Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Фенотипическая и генотипическая характеристики штаммов бруцелл различных видов и разработка экспресс-метода их идентификации

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

(РАСХН)

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я. Р. КОВАЛЕНКО

(ВИЭВ)

На правах рукописи

КУЗЬМИЧЕНОК Анатолий Павлович

ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ ШТАММОВ БРУЦЕЛЛ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ И РАЗРАБОТКА ЭКСПРЕСС-МЕТОДА ИХ ИДЕНТИФИКАЦИИ

(16.00.03— ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва — 1996

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я. Р. Коваленко

Заслуженный деятель наук РФ,

доктор ветеринарных наук, профессор К. В. Шумилов

кандидат биологических наук О. А. Верховский (ВИЭВ)

Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллеза и туберкулеза животных (ВНИИБТЖ) г. Омск.

в часов на заседании Диссерта1.

по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я- Р. Коваленко по адресу: 109472, г. Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Научные руководители: доктор ветеринарных наук В. А. Ромахов кандидат биологических наук Б. А. Фомин Официальные оппоненты:

(ВГНКИ)

Защита диссертации состоится

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат ветеринарных наук

Ф. Г. Терешков

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из Факторов, значительно сдерживающих развитие общественного и частного животновдства, являются инфекционные болезни, среди которых важное место занимает бруцеллез. Данная болезнь животных, являясь одной ИЗ наиболее распространенных, причиняет не только большой экономический ущерб животноводству, но имеет и определенное социальное значение. Еще довольно сложная эпизоотическая и эпидемическая ситуация по этой инфекции сохраняется в ряде Южных и Юго-Восточных регионов России.

Успешное решение проблемы бруцеллеза возможно только при внедрении в широкую практику эффективной научно обоснованной системы мероприятий с использованием наиболее совершенных средств и методов диагностики и специфической профилактики болезни, актуальность разработки которой возрастает в последнее время с учетом изменения форм ведения сельского хозяйства.

Важное место в комплексе противобруцеллезных мероприятий si <имает специфическая профилактика.

В течение длительного времени (с 1954 г) в нашей стране использовали живую вакцину из штамма В.abortus 19, с помощью которой удалось оздоровить многие неблагополучные пункты (Ворошилов К.П., I960! Орлов Е.С., Касьянов А.Н., 1972; Кац /1.С., Созонов И.И., 1973 и ДР.». В то же время в ряде регионов, особенно при тяжелой эпизоотической обстановке по бруцеллезу, применение этой вакцины не дало положительных результатов.

В последние годы в нашей стране широко используется вакцина из слабоагглютиногеннаго штамма В.abortus 82. В ряде мест ее применение способствовало достижении определенных успехов в борьбе с бруцеллезом крупного рогатого скота (K.M. Салмакоа и др. 19B0J И.П.Никифоров и др. 1981; О.З.Исхаков и ЛР. 19SH 0.В.Черкасов, А.П.Ростов, 1981; О.В.Ису.аков и др. 19S6I И.А.Косилов и др. 1986.). Однако существенным недостатком этой вакцины является ее высокая реактогенность, обусловливающая большой процент абортов у стельных животных и нестабильность основных биологических свойств <К.В.Шумилов

и ЯР.,1983, и др.). Все это указывает на своевременность и актуальность изыскания иммуногемных препаратов для профилактики бруцеллеза, применение которых обеспечило бы напряженный и продолжительный иммунитет у крупного рогатого скота и позволило вы избежать недостатков, свойственных вакцинам иэ штаммов 19 и 82. В связи с этим возникла необходимость в дополнительном изучении культуральна-морФологических и, особенно, биологических свойств штаммов бруцелл с целью выявления стабильных культур с ослабленной вирулентностью и определения возможности использования отдельных из них в качестве вакцинных.

Широкое применение антибиотиков и дезосредств, массовая вакцинация животных способствовали г ->явления измененных форм бруцелл, в частности R- и L-форм <П.А.ТРИленко, 19765 С.В.Прозоровский и др., 1981 и др.). Определение принадлежности таких атипичных культур к роду Brucella, а также их дифференциация от антигеннородственных микроорганизмов других видов по общепринятым методикам весьма трудоемки и продолжительны. Кроме того, манипуляции с инфицированным бру-целлами материалом представляют эпидемическую опасность. Следовательно разработка простого и надежного экспресс-метода идентификации бруцелл (в т.ч. измененных форм), дифференциации их от Фенотипически сходных микроорганизмов с использованием достижений современной биотехнологии и, в част— ности, определения гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК в реакции ДНК-ДНК гибридизации, является актуальной задачей.

< .

Цель и задачи исследований. Цель» исследований являлся отбор штаммов, перспективных для использования в качестве вакцинных путем изучения Фенотипических и генотипических характеристик культур бруцелл разных видов, а также усовершенствование методов их идентификации и дифференциации от Фенотипически сходных микроорганизмов при проведении бактериологического исследования биологического материала от животных на бруцеллез.

В число задач входипи(

- изучение культурально-морфологических и биохимических

свойств музейных штаммов бруцелл разных видов»

- изучение вирулентных свойств отдельных штаммов еруцелл в опытах на лабораторных животных I

- сравнительное изучение гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК музейных штаммов бруцелл, а также изоля-тов, палученых после их пассажирования через организм животных |

- определение диагностической эффективности реакции ЯНК-ДНК гибридизации в сравнении с общепринятыми методами идентификации бруцелл}

- разработка и апробация ДНК-гибридизационного зонда и. способ» его применения для идентификации бруцелл.

