хламидий - при окраске по Романовскому-Гимзе и выделение хламидий в клетках желточной оболочки куриного эмбриона у кошек с признаками конъюнктивита.

Установлено, что диагностическое выделение хламидий в куриных эмбрионах было достигнуто в 21-ом образце материала, давших положительный результат в морфологическом методе исследования только в 12 случаев.

Полученные данные позволяют подтвердить ранее высказанное предположение о том, что отрицательные результаты, получаемые при выявлении морфологических структур хламидий в пораженных клетках исследуемого материала в световом микроскопе не исключают инфицированности кошек патогенным агентом.

Диагностическое выделение хламидий при "неспецифических" конъюнктивитах, является несомненно необходимым инструментом в комплексной лабораторной диагностике хламидиоза у кошек и собак, направленной на изучение спектра инфекционной патологии животных, а также первым этапом для получения лабораторных штаммов микроорганизма, необходимым для разработки средств специфической профилактики.

3.2.Выделение хламидий в культуре клеток McCoy

Как известно, хламидии - облигатные внутриклеточные микроорганизмы, поэтому традиционные методы бактериологической диагностики, используемые для других бактерий не могут быть реализованы в связи с тем, что хламидии не размножаются в бесклеточных питательных средах. Вследствие этого культуральная диагностика хламидиозов базируется на методах, используемых при диагностике других внутриклеточных паразитов-вирусов и риккетсий.

Критерием диагностического выделения хламидий из конъюнктивы больных животных являлось установление в клетках зараженной культуры McCoy цитоплазматических включений при окраске препаратов по Романовскому-Гимзе. Оценку результатов выделения хламидий, как правило, проводили через 48-72 часа после первичного заражения культуры.

При обследовании 87 животных с признаками конъюнктивита культуральным методом, хламидийная этиология заболевания, по данным диагностического выделения хламидий была установлена у 39 животных (36 кошек и 3 собак), что составляло 44,8% обследованных. Однако если исключить 12 образцов с бактериальной контаминацией, которые были не учтены вследствие неэффективности использованных антибиотиков в отношении сопутствующей микрофлоры, то показатель чувствительности рассматриваемого метода в отношении выявляемое™ хламидийных инфекций среди "неспецифических" конъюнктивитов кошек и собак будет выше, достигая 58,6%.

Показатель частоты положительных случаев диагностического выделения хламидий в культуре клеток от кошек и собак при хламидиозе, зависит от удельного веса хламидийной инфекции в обследуемых популяциях и от чувствительности используемой культуральной системы. Приведенные нами данные показывают сравнительно высокую чувствительность метода выделения хламидий в культуре клеток McCoy от кошек и собак и довольно высокий уровень наблюдаемой у животных инфекции хламидийной этиологии.

Сравнительные показатели чувствительности культурального метода и метода индикации хламидий в соскобных препаратах при окраске образуемых ими цитоплазматических включений по Романовскому-Гимзе, показало, что наименьшая частота обнаружения хламидий при конъюнктивитах и уретритах хламидийной этиологии у животных характерна для метода выявления морфологических структур возбудителя -его цитоплазматических включений.

Учитывая высокую специфичность культурального метода, следует отметить, что постановка его трудоемка, сложна и требует не только специального обеспечения, но и длительного времени (до 10 суток).

Хламидийные конъюнктивиты и поражения урогенитального тракта у животных не патогномоничны, поэтому широкое распространение

возбудителя инфекции среди домашних животных связано с атипичными и бессимптомными формами заболевания.

Следовательно, учитывая особенности течения хламидийной инфекции среди домашних животных, в частности кошек и собак, частоту различных осложнений, а также алиментарный и половой путь передачи возбудителя инфекции, важное практическое значение приобретают экспресс-методы прямой диагностики хламидиозов, которые способствуют ранней постановке диагноза и своевременному проведению более рациональных лечебно-профилактических мероприятий.

3.3.Изучение патогенности штаммов К-1 и С-1

Патогенность выделенных хламидийных штаммов К-1 и С-1 определяли на белых мышах, беременных морских свинках, кошках и собаках.

Для заражения белых мышей использовали штаммы К-1, С-1 в дозе 1О5'0ЭЛД50/О,3 мл внутрибрюшинно, контрольной группе вводили аналогичным методом 0,3 мл 10% суспензии желточных мешков незараженных КЭ. Первые клинические признаки хламидиоза у мышей наблюдали на 4-7 сутки после заражения, а их гибель - на 8-10 сутки. Штаммы К-1, С-1 вызывали 100% заболеваемость животных, а в 80% -летальный исход.

Для сравнения определяли патогенность штаммов К-1 и С-1 на беременных морских свинках. Опытную группу животных заражали внутрибрюшинно в объеме 1 мл в дозе 104°ЭЛД5о/0,3 мл. Морские свинки заболевали на 3-4 сутки после заражения. На 6-8 сутки у всех 16 свинок наблюдали аборты и гибель на 10-12 сутки.

При просматривании мазков-отпечатков из органов (селезенка, печень, легкие, мозг) павших лабораторных животных в световой микроскоп под иммерсионным объективом, наблюдали следующую картину: цитоплазматические включения представляли собой компактные или рыхло расположенные зернистые массы, содержащие морфологические структуры возбудителя на разных этапах его размножения. Они часто определялись вблизи ядра, нередко смещая его к периферии клетки, имели разнообразную форму, отличаясь по цвету и внутренней структуре от ядра и цитоплазмы. Мелкие, ранние включения, содержащие крупные тельца со средним диаметром от 0,5 до 1,2 мкм имели сине-фиолетовый цвет, крупные включения, содержащие преимущественно мелкие зернистые структуры возбудителя имели розово-красный цвет. Обычно в одной клетке выявлялись включения хламидий разной степени зрелости и различной плотности, расположения. Нередко, при рыхлом расположении морфологических структур микроорганизма, обнаруживалась содержащая их вакуоль (рис. 1).

Рис.1. Хламидийные включения в эпителиальных клетках селезенки морской свинки. Окраска по Романовскому-Гимзе. х 900

В сыворотке крови зараженных морских свинок выявлены комплементсвязывающие антитела в титрах 1:64-1:128, при отсутствии последних в контрольной группе. Штаммы К-1, С-1 вызывали 100% заболеваемость морских свинок и в 80% - летальный исход.

Для дальнейшего изучения патогенности штаммов К-1, С-1 на животных в опыт взяли 10 кошек. У всех кошек специфические титры антител отсутствовали. Первая группа кошек была инфицирована внутримышечно штаммом К-1 в объеме 1 мл, в дозе 1050ЭЛД5о/0,Змл, вторая группа аналогично инфицирована штаммом С-1. Две кошки первой и второй групп абортировали на 8-14 сутки после заражения и две кошки из каждой группы родили ослабленное потомство, больное хламидиозом (развитие неонатального конъюнктивита). При исследовании сывороток крови, обнаружены комплементсвязывающие антитела в титрах 1:64-1:128 при отсутствии последних у кошек контрольной группы. Дальнейшее исследование показало, что штаммы К-1 и С-1 патогенны и для собак.

Для этого использовали 9 собак. По три собаки инфицировали внутримышечно штаммами К-1 и С-1, в объеме по 1 мл (Ю50ЭЛД 50/0,3 мл) каждого. Контрольной группе вводили 10% суспензию стенок желточных мешков незараженных КЭ, 1 мл - внутримышечно. На 5-7 день у зараженных собак наблюдали серозный конъюнктивит, ринит, незначительное повышение температуры до 39,2-39,5 °С и вялость. В сыворотках крови - обнаружены комплементсвязывающие антитела в титрах 1:64-1:128, при отсутствии последних у животных контрольной группы.

На основании проведенных исследований можно сделать заключение, что штаммы К-1 и С-1 вызывают заболевание и гибель лабораторных животных и являются патогенными для естественных хозяев-

кошек и собак, вызывая аборты и рождение ослабленного, больного хламидиозом потомства.

3.4.Ультраструктурная характеристика Chlamydia psittaci

При изучении штамма К-1 в куриных эмбрионах и в культуре клеток четко различались вегетативные, промежуточные и спороподобные формы (рис. 2).

На ультратонких срезах инициальные тельца представляли собой кокки, ограниченные двухконтурной цитоплазматической мембраной и содержащие большое количество рибосом. Отдельные кокки имели электронно-плотную зону - нуклеоид. Размер инициальных телец С.psittaci колебался от 0,5 до 0,7 мкм. Элементарные тельца (спороподобные формы) имели меньший размер (поперечник около 0,3 мкм) без жгутиков, фимбрий и пилей.

Первые включения хламидий, видимые в световом или люминесцентном микроскопе появлялись в инфицированных клетках, как правило, через 10-12 часов после заражения.

. При массивном заражении (обычно применяющемся в электронно-микроскопических экспериментах) в одной клетке может сначала образоваться несколько включений, которые затем часто сливаются в одно.

Рис.2. Клетки McCoy, зараженные штаммом К-1 C.psittaci. В фаголизосоме ретикулярные тельца, промежуточные тельца с уплотненным нуклеоидом и элементарные тельца, х 70000

Зрелые включения у штамма К-1 C.psittaci, заполняли обычно большую часть цитоплазмы клетки-хозяина. При этом ее ядро не

претерпевает существенной деформации. Цитоплазма, окружающая зрелое включение, имела вид узкого ободка уже через 48 часов после заражения и сохранялась в виде достаточно широких зон. Форма включения была достаточно разнообразной: от неправильной, разветвленной и как бы дольчатой, до округлой или овальной с извилистыми или ровными краями.

В зрелых включениях C.psittaci, наблюдаемых в ультратонких срезах, отдельные клетки хламидий упакованы достаточно плотно. Плотность упаковки хламидий во включении у штамма К-1, как правило, не менялась в зависимости от срока инфекции. Тем не менее, на одном и том же сроке инфекции (как по сроку после заражения, так и по соотношению ретикулярных и элементарных телец) плотность хламидий во включении варьировала от очень плотной упаковки до достаточно свободной.

Через 48-72 часа после заражения видно, что мембрана окружающая включение штамма К-1 C.psittaci, часто не выявляется, однако включение при этом сохраняет свою морфологическую целостность. Разрыв мембраны включения происходил в наших опытах только непосредственно перед выходом хламидий из клетки, на самых поздних стадиях их цикла развития.

Таким образом, исследования, проведенные на модельных системах in vitro в условиях, исключающих неконтролируемые воздействия организма хозяина, подтверждают и устанавливают ряд общих морфо-функциональных закономерностей внутриклеточного паразитизма хламидий.

3.5.Изучение длительности хранения хламидийного штамма К-1 Инфекционная активность штамма К-1 с титром 6,5 1д ЭЛД50/О,3 мл в нативном состоянии сохранялась на высоком уровне в течение девяти месяцев лишь при температуре минус 196 °С. В этом случае снижение титра не превышало 0,3 !д ЭЛД50/0,3 мл. При хранении материала при температуре минус (20-30) сС возбудитель кошачьего хламидиоза сохранял свои исходные инфекционные свойства лишь в течение 1 месяца, через 2,5-4 месяца титр снижался уже на 0,9 1д ЭЛД50/0,3 мл, а через девять месяцев - на 3,6 1д ЭЛД 50/0,3 мл.

Неблагоприятными условиями хранения для штамма К-1 в нативном состоянии являлась температура (4-8) °С. При этом наблюдалось резкое снижение титра уже через месяц, а через 9 месяцев данный показатель достигал 3,9 1д ЭЛД50/0,3 мл. Хранение образцов при температуре (1820) °С приводило к резкому снижению инфекционной активности возбудителя через 15 дней (нативный материал) и через 3 месяца (лиофилизированный материал). Титр штамма К-1 в нативном состоянии составлял 1,0-1,5 !д ЭЛД5О/0,3 мл через 1 месяц хранения и в лиофилизированном состоянии через 9 месяцев (титр штамма до закладки на хранение был 5,5-6,5 1д ЭЛД50/0,3 мл).

Испытание различных сред высушивания - фосфатно-буферного раствора с 7% сахарозы (ФБР-С), фосфатно-буферного раствора с

2% пептона (ФБР-П), молока, ВГНКИ №3 - для лиофилизации показало, что инфекционная активность штамма К-1 сохранялась в течение года с титром 5,5 lg ЭЛД50/0,3 мл при использовании в качестве стабилизатора ФБР-С и ФБР-П при температуре минус 196 "С в течение одного года, в то время, как при использовании молока и ВГНКИ №3 титр штамма снижался через 3, 6, и 9 месяцев на 0,5; 2,0; 3,0 lg и на 1,5; 2,8 и 3,5 lg, соответственно.

З.б.Получение моноклональных антител к антигенам Chlamydia psittaci и изучение их биологических свойств

В работе по получению м-АТ использовали штамм К-1 с учетом его высокой антигенной активности, описанной ранее.

В качестве доноров антителопродуцирующих селезеночных клеток использовали самок мышей линии BALB/c с массой 10-12 г. Антиген в дозе 100 мкг белка на инъекцию в полном адъюванте Фрейнда вводили внутрибрюшинно, двукратно, с двухнедельным интервалом. Бустерную иммунизацию проводили через 1 месяц за три дня до слияния, используя ту же дозу антигена в физиологическом растворе. Антиген инъецировали в интраорбитальный венозный синус в объеме 0,1 мл и внутрибрюшинно -0,2 мл.

