Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммунобиологическая характеристика хламидий, уосвершенствование методов и средств лабораторной диагностики хламидиозов

КАЗАНСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ имени Н.Э. БАУМАНА

На правах рукописи

ШАФИКОВА РИСАЛЯ АХАТОВНА

1ШУН0ЕГО10Е'1ЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХЛАМИДИП, УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ И СРЕДСТВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХЛАШДИ030В

16.00.03 - ветеринарная микробиология,вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора ввтеринарннх наук

Казань 1991

Работа выполнена в лаборатории вирусологии Казанского ордена Ленина вет ринарного института имени Н.Э.Баумана и Всесоюзного научно-исследовательского 'ветеринарного института Главного управления при Государственной комиссии Совета (Министров СССР по продовольствию и закупкам.

Научный консультант - заслуженный деятель науки РСФСР и ТАССР, доктор ветеринарных наук, профессор Равилов А.З.

Официальные оппоненты:

1. Доктор ветеринарных наук, профессор Госманов Р.Г.

2. Доктор медицинских наук, профессор Амфитеатрова Н.Ф.

3. Доктор ветеринарных наук Ковалев В.1.

Ведуая организация - Всесоюзный научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко

Защита состоится " № " 1991 г. в /О час.

на заседании специализированного совета Д 120.22.01 при Казанском ордена Ленина ветеринарном институте им. Н.Э.Баумана (420С74, Казань-74, ветеринарный институт).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского ордена Ленина ветеринарного института имени Н.Э.Баумана.

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета, доцент

Угршов В.И.

I. ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Продовольственная программа страны -одно; из ведущих направлений научно-технического прогресса, на основе которого происходят коренные преобразования в народном хозяйстве. Она призвана обеспечить устойчивое снабжение населения всеми видами продовольствия за счет повщпения сохранности, продуктивности сельскохозяйственных животных и элективного ветеринарного обслуживания отрасли. При этом важное значение имеет разработка новых методов я средств диагностики, лв.ения и профилактики инфекционных заболевай: 2 сельскохозяйственных тавотных.

Известно, что хламидии играют большую роль в патологии животных, вызывая остро, хронически и латентно протекающие болезни. Клинически хламидиозы цроявляются в зиде абортов / овец, коров, коз, свиней и лошадей ; рождения нежизнеспособного или слабого молодняка; пневмонии и артритов у телят, ягнят, поросят и жеребят; энтеритов, эн-эфаломиелитов и конганктивптов у телят. Наиболее значительный экономический "-дерб испытывает нивотково; • ство из-за больших потерь ожидаемого приплода в результате шс-совых абортов и гибели молодняка в первые дни после рождения. В последние годы установлено, что аборты хлаг/идийной этиологии распространены в звероводческих хозяйствах, особенно среди серебристо-черных лисиц и песцов (Равалов Р.Х. и др., 1288), что наносит немалый урон эконгшке страны.

Хламидии представляют такяо потенциальную угрозу здоровью человека, поскольку не исключено заболевание лхщей в резул-^аге контакта с животными и птицами, пораженными хтампдиями.

Лабораторная диагностика хламидиозов основана на: обнгпучении хламидий в тканях пораненных рганоЕ путем обычной млкрэ-скопии и в реакции иммунофлуоресценцил (РКФ) выделении возбудителя на куриных эмбрионах (КЭ) и его цдентаевлкацяи вирусологическими и серологическими методами; выявлении нарастания тигров комплементсвязыЕаюцпх аг-ител в спворотке крови болькнх пли переболевших .лзвотных.

В течение длительного времени ветеринарная служба страны для серологической диагностики хлашдпозов использовала медицинский орнитозный диагностику!,», который по отношению к возбудителям хламддяозов гагеог гых является гэгерологичш.\: я из-за

низкой чувствительности и специфичности не позволяет выявить полностью хронически и латентно «Зольных животных (хламидионосителвй),

В последнее время для лабораторией диагностики бактериальных и вирусных болезней предложена реакция энзиммеченых антител (РЭМА), основанная на применении меченых ферментом антител и антигенов (И.Ф.Вишняков, Л.Я.Цыбанова, 1983; Г.Х.Ильясова и др., 1983; Н.Я.Зуева и др., 1984,19^.5; М.А.Домейка, 1985; Е.И.Титова и др., 1987; E.C.Beuvery et al. , 1983; B.Hivetz et al. , 1985; V.P.Caporale et al. , 1986; T.M.Dani'il.S.li.Debanae , 1987 И др, К ее преимуществам относят высокую чувствительность, простоту постановки и учета, воспроизводимость, возможность обследования большою количества проб в короткий срок. В специальной литература имеются сообщения о применении РЭМА для выявления хламидийных антител и антигенов в исследуемом материале и о создании кабороп диагностикумов, которые, к сожалению, изготовлены из представителей Chl.tracbodatis и используются только в медицинской практике ( K.C.Uohanty et al. . 1986 ; F.Pothier.A.Kamierczalc, 1986 ; S.S.Hipp et al., 1987 ; D.C.YÏ.Mabey et al., 1987 И др.). Следует отметить, что несмотря на свою высокую чувствительность и специфичность и другие преимущества, в настоящее время этот метод еще не нашел широкого применения в ветеринарных лабораториях, продолжаются испытания различных модификаций PSÎ.1A в сравнении с другими тестами (М.А.Домейка, И.ИЛарских, 1987; И.И.Багдонас и др., 1988; ti.Pepia et al, I985;P.U.Finney,A.C.Buchell , 1986; R.Piccini et al. . 1987; N.Schmeer et al. , 1987;A.Souriau, A.Kodolakie , 1986 ; j.A.Perez-liartinez et al., 1986 и др.).

Перспективным направлением в диагностике хламидиозов является использование моноклональных антител (МКА), которые обладают узкой специфичностью по сравнению с обычными антисыворотками и позволяют выявлять антигенные различия не только между видами хламидий, но и меэду отдельными штаммами возбудителей хламидиозов (J.Alexander et al. , 1985; D.A.Hawking et al. , 1985 ;

D.C.W. Itabey , 1966; D.Heming.K.Nielsen , 1987; C.C.Kuo,

E.Ï.Chi , 1987 ; J.D.Patel et el. , 1988 И др.).

В связи с этим для более полного и своевременного проведения мер борьбы и профилактики в неблагополучных хозяйствах необходимо совершенствовать существующие и разработать новые методы и средства диагностики хламидиозов.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - изучить иммунобиологические свойства хлашдий, усовершенствовать существующие, разработать новые методы и средства лабораторной диагностики хламидиозов животных.

Задачи исследований.

1. Изучить иммунобиологические свойства шта"\юв хлямадий-зозбудителсй хламидиозов сельскохозяйственных животных и пуганых зверей.

2. Выяснить ультраструктурную характеристику взаимодействия хлаыидпй с клеткой-хозяином на лабораториях моделях.

3. Изыскать способ изготовления антигенов и иммунной сыворотки для серологической диагностики хламидийннх инфекций яи-вотных, используя возбудителя аборта овец.

4. Наладить производство флуоресцирующих иммуноглобулинов для диагностики хламидиозов животных.

5. Разработать РЭМА в качестве диагностического теста при хламидиозном аборте oí- ;ц.

6. Сравнительно испытать созданные наборы хламидиЯных диаг-ностикумов.

7. Получить моноклональныэ антитела к возбудители хлампдкоз-ного аборта овец, изучить их свойства.

Реаение гоставленных задач позволило сформулировать следующие основные научные положения, надвигаемые на защиту:

- выделение я идентификация штаммов возбудителей хлгмядпо-зов рогатого скота, пушных зверей ;

- результаты сравнительного изучения иммунобиологических свойств штаммов хламидий ;

- научно-теоретическое обоснование взаимодействия хламидий с клеткой-хозяином ин витро и пн виво ;

- способ получения ко.чялемектсвязыЕающэго антигена из возбудителя хламидиозного аборта овец, разработка научно-практических и технологических оснс» изготовления на его основе высокс-актпвнпх и с..ецнйичсс::их диагпостикуков (наборов) ,чля серологической диагностики хлаыидаозов сельскохозяйственных яивотных ;

- создание набора гёлуоресцируюцЕХ иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозов сельскохозяйственных яивотных ;

- разработка РЭМА в качестве метода диагностики хламидиозно-го аборта овец, наборов для выявления антител и антигенов, нормативно-технической документации по их изготовлению, контролю и применению;

- получгзие моноклональных антител к возбудителю хламидиоэ-ного аборта овец и их характеристика.

Научная новизна. Выделены возбудители при остром и латентном хламидиозе рогатого окота, пушных зверей; сравнительно изучены биологические свойства ряда штаммов хламидий (иммупомодулиругацее свойство и влияние на функциональную активности макрофагов изучены впервые), на основании этого часть штаммов в дальнейшем использована в качестве производственных, часть - признана в качестве изобретения (положительное решение Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий на выдачу авторского свидетельства ог 9 и 15 февраля 1990 г.).

Изыскан способ изготовления высокоактивного и специфического хламидийного антигена (авторское свидетельство .'3 543259 от 21 сентября 1976 г.). Разработаны научная основа технологии производства, • ормативно-техническая документация по изготовлению, контролю и применению наборов антигенов и сывороток для серологической диагностики, а также флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозов сельскохозяйственных кивотных, налакено плановое серийное производство вышеназванных наборов диагностикумов на биопредприятии.

Разработана РЭМА в качестве диагностического теста при хла-мидпозном аборте овец, созданы два набора диагностикумов для выявления антител и антигенов; составленная нормативно-техническая документация по изготовлению, контролю, применению опытных серий наборов утверздена ГУБ Госкомассии Совмина СССР по продовольствию и закупкам 19 декабря 1990 г.

Установлена пригодность планшетов, иммобилизованных антигеном из возбудителя аборта овец, для диагностики хламидиозов крупного рогатою скота, свиней, серебристо-черных лисиц в РЭМА при использовании соответствующих антивлдового перокевдазного кокъюгата и контрольных сывороток.

Впервые в отечественной ветеринарной науке получены МКА к возбудителю хламадиозного аборта овец, изучены их свойства, определена возможность применения в РИФ и РЭМА.