... В эксперименте по слиянию клеток мышиной лимфоцитарной линии NSO использованы спленоциты от 3-х мышей линии BALB/c. Скрининг м-АТ проводили в ИФА с пассивно сорбированными антигенами: со специфическим из элементарных телец хпамидий и с неспецифическим, названным нами "нормальным" антигеном, приготовленным из неинфицированных желточных оболочек КЭ. Из общего числа 215 выращенных гибридных клонов, 12 клонов (5,6%) продуцировали м-АТ, реактивные только в отношении специфического антигена, 11 клонов (5,1%) продуцировали м-АТ, которые связывались с обоими антигенами и м-АТ 5 клонов (2,3%) были реактивны только в отношении "нормального" антигена.

Из 12 м-АТ наибольшую группу (10) составили м-АТ изотипа G1 и по одному м-АТ изотипов G2b и G3. Все м-АТ не обладали комплементсвязывающей активностью. М-АТ были активны в ИФА (титр варьировал от 1:80 до 1:2000), РНИФ и не преципитировали специфические антигены. Три гибридомы - Хла-К-1, Хла-К-11 и Хла-К-12 были клонированы методом предельного разведения, выращены в массовую культуру в большом объеме и использованы для получения асцитической жидкости на сенсибилизированных пристаном мышах линии BALB/c 2-2,5-месячного возраста. Асцитические жидкости очищали сульфатно-каприлатным методом (Reik L.M., 1987). М-АТ эффективно конъюгировались с пероксидазой хрена. Активность пероксидазных конъюгатов на основе м-АТ коррелировала с активностью немеченых м-АТ. В табл. 1 представлены результаты определения активности и специфичности пероксидазного конъюгата на основе м-АТ Хла-К-1. В качестве антигенов исследованы инфицированные различными штаммами C.psittaci и C.trachomatis

неочищенные желточные оболочки КЭ. Данные табл. 1 иллюстрируют высокую активность и специфичность пероксидазного конъюгата как в отношении штаммов С.рвШай, так и СДгасЬотайз.

Таблица 1

Активность и специфичность пероксидазного конъюгата на основе м-АТ Хпа-К-1

Исследуемые антигены ОП492 при разведениях конъюгата

(обратная величина)

200 800 3200

C.psittaci

К-1 1,98 1,75 1,41

БЛ-84 1,54 1,10 0,25

ПП-87 1,28 1,37 0,25

С-1 1,35 1,15 0,37

Урманаево 1,46 1,27 0, 95

Ростиново-70 1,65 1,53 0,43

Лори 1,73 1,44 0,57

C.pecorum 1,49 1,38 0,89

Е 58

C.trachomatis

Серовар L2 1,12 0,82 0,63

Staphylococcus aureus 0,25 0,17 0,13

Вирус герпеса простого тип I 0,17 0,12 0,16

Mycoplasma pneumoniae 0,14 0,10 0,12

Взвесь желточных оболочек

интактных КЭ 0,08 0,05 0,02

Далее представляло интерес изучить возможность использования м-АТ и м-АТ-конъюгатов для выявления хламидийного антигена при постановке ИФА в прямом "сэндвич" варианте. С этой целью в лунки планшета вносили различные типы м-АТ в концентрации 1 и 10 мкг на лунку на 18-20 часов при 4 °С. В качестве испытуемого антигена использовали суспензию частично очищенных элементарных телец С-рвМаа, инактивированных формалином. Различные разведения антигена вносили в лунки с иммобилизованными м-АТ и после часового контакта при 37 °С иммунный комплекс проявляли различными м-АТ - пероксидазными конъюгатами в рабочем разведении. Установлено, что концентрация м-АТ, равная 1 мкг на лунку, была более оптимальной для "захватывания" антигена по сравнению с дозой 10 мкг на лунку. Наиболее эффективно "захватывали" антиген м-АТ Хла-К-2 и Хла-К-3, т.е. позволяли обнаруживать

антигены даже в концентрации 0,05 мкг или 50 нг (табл. 2). Однако независимо от использованных «захватывающих» м-АТ пероксидазный м-АТ-конъюгат Хла-К-1 лучше выявлял иммунный комплекс.

При постановке ИФА и РНИФ с целью определения хламидийного антигена в органах экспериментально инфицированных животных использовали для ИФА м-АТ Хла-К-1 - пероксидазный конъюгат в рабочем разведении 1:800, а для РНИФ очищенные м-АТ Хла-К-1 в разведении 1:50. Результаты этих опытов, представленные в табл. 3 показали, что при помощи м-АТ можно выявить хламидийный антиген в патологическом материале в ИФА (титр антигенов варьирует от 1:5120 до 1:20480) и РНИФ.

Таблица 2

Выявление хламидийного антигена в ИФА с использованием моноклональных антител

"Захватывающие" м-АТ Концентрация белка (мкг/0,1 мл), выявляемая моноклональным пероксидазным конъюгатом

(мкг/0,1 мл) Хла-К-1 _| Хла-К-2 Хла-К-3

Хла-К-1 0,5 0,5

Хла-К-2 0,05 0,05 0,25

Хла-К-3 0,25 0,5 -

Таблица 3

Результаты исследования патологического материала при помощи МКА на содержание хламидийного антигена

Исследуемый материал (органы экспериментально инфицированных животных) Результат исследования в

ИФА (титр антигена) РНИФ

Легкие 1:10240 +

Почки 1:5120 +

Сердце 1:5120 +

Печень 1:10240 +

Селезенка 1:20480 +

В табл. 4 приведены результаты электрофоретического изучения белков С.рвМаа из штамма К-1 с последующим иммуноблотингом м-АТ к С.рБМаа.

Таблица 4

Результаты иммуноблотинга антигенов С.рэМаа из штамма К-1

Молекулярный вес белков Наименование м-АТ Изотип

ЗЭ^Да Хла-К-1

62 кДа Хла-К-11 в2Ъ

76 кДа Хла-К-12 вз

Для определения физико-химической природы антигенов, к которым направлены м-АТ, проведено испытание антител в ИФА с химической предобработкой антигена. Для перйодатного окисления антигена в пластины, с сорбированным корпускулярным антигеном (КА) С.рэМаа вносили 0,1 мл на лунку 0,5 М перйодата натрия в 0,01 М растворе ацетата натрия (рН 4,4) на 24 часа при 4 °С с последующей инкубацией 0,25 М сахарозы в 0,01 М Трис-НС1 буферном растворе (рН 7,2).

Для белкового переваривания антигена в пластины с сорбированным КА антигеном С.р$Маа вносили 0,1 мл на лунку протеиназы К в концентрации 50 мкг/мл в ФБР на 4 ч при 37 °С. Эти процедуры проводили перед блокировкой раствором 1% БСА пластин с сорбированным антигеном. В табл. 5 представлены результаты данного исследования.

Таблица 5

Определение физико-химической природы антигенов С.рэМаа' с помощью моноклональных антител

м-АТ Суб- Титр в Титр в ИФА после обработки

класс ИФА протеиназой К перйодатом №

Хла-К-1 1д61 1,64 0,050 1,72

Хла-К-11 1дС2Ь 1,15 0,042 1,08

Хла-К-12 1дСЗ 1,57 0,084 1,48

При испытании м-АТ в ИФА с КА, обработанным протеиназой К и перйодатом натрия выявлено, что м-АТ Хла-К-1, Хла-К-11 и Хла-К-12 направлены к детерминантам чувствительным к протеиназе К и резистентным к перйодату натрия, что подтверждает их белковую природу.

Для приготовления экспериментального диагностического препарата, выявляющего хламидии прямым иммунофлюоресцентным методом, были

отобраны м-АТ, обладающие наибольшей эффективностью при выявлении хламидийных антигенов в биологическом материале - м-АТ Хла-К-1 (lgG1), направленные к консервативным эпитопам белка внешней мембраны хламидий (МОМР).

Полученные м-АТ предварительно были тестированы в ИФА и РНИФ с антигенами других видов микроорганизмов. М-АТ Хла-К-1 не взаимодействовали с ЛПС Mycoplasma pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Brucella abortus и реагировали с использованными в работе штаммами хламидий.

3.7.Сравнение чувствительности и специфичности экспериментального диагностикума на основе флюоресцирующих моноклональных антител с зарубежными и отечественными аналогами Испытание экспериментальных серий диагностикума при анализе патологического материала от инфицированных белых мышей, показало, что специфичность набора ХламиОрн, определяющаяся по соотношению с положительными результатами культуральной диагностики хламидий, составила 100%. Результаты исследования мазков-отпечатков из паренхиматозных органов (селезенка, печень) белых мышей, инокулированных штаммом С-1, представлены на рис. 3.

Для сравнения чувствительности и специфичности экспериментального диагностикума ХламиОрн с аналогичными зарубежным и отечественным препаратами исследовали биологический материал от больных животных с использованием наборов JMAGEN Chlamydia (Англия) и ХламиСкан (Россия).

CA-«

<C CC f- - -

>* 4 1

t tut» * }

V' "Ф^Щ

5p* - £ "I

»-в* «4; г » » * *i - .

4, « Sv-

-ч < S V 'S'

Рис.3. Специфическое свечение хламидийного антигена в эпителиальных клетках паренхиматозных органов белых мышей. ПИФ-метод. х 2000

При исследовании патологического материала диагностикумом ХламиОрн и коммерческим набором JMAGEN Chlamydia совпадение

результатов наблюдали в 100% случаев. При исследовании препаратов диагностикумом ХламиОрн и отечественным коммерческим набором ХламиСкан результаты совпадали только в 80% случаев. В остальных 4 (20%) случаях ХламиОрн также выявил хламидии, ХламиСкан показал отрицательные результаты.

3.8. Разработка ПЦР-тест-систем для диагностики хламидиоза и идентификации C.psittaci и C.pecorum

Независимо от инфекции и клинического материала, ПЦР-анализ включает в себя три этапа - подготовка биологического материала к проведению ПЦР, амплификация и детекция продуктов реакции. Эффективность анализа зависит от каждого из этапов, однако наибольшее значение для достижения высоких показателей специфичности и чувствительности имеют удачный выбор мишени для амплификации и разработка праймеров.

Для ПЦР-диагностики хламидиозов животных и птиц использовались праймеры специфичные гену 16S рРНК (D.R. Pollard et al., 1989), гену обогащенного цистеином белка внешней мембраны массой 60 kDa (M.W.Watson et al., 1991), гену, кодирующему основной белок внешней мембраны - MOMP(J.D.Corcish et al., 1991; B.Kaltenboeck et al.,1992). В процессе этих работ было установлено, что ген МОМР содержит наибольшее количество информации о родовых, видовых и типовых отличиях хламидий и таким образом, является идеальной мишенью для ПЦР-диагностики хламидиозов.

В связи с этим данный ген был взят за основу для поиска видоспецифичных праймеров, позволяющих в прямом эксперименте идентифицировать C.psittaci и C.pecorum. Приступая к решению данной задачи, мы ориентировались на вариант ПЦР, заключающийся в повторной реамплификации гена-мишени с внутренними видоспецифичными праймерами. На роль внешних родоспецифичных праймеров были выбраны праймеры, предложенные и охарактеризованные B.Kaltenboeck et al., располагающиеся в консервативных областях по краям гена ^ИОМР и ограничивающие фрагмент длиной 1120 нуклеотидов. Поиск видоспецифичных праймеров проводили внутри этого фрагмента. С этой целью 26 нуклеотидных последовательностей размером 1068 п.н. получены из Банка генов (Genebank) и выравнены друг относительно друга с помощью системы ClastalW Multi Sequence Aligment с целью их последующего анализа на вариабельность и поиска консервативных участков, необходимых для выбора праймеров. В результате были обнаружены на З'-конце гена МОМР участки специфичные для видов C.psittaci и C.pecorum (рис.4), где были выбраны праймеры: Ob 2 - для детекции хламидии вида С. pecorum и ОЬЗ - для детекции хламидии вида С. psittaci. Дополнительный праймер, названный ОЫ, был выбран на 5'-конце гена МОМР и обладал специфичностью по отношению к обоим видам.

ЯСНОМ? ОЫ

VDI п |v#;rnj п vj>re

Ш I _I 1_1 . i..' --.л.

C6PI30

LWSI3 L7I

mos

ОЬ2 ,СНОМ?371

'оьэХ

Chlantgdia psittaci TGTTGGTGC AAC (TIT AAT CGA CCC TCA CAA A

Chlamydia peconan

CA.G. .A.....T. . .C.T. . T. . C. . T.

CA.G. .A.....T. . -C.T. . T. . C. . T.

CA.G..A.....T...C.T. .T.. C. . T.

. A.G. .A.....T. . .C.T. . 7, . C. . T.

A

T. . T

Рис.4.Схема построения гена МОМР с указанием последовательностей ДНК различных изолятов хламидий, использованных для выбора праймеров: транслируемая область гена выделена большой прямоугольной рамкой, II - лидерный пептид, VDI-VDIV - вариабельные домены, кодирующие антигенные детерминанты, 9СНОМР и СНОМР371-родоспецифичные праймеры.