Практическая ценность раДогн. Результату исследований вошли в разработки: I) Временное наставление но постановке и учету реакции связывания комплемента (РСК) и реакции длительного связгаза-ния комплемента (РДСК) при диагностике энзоотичэского аборта овец и коз (утверздено ГУВ ГЛСХ СССР I августа 1976 г.); 2) Инструкция по профилактике и ликвидации хламидиозного (энзоотического) аборта овец и коз (утворадена 173 МСХ СССР 12.02.1981 г.); 3) Методические указания по лабораторной диагностике хламидиозного аборта овец и коз (утверадекы ГУВ МСХ СССР 28.10.1983 г.); 4) 'Яетодиче-ские указания по лабораторным исследованиям на хламидийнко инфекции сельскохозяйственных животных (утверад«ны ГУВ МСХ СССР 5.04. 1986 г.); 5) Временная инструкция по изготовлению и контролю набора антигенов и сывороток для лабораторной диагностики хламидиозного аборта овец и коз (утвервдена ГУВ МСХ СССР 27.12Л°82 г.) ; 6) Технические условия на набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозного аборта овец и коз (угверздекы ГУВ МСХ СССР 27.12.1982 г., зарегистрированы Государственным Комитетом стандартов 22.0^.1983 г., й 2342226); ) Технические условия на набор флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозного аборта овец и кез (утверя-дены ГУВ МСХ СССР 27.12.1982 г., зарегистрированы Государственным Комитетом ставдартов 22.02.1983 г., 1в 2342231); 8) Временное наставление по применению набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозного аборта овец я коз (утверждено 1УВ МСХ СССР 2Г.01.1983 г. ) ; 9) Временное наставление по применению набора флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозного аборта оззц и коз (утвервдено ГУВ МСХ СССР 21.01.1983 г.) ; 10) Временная инструкция по изготовлению и контролю чабора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозного тборта овец и коз и набора флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозного аборта овец и коз (утперздена ГУВ Госагропрома СССР 30.1Г. т<387 г.); II) Дополнения к 'Временной инструкции по изготовлению и контроль набопа ан.лгенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозного аборта овец и коз и набора флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозного аборта овен и коз'' (утверждены ГУВ Госагропрома СССР 10.07.1988 г.); 12) Технические условия на набор антигенов и сывороток для серологической

диагностики хламидиозов сельскохозяйственных тавотных (утверждены 1УВ Госагропрома СССР 22.07.1988 г., зарегистрированы Государственным Комитетом стандартов 18.08.1988 Г.,№ 058/164510); 13) Технические условия на набор флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрол .ных сывороток для диагностики хламидиозов сельскохозяйственных нивотных (утвервдены ГУВ Госагропрома СССР 22.07. 1988 г., зарегистрированы Государственным Комитетом стандартов 13.08.1988 r.,J* 058/1^5511); 14) Временное наставление но применению набора антигенов и сывороток для серологияесксй диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных (утнервдено ГУВ Госагропрома СССР 19.07.1988 г.); 15) Временное наставление по применению набора флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток'для диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных (утверздено 1УВ Госагропрома СССР 19.07.1986 г.) ;

16) Инструкция по профилактике и ликвидации хламидиоза животных (утвэрвдена Г/В Госагропрома СССР 8.08.1989 г., И 4323) ;

17) Временная инструкция го изготовлению и контролю препаратов для диагностики хламидиозного аборта овец в РЗ'ДА (набора) (утвержден? директором ВНИЗ" 20.11.1989 г.); 18-21) Технические условия на опытную партию препаратов для диагностики хламидиозного аборта овец в РЭМА путем выявления антител (набор)» Технические условия на опытную партию препаратов для диагностики хламидиозного аборта овец в РЭДА путем выявления антигена (набор), Временное наставление по применению препаратов для диагностики хламидиозного аборта овец в РЭМА, путем выявления антител (набора), Временное наставление по применению препаратов для диагностики хламидиозного аборта овец в РЭМА путем выявления антигена (набора) (согласована с ВГНКИ 16.03.1990 г. и утЕерадены ГУВ Государственной комиссии Совмина СССР ио продовольствию и закупкам 19.12.1990 г.).

Апробация работы. Основные результаты исследований, предлагаемые способы изготовления диагностических препаратов, степень их активности и специфичности прошли комиссионную проверку (1974,1975,1976 Д98С,1988,1989, КВИ, НИЕИ, ВШВИ, г. Казань; 1975, ЦВЛ МСХ СССР; 1976,1980, Ставропольская краевая ветлабо-ра тория ЫСХ РСФСР; 1980.1931,1986,1988, Приволжская и Херсонская биофабрпки Главбиопрома МСХ или Агропрома СССР). Материалы доложены на ветеринарной секции Научно-технического Совета МСХ СССР (16 декабря 1981 г.), ежегодны:: научных сессиях : конфе-

ренциях КВИ, ВДВИ, ВНИЕИ по итогам ИГР (1973-1989 гг.).республиканских научно-технических конференциях по вопросам ветеринарии и зоотехнии (г. Казань, 1980,1982), научно-производственных конференциях по теоретическим и практическим вс росам етерина-рии и зоотехнии (г. Казань, 1989, 1990 г.), заседаниях методического совета ВГНКИ ветпрепаратов (г. Москва, 1970,1990 гг.), Всесоюзных наглых конференциях по: ветеринарной нрусологли (г.Владимир, 1976 г., Казань, 1980 г.), научным основам технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов (г.Г.'осква, 1978,1983,1987 гг.), болезням овэц (г. Чита, 1980 г.), разработко, апробации и государственному контролю ветеринарных препаратов (.Москва, 1981 г.), проблемам эпизоотологии (Казань, 1983 г.), эпизоотологии, эпидемиологии, средствам диагностики, терапии и специфической профилактики пнг?р"ц:10мп!х болезней, обдих для человека и гшвопшх (Львов, 1988 г.), профилактике, диагностике и мерам борьбы с ип$окцнонни'.!Г!, инвазионными и незаразными заболеваниями сельскохозяйственных животных, птиц, пчел и рыб при ин'иксивном ведении хозяйс та (Баку, 19Я9 г) зональной научно-технической конференции гго актуальным проблемам интенсификации ядвотноводства... (Троицк, 1989 г.), I Всесоюзном иммунологическом съезде (Сочи, 1989 г.). Наборы хламидий-ных диагностикумов в 1982 г. экспонировались в павильоне

"Ветеринария" ВДНХ СССР и отмечены бронзовой медэяью ВДНХ СССР.

Публикация по темэ работы. По материалам диссертации опубл"-кованы 42 статьи, 3 временные инструкции, С тохппческих условий, 6 наставлений по применению, 2 методические рекомендации, 2 инструкции по профилактике и ликвидации хламиднозов. "здяцц в соавторстве книги: "Хл2мидиозы рогатого скота и мер:г борьбы с ними" (5,5 п.л., Казань, 1980 г.), "Хлашднозы содьскохозл^от-венных яивотннх" (11,76 п.л., Москва: Колос, т98-''1 г.). Получены I авторское свидетельство Л 5-13259, 3 полокнтелъшх решения пп выдачу авторского свидетельства от 9 и 15 (Тевралл, 22 :пр?а 1990 г., два удбетоверения иг рационализаторские гсредло-еннл.

Объем и структура диссертации. Диссертация л зле лш на 45". страницах машинописного текста и состоит из введения, обзор- литературы, материалов и методов исследований, собсгззнных исследований (7 глав), обсуждения, выводов, предложений для практики и указателя литератур:: (вгэго 613 источников, в том числе 385 иностранных авторов). Работа иллюстрирована 63 таблицами и 44

рисунками, при этом текстуальная часть диссертации состоит из 4G2 страниц. Прилагаются разработанные нормативно-технические документы, авторское свидетельство, положительные решения на выдачу авторского свидетельства и акты комиссионных испытаний.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований. Работа выполнена в соответствии с планом НИР в период 1973-1990 гг. в лаборатории вирусологии Казанского ордена Ленина ветеринарного института им.Н.Э. Бауыанг и Всесоюзного научно-исследовательского ветеринарного института, лаборатории гибридных культур института вирусных препаратов АМН СССР, а так?.г в условиях хозяйств, неблагополучных по зсламидиозам.

В опытах были использованы экспериментально инфицированные и естественно больше животные: овцы (1945), крушшй рогатый скот (1388), свиньи (428), лошади (12 гол.), кролики (87 гол.), морские свинки (345 гол.), мыши (1602 гол.), белые крысы (421 гол.), серебристо-черные лисицы (130 гол.), песцы (23 гол.), норки (18 гол.); применяли также 6-7-дневные КЗ (69500 шт) и культуры клеток (18700 фл.).

При выполнении работы были использованы 14 штаммов возбудителей хламидиозов сельскохозяйственных животных, птиц, пушных зверей ( Chl.psitteci ) и I - венерической лимфогранулемы ( Chi.trachomatis ). Все штаммы адаптированы к размножению в желточной оболочке КЗ.

Для выделения хламидий использовали патологические материалы от больных и переболевших хламидиозом животных: органы абортированных плодов, плаценту, влагалищные истечения, молозиво абортировавших животных, сперму производителей.

Идентификацию штаммов хламидий проводили по морфологическим и тинкториальным свойствам микроскопически, по групповой антигенной специфичности - серологически (в РИФ и РСК), используя гипериммунные сыворотки морских свинок, полученные к свежевыде-ленным штаммам хламидий и группоспецифический антиген из них.

Исследования проводили с помощью вирусологических (инфицирование КЭ, культур клеток, животных), серологических, иммунологических (определение антителообразующих клеток (АОК), функциональной активности макрофагов и др.), физических (центрифугирование, ультрацентрифугирование, электронная микроскопия,

изучение электрофоретической подвижности и др.), патоморфологи-ческих, гистологических и генетических методов.

Параллельно с лабораторными исследованиями изучали в производственных условиях эпизоотическую ситуацию хозяйств, осуществляли клиническое обследование животных, патоморфологическое исследование органов и тканей убитых и павших животных (ТАССР, Карельская АССР, РСФСР и др.).

Результаты исследований статистически обработаны по методам Ь.йееа.Н.МиепсЬ (1938), И.Бах1ау (1959), М.Л.Беленького (1963), Б.Ф.Семенова (1965) и Т.С.СаДцуллшга (1981).

Результаты исследиваниГ

Изучение биологических свойств штаммов хламидий, изолированных от рогатого скота и пушных зверей.

Вии изучены следующие биологические свойства тт~ммов хламидий:

1) патогенность для КЗ, белых мышей и морских свинок при разных способах заражения ;

2) способность размножаться в культурах к. зток и действие физико-химических факторов ;

3) иммуномодулирупдее свойство хяамидий п их антигенов ;

4) влияние на функциональную активность, электрофоретическую подвижность (ЭФЛ) перитонеалышх макрофагов морских свинок и белых мышей;

5) взаимодействие с клеткой-хозяином на лабораторных модегтх ин витро и ин виво ;

6) антигенная активность.

Сравнительная оценка штаммов хламидий по отдельным генетическим признакам выявила следующее. Все изучаемые штаммы одинаково хороио размножались в эпителиальных клетках желточнои оболочки КЭ, вызывая генерализованную инфекцию.ч накапливались в тигре Ю5 - Ю7 ЗДЛ50/0,3 мл.