Таким образом, согласно разработанной схеме ПЦР-детекции, после первой стадии ПЦР-амплификации с родоспецифичными праймерами проводится амплификация с одним общим и по отдельности с каждым из видоспецифичных праймеров. Длина амплифицируемых фрагментов гена МОМР составляла для C.psittaci - 1033 п.н., а для C.pecorum - 1036 п.н. Теоретическая специфичность предложенных праймеров была изучена с помощью компьютерных систем FASTA и BLASTA on line. В результате этой работы бы па показана гомология выбранных олигонуклеотидов с геном МОМР и не обнаружено их значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями других групп вирусов, бактерий или последовательностями эукариот. Таким образом, предложенные праймеры, исходя из теоретических расчетов, должны обладать 100% специфичностью. Необходимо отметить, что праймеры были выбраны на столь удаленном расстоянии друг от друга не случайно. При сравнительном анализе четырех консервативных областей мы остановили свой выбор на наиболее удаленных друг от друга последовательностях для того, чтобы в результате ПЦР получать фрагмент гена МОМР

максимальной длины - удобной для последующего рестрикционного —типирования.

3.9. Выбор методики выделения ДНК Чувствительность ПЦР-анализа при установленных оптимальных параметрах реакции зависит от процедуры подготовки исследуемого материала, включающей экстракцию ДНК-мишени и очистку пробы от веществ, ингибирующих ДНК-полимеразу. Для этого были выбраны несколько принципиально отличительных подходов, используемых в настоящее время различными исследователями для очистки тестируемого материала и выделения ДНК: 1) щелочной лизис с фенол-хлороформовой экстракцией и осаждением ДНК этанолом; 2) лизис неионными детергентами с протеиназой К; 3) лизис гуанидинтиоционатом с нуклеосорбцией на силикагеле.

После тестирования пяти штаммов С.рэМаа и С.ресогит было сделано заключение, что все указанные выше способы подготовки проб обеспечивают одинаковый уровень чувствительности - 10 м.к./мл. Однако, чтобы иметь полное представление об эффективности данных методов очистки ДНК-матриц необходимо было выявить хламидии в патологическом материале. ПЦР проводили с праймерами ОМ-ОЬЗ.

Наилучшие результаты получены при использовании методов нукпеосорбции с гуанидинтиоционатом и лизирующих буферов. Однако при использовании нуклеосорбента (1) с частицами силикагеля размером 0,510 мкм чувствительность метода была более высокая, чем при использовании нуклеосорбента (2) с частицами силикагеля 2-10 мкм. Следовательно, это свидетельствует о неодинаковой сорбционной активности испытанных марок силикагеля в отношении фрагмента гена МОМР, являющийся в данном случае ДНК-мишенью. Поэтому, очевидно, что нуклеосорбент (1) обеспечивает лучшую сорбцию за счет более оптимального размера частиц. Способ подготовки проб с помощью фенол-хлороформовой экстракции и осаждения нуклеиновых кислот этанолом был недостаточно эффективным, что наблюдалось в получении трех ложноотрицательных результатах, видимо вследствие возможности ингибирования реакции остатками фенола и потере ДНК на этапе преципитации. Также в одном случае способ подготовки проб, основанный на применении лизирующих буферов с протеиназой К, оказался неэффективным.

3.10. Определение аналитической специфичности и чувствительности ПЦР Специфичность разработанных праймеров была проверена при исследовании 18 штаммов, принадлежащих к 3 видам хламидий (табл. 6). В процессе серии экспериментов мы не обнаружили несоответствия между теоретически заданной специфичностью праймеров и результатами ПЦР, что дало возможность перейти к тестированию клинических проб. При этом

вся процедура одновременной детекции и дифференцирования видов С.рэМаа и С.ресогит занимала не более 3 часов, а чувствительность анализа достигала не менее 10 бактерий в пробе в присутствии фоновой нагрузки ДНК быка соответствовавшей 100000 эукариотических клеток.

Таблица 6

Специфичность ПЦР с парами праймеров (ОМ, ОЬ2) и (ОЫ, ОЬЗ) при исследовании штаммов С.рэЮаа и С.ресогит

Штаммы Видовая Результаты ПЦР

№ хламидий принадлежность Праймеры Праймеры

штамма ОЬ1, ОЬЗ ОЫ, ОЬ2

1 Avian 2b (1978) С. psittaci + -

2 Avian 2b (1981) С. psittaci + -

3 В 577 С. psittaci + -

4 MN С. psittaci + -

5 6BC С. psittaci + -

6 Storz С. psittaci + -

7 Урманаево-70 С. psittaci + -

8 Fepn С. psittaci + -

9 K-1 С. psittaci + -

10 C-1 С. psittaci + -

11 Лори С. psittaci + -

12 66P130 С. pecorum - +

13 LW613 С. pecorum - +

14 1710S С. pecorum - +

15 L71 С. pecorum - +

16 MOPN С. trachomatis - -

17 S45 С. trachomatis - -

18 L-2 С. trachomatis - -

Интересно отметить, что несмотря на то, что некоторые штаммы имели в области гена МОМР мутации, ослабляющие взаимодействие праймеров с ДНК-матрицей, мы не обнаружили существенных различий в чувствительности ПЦР при тестировании данных изолятов. Это свидетельствует об устойчивости используемых праймеров к имеющимся мутациям при соблюдении подобранных нами условий отжига.

В поставленном эксперименте продемонстрировано отсутствие перекрестных реакций с другими бактериями и 100% специфичность выбранных праймеров к изученным штаммам хламидий С.рэМаа и С.ресогит.

Таким образом, подобранные условия ПЦР и выбранные праймеры характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью, что позволяет использовать данный метод в практических условиях.

С целью определения аналитической чувствительности ПИФ и сравнения двух методов диагностики хламидийной инфекции - ПИФ и ПЦР, был проведен модельный опыт, в котором использовали разведения хламидий 104, 103, 102, 10, 1 хламидийная частица в 1 мл конъюнкгивальных экстрактов. Результаты исследований показали, что ПЦР обладает чувствительностью в 10 раз превосходящей ПИФ и выявляет 10 хламидийных частиц в тестируемой пробе.

3.11.Внутривидовая дифференциация штаммов C.psittaci методом рестрикционного анализа

Для получения четких электрофореграмм рестриктов необходимо было подобрать адекватную рестрикционную эндонуклеазу и условия проведения электрофоретического разделения рестриктов.

Условия проведения рестрикции в полиакриламидном геле варьировали: изучали разные количества ампликона и фермента, необходимые для рестрикции, время инкубации, концентрацию полиакриламида, напряжение электрического поля и время проведения электрофореза (табл. 7).

Четкое разделение продуктов рестрикции наблюдали при использовании ферментов Alul, BstUI и Cfol. Электрофореграммы рестриктов ампликонов с применением EcoRI были недостаточно четкие.

Таким образом, были отработаны условия проведения рестрикционного анализа. Затем с помощью программы Clone были построены теоретические рестриктные карты, полученные на основе рестрикции с различными штаммами хламидий.

Генотипирование с помощью рестрикционного анализа штаммов C.psittaci, выделенных от разных видов животных на территории РФ показало, что полученные рестрикты не всегда совпадали с построенными теоретическими рестрикционными картами и имели отличия. Так, штаммы К-8 и Калининский, были близки к теоретической карте штамма В 577, однако отличались отсутствием нескольких полос на уровне 100-50 п.н.

При рестрикции штаммов С. psittaci, перечисленных в разделе "Материалы и методы" под № 1-5, ферментом Alul были получены гомологичные рестриктные карты. Однако при использовании рестрикционной эндонуклеазы Cfol штаммы разделились на две рестрикционные группы, включающие: I - № 1, 5; II - № 2-4 (рис. 5).

Таблица 7

Отработка условий проведения рестрикционного анализа

Этапы рестрикционного анализа Условия проведения рестрикционного анализа

Изученные Оптимальные

Рестрикция Рестрикционные эндонуклеазы А1и1, С{Ы, В5Ш1, Есот А1и1, ВэШ!, Сйэ1

Концентрация ампликона (мкг) 200-400 300

Количество ампликона ^мкл) 2-5 3

Количество рестрикционной эндонуклеазы (ед) 1-3 2

Время проведения рестрикции (час) 1-3 2

Электрофорез в полиакриламидном геле Концентрация полиакриламида (%) 3-7 5

Напряжение электрического поля (В) 10-30 15

Размер полиакриламидного геля(смхсм) 10x10

Толщина полиакриламидного геля (мм) 1-2 1

Время проведения электрофореза (час) 1-3 2

Также были исследованы штаммы К-1 и Рерп. При тестировании этих штаммов С-рэМаа получены гомологичные рестриктные карты.

При рестрикции шести штаммов хламидий на рис. 6 показано, что популяция С.рэШай гетерогенна по генетической структуре.

Таким образом, полученные результаты показывают отличия между штаммами хламидий и свидетельствуют, что рестрикционный анализ является одним из необходимых инструментов для внутривидового типирования для получения объективной оценки циркулирующих штаммов микроорганизмов.

М 1 2 3 4 5

М 1 2 3 4 5 6М

-.л»:

Рис.5. Результаты

рестрикции штаммов С.рз1Нас1 ферментом Сйэ1

М - рестрицирозанная плазмида р11С-19 с длиной полос 502, 489, 404, 330, 242, 90, 142, 100,67;

1 - штамм "Урманаево-70";

2 - штамм ПП-87;

3 - штамм КС-93;

4 - штамм БЛ-84;

5 - штамм "Ростиново-70".

Рис.6. Результаты рестрикции ДНК штаммов хламидий ферментом А!и1

М - рестрицированная плазмида риС-18 с длиной полос 502, 489, 404, 353, 242, 90,142,100, 67; 1 - штамм 66Р130;

2-штамм 171 ОБ;

3- штамм 171;

4 - штамм Рерп;

5 - штамм В577;

6 - штамм 6ВС.

3.12.Сравнительная оценка методов лабораторной диагностики офтальмохламидиоза у кошек

Так как своевременная лабораторная диагностика является ведущим фактором в деле борьбы с хламидийной патологией, целесообразно было провести сравнительную оценку диагностической ценности ряда лабораторных тестов, широко применяющихся при диагностике хламидиозов.

Лабораторными методами обследовано 47 больных животных с клинически установленным или подозреваемым диагнозом "хламидиозный конъюнктивит".

На рис. 7 приведены данные по выявлению офтальмохламидиоза разными методами при однократном и одномоментном сборе материала для лабораторного исследования. Представленные показатели

характеризуют чувствительность и диагностическую информативность использованных лабораторных тестов.

Рис.7. Аналитическая чувствительность методов диагностики офтальмохламидиоза

Р-Г-40%

ПЦР-100%

Безусловным лабораторным подтверждением клинического диагноза-наличие текущей хламидийной инфекции - являются данные, получаемые путем непосредственного выявления этиологического агента в пораженных клетках при окраске по Романовскому-Гимзе (Р-Г), методом прямой иммунофлюоресценции (ПИФ), ПЦР и при диагностическом выделении хламидий из того же источника в культуре клеток (КК).

Сравнение диагностической значимости этих показателей убедительно показывает, что ориентация ветврачей только на традиционные методы выявления хламидий чревата гиподиагностикой и ее последствиями. Отсутствие хламидийных телец в исследуемом соскобном материале, окрашиваемом по Р-Г, не исключает хламидийной офтальмоинфекции, которая может быть выявлена методом ПИФ и ПЦР.

У обследованных больных животных РСК проявила низкую информативность, выявив комплементсвязывающие антитела только в 14 из 47 случаев, с преимущественными показателями титров 1:32-1:64.

Следует отметить, что только у 2 из 47 больных животных, при исследовании парных сывороток в РСК отмечалось 4-кратное увеличение титров антител. В остальных случаях уровень антител оставался стабильным как в период течения офтальмохламидиоза, так и спустя многие месяцы у реконвалесцентов.

Следовательно, хламидийные антитела не имеют ведущего значения в индивидуальной диагностике офтальмохламидиоза и в большинстве случаев являются лишь маркером как текущей, так и перенесенной хламидийной инфекции различной локализации.

Этиологический диагноз хламидийного уретрита или цервицита был установлен методом Р-Г у 8 (4%); методом ПИФ у 32 (68%) и методом ПЦР у 36 (76%) больных животных с офтальмохламидиозом, в том числе у 27 из 38 обследованных кошек и котов, у которых предполагалась возможность бессимптомной хламидийной инфекции (71%). Отрицательные результаты могли отражать предел чувствительности теста, использованного при однократном обследовании кошек и котов, другую природу воспалительного процесса, выявляемого в урогениталиях, а также отсутствие у этой группы собственного урогенитального резервуара хламидий при наличии гипотетического урогенитального источника глазной инфекции при вязке. Реальность последнего утверждения основывалась на анамнестических данных, указывавших на наиболее частое возникновение офтальмоинфекции спустя 7-15 дней после вязки.

Сравнительная оценка диагностической значимости использованных диагностических тестов подчеркивает необходимость совершенствования лабораторной службы ветеринарных учреждений и использования в системе этиологической диагностики хламидийной инфекции метода ПЦР, резервы повышения чувствительности которого еще не исчерпаны. Высокая частота взаимосвязи офтальмо- и урогенитального хпамидиоза определяет обязательность комплексного обследования больных животных с устанавливаемой глазной формой инфекции.

Таким образом, высокоэффективная экспресс-диагностика крайне необходима, в связи с тем, что только она способна обеспечить проведение эффективных лечебных и профилактических мероприятий при борьбе с хламидийными инфекциями животных, имеющими широкое распространение.

ВЫВОДЫ

1. Методы диагностического выделения хламидий в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов и в перевиваемой линии клеток McCoy могут быть использованы для постановки диагноза "хламидийный конъюнктивит" у кошек и собак. Метод выявления цитоплазматических включений в эпителиальных клетках конъюнктивы, окрашиваемых по Романозскому-Гимзе, обладает низкой чувствительностью при конъюнктивитах и уретритах хламидийной этиологии.

2. Штаммы хламидий, выделенные от кошек и собак, способны вызывать заболевание и гибель естественных хозяев, у которых возникают аборты и рождение ослабленного, больного хламидиозом потомства, а также у морских свинок и белых мышей.

3. Электронно-микроскопические исследования ультраструкгуры C.psittaci и изучение характера взаимоотношений возбудителя с культурой клеток McCoy и с развивающимися куриными эмбрионами показали, что внутриклеточные включения хламидий характеризуются неоднородностью

по форме включений и по упаковке С.рэМаЫ в них. Указанная закономерность, является характерной для хламидий и не отражает многообразие штаммов хламидий, циркулирующих в природе.

4. Определены условия хранения штаммов К-1 и С-1 в нативном и лиофилизированном состоянии. Инфекционная активность штаммов сохраняется на высоком уровне с титром 6,5 1д ЭЛД50/0,3 мл, при использовании в качестве стабилизатора фосфатно-буферного раствора с 7% сахарозы или фосфатно-буферного раствора с 2% пептоном.

5. Методом соматической гибридизации клеток мышиной лимфоцитарной гибридомы N50 и спленоцитов мышей линии ВА1В/с, иммунизированных антигеном из штамма К-1, получена панель из 12 гибридом, продуцирующих моноклональные антитела различного изотипа. Установлено, что моноклональные антитела Хла-К-1 изотипа С1 реагируют с консервативными эпитопами белка внешней мембраны (МОМР) различных штаммов хламидий, изолированных от разных видов животных.

6. На основе родоспецифических моноклональных антител получены первые экспериментальные серии отечественного диагностического препарата для выявления антигенов С.рэМаа прямым иммунофлюоресцентным методом, который по своей чувствительности и специфичности не уступает зарубежным коммерческим аналогам и позволяет поставить диагноз на хламидиоз в течение 35-45 минут после взятия клинического материала.

7. С целью диагностики хламидиоза и идентификации С.рзМаЫ и С.ресогит предложен метод ПЦР. Выбранные праймеры, располагающиеся в консервативных областях гена МОМР, обладают высокой чувствительностью (10-30 м.к./мл) и 100% специфичностью при детекции хламидий в патологическом материале.

8. Для выделения и очистки исследуемой ДНК наиболее оптимальной является схема однопробирочной процедуры ее выделения из клинического материала с помощью лизиса клеток гуанидинтиоцианатом с последующей сорбцией ДНК на частицах силикагеля размером 0,5-10 мкм.

9. Применение рестрикционного анализа с ПЦР для изучения внутривидовых различий между штаммами хламидий при использовании специфических эндонуклеаз А1и1, ВвШ! и Сй>1, показало, что популяция С.рзМаа гетерогенна по генетической структуре. Определено, что рестрикционный анализ является одним из необходимых инструментов для внутривидового типирования хламидий для получения объективной оценки циркулирующих штаммов.

10. Эффективность прямых методов диагностики при офтальмохламидиозе по сравнению с ПЦР показывает, что чувствительность ПИФ составляет 93%, культуры клеток - 67% и окраски по Романовскому-Гимзе - 40%. Установлено, что ПЦР-анализ необходимо использовать не только в целях ранней экспресс-диагностики, но и для экспертизы сомнительных результатов, полученных традиционными методами.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1) Санитарные и ветеринарные правила по профилактике и борьбе с орнитозом (утверждены Госкомсанэпиднадзором России от 31 мая

1996 года и Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России от 18 июня 1996 года);

2) Методические указания по выявлению антигенов рода Chlamydia у животных методом прямой иммунофлуоресценции (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 20 ноября

1997 года);

3) Методические указания по индикации Chlamydia psittaci методом полимеразной цепной реакции (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 20 ноября 1997 года);

4) Методические указания по индикации Chlamydia pecorum методом полимеразной цепной реакции (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 20 ноября 1997 года);

5) Методические указания по выявлению хламидиоза методом полимеразной цепной реакции (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 20 ноября 1997 года);

6) Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод ПЦР. Основные положения (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 27 января 1997 года);

7) Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных методом полимеразной цепной реакции (Владимир - 1998 год);

8) Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом (Владимир - 1998 год);

9) Наставление по применению вакцины против хламидиоза пушных зверей, кошек и собак инактивированной ХламиКон (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года);

10) Технические условия на вакцину против хламидиоза пушных зверей, кошек и собак инактивированную ХламиКон (ТУ 9384-184-00494189-99);

11) Наставление по применению набора "ХламиОрн" для выявления родоспецифического антигена хламидий методом прямой иммунофлюоресценции у животных и птиц (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 5 мая 1999 года);

12) Технические условия на набор "ХламиОрн" для выявления родоспецифического антигена хламидий методом прямой иммунофлюоресценции у животных и птиц (ТУ 9388-189-00494189-99);

13) Наставление по применению тест-системы «ХЛА-ПСИТ» для выявления возбудителя хламидиоза Chlamydia psittaci методом ПЦР

(утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года);

14) Технические условия на тест-систему «ХЛА-ПСИТ» для выявления возбудителя хламидиоза Chlamydia psittaci методом ПЦР (ТУ 9388-18500494189-99);

15) Наставление по применению тест-системы «ХЛА-ПЕК» для выявления возбудителя хламидиоза Chlamydia pecorum методом ПЦР (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года);

16) Технические условия на тест-систему «ХЛА-ПЕК» для выявления возбудителя хламидиоза Chlamydia pecorum методом ПЦР (ТУ 9388-18600494189-99);

17) Наставление по применению тест-системы «ХЛА-КОМ» для диагностики хламидиоза животных и птиц методом ПЦР (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года);

18) Технические условия на тест-систему «ХЛА-КОМ» для диагностики хламидиоза животных и птиц методом ПЦР (ТУ 9388-180-00494189-99);

19) Наставление по лабораторной диагностике орнитоза (хламидиоза) птиц (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года);

20) Методические указания по лабораторной диагностике хламидийных инфекций у животных (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 30 июня 1999 года).

. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. И.Л.Обухов. - Хламидиоз кошек. - М.,1994, 92с.

2.И.Л.Обухов, К.Н.Груздев. - Лабораторная диагностика инфекционных болезней методом ДНК-амплификации при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). - Сборник научн. трудов ВГНКИ, 1995, т.57, с.36-45.

3. И.Л.Обухов. - Обнаружение C.psittaci при конъюнктивитах у собак. -Сборник научн. трудов ВГНКИ, 1995, т.57, с.45-51.

4. И.Л.Обухов. - Лабораторное исследование конъюнктивальной флоры у кошек с конъюнктивитом. - Сборник научн. трудов БГНКИ, 1995, т.57, с.51-56.

5. И.Л.Обухов. - Полимеразная цепная реакция-высокочувствительный метод определения возбудителя хламидиоза у птиц и сельскохозяйственных животных. - Мат. Всерос. науч. конф. "Инфекционные болезни молодняка с.-х. животных" Москва, 1996, с.10-12.

6. Б.Л.Черкасский, П.К.Шумилов, Л.А.Цвиль, И.Л.Обухов, К.Н.Груздев, Ю.Д.Караваев. - Орнитоз. - Сборник санитарных и ветеринарных правил "Профилактика и борьба с заразными болезнями, общими для человека и животных" Москва, 1996, с.149-156.

7. I.L.Obukhov, G.A.Shipulin, K.N.Gruzdev. - PCR-identification of Chlamydia psittaci and Chlamydia pecorum by using species-specific primers.- Abstr. Vlllth Intern. Symposium of Vet. Lab. Diagnosticians, Jerusalem, Israel, 1996, p.39.

8. И.Л.Обухов. - Хламидийные инфекции животных и птиц. - Ветеринаоия, 1996, 10, с.19-26.

9. И.Л.Обухов, К.Н.Груздев, А.Н.Панин. - Перспективы использования полимеразной цепной реакции в лабораторной диагностике возбудителей инфекций. - Тез. конф. "Актуальные проблемы биотехнологии в растениводстве, животноводстве и ветеринарии" Москва, 1996, с.58.

10. И.Л.Обухов, К.Н.Груздев, ГАШипулин, А.Н.Панин. - ПЦР - экспресс-метод идентификации Chlamydia psittaci и Chlamydia pecorum. - Там же, с.59.

11.И.Л.Обухов, Г.А.Шипулин, К.Н.Груздев. - Молекулярно-генетический подход в диагностике хламидиозов животных и птиц на основе полимеразной цепной реакции. - Сельскохозяйственная биология, 1996, 4, с.10-19.

12. И.Л.Обухов. - Пеританальные хламидийные болезни у кошек. - Сборник научн. трудов ВГНКИ, 1996, т.59, с.18-21.

13. И.Л.Обухов. - Модель хламидийной инфекции in vitro для первичного отбора этиотропных химиопрепаратов. - Там же, с.21-24.

14. И.Л.Обухов, Ф.Г.Нагиева, К.Н.Груздев. - Набор ХламиОрн для диагностики хламидиоза методом прямой иммунофлюоресценции. - Там же, с.24-29.

15. И.Л.Обухов, Г.А.Шипулин, К.Н.Груздев, А.Н.Панин. - Использование полимеразной цепной реакции для определения видов хламидий. -Цоклады РАСХН, 1997, 1, с.44-45.

16. И.Л.Обухов. - Молекулярный механизм паразитизма хламидий и их внутриклеточное развитие. - Сельскохозяйственная биология, 1997, 2, с.86-Э8.

17. И.Л.Обухов, К.Н.Груздев, А.Н.Панин. - Использование полимеразной цепной реакции в практических ветеринарных лабораториях. Ветеринария, 1997, 2, с.24-27.

18. И.Л.Обухов. - Диагностика хламидийной инфекции у кошек. -Ветеринария, 1997, 5, с.49-50.

19. А.Н.Панин, И.Л.Обухов, Г.А.Шипулин, К.Н.Груздев. - Правила проведения работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. - Ветеринария, 1997, 7, с.19-21.

20. И.Л.Обухов, А.Н.Панин, К.Н.Груздев. - Механизмы иммунитета при хламидийных инфекциях. - Сельскохозяйственная биология, 1997, 4, =.109-116.

21. И.Л.Обухов. - Хламидиоз кошек: этиология, клиническая картина, диагностика, лечение и профилактика. - Сборник мат. конф. "Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных" С.Петербург, 1997, с. 13-21.

22. А.Н.Панин, И.Л.Обухов, К.Н.Груздев. - Перспективы совершенствования микробиологической диагностики возбудителей инфекций с помощью полимеразной цепной реакции. - Тезисы 2-ой Межд. научно-практ. конф. "Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля с.-х. продукции" Москва, 1997, с.117.

23. И.Л.Обухов, А.Н.Панин, К.Н.Груздев. - Разработка и изучение чувствительности и специфичности ПЦР-тест-системы для диагностики хламидиоза. - Там же, с.119.

24. И.Л.Обухов, А.Н.Панин, К.Н.Груздев, К.И.Кумалагова. - Профилактика хламидиоза пушных зверей, кошек и собак. - Там же, с. 120.

25. И.Л.Обухов, А.Н.Панин, Ф.Г.Нагиева, К.Н.Груздев. - Получение и применение моноклональных антител к С. psittaci. - Там же, с. 121.

26. И.Л.Обухов.- Хламидиоз кошек. - Друг, 1997, 6, с.38-39.

27. И.Л.Обухов, К.Н.Груздев, К.И.Кумалагова. - Штамм Chlamydia psittaci, используемый для изготовления инактивированной вакцины против хламидиоза кошек и пушных зверей.- Патент РФ № 2122579 от 27.11.1998 г.

28. И.Л.Обухов. - Методы диагностики орнитоза. - Птицеводство, 1998, 5, с.27-29.

29. И.Л.Обухов, К.Н.Груздев, А.Н.Панин. - Чувствительность и специфичность видовых тест-систем для индикации хламидиоза методом полимеразной цепной реакции (ПЦР).- Мат. 2-ой Всерос. конф. "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний" Москва, 1998, с.52-53.

30. И.Л.Обухов. - Методы прямого обнаружения хламидий при орнитозе. -Ветеринария, 1998, 9, с.22-24.

31. И.Л.Обухов, А.Н.Панин, К.Н.Груздев, Д.А.Васильев. - Орнитоз,-Ульяновск, 1998, 56с.

32. И.Л.Обухов, К.Н.Груздев, А.Н.Панин. - Элизоотологический анализ хламидийных инфекций. - Мат. 2-ой Межд. конф. "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" С.-Петербург, 1998, с. 106.

33. И.Л.Обухов. - Ультраструктурная характеристика Chlamydia psittaci.-Ветеринария, 1998,10, с.26-28.

34. А.Н.Панин, И.Л.Обухов, К.Н.Груздев и др. - Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод полимеразной цепной реакции. - В кн.: Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных методом полимеразной цепной реакции. - Под ред. ААГусева, А.Н.Панина. -Владимир, 1998, с.17-22.

35. А.Н.Панин, К.Н.Груздев, И.Л.Обухов и др. - Методические указания по выявлению хламидиоза методом полимеразной цепной реакции. - Там же, с.327-339.

36. А.Н.Панин, К.Н.Груздев, И.Л.Обухов и др. - Методические указания по индикации Chlamydia pecorum методом полимеразной цепной реакции. -Там же, с.340-351.

37. А.Н.Панин, К.Н.Груздев, И.Л.Обухов и др. - Методические указания по индикации Chlamydia psittaci методом полимеразной цепной реакции. - Там «е, с.352-363.