Результаты определения чувствительности белых мышей и морских свинок к введению 10 штаммов возбудителей хламидкозов рогатого скога и лушных зверей показали, чп. эти штам,\.. неодинаковы по патогенности. Наименьшая патогенность для белых мышей была характерна при подложном способе введения, наибольшая - при пн-траназаяьном. Гак, процент гибели белых мышей при инъекции различных штаммов в нос вар*провал от 20 до 100, в мозг и ЕкутриЕен-

но - от 0 до 80, подкожно - от 0 до 50. Из числа изученных штаммов наибольшая патогенность выявилась у возбудителей хла-мидиозов серебристо-черных лисиц и песцов - при интраназальном, - церебральном и -венозном путях гнокуллции они вызывали 10СЙ-ную гибель белых «шей. Результаты изучения патогенности птам-мов хламидий при внутрпбршинном заражении дали возможность разделить их на 3 группы: I) апатогенные (.% гибели = 0) ; 2) среднепагогенные {% гибели 4 50); 3) с выраженной патоген-ностью {% гибели > 50). Анализ показал, что к первой группе отноиггся штаммы Стемп и HL-84 возбудителей аборта овец и серебристо-черных лисиц соответственно, к третьей - штамм Л 250 врзбудителя аборта кор^а. Остальные 7 штаммов хламидий относятся ко второй группе. Различия в вирулентности штаммов хламидий, выделенных от овец, телят, голубей, для мышей беспородных и пород Porten , Swiss И СБА выявили J.Wehr (1980), I.E. Anderson (1986).

Изучение спектра патогенности штаммов хламидий для морских свинок показало их меньшую чувствительность по сравнению с белыми мытыми - процент гибели животных при введении в нос и мозг не превышал 50. Лишь штамм EI-84 возбудителя аборта сере-бристо-чорных лисиц, в отличие от других штаммов хламидий, вызвал 100^-ную гибель морских свинок при подкожном заражении.

Различия в клиническом проявлении выявлены при экспериментальном воспроизведении аборта на овцах и серебристо-черных лисицах при использовании штаммов Урыанаево-70 и ЕЛ-84 соответственно. при этом у 2 из 5 зараженных овец наблвдался симптоматический аборт, у I - рождение слабого ягненка и его гибель, У 2 - "нормальный" окот. У серебристо-черных лисиц, наряду с симптоматическими абортами и мертворовдениями .выявлены скрытые (полные и неполные) аборты, что было доказано при патолого-анатомпческом исследовании 'обнаружением на стенке матки кольцевидных участков, на которых имплантировались плоды. При неполном скрытом аборте у подопытных животных замечено большее количество таких кольцевидных участков на стенке матки, чем число родившихся 'донят. Возникновение скрытых абортов является доказательством проникновения хламидий через плацентарный барьер и развития внутриутробной инфекции плода с последующие его рассасыванием. Причем, скрытые аборты в большем проценте случаев нэблвдались при интраперитонеальной инъекции хлам/дий, о чем

свидетельствуют сравнительное показатели плодовитости лисиц: на I подопытную самку получено по 2,25 щенка, тогда как на основной лисьей ферме - по 5,35 щенка на I осемененную самку; при внутрибргашинном введении хламздий лисицам со срсом беременности 10-15 дней получено по 0,8 щенка на самку, со сроком беременности 30-35 дней - 2,8 ; при комбинированной (ннтра-трахоально и подкожно) инокуляции эти цифры рар"ч 2,4 и 3,0 соответственно. Выделение а идентификацию, изучение биологических свойств возбудителей хламиднозов пуишх зрс-pel проводил совместно с Р.Х.Равиловым.

Серия экспериментов бала посвящена и. учению способности возбудителей хламидиозного аборта овец и коз размножаться в культуре клеток. Результаты наших исследований показали, что штаммы возбудителей абортов овец и коз не размножаются в линиях клеток ПЯЭК, ППЭО, ППЭС и ПП, а такяе в первичнотрипсинизиро-ванкых фибробластах и клетках хорноналлантоисной оболочки (ХАО) КЗ в пределах 3-12 пассаяей. Установлена способность щтамкоп возбудителей аборта oi ц размножаться в культ-ре эксплантатов тканей и клеток ХАО КЗ, лоддеряивзеых в виде Е^веси путем перы-незивания, с сохранением антигенной активности после 19 пассажей.

Показано, что добавленио в поддерглиавдув среду ДЕАЕ-декст-рана в дозе 50-100 мкг/мл, а также сочеташюа применение центрифугирования инокулума на клетки и добавления ДЕАЕ-декстрана стимулирует размножение штаммев возбудителя аборта овец в линии клеток ГГПЗС и первичных фибробластах КЭ. Выявлено положительное влияние ДЕАЕ-декстрана и ь -изолойцина в дозе 20-10 мкг/мя на развитие возбудителя аборта овец в культуре эксплантатов тканей КЭ. На необходимость применения "принудительной" адсорбщ.^ хла-мидий на клетки путем центрифугирования или добавления химических препаратов в поддерживающую сроду указывают многие исследователи, применяющие выявление цитоплазматических включений в культуре клеток в качестве диагностического теста в медицинской практике ( Г НоЪзоп , 1978; I.D.Paul 1982; J.^seler f 1983; S.F.Sabet et al. , 1984; T.S.K&skey , I9So и др.). Мкпкшю фибробласты (L -клетки) являются единственной линией клеток; на которых штамм возбудителя аборта овец без "прпнукденяя" и стимуляции прошел 101 пассах, сохранив свои исходные свойства (V.M.iJeoerra,J.Storz , 1974). Недавно J.A.Perez-Martinez,

¿■.Б^гг (1986) сообщили о зависимости чувствительности ь -клеток к хламидиям от штаммовой принадлежности. В своих опытах они использовали шгамми хладщдий, выделенные из абортированных плодов овец и коров, а также от животных, больных полиартритами другими формами хламздисзов. Первичным источником заражения клеток была взвесь инфицированных КЭ. Инфекционность хламвдий определяли по количеству образовавшихся включений в I мл. Отмечено, что абортогенные хламидии (биотип I) размножались до высокого титра и высокий урокай хламидий получали в последующих пассажах. Наоборот, штаммы хламидой биотипов 2,3,4, 5,7 и 8 не поражали клетка эффективно. Низкая степень поражения выявлялась в перво... пассаже, а в дальнейших пассатах ян-фекционность исчезала. Исходя из этих данных, авторы пришли к выводу, что не все штамш сы.р81«ас1 одинаково размножаются в культуре клеток.

Как ухе упоминалось, кроме изучения способности штаммов хламидий размножаться в культуре клеток, мы определяли их им-муномодулиругацую активность.

Поисчи кммуномодулирувдих препаратов имеют первостепенное значение для современной иммунологии, практической медицины и ветеринарии, поскольку эти вещества дают возможность осуществлять управление ходом иммунных процессов в организме, что необходимо для лечения и профилактики ряда заболеваний и патологических состояний.

В результате проведенных нами исследований получены данные, свидетельствующие о двояком действии возбудителе:! абортов овец и коров на развитие первичного иммунного ответа к чужеродному тимусзависимому ангигену-эритроцитам барана (ЭБ) в организме белых мышей в зависимости от дозы и срока введения по отношению к тест-антигену. Возбудитель аборта овец в течение первой недели подавлял этот ответ, в течение последующих 2-6 недель - стимулировал. Высокая доза патогенного для белых мышей штамма возбудителя аборта коров депрессировага иммунный ответ при инокуляции за и через 2 часа после тест-антигена, низкая - в эти сроки не влияла; иммунный ответ в течение 3 дне! после введения низкой дозы этого возбудителя был повышен. Аналогичные данные о зависимости имыуномодулирутацего действия от дозы, интервала ыевду ::ньекцией аденовируса, вирусов Коксаки а тест-антигена получили В.С.Низамов, И.Х.Шуратов (1979),

О.П.Шестенко, Е.Ф.Бочаров (1988).

Однократное введение эфирорастворкмого гермостабильного группоспецийического антигена возбудителя хламздиозного аборта овец стимулировало формирование АОК в сслезенкг белых клей, иммунизированных ЭБ. В дальне;1шем било выяснено, что увеличение количества АОК после инъекции группоспоцифического антигена хла-мидий связано с его способностью повисать функцпсчальную актив-кость макрофагов брюшной полости белых мыаей. На иммуностимулирующую и ангизнфехционяуп активность гликополипептидов клеточной стенки грамотрицагельных бактерий, слцерлааах кзто-дезокслокта-новую кислоту, указывают Ф.С.Носков и др. ,1984), В.Г.Квачов, Э.М.Попова (1988), Н.К.Токаревич и др. (1989), н.Вгаае,с.аа1а-ПОЗ (1283), И.КаЪо et а1. (1983), Е.ШЫ ей аХ.

(1984), .ГЛ/аушаск et а1. (1985), З.ЗсЬггиек е! а"1 . (1985) И др.

Велика роль иммуномодуляцпи при смешанных или ассоциированных инфекциях, часто встречающихся у сольскохозяйственных животных при современных оловиях содержания (Х.Г,Гаффаров и др., 1977; Р.Х.Хамадеев и др., 1983; Л.Кокипаткин и др., 1982; П.М.Ыятро<гднов, 1986; о.Р.Возлег , 1971; С.ЦоНщгЬу ,1978 ;

Л.Кауг , 1979; 17.Ы111ег ,1980; ей а1. , 1982 а др.)

*.К1е1зйе1п ей а1. (1983) с учетом результатов экспериментального воспроизведения пневмонии поросят и телят делают вывод, что скрыто протекающие хламидиозы являются провоцирующим «актором для проявления различных бактериальных инфекций, тогда как Р.НогасЬ, (1980) в своих опытах удалось продемонстряпо-вать обратное описанному - пастереллы усиливали проявление хламидийной инфекции у телят.

Помимо определения иммуномодулврущей активности возбудителей аборта овец и коров, мы изучали влияние их на функциональную активность перитонеальных макрофагов лабораторных животных. В этих опытах выяснили, что однократное внутрибпюшин-ноа введение возбудителя абота овец морским свинкам вызывает количественны; изменения клеточных олемекгоа порите зального экссудата (ПЭ) и функциональной активности свободных перитонеальных макрофагов - неспецифическую и специфическую сенсибилизацию организма. Результаты наших исследований показали большую выраженность процесса специфической сенсибилизации организма морских свинок: процент фагоцитоза макрофагами "нагруженных" возбудителем аборта овец ЭБ во все сроки превышал и контроль,

и уровень фагоцитоза интактных ЭБ. Наибольший процент фагоцитирующих макрофагов был установлен га 4-й и 14-й дни после заражения. Это явление, вероятно, объясняется опсонизирукхдим действием антител. Аналогичные данные пс гучены на белых мышах при инъекции воьоудителя аборта овец в дозе Ю7 ЭЛД50/0,3 мл. В своих опытах мы подтвердили результаты исследований Г.И.Ильина и др. (1969), Л.В.Солиловой-Боженко и др. (1974), выявивших, что процесс фагоците .а в иммунном организме в большей степени носит специфический характер.