38. И.Л.Обухов, К.Н.Груздев, Ф.Г.Нагиева и др. - Методические указания по зыявлению антигенов рода Chlamydia у животных и птиц методом прямой лммунофлюоресценции. - В кн.: Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом. - Под ред. А.А.Гусева, А.Н.Панина. - Владимир, 1998, с. 125-128.

39. И.Л.Обухов, К.Н.Груздев, А.Н.Панин. - Сравнительный анализ различных способов подготовки клинических образцов при детекции D.psittaci методом полимеразной цепной реакции. - Доклады РАСХН, 1999, >, с.49-50.

tO. И.Л.Обухов, К.Н.Груздев, К.И.Кумалагова. - К вопросу об условиях сультивирования и хранения производственного хламидийного штамма (-1. - Сельскохозяйственная биология, 1999, 2, с.99-103. И. И.Л.Обухов. - Эффективность глазных мазей при хламидиозном юнъюнктивите кошек. - Ветеринария, 1999, 6, с.50-51. 12. И.Л.Обухов, К.И.Кумалагова, К.Н.Груздев.- Влияние различных (эакторов на эффективность культивирования хламидий в культуре клеток.-;борник научн. трудов ВГНКИ, 1999, т.61, с. 53-58.

№. И.Л.Обухов, К.И.Кумалагова, К.Н.Груздев. - Диагностическое выделение ламидий от больных кошек. - Сборник научн. трудов ВГНКИ, 1999, т.61, с. 58-64.

14. И.Л.Обухов. - Свойства и цикл развития хламидий. Взаимодействие с леткой - хозяином. - Сельскохозяйственная биология, 1999, 4, с. 12-27.

15. И.Л.Обухов. - Кпинико-эпизоотологические особенности хламидиоза ошек. - Ветеринария, 1999, 11, с.50-55.

16. И.Л.Обухов, Г.А.Шипулин, М.В.Яковенко, Р.Х.Равилов. - Внутривидовая (ифференциация штаммов Chlamydia psittaci методом рестрикционного 1нализа,- Мат. 3-ей Всерос. конф. "Генодиагностика в современной чедицине", Москва, 2000, с.328-330.

•7. Ф.Г.Нагиева, К.Н.Груздев, И.Л.Обухов, Е.П.Баркова, В.Г.Никулина. -итамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.Muskulus L., юпользуемый для получения моноклональных антител к Chlamydia.-1оложительное решение о выдаче патента на изобретение № 98123923/13 it 25.01.2000 г.

Актуальность темы. Хламидиозная инфекция широко распространена среди практически всех видов млекопитающих и птиц, наносит существенный экономический ущерб различным отраслям животноводства и птицеводства, вызывая гибель животных, патологию их воспроизводительных органов, аборты, рождение мертвого или нежизнеспособного приплода. Больные животные часто становятся источником инфекции работников животноводческих хозяйств. Распространенность возбудителей хламидиоза в природе среди диких животных и особенно птиц представляет постоянную угрозу спорадических заболеваний для людей, профессионально не занятых в сельском хозяйстве (18; 43; 44; 47; 50; 51; 64; 69; 71; 72; 233; 324; 351).

Особенностью хламидиозной инфекции, значительно усложняющей эпизоотологический контроль за ней, является часто хроническое, со стертой клинической картиной или латентное течение (52; 53; 56; 57; 58; 63; 64). Поэтому, в системе проведения ветеринарно-санитарных мероприятий по своевременной профилактике, а также специфическому лечению хламидиозов животных и людей важное значение имеет как можно более раннее и достоверное обнаружение возбудителя при разных формах заболевания. С этой целью на протяжении последних лет был разработан целый ряд лабораторных методов прямой и косвенной диагностики хламидиозов.

В настоящее время общепризнанным эталоном для прямых методов выявления хламидий считается выделение возбудителя в культуре клеток. Однако этот метод имеет недостатки, существенно затрудняющие его широкое использование в практической ветеринарии. Прежде всего, это высокий риск инфицирования персонала и необходимость проведения работ по выделению возбудителя в специальной лаборатории. Кроме того, культуральный метод трудоемок и занимает много времени. Несмотря на то, что для высева патогена подходит практически любой материал от инфицированного животного, успех исследования во многом зависит от скорости транспортировки проб в лабораторию и соблюдения условий доставки образцов (специальные транспортные среды, охлаждение, добавление антибиотиков, предварительная очистка материала от токсичных для клеток веществ и т.д.) (12; 92; 174; 351).

В связи с этим предпринимаются попытки заменить метод культурального выделения хламидий другими методами их прямого обнаружения. Так, в последние годы большое значение приобрел подход, основанный на выявлении антигенов С.рвМаа методом иммуноферментного анализа (ИФА), имеющий по сравнению с культуральным следующие достоинства: возможность одновременного анализа большого числа образцов, быстрота (продолжительность анализа составляет 4 часа) и безопасность для персонала. Однако для ИФА-детекции антигенов так же, как и для культурального метода, характерны не высокая чувствительность в связи с низкой концентрацией возбудителя в пробе, особенно при латентном течение инфекции (92; 116; 152; 291).

Проблема низкой чувствительности рассмотренных выше подходов была решена с введением в схему анализа методов прямой и непрямой иммунофлюоресценции. Методы иммунофлюоресценции не требуют много времени для исследования, а также наличия живого возбудителя в пробе; позволяют выявлять не только корпускулярные антигены, входящие в состав морфологических структур возбудителя, но и растворимые, содержащиеся во включениях. (79; 118; 126; 130; 174). Поэтому, получение методом гибридомной технологии моноклональных антител к С.рэМаа и разработка на их основе диагностикумов для внедрения в практику - является актуальной задачей отечественной ветеринарии.

При сопоставлении результатов полученных с помощью серологических методов и прямых методов детекции хламидий, как правило, наблюдается высокий процент дискордантных результатов (151; 152; 174). Поэтому, наличие специфичных антител у животных, не является доказательством активного инфекционного процесса и требует обязательного подтверждения каким-либо прямым методом (92; 151; 276; 351; 352).

Однако общепринятые методы диагностики и типирования хламидий, основанные на фенотипическом выражении биологических свойств, не всегда дают объективную характеристику циркулирующих штаммов (134; 293).

В настоящее время в микробиологии получили широкое применение молекулярно-генетические методы, характеризующие возбудителей инфекционных заболеваний по особенностям их генетической структуры. Их применение для характеристики хламидий позволяет устанавливать внутривидовые различия между штаммами микроорганизмов по особенностям нуклеотидного состава ДНК, характеризовать штаммовый состав популяции и следить за распространением инфекции (134; 175; 179; 233; 376).

Одним из наиболее перспективных методов прямой диагностики инфекций следует считать специфическую амплификацию нуклеиновых кислот in vitro и, в частности, наиболее разработанный вариант этой амплификации - метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Уже в первых работах, посвященных применению ПЦР для обнаружения хламидий, отмечены чрезвычайно важные для диагностики хламидиозов особенности этого метода: высокая чувствительность и специфичность, способность идентифицировать виды хламидий (119; 134; 192; 193; 234; 270; 276; 293).

Дополнительная информация о разновидности возбудителя, легко получаемая методом ПЦР, позволяет проводить эпизоотологический контроль и предотвращать распространение опасных штаммов хламидий. Однако завышенная стоимость импортных ПЦР-наборов не позволяет широко использовать данный метод в практике. Поэтому создание недорогих и качественных отечественных тест-систем для обнаружения хламидий является актуальной задачей (50; 304; 317; 324; 363).

Цель и задачи исследований. Цель исследований -изучить биологические свойства хламидий, разработать тест-системы для экспресс-диагностики хламидиоза и определить внутривидовые различия между штаммами хламидий.

Основные задачи исследования:

• Выделить штаммы возбудителей хламидиоза кошек и собак, изучить их биологические свойства;

• Провести электронно-микроскопические исследования ультраструктуры C.psittaci и изучить характер взаимодействия возбудителя с культурой клеток McCoy и с развивающимися куриными эмбрионами;

• Получить моноклональные антитела к различным антигенным детерминантам C.psittaci и изучить их биологические свойства;

• Разработать на основе моноклональных антител, меченных флуоресцеинизотиоцианатом экспериментальный диагностический препарат для выявления хламидий методом прямой иммунофлюоресценции;

• Сравнить эффективность полученного диагностикума с аналогичным коммерческим препаратом зарубежного производства;

• Разработать тест-систему методом ПЦР для диагностики хламидиоза у животных;

• Разработать тест-систему методом ПЦР для диагностики и идентифицикации C.psittaci в клиническом материале от разных видов сельскохозяйственных животных и птиц;

• Разработать тест-систему методом ПЦР для диагностики и идентифицикации C.pecorum в клиническом материале от разных видов сельскохозяйственных животных;

• Адаптировать метод генотипирования рестрикционный анализ и изучить возможности его применения для внутривидовой дифференциации хламидий.

Положения, выносимые на защиту:

1. Выделение и идентификация штаммов возбудителей хламидиоза кошек и собак в куриных эмбрионах и культуре клеток;

2. Получение гибридомы - продуцента моноклональных антител к антигенам C.psittaci и разработка диагностического набора методом прямой иммунофлюоресценции;

3. Разработка тест-систем для диагностики хламидиоза и идентификации C.psittaci и C.pecorum у разных видов сельскохозяйственных животных и птиц;

4. Внутривидовое генотипирование хламидий с помощью рестрикционного анализа.

Научная новизна. Впервые в РФ выделены и идентифицированы штаммы возбудителей хламидиоза кошек и собак (К-1; С-1), изучены их биологические свойства. Новизна исследований подтверждена получением патента "Штамм Chlamydia psittaci, используемый для изготовления инактивированной вакцины против хламидиоза кошек и пушных зверей" № 2122579 от 27.11.1998 г.

Получены лимфоцитарные гибридомы, стабильно секретирующие моноклональные антитела, направленные к родоспецифическим детерминантам C.psittaci, являющиеся основой для создания в РФ современной иммунодиагностики хламидиозов животных.

Выявлены моноклональные антитела, обладающие наибольшей эффективностью при обнаружении хламидийных антигенов в биологическом материале - Хла-К-1 (lgG1), направленные к консервативным эпитопам основного белка внешней мембраны хламидий (МОМР) и обладающие высокой чувствительностью (100 м.к./мл) и 100% специфичностью.

На «Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus L., используемый для получения моноклональных антител к Chlamydia» получено положительное решение о выдаче патента на изобретение № 98123923/13 от 25.01.2000 г.

Впервые в РФ на молекулярно-генетическом уровне изучены и типированы штаммы и изоляты хламидий, выделенные от животных. На основе анализа 26 последовательностей ДНК гена МОМР хламидий выбраны оригинальные праймеры, позволяющие дифференцировать виды C.psittaci и C.pecorum методом ПЦР. Чувствительность реакции составила 10 геномов бактерий в пробе при фоновой нагрузке ДНК быка, взятой в количестве, эквивалентном 100000 клеток.

Адаптирован метод генотипирования - рестрикционный анализ с применением ПЦР и определены возможности его применения для внутривидовой дифференциации хламидий.

Показано, что популяция хламидийной инфекции у животных гетерогенна по генетической структуре.

Практическая значимость работы. Предложена и внедрена в ветеринарную практику инактивированная культуральная вакцина против хламидиоза кошек, собак и пушных зверей, изготовленная на основе штаммов, выделенных нами от естественно зараженных кошек и собак (ТУ и наст, по применению утв. Департаментом ветеринарии в 1999 г.). Штаммы депонированы во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве "Chlamydia psittaci К-1 ДЕП" № 87/274 от 22.01.1996 г. и "Chlamydia psittaci С-1 ДЕП" № 86/274 от 22.01.1996 г.

Разработан и впервые внедрен в ветеринарную практику отечественный диагностикум для выявления антигенов хламидий методом прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) в патологическом материале от сельскохозяйственных животных и птиц (ТУ и наст, по применению утв. Департаментом ветеринарии в 1999 г.). Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus. Musculus L. - продуцент моноклональных антител к Chlamydia депонирован во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве с присвоением наименования «Штамм гибридомы Хла-К-1-ДЕП» от 15.04.1996 г.

Впервые в РФ разработаны и внедрены в ветеринарную практику ПЦР-тест-системы для диагностики и идентификации разных видов хламидий, обладающие высокой таксономической специфичностью (ТУ и наст. по применению утв. Департаментом ветеринарии в 1999 г.).

Детекция хламидий методом ПЦР в патологическом материале впервые включена в «Наставление по диагностике орнитоза (хламидиоза) у птиц», утвержденное Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года и «Методические указания по лабораторной диагностике хламидийных инфекций у животных», утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 30 июня 1999 года.

Использование методов ПИФ и ПЦР в диагностических ветеринарных лабораториях, дает возможность быстро и надежно установить диагноз на хламидиоз, что приведет к своевременной эффективной терапии и научно обоснованной профилактике этого заболевания.

Метод рестрикционного анализа с применением ПЦР позволяет получать дополнительную информацию о разновидности возбудителя, проводить эпизоотологический контроль и предотвратить распространение опасных штаммов хламидий на территории РФ.