В экспериментах по выяснению действия возбудителя аборта коров на функциональную активность макрофагов было выявлено, что способность макрофагов поглощать, переваривать зависит от количества возбудителя инфекции, а также от сенсибилизирован-пости организма, что было отмечено Г.И.Лариной и Е.Н.Левкович (1980) и др. Сенсисилизированность организма белых мышей очень четко выявилась при введении им 10^ ЛД^/О.З мл возбудителя аборта коров - был определен больший процент фагоцитирующих клеток по отношению к "сенсибилизированным" хламидиями ЭБ на 3-5 дни после заражения, то есть в сроки, когла в крови обнаруживаются антитела. А при инъекции белым мышам более высокой дозы хламидий (10^ ЛД5д/0,3 мл) количество лимфоцитов в ПЭ уменьшалось или поддерживалось на уровне контроля, что сопровождалось торыс-ением выработки антител. В то же время угнетения фагоцитоза гегерологичных эритроцитов перитонеальними макрофагами зараже'ных животных не отмечено, наоборот, он усилен. В.В.Варпш и Б.Ф.Семенов (1983) предположительно объясняют это явление выделением Т-лимфоцитами под влиянием возбудителя инфекции лимфокинов, которые угнетают антигенпредъявляшую фикцию некоторых субпопуляций ыононуклоарных клеток. ЗФП макрофагов белых мышей (изучена совместно с Р.Я.Гильмутдиновим) зависела от степени патогенности использованного штамма для этих животных. Например, при заражении белых мышей I и Ю4 ЛД50/0,3 мл возбудителя аборта коров была установлена взаимосвязь между ЭФП, процентом фагоцитирующих макрофагов и фагоцитарным числом; корреляция при первой дозе положительная, при второй - отрицательная. При введении белым мышам непатогенного для них возбудителя аборта овец корреляция мезду вышеперечисленными показателями чаблэдалась не всегда. Подобные данные получены Н.Н.За-строжновой и др. (1985), Б.АЛарановым при изучении взаимо-

связи изменения ЭФП и функциональной активности макрофагов под действием бактерий к их компонентов.

Кроме влияния на функциональную активность перитонеальных макрофагов,совместно с В.А.Шошокиным и 0.П.Ионной би~о изучено поведение хламидий при непосредственном контакте с фагоцитами ин витро а ин виво.

В предварительных опытах было выявлено, что ^-¡свитио возбудителя аборта овец в макрофагах, полученных от иммунных белых мышей, происходит менее интенсивно: инфекционный титр . .а 1,752,0 lg нижа, чем в культуре нормалыг'х макоофагов. По данным ряда авторов (А. А. Климова, А.А.Смородпнцеи, 1968; В.Л.Попов и др., 1974 ; A.A.benedicfc.C.KcI'ariand , 1958) хламидии не размножаются в макрофагах шмунных животных, по мнению других (Л.А. Вишнякова, 1974 ; T/.A.Blyth, J.Taverce , 1974) - цирку чрувдио антитела, соединяясь с хламидиями, •способствуют их фагоцитозу и внутриклеточной гибели. Результаты наших исследований выявили зависимость размножения хламидий в макрофагах иммунных животных гак же, как и в «штах P.3.Wyr»ick et al. (1978), от множественности инфекции, то есть от соотношения элементарное тельце: макрофаг. При соотношении 1:10-1:100 наблюдается максимальная выживаемость хламидий, 1:10000 и более - деструкция и переваривание. Эти данные не только били подтверждены при электронно-микроскопическом изучении взаимодействия макрофагов с хламидиями, но и дополнены Макрофаги, содержащие большое количество лизосом, активно разрушают хламидии в фаголизосомах в первые сутки после заражения. Макрофаги, содержащие незначительное количество лизосом, образуют крупные вакуоли, где большинство хламидий сохраняют целостность и структуру и к 72 "асам после заражения проходят полнг1 откл развития. 3.А.Поповым и др. (1980) также высказано предположение, '-то взаимоотношение хламидий с клеткой на разных этапах регулируется "пороговым эффектом" лизосомальных ферментов. Весь запас лизосомальных ферментов может при этом расход"ваться на деструкцию фагоцитированных хламидий, а те элементарные тельца, на которых *ix "не хватило", начинают размножаться. Тем не менее такое предположение не исключает зависимости развития хламидий от функциональной гетерогенности макрофагов, так как среди индуцированных перитонеальннх макрофагов мчав" выявлены различные морфологические варианты плеток, отличающихся по размерам, содержания ерганои-

дов в цитоплазме, активности лизосомальных ферментов (И.С.Фрейд-лин, 1984; В.Ы.Манько, Р.М.Хаитов, 1985; В.М.Земсков и др.,1986; Т.Одаига , 1984; Е.,7о1ш81;оп , 1988). Возможно, эта гетерогенность популяции пернтонеальных макрофагов в какой-то мере отражает их функзональную гетерогенность. .

На элекгронограммах нам удалось зарегистрировать адсорбцию, эпдоцитоз элементарных телец возбудителя аборта овец, их трансформацию через промежуточные формы в инициальные тельца, внутри которых происходит образование нового поколения элементарных телец. Деления инициальных телец бинарным способом пли путем "отщепления" не наблюдали. Наряду с типичным циклом развития возбудителя хламздиозного аборта овец установили процесс Ъ -подобной трансформации, то есть формирование мелких аномальных структур, отделяющихся от крупных промежуточных форы. Кроме обнаружения нами фор;.! проявлена, взаимодействия СЫ.рв1^ас1 с перитоне-алышми макрофагами ин ситро Ь.ЕхпзепЪегк et ах. (1983) выявили, что элементарные тельца поглощались макрофагами по типу специфического фагоцитоза и проявляли выраженную способность инги-бировать ф^голизосомную активность клетки-хозяина, препятствуя слиянию лизосом с содержащими элементарные тельца фагосомами. Персистенцпя элементарных телец в фагосоыах сопровождалась освобождением поверхностных антигенов хламидий, которые определялись па поверхности содержащих и несодершцих элементарные тельца клеток.

Опыты пс изучению взаимодействия возбудителя хлзмпдиозного аборта коров с клеткой-хозяином ин виво подтвердили закономерность, выявленную при изучении поведения возбудителя хламидиоз-ного аборта овец в культуре перигонеальных макрофагов ин витро - первоначальное повышение функциональной активности макрофагов, фагоцитоз и переваривание ими. части хламидий. В дальнейшем выяснено, что хламэдии, ингибироваваие слияние лизосом клетки-хозяина с фагосоыой (БЛ!ог1апа , 1987), начинают репродуцироваться в макрофагах лимфатических узлов, селезенки, печени, формируя характерные-элементарные и, хотя в небольшом количестве, аномальные тельца. Было замечено также, что судьба фагоцитированиях хламидий зависела от их патогенности, дозы, состояния активности и количества макрофагов. Большее количество как разрушенных,"переваренных хламидий, так и элементарных телец новой генерации были обнаружены в селезенке, печени, лимфатических уз-

лах, отличающихся наибольшим содерианием фиксированных макрофагов: 5-10 % от массы печени или 30-35 % всех клеток составляют макрофаги; селезенка по сравнению с другими тканями содержит наибольшее количество макрофагов на I грамм ткани (И Я.Учитель, 1978; А.М.Воскресенский, Г.Е.Аркадьева, 1984). Казалось <5и, в этих макрофагах должны все хламядия подвергаться только деструк-* ции. А на самом деле идут параллельно два процесса: одна часть хламидий разрушается, другая - в противоположность многим бактериям, которые, попадая в макрофаги, быстро подвергаются деструкции в фаюлизосомах - размножается в цитоплазме клеток внутр;: фагосом, предотвращая слияние с ник.: лизпом. Рядом исследователей (А.С.Толыбекоа, 1978 ; П.М.Митрофанов, 1980; Е.Н.РгИэ 1372 ; М.Хсгаоуа,<Т.ТЛ1Ъ , 1976) установлено, что клетки моно-нуклсарной фагоцитарной системы наряду с эпителиальными клетка-ил, клетками синовиальных оболочек и плаценты являются излюбленным местом персястенции и размножения хламидий. Обобщая суждение о взаимодействия хламвдий с клеткой-хозяинсм - макрофагами пн витро и ин виво мояно подчеркнуть, что для хламидий характерны параллельно протекающие и завершенный, и незавершенны., фагоцитоз, приводящий к гибели их или к размножению, илп к пер-снстенции в макрофагах соответственно.

Заключительны;.! разделом по сравнительному изучению иммунобиологических свойств штаммов возбудителей хламвдиозов явилось изучение их антигенной активности. Перекрестное исследование в РП, РСК гипериммулных сывороток кроликов и морских евпнок к возбудителям абортов оевц, коз, коров, серебристо-черных лисиц, энтерита крупного рогатого скота, хламздиоза быков, песцоь, пневмония телят я орнитоза с труппо- и вздоспецифяческлмя антигенами из этих же штаммов выявило антигенное родство иссл до-ванных представителейсЫ.раДЬЬаса ' . Выла отмечена низкая активность орнигозного антигена, при применении которого титр ком-племектсяязнпающих антител в тпперкммунных сыворотках нихэ 2 -64 раза, чем при исследовании с антигенами из других штатов хламяднн. Зти данные свидетельствуют об антигенной неоднородности итаммоя хламидий, указывают на возможность существования различных серотипов хламидий, поражашпх животных и птиц. 3 опытах сг.кеЬг (1980) антигеннонеоднородные штаммы были обнаружены как среди штаммов возбудителей хламэдиозов у разных видов

хозяев, так и среди штаммов, выделенных от одного и того же вида хозяина. J.A.PeTez-Martlnez и J.Storz (1985), используя метод непрямой ыикроаммунофлуоресценции, иммуногипировали 25 штаммов Chl.pcittaui - возбудителей различных форм хламидий-ной инфекци" у крупного и мелкого рогатого скота, свиней, лошадей, кошек и морских свинок. Им удалось подразделить использованные штаммы хламидяй на 9 групп, каждая из которых характеризовала самостоятельней имыунотип, взаимосвязанный с видом хозяина и вызываемой формой патологии. Авторы справедливо подчеркивают необходимость углубленного сравнительно"о изучения антигенной структуры у различных представителей вида Chl.pcittaci, который обладает не меньшей биологической и антигенной гетерогенностью, чем Chi. txachocatla.

При перекрестном исследовании в РСК хламвдииных антигенов и антисывороток нами обнарукона более выраженная антигенная активность штамма возбудителя аборта овец Ростиново-70 как по сравнению с другими штаммами возбудителя аборта овец,'так и по сравнению со штаммами возбудителей абортов коз, коров, серебристо-черных лисиц, энтерита крупного рогатого скога, хламидиоза быков, песцов, пневмонии телят и орнит&за. Группо-, вадоспеци-фические антигены из штамма Роотиново-70 позволяли выявлять более высокий титр комплементсвязывагацих антител из гипериммунных сывороток, полученных не только к гомологичному штаг.'му, но и к гетерологичным. Этот факт, на наш взгляд, достоин внимания, поскольку в дальнейшей работе, проведенной с целью усовершенствования средств и методов лабораторной диагностики хламидио-зов, использован этот высокоантигешшй штамм - шгамм Ростиново-70 хламидиозного аборта овец.

Усовершенствование средств и методов лабораторной диагностики.

Разработка набора антигенов и сывороток для серологичо-ской диагностики хламидиозного аборта овец и коз.

Предложен нами качественно новый подход в получении группо-специфического хламидийного антигена для выявления комплемент-связывавдих антител у животных. С целью разрушения элементарных телец хламидий и высвобождения внутренне расположенных антигенных компонентов впервые были использованы ионный детгргент до-децилсульфат натрия (ДСП) совместно с 2-меркаптоэтанолом в концентрации 0,1 и I % соответственно. Впоследствии 2-черкаптоэта-

нол был заменен отечественным этилмеркаптаном (Э!Л). Получаемые антигенные препараты обладали высокой актчвностьп и специфичностью.

Источником получения хламидийных ан._тед, исшшауемых в качестве обязательного положительного контроля в РСК и исходного сырья для изготовления флуоресцирующих хламидийных иммуноглобулинов можно применят* сыворотки лабораторных клвотных и более крупных доноров. Одни исследователи предлагают иммунизировать морских свинок хламцдиями, очищенными путем дифференциального центрифугирования и гельфильтрации через софарозу-2В ( Р.Уауе at а1. . 1968), другие - использовать сыворотку крови овец, переболевших хламидиозным абортом (В.Сербезов и др., 1965), третьи - получать сыворотки от естественно инфицированных голубей, показывающих наличие неполных антител в НРСК в титре не менее 1:128 (В.А.Вишнякова, 1973). В наших опытах была установлена возможность получения иммунной хламидийной сыворотки с титром в РСК 1:64 - 1:256 путем гипериммунизации морских свинок. Однако малый объем сыворотки и различия в индивидуальной чувствительности лабораторных животных к введению хла-мидийного антигена (титр антител колеблется от 1:16 до 1:512) делают этот компонент диагностикума дорогостоящим. В результате проведенных исследований была выявлена технологичность и эффективность использования сывороток крови суягных овец, однократно зараженных возбудителем хлашщнозного аборта. Комплементсвязы-вашая активность такой сыворотки доходит до 1:160-1:320.

Предложенный набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хлампдпозного аборта овец и коз при испытании показал высокую активность, специфичность, пригодность для массовых исследований и получил всеобщее одобрение. В настоящее время диагностикум внедрен в ветеринар ую практику и, серийно выпускается Херсонской бпофабрикой Главбиопрома Госксилссии Совмина СССР по продовольствию я закупкам.

В период освоения и налаживания серийного производства хламидийных диагностикумов на Херсонской биофабрике были выяснеш1 необходимость усовершенствования способа получения хламвдийной иммунной сыворотки, используя кнактиБированние хламидии.

Данные специальных опытов выявили, что однократное внутримышечное или внутрикозшое введение носуягным овцам или баранам н.'штшированных очщешшх хламидий в смеси неполным адъювэнтом

Фрсйвда позволяет получить высокоактивные специфические сыворотки. При комиссионном испытании усовершенствованного способа получения иммунной хламндийной сыворотки отмечена возможность использования его при производстве хламидийных диагностикумов, а сам способ признан в качестве рационализаторского предложения (удостоверение ВШВИ й 21 от 27.09.1989 г.). С учетом этих данных будут внесены дополнения во "Временную инструкцию по изготовлению и контролю набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозного аборта овец и коз и набора флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозного аборга овец и коз, утвержденную 1УВ Гос-агропроаа 30.11.1987 г. Установлено, что общий годовой экономический эффект от внедрения "Набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозного аборта овец и коз" в ветеринарную практику составляет 840790 рублей.

Создание набора флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламвдиозного аборта овец и коз

Для выявления хламидийного, антигена в патологическом материале создан набор флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных (км.'.Пню!: и отрицательной) сывороток.

До начала наших исследований хламидийные флуоресцирующие иммуноглобулины не бы- . внедрены в практику диагностических исследований хламидиозов сельскохозяйственных животных.

' Целью исследований явилось налаживание производства стандартных высококачественных флуоресцирующих иммуноглобулинов для диагностики хламвдиозного аборта овец и коз. Основной трудностью изготовления качественного диагностического "препарата, способного избирательно реагировать с гомологичными антигенами, образуя флуоресцирующие комплексы, является получение высокоактивной хламадик . и иммунной сыворотки, служащей исходным сырьем. Для приго вления флуоресцирующих иммуноглобулинов использовали иммунную сыворотку,'полученную по вышеописанной технологии.

Гетерогенность меченых антител, не совсем точное выполнение методики постановки РИФ приводят к большому проценту неспецифических реакций (Л.Е.Камфорин, 1969). Поэтому окраска препаратов должна сопровождаться рядом контролен, исключающих возможности ошибок из-за неспецифических результатов. В связи с этим в состав набора флуоресцирующих иммуноглобулинов включены

иммунная и отрицательная (неимунная) сыворотки овец с целью проведения иммунологического контроля путем блокировки реакции исходной помеченной ФИТЦ иммунной сывороткой. Эффект от неиммунной сыворотки должен отсутствовать. Вышеописанным способом нами испытаны з лабораторных условиях 967 проб патологического материала, полученные от экспериментально зараженных и естественно переболевших хлашщиозом животных. Проведенные исследования показали большую чувствительность метода иммунофлуоресценции по с~аЕнению со световой микроскопией, пригодность флуоресцирующих иммуноглобулинов, изготовленных с использованием возбудителя хламидиозно-го аборта овец, для выявления специфического антигена хламидий в патологическом материале от рэзных видов сельскохозяйственных животных и пушных зверей. Лиофилизированные флуоресцирующие хлами-дийные иммуноглобулины сохраняют свою активность в течение 3-х лет (срок наблюдения) при хранении при 4 °С .

Изготовленные наборы флуоресцирующих иммуноглобулинов и кон- • трольннх сывороток внедрены в ветеринарную практику и годоеой экономический эффект от этого составляет 628500 рублей.

Результаты исследований специфичности и активности "Набора антигенов и сивороток для серологической диагностики хламидиозно-го аборта овец и коз" по отношению хламидиозов крупного рогатого скота, свиней, лошадей показали пригодность его для диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных. Эти данные позволили внести дополнения во "Временную инструкцию по изготовлению и контролю набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозного аборта овэц и коз и наборл флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозного аборта овец и коз", где имеется пункт "изменить выражение "хламидиозного аборта овец и коз" на "хламидиозов сельскохозяйственных животных".

В связи с этим последний вариант НТД включает :

- временную инструкцию по изготовлению и контролю набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных и набора флуоресцирующих иммуноглобулинов я контрольных сывороток для диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных;

- технические условия на набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных жизот-н: с; ■

- технические условия на набор флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных;

- временное не давление по применению набора антигенов и сывороток для серологической диагнс :тики хламидиозов сельскохозяйственных животных;

- временное наставление по применению набора флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных.

Разработка набора антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных выполнена совместно с Х.З.Гаффаровым, Р.Х.Хамадеевым и Р.В.Боровиком, набора флуоресцирующих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных -с Х.З.Гаффаровым, Р.Х.Хамадеевым и В.В.Гуиенковым, расчет экономической эффективности диагностических наборов - с И.Н.Кикити-ным.

Препараты для диагностики хламидиозного аборта овец в РЭМА.

Параллельно с налаживанием серийного биофабричного производства первых ветеринарных хламидийшх диагшстикумов для выявления антител в РСК, антигенов в РИФ были продолжены работы по усовершенствованию и разработке новых методов и средств диагностики хламидиозов. Поводом для этого служили: I) общепризнанная низкая чувствительность РСК, особенно при выявлении хламидио-носителей,субъективность оценки и невысокая эффективность исследований в РИФ и необходимость затраты 12-35 дней для выделения возбудителя аборта овец на КЭ ; 2) данные отечестве- ной и зарубежной литературы о применении РЭМА., отличающейся еысокой чувствительностью, простотой постановки и учета, возможностью проведения в обычной районной ветеринарной лаборатории, при диагностике многих инфекционных болезней (В.Б.Гуненков и др.,1985 ; Э.Б.Маматова, 1985 ; Р.А.Хамзин и др., 1985 ; Ж.А.Сажко и др., 1985 ; N.Schmeer , 1983 ; E.T.Evans et al. , 1983 ; M.F. Jones et al. . 1984 ; c.Vitu et al. , 1984 ; M.Pepin et al. , I9S5 ; J.Raymond et al. , 1985 И др.).

Основным фактором, определяющим чувствительность и специфичность РЭМА при выявлении антител, является вид антигена хлами-дий, применяемого для иммобилизации планшета. Еольиинствс иссле-

доватслей использовало для этих целей элементарные тельца хламидий, выращенных в культуре клеток или КЗ, после очень тщательной и сложной процедуры очистки в "наушном виде или подвергнутые какому-либо воздействию ( il.Cevenini et al. , 1981 ; V.Puanters et ala , 1902; R.T.Dvane et al. , 1983; li.P.Finn et al. , 1983 ; A.nai,V.U.Hc.hajan , 1983 ; J.B.L'ahor^ et nl. 1983 ; ¡».Schmeer et al. > 1^83). Наряду с этим имелись сведения U.Kraues et al. (1980), R.T,Evuna .D-Tuylor-ilobinson (IJ82), J.Raymond et ai.(Ig85)> м.А.Домейки (1985) о положительных результатах определения антител при применении груггпоспецифиче-ского антигена хламидий, экстрагированного различными способами: тритоном -X, ДСП, ультразвуком, воздействием тепла (30-минутная выдержка взвеси желточных оболочек инфицированных КЭ при 80 °С с последующим осаждением тканевого балласта при помощи центрифугирования). В сравнительных опытах установлена одинаковая способность очищенных инактивированннх формалином элементарных телец хламидий и антигена, полугчнного при помощи ДСН и ЭМ, выявлять антигола в испытуемых сыворотках. Учитывая, что каждая сыворотка подвергалась параллельному исследованию в PC К и РЭ'/А, в основных опытах нами использован специфический антиген, изготовленный при помощи ДСН и ЭМ по разработанномуг!ами методу (Р.В.Боровик и др.,1975) из высокоочищенных хламидий. Выявлена большая (от 4 до 128 раз) чувствительность РЗГ.-tA по сравнению с РСК при испытании сывороток крови экспериментально зараженных суягных овцематок и овец из неблагополучного по хла-мидиозному аборту хозяйства. Полученные нами данные согласуются с результатами работ H.Schmesr (1983), М.А.Домейки и др. (1985), М. Pepin et (1984), C.Yitu et al. (1985), J.A.IVrez-Mar-tlnez et al. (1986), H.Schmeer et al. (1987), ВЫЯВИВШИХ В

2-70 раз больший титр антител ь РУМА при хламидиозах голубей, крупного и мелкого рогатого скога, чем в РСК а ШФ я заявивших о возможности использования РЭМА дл„ массовых исследований животных на хламидиоз.