Апробация работы. Основные результаты исследований доложены на: 2-ой Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственной продукции" (Москва, 1997); Всероссийской научной конференции "Актуальные проблемы биотехнологии в растеневодстве, животноводстве и ветеринарии" (Москва, 1996); Всероссийской научной конференции "Инфекционные болезни молодняка сельскохозяйственных животных" (Москва, 1996); VIII Международном симпозиуме по ветеринарной лабораторной диагностике (Иерусалим, 1996); Всероссийской научной конференции "Актуальные вопросы ветеринарно-санитарного обеспечения в мясной отрасли" (Москва, 1997); Всероссийской научной конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины мелких домашних животных" (С.Петербург, 1997); 2-ой Всероссийской конференции "Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний" (Москва, 1998);

2-ой Международной конференции "Идеи Пастера в борьбе с инфекциями" (С.-Петербург, 1998); Методических советах по вирусологии ВГНКИ (Москва, 1993-1998); Межлабораторном совещании сотрудников ВГНКИ (Москва, 1999),

3-ей Всероссийской научно-практической конференции "Генодиагностика в современной медицине" (Москва, 2000).

Диагностические препараты экспонировались в павильонах "Ветеринария" и "Микробиология" ВДНХ РФ и отмечены золотыми медалями.

Публикации по теме работы. По теме диссертации опубликовано 47 статей, в том числе монография "Хламидиоз кошек" (Москва, 1994, 5,4 п.л.). Получены один патент и одно положительное решение о выдаче патента на изобретение. Разработаны 5 наставлений по применению, 5 технических

14 условий, 8 методических указаний, наставление по диагностике орнитоза и правила по профилактике и борьбе с орнитозом.

ВЫВОДЫ

1. Методы диагностического выделения хламидий в желточных мешках развивающихся куриных эмбрионов и в перевиваемой линии клеток McCoy могут быть использованы для постановки диагноза "хламидийный конъюнктивит" у кошек и собак. Метод выявления цитоплазматических включений в эпителиальных клетках конъюнктивы, окрашиваемых по Романовскому-Гимзе, обладает низкой чувствительностью и специфичностью при конъюнктивитах и уретритах хламидийной этиологии.

2. Штаммы хламидий, выделенные от кошек и собак, способны вызывать заболевание и гибель естественных хозяев, у которых возникают аборты и рождение ослабленного, больного хламидиозом потомства, а также у морских свинок и белых мышей.

3. Электронно-микроскопические исследования ультраструктуры C.psittaci и изучение характера взаимоотношений возбудителя с культурой клеток McCoy и с развивающимися куриными эмбрионами показали, что внутриклеточные включения хламидий характеризуются неоднородностью по форме включений и по упаковке C.psittaci в них. Указанная закономерность, является характерной для хламидий и не отражает многообразие штаммов хламидий, циркулирующих в природе.

4. Определены условия хранения штаммов К-1 и С-1 в нативном и лиофилизированном состоянии. Инфекционная активность штаммов сохраняется на высоком уровне с титром 6,5 lg ЭЛД50/0,3 мл, при использовании в качестве стабилизатора фосфатно-буферного раствора с 7% сахарозы или фосфатно-буферного раствора с 2% пептоном.

5. Методом соматической гибридизации клеток мышиной лимфоцитарной гибридомы ЫБО и спленоцитов мышей линии ВА1В/с, иммунизированных антигеном из штамма К-1, получена панель из 12 гибридом, продуцирующих моноклональные антитела различного изотипа. Установлено, что моноклональные антитела Хла-К-1 изотипа 01 реагируют с консервативными эпитопами белка внешней мембраны (МОМР) различных штаммов хламидий, изолированных от разных видов животных.

6. На основе родоспецифических моноклональных антител получены первые экспериментальные серии отечественного диагностического препарата для выявления антигенов С.рэ^аа прямым иммунофлюоресцентным методом, который по своей чувствительности и специфичности не уступает зарубежным коммерческим аналогам и позволяет поставить диагноз на хламидиоз в течение 35-45 минут после взятия клинического материала.

7. С целью диагностики хламидиоза и идентификации С.рэМаа и С.ресогит предложен метод ПЦР. Выбранные праймеры, располагающиеся в консервативных областях гена МОМР, обладают высокой чувствительностью (10-30 м.к./мл) и 100% специфичностью при детекции хламидий в патологическом материале.

8. Для выделения и очистки исследуемой ДНК наиболее оптимальной является схема однопробирочной процедуры ее выделения из клинического материала с помощью лизиса

277 клеток гуанидинтиоцианатом с последующей сорбцией ДНК на частицах силикагеля размером 0,5-10 мкм.

9. Применение рестрикционного анализа с использованием ПЦР для изучения внутривидовых различий между штаммами хламидий при использовании специфических эндонукпеаз А1и1, ВбШ! и Сйэ1, показало, что популяция С.рэ^аа гетерогенна по генетической структуре. Определено, что рестрикционный анализ является одним из необходимых инструментов для внутривидового типирования хламидий для получения объективной оценки циркулирующих штаммов. 10. Эффективность прямых методов диагностики при офтальмохламидиозе по сравнению с ПЦР показывает, что чувствительность ПИФ составляет 93%, культуры клеток - 67% и окраски по Романовскому-Гимзе - 40%. Установлено, что ПЦР-анализ необходимо использовать не только в целях ранней экспресс-диагностики хламидиоза, но и для экспертизы сомнительных результатов, полученных традиционными методами.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1) Санитарные и ветеринарные правила по профилактике и борьбе с орнитозом (утверждены Госкомсанэпиднадзором России от 31 мая 1996 года и Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России от 18 июня 1996 года);

2) Методические указания по выявлению антигенов рода Chlamydia у животных методом прямой иммунофлуоресценции (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 20 ноября 1997 года);

3) Методические указания по индикации Chlamydia psittaci методом полимеразной цепной реакции (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 20 ноября 1997 года);

4) Методические указания по индикации Chlamydia pecorum методом полимеразной цепной реакции (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 20 ноября 1997 года);

5) Методические указания по выявлению хламидиоза методом полимеразной цепной реакции (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 20 ноября 1997 года);

6) Методические рекомендации по проведению работ в диагностических лабораториях, использующих метод ПЦР. Основные положения (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 27 января 1997 года);

7) Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных методом полимеразной цепной реакции (под ред. А.А.Гусева, А.Н.Панина - Владимир - 1998 год);

8) Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом (под ред. А.А.Гусева, А.Н.Панина - Владимир -1998 год);

9) Наставление по применению вакцины против хламидиоза пушных зверей, кошек и собак инактивированной ХламиКон (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года);

10) Технические условия на вакцину против хламидиоза пушных зверей, кошек и собак инактивированную ХламиКон (ТУ 9384-184-00494189-99);

11) Наставление по применению набора "ХламиОрн" для выявления родоспецифического антигена хламидий методом прямой иммунофлюоресценции у животных и птиц (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 5 мая 1999 года);

12) Технические условия на набор "ХламиОрн" для выявления родоспецифического антигена хламидий методом прямой иммунофлюоресценции у животных и птиц (ТУ 9388-18900494189-99);

13) Наставление по применению тест-системы «ХЛА-ПСИТ» для выявления возбудителя хламидиоза Chlamydia psittaci методом ПЦР (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года);

14) Технические условия на тест-систему «ХЛА-ПСИТ» для выявления возбудителя хламидиоза Chlamydia psittaci методом ПЦР (ТУ 9388-185-00494189-99);

15) Наставление по применению тест-системы «ХЛА-ПЕК» для выявления возбудителя хламидиоза Chlamydia pecorum методом ПЦР (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года);

16) Технические условия на тест-систему «ХЛА-ПЕК» для выявления возбудителя хламидиоза Chlamydia pecorum методом ПЦР (ТУ 9388-186-00494189-99);

17) Наставление по применению тест-системы «ХЛА-КОМ» для диагностики хламидиоза животных и птиц методом ПЦР (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года);

18) Технические условия на тест-систему «ХЛА-КОМ» для диагностики хламидиоза животных и птиц методом ПЦР (ТУ 9388-180-00494189-99);

19) Наставление по диагностике орнитоза (хламидиоза) у птиц (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 26 апреля 1999 года);

20) Методические указания по лабораторной диагностике хламидийных инфекций у животных (утверждено Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 30 июня 1999 года).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние десятилетия инфекции, вызываемые хламидиями, характеризуются повсеместным распространением, кпинико-эпидемиологическим многообразием и значительным влиянием на уровень здоровья человека и продуктивность животноводства.

Несмотря на то, что средства диагностики и терапии в последние годы стали более эффективными, распространенность хламидийных инфекций и вызываемые ими осложнения продолжают увеличиваться. На сегодняшний день в эпизоотической цепи хламидиоза вакцинопрофилактикой не охвачены такие животные, как кошки и собаки, которые выделяя хламидии через органы дыхания, конъюнктивальную слизь, желудочно-кишечный тракт и мочеполовую систему контаминируют окружающую среду и создают природные очаги этой инфекции. За счет этого возникает прямая угроза здоровью человека. Следовательно, актуальной задачей является выделение штаммов от этих животных и их использование для разработки специфической профилактики данной болезни, что явилось одним из основных направлений нашей работы.

Кроме того, возбудители хламидиозов, вызывая сходную клиническую картину у разных животных, представляют собой крайне полиморфную группу. И наоборот, один и тот же возбудитель может вызывать разные формы инфекции как у птиц, так и у млекопитающих. Поэтому, важнейшим этапом в системе проведения ветеринарно-санитарных мероприятий для своевременной профилактики, а также специфического лечения хламидиозов животных и людей является не только максимально ранняя и точная лабораторная диагностика возбудителя при разных формах течения инфекции, но и одновременное определение вида и типа хламидий.

До недавнего времени основные принципы диагностики хламидиозов сводились к выделению хламидий в культуре клеток, непосредственному выявлению специфических включений, микробных клеток или антигенов хламидий в пораженных органах и тканях, а также определению специфических антител в сыворотках больных особей. Диагностическое выделение хламидий в культуре клеток считалось до настоящего времени "золотым стандартом" и рассматривалось как самый специфичный и чувствительный метод диагностики.

Однако данный подход имеет целый ряд недостатков существенно затрудняющих его широкое использование. Прежде всего, это необходимость проведения работ по выделению живого возбудителя только в специальной режимной лаборатории, что связано с высоким риском инфицирования персонала. Метод культивирования трудоемок и занимает много времени - около 6-10 дней. Несмотря на то, что для анализа подходит практически любой материал от инфицированного животного, успех исследования во многом зависит от того, как скоро данная проба была доставлена в лабораторию.

Кроме того, для транспортировки необходимы также специальные транспортные среды и часто трудно соблюдаемые условия транспортировки образцов (охлаждение, добавление антибиотиков, предварительная очистка материала от токсичных для клеток веществ и т.д.).

Поэтому необходимость в усовершенствовании метода культуры клеток уже возникла после работ Grayston и Campbell, которые проводили исследования по характеристике и эпидемиологии штаммов TWAR (107; 158). В настоящее время данные штаммы выделены в вид С.pneumoniae. Представители этого вида плохо репродуцируются как в куриных эмбрионах, так и в культуре клеток. Авторы проводили выделение штаммов TWAR в клетках HeLa-229 с применением центрифугирования, ДЕАЕ-декстрана и циклогексимида. Эффективным методом окраски было признано использование флуоресцирующих родоспецифических или TWAR-специфичных монокпональных антител (158). Вследствие этого, в последние десятилетия большое распространение получили быстрые иммунологические методы определения хламидий непосредственно в патологическом материале, которые основываются на технике иммунофлюоресценции или на иммуноферментном анализе с применением высокоспецифичных моноклональных антител и не требуют наличия в пробе жизнеспособного микроорганизма.

На сегодняшний день зарубежные и отечественные фирмы выпускают большое количество разных комерческих наборов, в составе которых используются монокпональные антитела, предназначенные для диагностики урогенитальных хламидиозов у человека, вызываемых С.trachomatis. Однако аналогичные диагностические тесты в нашей стране для сельскохозяйственных животных и птиц до настоящего времени не были разработаны.

Поэтому, получение методом гибридомной технологии моноклональных антител к C.psittaci и конструирование на их основе диагностикума для внедрения в ветеринарную практику -является вторым основным направлением нашей работы.

Совершенствование методов молекулярной биологии дало возможность расширить диапазон применяемых диагностических методов. Так, шестнадцать лет назад сотрудник компании "Cetus Corporation" Кэри Б. Мюллис реализовал идею, высказанную 30 лет назад двумя Нобелевскими лауреатами А. Кронбергом и Дж. Ледербергом и открыл принцип избирательного умножения нуклеотидных последовательностей - метод ПЦР, который поднял генодиагностику на принципиально новый уровень в связи с очень высокой чувствительностью (до 10~17 г ДНК), специфичностью и быстротой получения конечного результата. В связи с тем, что ПИФ, ИФА и другие методы ориентированы на выявление микроорганизма на основании его фенотипических признаков, проявление которых зависит от экспрессии генов, молекулярно-биологические технологии позволяют определить непосредственно генотипическую принадлежность бактерии или вируса. Также многие бактерии и вирусы могут длительно находиться в латентной форме и присутствовать в столь малых количествах, что их не удается обнаружить ни одним из традиционных методов. Высокая специфичность, но недостаточная чувствительность ПИФ-метода при обследовании популяций с отсутствием симптоматики (при уровне инфицированности ниже 10%) несколько снижает его диагностическую ценность. Кроме того, антигенные свойства микроорганизмов могут меняться под давлением защитных сил иммунитета и даже единичные мутации в их геноме иногда сопровождаются существенным снижением взаимодействия диагностических антител с антигенными детерминантами инфекционных агентов (13). Вследствие этого, работ, посвященных использованию ПЦР для идентификации инфекционных агентов вполне достаточно, чтобы представить необходимость применения метода ПЦР для создания диагностических тест-систем, в частности для диагностики и типирования хламидиозов животных и людей. Поэтому, проблемы связанные с контролем за распространением хламидийных инфекций являются следствием несовершенства и трудоемкости традиционных методов выявления хламидий.