При изучении количества реагирующих в ГСК и РЭМА овец в зависимости от срока после аборта было установлено, что в течение первых 2 месяцев эти показатели существенно не отличаются, однако наблюдается резкая разница в титрах антител. Через

3-3,5 месяца процент реагирующих положительно в РСК животных

почти в 2 раза меньше, чем по данным РЭМА.; по истечении 7 месяцев комплементсвязыващие антитела у всех 100 % овец отсутствовали, тогда как 30 % животных продолжали реагировать положительно в РЭМА. На длительное сохранение в организме антител, определяемых в РЗГ/А, обратили внигэние П.М.Барышов и др. (1988), Е.Н.Горбачев с соавт.(1989), выявившие положительную реакцию через I год после вакцинации против лелтоспироза и перенесения Ку-лихорадки. Обнаружение реагируюцих на хламидиоз овцематок, баранов-производителей в благ .шолучных по абортам хозяйствах свидетельствует о том, что РЭМА позволяет обнаруживать антитела не только после острого проявления инфекции, но и у хламидио-косителей.

Данные РЭМА показывают на инфицированность хламидиями 86,4 % клинически здоровых овец в неблагополучных по абортам хозяйствах, тогда как по результатам РСК этот показатель равен 8,73. В связи с этим представляют интерес сведения В.ЗсЬиеег еЬ а1. (1987), полученные при хламидиозе коз: в РЭМА на хламидиоз положительно реагировало в инфицированном стаде 76 % животных, в РСК - только 18 %. Аналогичный процесс наблюдали м.£ер1п еъ а1(1985). Факт обнаружения антител в инфицированном стадо и в период поз; реконвалесценцяи обосновывает целесообразность применена: РЭМ для целей эпизоотологической разведки.

При сопоставлении результатов исследований сывороток крови абортировавших овец отмечена корреляция данных РСК и РЭМА, в 65-94 % случаев. Однако нами установлена зависимость процента корреляции от срока, прошедшего после аборта - наибольшая со-впадаемость результатов РСК и РЭМА наблюдалась через 1-2 месяца после аборта (94,1 %)', с удлинением срока, прошедшего после аборта, процент корреляции уменьшался до 65-70. Совпадение результатов РСК и Рс)?»!А в 80-86,5 % исследованных сывороток при хламидиозах жвачных показали Н.Кгаиаз et а1. (1980) и Ы. РерЛп еЪ а1. (1985).

В проведенных экспериментах установлена пригодность планшетов с иммобилизованным специфическим хламидийным антигеном, изготовленным из штамма Ростиново-70 возбудителя аборта овец,для диагностики хламидиозов крупного рогатого скота, свиней и серебристо-черных лисиц, а также для определения содержания ан-

тител в сыворотке крови зараженных или гипериммунизировантшх хламядиями лабораторных животных в РЭМА при использовании соответствующих антивидового пероксидазного коньюгата и контрольных сывороток.

Учитывая сведения литературы о применении РЭМА для обнаружения вирусных и бактериальных антигенов (В.В.Гуненксви др., 1985 ; Л.А.Мникова и др., 1985 ; И.В.Непоклонова, А.В.Васильев, 1985 ; Н.З.Хазипов и др., 1985 ; Й.А.Шакко и др.. 1985 ; Н. ^.Василенко и др., 1987 ; Л.И.Заревина и др., 1987 ; Н.С.Умнова и др., 1987 и др. \ нами испытаны разгае варианты постановки РЭМА с целью выявления хламидийных антигенов. Постановка РЭМА по непрямому методу с использованием иммунной овечьей сыворотки и антивидового конъюгата показала возможность определения нано-граммовых количеств хламидийного корпускулярного антигена (6175 нг/0,1 мл). После получения положительных результатов обнаружения хламидийного антигена в желточных оболочках КЭ, органах белых мышей, инфицированных разными штаммами хламидий, о этой целью исследовали параллельно в РЗМА и РЛФ органы абортированных плодов, плаценту, молозиво абортировавших овец после экспериментального и естественного хламвдиоза. При этом наблюдалась корреляция результатов выделения возбудителя на КЭ с данными РЭМА в 100 Я случаев, РИФ - 81,4 % и установлена зависимость выявления хламидийного антигена от срока и условий хранения патологического материала. Показатели наших экспериментов согласуются с наблюдениями других исследователей (М.А.До-мейка, 1985,1987; G.Lfuiataz ■зЪ al. , 1985; C.E.Farshy, Н.С. Вагпез , 1986 ; H.A.levy,А.L.Warford , 1986 ; A.Souriau.A.iio-dolakia , 1989; 1.M.Taylor et al. , 1989 ; S.Bygdeman et al., 1989). РЭМА позволяет ставить диагноз путем выявления антигена в течение 2-3 дней, тогда как для выделения хламидий на КЭ требуются 12-36 дней.

Испытание созданных наборов пр варатов для выявления хла-мидийны> антител и антигенов показало их высокую чувствительность , специфичность и пригодность для диагностики хламидиоз-ного аборта овец. При разработке РЭМА в качестве диагностического теста при хламидиозном аборте овец принимали участие Х.З.Гаффаров, А.З.Равялов и А.Ю.Боклешова.

Получение, характеристика и испытание МКА.

С целью повышения специфичности РИФ, РЭМА при определении вирусных и бактериальных, в том числе и хламидийннх, антигонов применяют Í-'KA (0.И.Быкова, Н.П.Храгова, 1989; KG. Hallsworth, 1-. J.McDonald , 1985 ; j.Fournier , 1987 ; в. Ojeniyi et ol. , 1989 ; к.S.VaBquez.l.R.lernendes , 1989).

В экспериментах nv получению МКА для иммунизации мышей BAIE/c был использован штамм Ростиново-70 возбудителя аборта овец с учетом его высоко" антигенной активности. Сливающим агентом клеток мышиной миеломной линии uso и иммунных спленоцитов от мышей линиa ВА1В/с служил 50$-ный раствор ло-лиэтиленгликоля м.м.ЮОО. Всего было выращено 710 гибридных клонов. При скрининге по непрямому методу РЭМА, используя корпускулярный антиген хламидий, выяснилось, что 22 клона (3,1 %) продуцировали МКА, активные только в отношении специфического антигена, 45 (6,3 %) - только в отношении "нормального" антигена, МКА 112 клонов (15,6 %) связывались как со специфическим, так и с "нормальным" антигенами. В дальнейшем пассировали и изучали свойства 22 реагирующих только со специфическим антигеном клонов - определяли изотип, комплемент-связывающую и преи'"пятирующую способности, активность в РЭМА и И®.

Из 22 МКА наибольшую группу (15) составили '.CÍA изотипа G 1,4 МКА изотипа М и го I МКА изотипов G-3,G-2b и А.МКА изотипов ü I и М не обладали комплемонгевязывающей активностью; 2 МКА изотипов G 2в и А (Хла-383 и Хла-104) имели титр в РСК, равный 1:4. Все МКА были активны в РЭМА (титр вапьировал от 1:81 до 1:2000), НРИФ я не преципитировали специфические антигены. Несколько гибридом - Хла-62, Хла-154, Хла-159, Хла-175, Хла-379, "--1-383 и Хла-544, были клонированы методом предельного разведения, выращены в массовую культуру в большом объеме и использованы для получения асцитяой жидкости ка сенсибилизированных приставом мышах линии ВА1В/с 2-2,5-месячного возраста. Было доказано, что активность МКА-асцит-ной жидкости гораздо выше (в 10 и более раз) активности МКА-кульгуральной жидкости.

Изученные нами препараты МКА обладали перекрестной активностью и с Chl.psitteoi и С Chi. trachomatis , эффек-

тивно конъюгирэвались с перокслдазой хрена. МКА-пэроксидазные конъюгаты были высокоактивными, специфичными и стабильными при хранении. ККА были использованы при выявлении хламидийних антигенов в РЭМА и РИФ в желточных оболочках инфицированных КЭ, патологическом маториало (органах абортированных плодов овоц и соребристо-чершх лисиц). Результаты наших исследований совпадают с данными других ав; jpos, применивших МКД. для диагностики хламидиозов (А.Л.МашкиллейсонЛ.А.Гомберг, IS86; n.Coli iaa et al. , 1984; К.С.Bornes et al. , 1985 ; D.A.Uav-kins et al. , 1985; D.C.W.-'-аЪеу , 1986 ; U.Chkawa et al. , 1986 ; E.Sturcova 1987 ; T.Krech.D.Gerhsra-ï'sadni , 1988 и др.). Получение, изучение свойств и испытание хламидийних Î.ÎKA при диагностике абортов овец и серебристо-черных лисиц проводили совместно с Ф.Г. 1£агиевой и А.З.Равиловнм.

Внедрение разработанных нами средств я методов серологической диагностики в ветеринарную практику позволит более планомерно и масштабно проводить диагностические исследования в отношении хламидиозов как после пероболевания, так и при латентном течении, а также будут способствовать эффективной профилактике и ликвидации хламидийних инфекций животных.

ВЫВОДЫ

1. При сравнительном изучении биологических свойств 14 штаммов возбудителей хламидиозов крупного и мелкого рогатого скота, пушных зверей между ними выявлены различия по токсичности, патогенности для белых мышей и морских свинок при различных способах заражения, а также по характеру проявления инфекции при экспериментальном воспроизведении на естественных хозяевах: возбудитель аборта овец вызнвает симптоматический аборт, возбудитель аборта сер^б; ;с?о-черных лисиц наряду с клиническим обусловливает скрытий (полный и неполный) аборт.

2. Установлено, что штаммы возбудителей абортов овоц и коз но размножаются в линиях клеток ППЭК, ГОЭО, IÏÏI3C, ПП, а также в перви'-нотрипсинизированннх фибробластах и клетках хорионэл-лантоисной оболочки куриного эмбриона в пределах 3-Î2 пассажей. Добавление в поддерживающую среду ДБАЕ-докстрана в дозе Ч)-100 мкг/мл, а такле сочетанное воздействие центрифугирования и ДЕАЕ-декстрана сгимулнрупт репродукцию штаммов возбудителя "борта овец в линии меток 1ШЭС и первичных фибробластах кури-

ного эмбриона. Показана способность штаммов возбудителя аборта овец размножаться в культуре эксплантатов тканей и клеток хо-рпоналлантоисной оболочки куриного эмбриона с сохранением антигенной активности.

3. При испытании иммуномодулирупцвго свойства выявлено двоякое де{'сгвие возбудителей хламидиозного аборта овец, коров и их антигенов на развитие первичного иммунного ответа к чужеродному тимусзависимому антигену (эритроцитам барана) в организме белых мышей в зависимости от дозы и срока введения по отношению к тест-антигену. Подкожная, внутримышечная и внутрибрюшинная инъекция зфирорпстворимого группоспецифического антигена одновременно с тест-антигеном существенно стимулирует иммунный ответ.

4. Выяснено, что однократное внутрибрюшинное введение хла-мидий морским свинкам и белым мысам вызывает неспецифическую и специфическую сенсибилизацию свободных перитонеальных макрофагов, выраженные в виде изменений соотношения клеточных элементов перитонеального экссудата, функциональной активности и электрофо-ретической подвижности макрофагов. Степень проявления перечисленных признаков зависит от дозы и патогенности использованного возбудителя хламидиозов для белых мышей.

5. Отмечено, что характер взаимодействия возбудителя аборта овец и коров с клеткой : -зяином (макрофагом) ин витро и ин виво одинаков: повышение функциональной активности макрофагов, фагоцитоз и переваривание части хламвдий в фаголизосомах; выжившие хламидии вступают в цикл развития в фагосомах, формируя последовательно инициальные, промежуточные и элементарные тельца новой генерации. Наряду с последними могут появиться и аномальные тельца, напоминающие ь -подобную трансформацию бактерий.

6. Путем перекрестного исследования в РСК и РП установлено антигенное родство возбудителей абортов овец, коз, коров, серебристо-черных лкс!гч, энтерита крупного рогатого скота, пневмонии телят, хламидиоза бикоЕ, песцов и орпитоза. Из числа изученных штаммов хламиций более выраженной антигенной активностью отличался штамм Ростиново-70 возбудителя абсрта овец -специфические антигены из этого штамма позволяли выявлять более высокий тигр ком-плементсвязывающих антител в гипериммунных сыворотках, полученных как к гомологичному, так и гетерологячннм штаммам.

7. Изыскан новый способ изготовления группоспецифического антигена, обладающего высокой активностью и специфичностью при при-

менении в ряде серологических реакций, путем избирательного разрушения хламидий додецилсульфотом натрия в присутствии 2-меркап-тоэтанола или этилмеркаптана (авторское свидетельство № 543259 от 21 сентября 1976 г.).

8. Предложены схемы получения активной иммунной хламидийной сыворотки от морских свинок, суягных и несуягных овец. Наиболее эффективным признан метод получения иммунной сыворотки путем однократного внутримышечного или внугрикожного введения 1.зсуяг-ным овцам или баронам очищенных инакгивированных хламидий в смеси с неполным адыовантом Фрейнда.

9. Впервые для ветеринарной практики создан "Набор антигенов и сывороток для серологической диагностики хламидиозев сельскохозяйственных животных" и освоена технология его промышленного производства. Установлена высокая активность, строгая специфичность и большая чувствительность препарата по сравнению с медицинским орнитозным диагностикумом. Налажено серийное производство "Набора флуоресцирующих иммуноглобулиног и контрольных сывороток для диагностики хламидиозов сельскохозяйственных животных". Годовой экономический эффект от внедрения наборов в ветеринарную практику составляет 840790 и 628500 рублей соответственно.

10. Разработан метод диагностики хламидиозного аборта овец в РЭМА путем выявления антител в сыворотке крови больных и переболевших животных, а также хламидионосителей с применением специфического антигена, изготовленного из очищенных и концентрированных хламидий путем добавления додецилсульфага натрия и этилмеркаптана. Обнаружено, что РЭМА чувствительнее РСК в 4-128 раз, специфична и позволяет определять антитела в более отдаленные срони реконвалесценции.

11. Показана возможность диагностики хламидиозного аборта овец в РОМА путем выявления антигена в органах абортированных плодов и абортировавших овцематок, ^ыяснено, что РЭМА по чувствительности превышает РИФ: позголяет ставить диагноз в течение 2-3 дней, тогда как для выделения хламидий на куриных эмбриона, требуется 12-36 дней.

12. Созданы диагностические наборы "Препараты для диагностики хламидиозного аборта овец в РЭМА путем выявления антител", "Препараты для диагностики хламидиозного аборта овец в РЭМА пу-тьм выявления антигена" и разработана нормативно-техническая дс-

кументация по их изготовлению, контролю и применению.

13. Впервые в отечественной ветеринарной науке получены мо-ноклональные антитела к возбудителю хламидиозного аборта овец, измены их свойства, определена возможность применения при диагностике хламидиозов в К'Ф и РЭМА..

14. Итоги сравнительного изучения биологических свойств ряда штаммов хламндий, изолированных от мелкого и крупного рогатого скота, пустых зверей, явились научной предпосылкой при разработке принципиально новых средств и методов лабораторной диагностики хлзмидиозов животных. Впервые разработана технология, налажено серийное промышленное производство и внедрены в практику наборы ветеринарии;: хлампдпйных дпапюстнкумов для выявления антител в РСК, антигенов в Разработаны наиболее чувствительные и специфичные методы и средства диагностики хлпмидиозов животных, внедрение котсрих в практику позволит более планомерно и масштабно проводить диагностические исследования и будет способствовать попгленпю эффективности противохламидийных мероприятий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ П?ВД102£НЛЯ

1. Временное наста)_--ение по постановке и учету реакции связывания комплемента (РСК) и реакции длительного связывания комплемента (РДСК) при диагностике энзоотического аборта овец и коз (утверждено Г7В МСХ СССР I августа 1976 г.).

2. Инструкция по профилактике и ликвидации хламидиозного (энзоотического) аборт? овец и коз (утверждена ГУБ МСХ СССР 12.02.1981 г.).

3. Методические указания по лабораторной диагностике хламидиозного аборта овс и коз (утверждены ГУВ МСХ СССР 28.10.1983 г).

4. ['етодвчесянс /касания по лабораторным исследованиям на хламидийше юЗздпяк :• гльскохозяйствешшх животных (утверждены ГУБ МСХ СССР 5.04.1986 г.).

5. Временная инструкция по изготовлению и контролю набора антигенов и сывороток для лабораторной диагностики хламидиозного аборта овец и коз (утверждена ГУВ МСХ СССР 27.12.1982 г.).

6. Технические условия на набор антигенов и сывороток для-серологической диагностики хламидиозного аборта овец и коз (утверждены ГУВ МСХ СССР 27.12.1982 г., зарегистрированы Госу-

дарственным Комитетом стандартов 22.02.1983 г., № 2342226).

7. Технические условия на набор флуоресцирующих иммуногло булинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозного аборта овец и коз (утверждены ГУВ МСХ СС(__• 27.12.1982 г., зарегистрированы Государственна'.! Комитетом стандартов 22.02.19£ № 2342231).

8. Временное наставлен-"! по применению набора антигенов сывороток для серологической диагностики хламидиозного аборта овец и коз (утверждено ГУВ "СХ СССР 21.01.1983 г.).

9. Временное наставление по применению набора флуоресциру тих иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики мидиозного аборта овец и коз (утверждено ГУВ МСХ СССР 21.ОГ. 1983 г.).

ГО. Временная инструкция по изготовлению и контролю наб0£ антигенов и сывороток для серологической диагностики хламвдис ного аборта овец и коз » набора флуоресцирующих г.ммуноглобули и контрольных сывороток для диагностики хламидиозного аборта овец и коз (утверждена ГУВ Госагропрома СССР о0.1Г.Г987 г.).

ГГ. Дополнения к "Временной инструкции по изготовлению I контролю набора антигенов и сывороток для серологической диа1 ностики хламидиозного аборта овец и коз и набора флуоресцируя иммуноглобулинов и контрольных сывороток для диагностики хлаг, диозного аборта овец и коэ' (утверждены ГУВ Госагропрома СССР 10.07.Г988 г.).

12. Технические условия на набор антигенов и сывороток д; серологической диагностики хламидиозов сельскохозяйственных г нотных (утверждены ГУВ Госагропрома СССР 22.07.1988 г., зарез трированы Государственным Комитетом стандартов Г8.08.1988 г. й 058/164510).

ГЗ. Технические условия на ча^ор флуоресцирующих иммуною булинов и контрольных сывороток для диагностики хламидиозов < скохозяйственных животных (утверндег"ч ГУВ Госагропрома СССР 22.07.1928 г., зарегистрированы Государственным Комитетом стг дартов 18.08.1988 г., № 058/Г655П).

Г4. Временное наставление по применению набора знтигонов сывороток для серологической диагностики хламидиозов сель' :о: зяйственных животных (утверждено 1УВ Госагропрома СССР 19.07, 1988 г.).

/линов и контрольных сывороток для диагностики [ьскохозяйсгеснных животных (утверждено ГУВ Гос-19.л7.1988 г.).

ю. инструкция по профилактике ■ ликвидации хламидиоза животных (утверждена 1УВ Госагропрома СССР 8.08.1989 г.,Л 4323).

17. Временная инструкция по изготовлению и контролю препаратов для диагностики хламвдиозного аборта овец в РЭМА, (набора) (утверждена директором ВНИВИ 2G.II.1989 г.).

18-21. Технические условия на опытную партию препаратов для диагностики хламидиозного аборта овец в РЭМА путем выявления антител (набор), Технические условия на опытную партию препаратов для диагностики хламвдиозного аборта овец в РЭМА путем выявления антигена (набор), Временное наставление по применению препаратов для диагностики хламидиозного аборта овец в РЭМА путем выявления антител (набора), Временное наставление по применению препаратов для диагностики хламидиозного аборта овец в РЭМА путем выявления антигена (набора) (согласованы с ВГНКИ 16.03.1990 г., утверж- . дены ГУВ Государственной комиссии Совмина СССР по продовольствию и з;.лупкам 19.12.1990 г.).

СПИСОК РАБОТ, 0'Г/ЕЛЖОВАНШХ ПО ТЕ,® ДИССЕРТАЦИИ

1. Хамадеев Р.Х., Боровик Р.В., Гаффаров Х.З., Шафикова P.A. Свойства иммуноглобулинов сывороток крови и молозива овцематок, экспериментально зараженных вирусом аборта овец. Тезисы докладов на научном совещании. - Махачкала, 1973. - С.156-158.

2. Боровик Р.В., Хамадеев Р.X., Гаффаров Х.З., Кафикова P.A. Комплементсвязывающая активность иммуноглобулинов в крови и молозиве овцематок, зараженных возбудителем аборта овец // Сельскохозяйственная биоло'яя. - 1975. - 10. - № I.- С. 107-109.