В связи с этим третьим основным направлением нашей работы являлась разработка родо- и видоспецифичных праймеров для ПЦР-детекции видов С-рэМаа и С.ресогит, которые представляют наибольшую актуальность для сельского хозяйства. Дополнительная информация о разновидности возбудителя получаемая методом ПЦР, позволит проводить эпидемиологический контроль и предотвращать распространение опасных штаммов. Вследствие этого был использован рестрикционный анализ для определения штаммовых различий хламидий внутри вида, которые определяли по характеру расщепления ампликонов специфическими эндонуклеазами, имеющими строго определенные сайты узнавания.

Первый этап исследования заключался в выделении возбудителей хламидиоза кошек и собак, изучении их биологических свойств и адаптирование возбудителей к перевиваемой культуре клеток.

Для первичного выделения хламидий были использованы развивающиеся куриные эмбрионы 6-7-дневного возраста. В качестве инфекционного материала мы использовали соскобы с конъюнктивы больных кошек и собак.

Для получения мазков-отпечатков желточной оболочки куриные эмбрионы с признаками их малой подвижности или гибели не ранее, чем через 3 суток после заражения, вскрывали, извлекали желточный мешок и готовили препараты для окраски по Романовскому-Гимзе. Также делали мазки-отпечатки с желточной оболочки отдельных живых, подвижных эмбрионов, вскрытых в более поздние сроки после заражения (10-12 суток). При отсутствии признаков наличия хламидий проводили слепые пассажи желточного материала, в которых повторяли данную процедуру. При выявлении морфологических структур или антигенов хламидий, наличие которых обычно сочеталось с летальностью куриных эмбрионов, устанавливался положительный результат диагностического выделения. При отсутствии этих показателей на протяжении 2-3 слепых пассажей, опыт прекращали и результаты оценивали, как отрицательные.

Для адаптации эмбрионального штамма к культуре клеток и создания оптимальных условий культивирования с целью повышения чувствительности клеток к хламидиям, для лучшей адсорбции и проникновения хламидий в клетку хозяина проводили предварительное центрифугирование используемого материала на монослой выращенных клеток. Позитивные результаты диагностического выделения, определялись суммарными показателями индикации цитоплазматических включений в клетках культуры, выявляемых методом обнаружения морфологических структур при окраске по Романовскому-Гимзе.

Широкий спектр патогенности хламидий и глобальная распространенность хламидиозов, объясняют необходимость изучения закономерностей их внутриклеточного способа существования. Изучение ультраструктуры хламидий с помощью электронного микроскопа началось еще с конца 40-х годов, когда были опубликованы первые электронограммы ЭТ возбудителей пситтакоза, кошачьей пневмонии и венерической лимфогранулемы.

При изучении кошачьего штамма К-1 в куриных эмбрионах и в культуре клеток McCoy четко различались вегетативные, спороподобные и переходные формы. На ультратонких срезах инициальные тельца представляли собой кокки, ограниченные двухконтурной цитоплазматической мембраной и содержащие большое количество рибосом. Отдельные кокки имели электронно-плотную зону - нуклеоид. Размер инициальных телец C.psittaci колебался от 0,5 до 0,7 мкм.

Элементарные тельца (спороподобные формы) имели меньший размер (поперечник около 0,3 мкм) без жгутиков, фимбрий и пилей. Цитоплазма их более компактна и отнесена к периферии электронно-плотным нуклеоидом.

Первые включения хламидий, видимые в световом или люминесцентном микроскопе появлялись в инфицированных клетках, как правило, через 10-12 часов после заражения. На этих сроках методом ПИФ в цитоплазме отдельных клеток вблизи ядра выявлялись небольшие светящиеся зоны. При массивном заражении (обычно применяющемся в электронно-микроскопических экспериментах) в одной клетке может сначала образоваться несколько включений, которые затем часто сливаются в одно.

Зрелые включения у штамма К-1 С.райаа, заполняли обычно большую часть цитоплазмы клетки-хозяина. При этом ее ядро не претерпевает существенной деформации. Цитоплазма, окружающая зрелое включение, имела вид узкого ободка уже через 48 часов после заражения и сохранялась в виде достаточно широких зон.

Форма включения была достаточно разнообразной: от неправильной, разветвленной и как бы дольчатой, до округлой или овальной с извилистыми или ровными краями.

В зрелых включениях С.рвМаа, наблюдаемых в ультратонких срезах, отдельные клетки хламидий упакованы достаточно плотно. Плотность упаковки хламидий во включении у штамма К-1, как правило, не менялась в зависимости от срока инфекции. Тем не менее, на одном и том же сроке инфекции (как по сроку после заражения, так и по соотношению РТ, ПТ и ЭТ) плотность хламидий во включении варьировала от очень плотной упаковки до достаточно свободной.

Через 48-72 часов после заражения видно, что мембрана окружающая включение штамма К-1 C.psittaci, часто не выявляется, однако включение при этом сохраняет свою морфологическую целостность. Разрыв мембраны включения происходил в наших опытах только непосредственно перед выходом хламидий из клетки, на самых поздних стадиях их цикла развития.

Результаты нашего исследования показали, что форма включения и упаковка кошачьих хламидий по включениях C.psittaci, являются характерными для данного вида хламидий.

Таким образом, исследования, проведенные на модельных системах in vitro в условиях, исключающих неконтролируемые воздействия организма хозяина, подтверждают и устанавливают ряд общих морфо-функциональных закономерностей внутриклеточного паразитизма хламидий, которые позволят более детально изучить внутриклеточный паразитизм на органном и организменном уровне развития.

Выделенные нами штаммы хламидий К-1 и С-1 от больных хламидиозом кошек и собак, были депонированы в Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ) в качестве производственных штаммов для изготовления вакцины против хламидиоза кошек, собак и пушных зверей. Новизна исследований подтверждена получением патента "Штамм Chlamydia psittaci, используемый для изготовления инактивированной вакцины против хламидиоза кошек и пушных зверей" № 2122579 от 27.11.1998 г.

Несмотря на то, что средства профилактики и терапии в последние годы стали более эффективными, распространенность хламидиоза среди животных, продолжает увеличиваться в связи с наличием неконтролируемого резервуара инфекции в природе. Данная ситуация осложняется отсутствием в ветеринарных лабораториях надежных и простых диагностических тест-систем, что затрудняет этиологическую диагностику и эпидемиологический надзор за хламидийными инфекциями.

Исследования последних лет показали высокую эффективность выявления антигенов микроорганизмов с помощью реакции прямой иммунофлюоресценции и иммуноферментного метода, с использованием высокоспецифичных м-АТ. Поэтому одним из главных направлений нашей работы было получение монокпональных антител к антигенам С.рвИаа и разработка диагностической тест-системы методом прямой иммунофлюоресценции, предназначенной для выявления хламидий у животных.

Первый этап исследования заключался в получении серии гибридом, стабильно секретирующих м-АТ к различным антигенам С.рэ^аа, в первую очередь к родо- и видоспецифическим детерминантам антигенного комплекса микроорганизма. Немаловажным условием для получения гибридом, стабильно продуцирующих антитела нужной специфичности, является иммунизация мышей- доноров спленоцитов, вырабатывающих специфические антитела. С этой целью нами использованы штамм К-1 C.psittaci, в антигенной структуре которого наиболее широко представлены родо- и видоспецифические детерминанты, ответственные за серологический перекрест со всеми остальными сероварами C.psittaci, а также с видами C.pecorum и С.trachomatis. Выраженный иммунный ответ у животных был получен при введении антигена в дозе 100 мкг белка на инъекцию в полном адъюванте Фрейнда внутрибрюшинно, двукратно, с двухнедельным интервалом. Бустерную иммунизацию проводили через 1 месяц за три дня до слияния, используя ту же дозу антигена в физиологическом растворе. Антиген инъецировали в интраорбитальный венозный синус в объеме 0,1 мл и внутрибрюшинно - 0,2 мл.

При скрининге в ИФА 215 выращенных гибридных клонов, 12 клонов (5,6%) продуцировали м-АТ, реактивные только в отношении специфического антигена, 11 клонов (5,1%) продуцировали м-АТ, которые связывались с обоими антигенами и м-АТ 5 клонов (2,3%) были реактивны только в отношении "нормального" антигена. Определение субклассовой принадлежности м-АТ показало, что 10 клонов (Хла-К-1, Хла-К-2, Хла-К-3, Хла-К-4, Хла-К-5, Хла-К-6, Хла-К-7, Хла-К-8, Хла-К-9, Хла-К-10) продуцировали антитела lgG1 субкласса, один клон (Хла-К-11) - lgG2b субкласса и один клон (Хла-К-12) - антитела lgG3 субкласса. Все м-АТ не обладали комплементсвязывающей активностью. м-АТ были активны в ИФА (титр варьировал от 1:80 до 1:2000), РНИФ и не преципитировали специфические антигены. Три гибридомы -Хла-К-1, Хла-К-11 и Хла-К-12 были клонированы методом предельного разведения, выращены в массовую культуру в большом объеме и использованы для получения асцитической жидкости на сенсибилизированных пристаном мышах линии BALB/c 2-2,5-месячного возраста.

М-АТ эффективно конъюгировались с пероксидазой хрена. Активность пероксидазных конъюгатов на основе МКА коррелировала с активностью немеченых м-АТ. В качестве антигенов исследованы инфицированные различными штаммами C.psittaci и С.trachomatis неочищенные желточные оболочки КЭ. Получена высокая активность и специфичность пероксидазного конъюгата как в отношении штаммов C.psittaci, так и С.trachomatis.

Далее представляло интерес изучить возможность использования м-АТ и м-АТ - конъюгатов для выявления хламидийного антигена при постановке ИФА в прямом "сэндвич" варианте. Установлено, что концентрация м-АТ, равная 1 мкг на лунку, была более оптимальной для "захватывания" антигена по сравнению с дозой 10 мкг на лунку. Наиболее эффективно "захватывали" антиген м-АТ Хла-К-2 и Хла-К-3, т.е. позволяли обнаруживать антигены даже в концентрации 0,05 мкг или 50 нг. Однако независимо от использованных «захватывающих» м-АТ пероксидазный м-АТ-конъюгат Хла-К-1 лучше выявлял иммунный комплекс.

При постановке ИФА и РНИФ с целью определения хламидийного антигена в органах экспериментально инфицированных животных для ИФА использовали м-АТ Хла-К-1 - пероксидазный конъюгат в рабочем разведении 1:800, а для РНИФ очищенные м-АТ Хла-К-1 в разведении 1:50. Результаты этих опытов, показали, что при помощи м-АТ можно выявить хламидийный антиген в патологическом материале в ИФА (титр антигенов варьирует от 1:5120 до 1:20480) и РНИФ.

При испытании м-АТ в ИФА с КА, обработанным протеина-зой К и периодатом натрия выявлено, что м-АТ Хла-К-1, Хла-К-11 и Хла-К-12 направлены к детерминантам чувствительным к протеиназе К и резистентным к периодату натрия, что подтверждает их белковую природу.

Для приготовления экспериментального диагностического препарата, выявляющего хламидии прямым иммунофлюорес-центным методом были отобраны м-АТ, обладающие широким спектром специфичности - м-АТ Хла-К-1 (lgG1), направленные к консервативным эпитопам МОМР. Полученные м-АТ предварительно были тестированы в ИФА и РНИФ с антигенами других видов микроорганизмов. М-АТ Хла-К-1 не взаимодействовали с ЛПС Mycoplasma pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella typhimurium, Brucella abortus и реагировали с использованными в работе штаммами видов C.psittaci и C.pecorum.

При исследовании клинических препаратов экспериментальным иммунофлюоресцентным диагностикумом ХламиОрн и коммерческим иммунофлюоресцентным набором JMAGEN Chlamydia (Англия) совпадение результатов наблюдали в 100% случаев.

Для сравнения чувствительности и специфичности экспериментального диагностикума ХламиОрн с аналогичными зарубежным и отечественным препаратами исследовали биологический материал от больных животных с использованием наборов JMAGEN Chlamydia (Англия) и ХламиСкан (Россия).

При исследовании патологического материала диагностикумом ХламиОрн и коммерческим набором JMAGEN Chlamydia совпадение результатов наблюдали в 100% случаев. При исследовании препаратов диагностикумом ХламиОрн и отечественным коммерческим набором ХламиСкан результаты совпадали только в 80% случаев. В остальных 4 (20%) случаях ХламиОрн также выявил хламидии, ХламиСкан показал отрицательные результаты.

Следовательно, полученная нами серия м-АТ к C.psittaci обладает способностью связывать хламидийные антигены в инфицированных клетках и тканях, что позволяет обнаруживать иммунный комплекс при иммунофлуоресцентном анализе. Это свойство м-АТ было использовано для прямого обнаружения хламидий в биологических материалах. Этот метод позволяет обнаружить вне- и внутриклеточно расположенные элементарные и ретикулярные тельца и включения хламидий в инфицированных клетках. Скрининг антихламидийных м-АТ ФИТЦ-конъюгатов выявил, что наиболее эффективным по способности выявлять хламидийные антигены в биоматериалах оказались м-АТ Хла-К-1. На основе м-АТ Хла-К-1 было создано несколько серий диагностического препарата и исследовано уже более 1000 образцов от больных животных. Было показано, что м-АТ ФИТЦ-конъюгатов являются высоко чувствительными и специфичными.

Таким образом, разработана технологическая схема получения диагностикума «ХламиОрн», заключающаяся в следующем:

1. Получение м-АТ: а) Восстановление гибридом из замороженного состояния; б) Получение асцитической жидкости; в) Выделение м-АТ; г) Контроль активности м-АТ.

2. Конъюгация м-АТ с флуорохромом: а) Очистка м-АТ; б) Добавление флуоресцеинизотиоцианата (ФИТЦ) к м-АТ; в) Очистка ФИТЦ-конъюгата от несвязавшегося красителя; г) Определение активности и специфичности флуоресцирующих м-АТ.

3. Лиофилизация флуоресцирующих м-АТ: а) Розлив препарата; б) Лиофилизация препарата.

4. Приготовление вспомогательных ингтедиентов: а) Приготовление растворителя; б) Приготовление жидкости для заключения препарата; в) Маркировка и упаковка препарата.

Этот диагностикум рекомендуется для использования в ветеринарных диагностических лабораториях, оснащенных люминесцентным микроскопом. На данный диагностикум разработана и утверждена научно-техническая документация (ТУ 9388-189-00494189-99). Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus.musculus L., используемый для получения монокпональных антител к Chlamydia имеет решение о выдаче патента на изобретение № 98123923/13 от 25.01.2000 г.

Эффективная профилактика и лечение хламидиоза животных зависит от постановки своевременного диагноза. Поэтому лабораторная диагностика хламидийной инфекции имеет важное значение и обеспечивает проведение этиотропной терапии и научно-обоснованных противоэпизоотических мероприятий.

Традиционные (вирусологические и бактериологические) методы диагностики возбудителей инфекций характеризуются значительной продолжительностью исследования, большой трудоемкостью, высокой себестоимостью и не всегда надежны.

Однако рост заболеваемости хламидиозом животных и человека в настоящее время требует применения принципиально новых ускоренных высокочувствительных и специфичных методов диагностики, позволяющих проводить раннее выявление инфекционного агента.

На сегодняшний день современные требования к лабораторной диагностике возбудителей инфекций следующие:

1. Абсолютная специфичность;

2. Чувствительность, гарантирующая обнаружение единичных копий микроорганизма;

3. Возможность количественного определения возбудителя инфекции в исследуемом материале;

4. Получение результата в течение одного рабочего дня;

5. Сравнительная простота подготовки исследуемого материала и проведение анализа с возможностью полной их автоматизации;

6. Низкая стоимость анализа;

7. Исключение возможности инфицирования персонала в процессе проведения анализа.

Вышеперечисленным требованиям наиболее полно отвечает метод диагностики, основанный на использовании ПЦР. Современными характеристиками которого в лабораторной диагностике инфекций является его быстрота, непревзайденная чувствительность и высокая специфичность, что позволяет надежно и к тому же количественно обнаруживать микроорганизмы, присутствующие в очень малом количестве (1-10 бактерий в пробе).

Несмотря на большое количество публикаций по применению метода ПЦР для детекции возбудителей инфекционных болезней и его очевидные достоинства, данный подход пока не нашел заслуженного практического применения. Общепринятым лидером, имеющим монопольный патент, по производству диагностических наборов методом ПЦР, является фирма Хоффман-Ля Рош. Однако завышенная стоимость разработанных ПЦР-наборов (цена набора на 96 исследований в зависимости от инфекции от 1800 до 3000 $) не позволяет широко использовать данный метод в практике. Поэтому создание недорогих и качественных отечественных тест-систем для обнаружения различных микроорганизмов является актуальной задачей.

ПЦР благодаря высокой чувствительности и быстрой детекции без этапа культивирования, позволяет преодолеть традиционные трудности при лабораторной диагностике хламидиоза. Выбор оптимальной подготовки образца для ПЦР является не единственным условием для получения достоверных результатов. Вследствие этого для повышения чувствительности и специфичности реакции необходимо оптимизировать условия амплификации, включающие: выбор наиболее специфичных праймеров, реагентов реакционной ПЦР-смеси и их концентрации, подбор оптимального температурного режима выполнения реакции.

В связи с этим, теоретическая специфичность предложенных праймеров была изучена с помощью компьютерных систем FASTA и BLASTA on line. В результате этой работы была показана гомология выбранных олигонуклеотидов с геном МОМР и не обнаружено их значимой гомологии с нуклеотидными последовательностями других групп вирусов, бактерий или последовательностями эукариот. Таким образом, предложенные праймеры, исходя из теоретических расчетов, должны обладать 100% специфичностью. Необходимо отметить, что праймеры были выбраны на столь удаленном расстоянии друг от друга не случайно. При сравнительном анализе четырех консервативных областей мы остановили свой выбор на наиболее удаленных друг от друга последовательностях для того, чтобы в результате ПЦР получать фрагмент гена МОМР максимальной длины - удобной для последующего рестрикционного типирования.

Согласно разработанной схеме ПЦР-детекции, после первой стадии ПЦР-амплификации с родоспецифичными праймерами проводится амплификация с одним общим и по отдельности с каждым из видоспецифичных праймеров. Длина амплифицируемых фрагментов гена МОМР составляла для С.рв^аа - 1033 п.н., а для С.ресогит - 1036 п.н.

При оптимизации ПЦР в экспериментах с препаратами ДНК и штаммами хламидий, а также с клиническим материалом от кошек и птиц, выбранные праймеры обеспечивали выявление порядка 0,1 пг ДНК или 10-100 хламидийных телец/мл. Следовательно, праймеры на основе МОМР обеспечивают высокую чувствительность реакции. Этот вывод совпадает с мнением ряда авторов, таких как РавтиБвеп Б.и. е1 а1., 1991; В.КаКепЬоеск а1., 1992; 1993; ГМ.ЭЬееЬу е! а!., 1996 и т.д. (191; 192; 193; 275)

В настоящее время ПЦР применяется для детекции большей части патогенных микроорганизмов. Однако при работе с клиническим материалом исследователь сталкивается с рядом сложностей, которые заключаются в наличии веществ, ингибирующих реакцию и повреждающих ДНК-мишень.

Поэтому следующая задача заключалась в выборе и оценке соответствующих способов подготовки проб на штаммах и клиническом материале, т.к. чувствительность ПЦР-анализа при установленных оптимальных параметрах реакции зависит от процедуры подготовки исследуемого материала, включающей экстракцию ДНК-мишени и очистку пробы от веществ, ингибирующих ДНК-полимеразу (182). Для этого были выбраны несколько принципиально отличительных подходов, используемых в настоящее время различными исследователями для очистки тестируемого материала и выделения ДНК: 1) щелочной лизис с фенол-хлороформовой экстракцией и осаждением ДНК этанолом; 2) лизис неионными детергентами с протеиназой К; 3) лизис гуанидинтиоционатом с нуклеосорбцией на силикагеле.

После тестирования пяти штаммов С.рвМаа и С.ресошт было сделано заключение, что все указанные выше способы подготовки проб обеспечивают одинаковый уровень чувствительности - 10 м.к./см3. Однако, чтобы иметь полное представление об эффективности данных методов очистки ДНК-матриц необходимо было исследовать хламидии в патологическом материале. ПЦР проводили с праймерами ОЫ-ОЬЗ. При сравнивании различных способов подготовки клинических проб (соскобы со слизистой глаза и клоаки), наилучшие результаты получены при использовании методов нуклеосорбции с гуанидинтиоционатом. Однако при использовании нукпеосорбента с частицами силикагеля размером 0,5-10 мкм (II) чувствительность метода наиболее высокая, а при использовании нукпеосорбента с частицами силикагеля размером 2-10 мкм (I) - гораздо ниже. Следовательно, это свидетельствует о неодинаковой сорбционной активности испытанных марок силикагеля в отношении фрагмента гена МОМР, являющийся в данном случае ДНК-мишенью. Поэтому, очевидно, что нуклеосорбент (II) обеспечивает лучшую сорбцию за счет более оптимального размера частиц (0,5-10 мкм). Способ подготовки проб с помощью фенол-хлороформовой экстракции и осаждения нуклеиновых кислот этанолом был недостаточно эффективным, что наблюдалось в получении трех ложноотрицательных результатах, видимо вследствие возможности ингибирования реакции остатками фенола и потере ДНК на этапе преципитации. Также в одном случае способ подготовки проб, основанный на применении лизирующих буферов с протеиназой К, оказался неэффективным.

Таким образом, в результате тестирования известных способов подготовки биологического материала для ПЦР, исследуемого на наличие C.psittaci, было установлено, что при обработке соскобов с конъюнктивы у кошек и клоаки у птиц наилучшие результаты были получены при использовании гуанидинтиоционата с нуклеосорбентом (II).

В процессе выполнения настоящей работы, исследование материала от животных проводили методом ПЦР в сравнении с традиционными подходами: культуральным методом, методом ПИФ, окраской по Романовскому-Гимзе и РСК. Полученные результаты позволили охарактеризовать диагностическую чувствительность и специфичность данных подходов. Так, чувствительность морфологического метода составила - 40%, культурального - при первичном высеве 67%, иммунологического - 93%, РСК - 29% и ПЦР -100%. Наши результаты совпадают с данными по изучению чувствительности и специфичности различных диагностических тестов, полученными такими авторами как П. Вяянанен, 1987; C.M.Black, 1997 и т.д. (12; 92)

Таким образом, впервые в РФ проведен ПЦР-анализ по выявлению хламидийной инфекции у животных, обладающий более высокой чувствительностью и специфичностью по сравнению с другими общепринятыми методами. Подобранные праймеры, оптимизация условий ПЦР и этап подготовки проб взяты за основу при конструировании диагностических ПЦР-тест-систем для детекции Chlamydia и идентификации C.psittaci, C.pecorum.

Использование данных препаратов в ветеринарной лабораторной практике даст реальную возможность в короткие сроки (всего за 3-4 часа) при относительно не сложной методике обнаруживать наличие ДНК хламидий в исследуемом материале. Широкое распространение, разнообразие хламидийных инфекций, возможность носительства и длительное персистирование возбудителя инфекции определяют необходимость проведения мониторинга за различными штаммами разных видов хламидий, включающее их типирование с целью определения путей распространения инфекции и прогнозирования потенциальной опасности для человека и животных. Общепринятые методы диагностики и типирования хламидий, основанные на фенотипическом выражении биологических свойств, не всегда дают объективную характеристику циркулирующих в природе штаммов. Так, например серотипирование часто не позволяет проводить внутривидовую дифференциацию штаммов C.psittaci и C.pecorum по ряду причин. Серотип определяется поверхностными антигенами, подверженными изменчивости. Смена антигенного состава приводит к появлению штаммов, для которых не разработаны серотиповые сыворотки, поэтому современная микробиология использует специфические методы молекулярной биологии, которые могут по-новому раскрыть структурные особенности клетки и механизмы распространения патогенных микроорганизмов. В связи с этим, в диагностике и наблюдении за рядом инфекций широкое распространение получили молекулярно-генетические методы, характеризующие возбудителей инфекционных заболеваний по особенностям нуклеотидного состава ДНК, вне зависимости от проявления биологических свойств. Поэтому наши дальнейшие исследования заключались в адаптации метода генотипирования - рестрикционного анализа ампликонов, полученных в результате проведения ПЦР и изучения возможности его применения для внутривидовой дифференциации штаммов хламидий.

В рестрикционном анализе штаммовые различия определяли по характеру расщепления продуктов ПЦР специфическими эндонуклеазами, специально подобранными для этих целей. Генотипирование с помощью рестрикционного анализа штаммов С.рв^аа, выделенных от разных видов животных показало, что полученные рестрикты не всегда совпадали с построенными теоретическими рестрикционными картами и имели отличия. Так, штаммы К-8 и Калининский, были близки к теоретической карте штамма В 577, однако отличались отсутствием нескольких полос на уровне 100-50 п.н.

Также были исследованы штаммы К-1 и Рерп. При тестировании этих штаммов С.рв^аа получены гомологичные рестриктные карты.

При рестрикции шести штаммов хламидий (66Р130, 171 OS, L71, Fepn, В577, 6ВС) показано, что популяция С.psittaci гетерогенна по генетической структуре.

Полученные результаты согласуются с данными других авторов (193, 295) и свидетельствуют, что рестрикционный аназиз в целом отражает структуру генома бактериальной клетки и является одним из необходимых инструментов для внутривидового типирования для получения объективной оценки за циркулирующими штаммами микроорганизмов.

В заключение, хотелось бы отметить, что внедрение в лабораторную практику молекулярно-биологических методов диагностики и типирования даст возможность микробиологам изучать и другие инфекционные агенты. Метод уже получил широкое распространение и успешно зарекомендовал себя в ветеринарной практике при обнаружении Mycobacterium bovis и tuberculosis, Brucella sp., Listeria monocitogenes, Mycoplasma sp. и т.д. Использование ПЦР-анализа в диагностических ветеринарных лабораториях обеспечит быструю и объективную постановку диагноза, что приведет к своевременной и эффективной терапии и научно-обоснованной профилактике разных инфекционных заболеваний. Не вызывает сомнения, что в ближайшем будущем молекулярно-биологические методы займут одно из ведущих мест в диагностике инфекционных заболеваний и в системе эпизоотологического надзора.