3. Боровик Р.В., Хамадеев Р.Х., Гаффаров Х.З., Шафикова P.A. Получение антигена для диагностики энзоотического аборта овец с помощью РСК // Ветеринария. - 1975. - & 6. - С.51-53.

4. Хамадеев Р.Х., Боровик Р.В., Гаффаров Х.З., Шафикова P.A. Получение гипериммунных сывороток для диагностики энзоотического аборта овец // Ветеринария. - 1975. - й 10. - С.36-38.

5. Хамадеев Р.Х., Гаффаров Х.З., Боровик Р.В., Шафикова P.A. Формирование постинфекционного иммунитета у овец при естественном и экспериментальном вирусном аборте // Ученые Записки КГВИ.

-1976. - Т.117. - С.I05-II2.

6. Боровик Р.В., Хамадеев Р.Х., Гаффаров Х.З., Шафикова P.A. Способ получения антигена для серологической диагностики вирусных заболеваний : Авторское свидетельство JS 543259 с приоритетом от 17.09.1973 г.

7. Кафикова P.A. Культивирование возбудителя энзоотического аборта овец в линии клето . Ш // Тезисы докладов 1У Всесоюзной ветеринарной вирусологической конференции. - Владимир, П76. -ЧЛ. - С. 127-129.

8. Хамадеев Р.Х., Гаффаров Х.З., Шафикова P.A. и др. Групго-спецлфический антиген и иммунная сыворотка для диагностики хла-мидийних инфекций сельскохозяйственных животных и птиц // Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Научныо основы технолог, промышл. производства ветеринарных биологических препаратов . -И., 1978. - С.170-171.

9. Шафикова P.A. Изучение признака антигенной специфичности возбудителя аборта овец // Тезисы докладов республиканской на-учно-тохнической конф. по проблемам ветеринарии и зоотехнии.

- Казань, 1980. - С. 145-146.

10. Еафикова P.A., Боровик Р.В., Гаф<фаров Х.З. и др. Получение гипериммунных сывороток к хламэдиям от лабораторных животных. - Там же. - С.147-148.

11. Гаффаров Х.З., Хамадеев Р.Х., Шафикова P.A. и др.'Итоги широкого производственного испытания диагностикума хламидийного аборта овец и коз // Матер. Всесоюзн.научн.конф. "Болезни овец и меры борьбы с ними". - Чита, 1980. - С.33-36.

12. Шафикова P.A., Боровик Р.В., Гаффаров Х.З. и др. Возможность использования антихламидийных сывороток, полученных от лабораторных животных, при диагностике энзоотического аборта овец. - Там же. - С.123-124.

13. Кафикова P.A. Изучение возможности культивирования возбудителей абортов овец (BAO) и коз 'ВАК) в культуре клеток // Научн.тр. КВИ "Актуальные вопросы вирусологии". - Казань,1980.

- 0.69-69.

14. Шафикова P.A. Влияние некоторых физико-химических факторов на размножение возбудителя аборта овец в культуре ..леток. - Там же. - С.70-70.

15. Гаффаров Х.З., Хамадеав Р.Х., Шафикова P.A. п др. Экспресс метод выявления инфицированности микоплазмами эмбрионов птиц // Тезисы докладов конф..посвященной 50-летию ВГНКИ ветпрепаратов ,,т>азработка, апробация и государственный контроль ветеринарных препаратов". - М., T98I. - C.I3I-I32.

16. Шафикова P.A. Генетический признак антигенной специфичности возбудителя аборта овец // Сб.научн.тр. КЕМ "Разработка эффективных методов профилактики и лечения животных при инфекц. заболеваниях. - Казань, 138Г. - С.35-41.

17. Шафикова P.A. Стимулирование развития возбудителя аборта овен в культуре клеток // Тезисы докладов на респуб.научно-технич.конф. по проблемам ветеринарии и зоотехнии.- Казань, 1982. - С.59-60.

18. ¡йафикова P.A. Оптимизация условий культивирования возбудителя аборта овец в культура клеток // Тезисы докладов конф. "Научные основы технологии промышленного производства вет. биопрепаратов". - 1.1., 1963. - С.21-22.

J.9. Хафикова P.A. Роль фагоцитоза при хламидпйном аборте овец // Тезисы докладов Всесоюзной-научи.конф. по проблемам эпизоо'-ллогии. - Казань, 1983. - С.144-144.

20. Шафикова Р.Л Значение фагоцитоза в цротивоинфекцион-ном иммунитете // Сй.чаучн.тр. КВИ "Оздоровительные мероприятия в промышленных животноводческих комплексах при инф. заболеваниях". - Казань, 1983. - C.S-I5.

21. Шафикова P.A. Поведение возбудителей хламидиозных абортов овец и коз в перевиваемых линиях и первичнотрипсинизирован-ннх культурах клеток // Сб.науч.тр. КВИ "Усовершенствование методов иммунной профилактики инфекционных заболеваний с/х ни-еотных". - Казань, 1985. - С.66-70.

22. Шафикова P.A. Влияние возбудителя хламидиозного аборта овец на функциональную активность перитонеальных макрофагов морских свинок // Сб.научн.тр. КВИ "Диагностика, профилактика

и меры борьбы с туберкулезом животных".- - Казань,1985.-С.40-53.

23. Гаффаров Х.З., Шафикова P.A. Обнаружение хламидий в сперме быков-производителей // Сб.науч.тр. КВИ "Меры борьбы с хроническими инфекциями в животноводческих комплексах".- Казань, 1986. - С.55-57.

24. Шафикова P.A., Гаффаров Х.З., Райилов А.З. Выявление антител к возбудителю хламидиозного аборта овец в РЭМ // Сб.

научн.тр. КВИ "Актуальные вопросы инфекционной патологии в промышленном животноводстве". - Казань, 1987. - С.35-40.

25. Шафикова P.A., Равилов А.З. Иммуномодулирутсщее действие возбудителей хламидиозных абортов овец и коров.- Там же. -0.40-43.

26. Хамадеев Р.Х., Шафикова P.A., Гаффаров Х.З. Наборы антигенов и сывороток для диагностика хламидиозов сельскохозяйственных животных // Тезисы докладов Ш Всесоюзной конф. "Научные основы технологии промышленного производства вет.биол.препаратов". - M., 1987. - С.240-242.

27. Шафикова P.A., Гаффаров Х.З., Раь .лов f 3. Диагностика хламидиозного аборта овец в РЭМА. - Там ке. - С.204-206.

28. Шафикова P.A., Гаффаров Х.З., Равилов А.З. Применение реакции энзпммеченых антител при диагностике хламидиозного аборта овец // Материалы Всесоюзн.конф. "Эпизоотология, эпидемиология, средства диагностики, терапии и специфической профилактики инфекционных болезней, общих для человека и животных",- Львов, 1988. - С.107-108.

29. Равилов Р.Х., Шафикова P.A., Eodpi зев К.П. лламидиозный аборт пушных зверей. - Там же. - C.II8-II9.

30. Шафикова P.A., Равилов А.З., Га$<фаров х.З. Новое в диагностике хламцциозного аборта овец // Тезисы докладов республ. научно-производственной конф. "Теоретические и практические вопросы ветеринарии и зоотехнии. - Казань, IS89. - С.4-4.

31. Равилов Р.Х., Шафикова ЛА., Бобрышев К.П. Изучение экспериментального хламидиоза серебристо-черных лисиц.- Там же. - 0.4-5.

32. Равилов Р.Х., Шафикова P.A. Применение иммунск^ерментно-го анализа для диагностики хламидиоза пуиных зверей // Тезисы докладов научн;конф. "Актуальные проблемы интенсификации животноводства в исследованиях молодых ученых".- Троиц.., 1989. -

С.15-16. .

33. Шафикова P.A., Равилов А.З. Ш.муномодулирущеа действие возбудителя хламидиозного аборта овец // Тезипы докладов научн. конф. "Профилактика, диагностика и г.гры борьбы с i фекциокнкми, инвазионными и незаразными заболеваниями сельскохозяйственных животных, птиц, пчел и рыб при интенсивном ведении хозяйства".-Баку, 1989. - С.38-39.

34. Гнльмутдинов Р.Я., Шафикова P.A. Оценка функционального состояния макрофагов при хламидийной инфекции методом клеточного электрофореза // Доклады ВАСХНШ. - 1989. - }'> 5. - С.36-37.

35. Шафикова P.A., Равилов А.З. Модуляция иммунного ответа возбудителями хламцциозного аборта овец, коров и их антигенами // Тез. докладов I Всесоюзного иммунологического съезда. - М., 1989. -'ГЛ. - С.401-401.

36. Равилов Р.Х., Шафикова P.A., Равилов А.З..Беклешова А.Ю. Штамм Chl.psittaci ПП-87, используемый для изготовления биопрепаратов для диагностики и профилактики хламэдиоза песцов. Положительное решение ВНЙИГПЭ на выдачу авторского свидетельства от 9.02.I9S0 г.

37. Равилов Р.Х., Шафикова P.A., Бобрышев К.П. и др. Штамм Ctil.psifctaci Ш-84, используемый для приготовления диагностических препаратов и инактивированных вакцин против хламидиоза лисиц. Положительное решение ВНИйГПЭ на выдачу авторского свидетельства от 15.02.1990 г.

38. Хамадеев Р.Х., Равилов А.З., Шафикова P.A. и др. Хлами-диоз крупного рогатого скота // Ветеринария. - 1990. - Ji 2. -

39. Равилов Р.Х., Шафикова Р.А. Выявление специфических хла-мпдиГшых антител в сыворотке крови экспериментально зараженных серебристо-черных лисиц в ранние и поздние сроки реконвалесцен-ции // Тезисы докладов республик.научн.-производств.конф. "Животноводству- комплексную программу развития". - Казань, 1990.

- С.48-48.

40. Нагиева Ф.Г., Шафикова Р.А., Никулина Б.Г. и др. Моно-клональные антитела к Chl.psiUaci . Получение, характеристика и примененге // Тез. докладов Ш Всесоюзного совещания "Культивирование клеток животных и человека". - М., 1990. - С.38-39.

41. Шафикова Р.А., Равилов А.З., Гилъмутдинов Р.Я. Изменение биологических и физико-химических свойств перигонеальных макрофагов белых мышей после введения хламидий // Межвузовский сб. научн.тр. "Актуальные вопросы эпизоотологии и меры борьбы с туберкулезом животных". - Казань, 1989. - C.92-S9.

42. Нагиева Ф.Г., Шафикова Р.А., Никулина В.Г. и др. Штамм гибридных культивируемых клеток животных" ttus.musclulus L. , используемый для получения моноклональных антител к Chlamydia. Положительное решение ВНИИГПЭ на выдачу авторского свидетельства от 22 марта 1990 г.

С.42-44.