Научная новизна работы. Изучены в сравнительном аспекте культурально-морФологические, биохимические и биологические свойства 120 культур бруцелл производственных и музейных штаммов, из которых отобрано 3 штамма с пониженной вирулентность», перспективных для дальнейшего изучения в качестве вакцин 1ых.

Определена степень подобия нуклеотидных последовательностей ДНК 33 штаммов бруцелл в реакции ДНК-ДНК гибридизации и показана возможность использования данного метода для ускоренной высокодостоверной идентификации бруцелл и дифференциации их от Фенотипически сходных микроорганизмов.

Методами генной инженерии сконтруирована рекомбинантная плазнида рВ7С, содержащая нуклеотидную последовательность, гомологичную ДНК бруцелл, получен штамм Escherichia coli В7С, продуцент данной плазмиды. Предложен способ использования рекомбинантной плазниды рВ7С в качестве гибридизационного зонда для идентификации бруцелл (А,С. N" 164В0В9 от 12.05,В9 г.).

Практическая ценность. Отобраны и предложены для дальнейшего изучения 3 штамма бруцелл, перспективных в качестве исходных для получения вакцины против бруцеллеза животных.

Установлено, что способ хранения микроорганизмов, о т.ч. еруцелл, в лиоФилизированном состоянии в ампулах под вакуумом, позволяет длительное время сохранять их биологические свойства. Разработаны и предложены для практики мето-

дические рекомендации "ЛиоФилизация микобактерий туберкулеза бычьего вида" (одобрены ученым советом ВИЭВ 26 октября 19В7 г., протокол N"39). Разработаны и рекомендованы для использования в научно-исследовательской работе НИВИ и других НИИ биологического профиля методические рекомендации "Идентификация бруцелл методом ДНК-ДНК гибридизации" (одобрены ученым Советом ВИЭВ 26 октября 1907 г.,протокол N"39 и рабочей комиссией "Биология, иммунология и биотехнология в ветеринарии" ОНКВет ВАСХНИЛ 11 мая 19ВЭ г., протокол №2).

Предложен для использования в НИУ и практических диагностических лабораториях ДНК-гибридизанионный тест-набор для идентификации бруцелл и дифференциации их от Фенотипи-чески сходных посторонних никроог ^аниэмов в бактериальных культурах и в биологических жидкостях.

Разработана нормативно-техническая документация на ДНК—гибридизационный набор для идентификации еруцеля, включающая Временную инструкцию на изготовление набора (утв. директором ВИЭВ 06.11.91 г.)., Технические условия - "ТУ Ю.07.227-91" (утв. Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 15.11.91г.) и Наставление по применению набора <утв.эам. директора ВИЭВ 10.12.90 г.).

Апробация работы.

Материалы диссертационной работы доложеньи

- на конференции молодых ученых ВИЭВ (Москва, 19В5 г.15

- на годичных итоговых отчетах лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики бруцеллеза ВИЭВ <1986 - 199S)5

- на васедании рабочей комиссии "Биология, иммунология и биотехнология в ветеринарии" ОНКВет ВАСХНИЛ (19ВВ)5

- на Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организация медицинской помощи больным" (Новосибирск, 1989);

- на Всесоюзной научной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии (Целиноград, 1991),

- на научной конференции "Проблемы изыскания, синтеза и производства новых препаратов для ветеринарии" (Самарканд, 1994)I

- на научно-практической конференции "Основные научные

исследования по проблеме туберкулеза и бруцеллеза с.-х. животных, профилактики и ликвидации болезней в регионе Сибири (Новосибирск, 1995)J • - на межлабораторном совещании сотрудников ВИЗЕ- (Москва, 1996) .

Публикации. По результатам проведенных исследований опубликовано 9 научных работ, а том числа одно авторское свидетельство на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа

изложена на ___ страницах машинописного текста и состоит из

введения, обзора литературы, собственных исследований, заключения, выводов, предложений и списка литературы.

Материалы диссертации иллюстрированы 12 таблицами и 3 рисунками. Список литературы содержит 273 наименований работ, в т.ч. S3 зарубежных авторов.

N

2. Собственные исследования

Материалы и методы. Работа выполнена в лаборатории эпизоотологии, диагносностики и профилактики бруцеллеза, в лаборатории молекулярной биологии и биохимии ВИЭВ и на опытной базе Вышневолоцкого отдела ВИЭВ в период с 1985 по 1995 гг.

В работе использованы 120 производственных и музейных штаммов бруцелл, в том числе 50 штаммов вида abortus, 24 -aelitenaiB, 41 - suis, 4 - Ovis и 1 штамм вида neotomae. Большинство изученных культур хранились при +4-с в лиофили-зировамном состоянии а ампулах под вакуумом в течение от I -до 40 лет.

Культуры бруцелл регенерировали из лиоФилизиРованного состояния и а процессе работы хранили на КППГГА с кратностью пересева 1 рае в 2 - 3 мес.

Изучение «енотипическим свойств (культурально-морфоло-гических, тинкториальных, антигенных и биохимических) проводили по методикам, рекомендованным Оёьедингнным комитетом вкспертов ОАО/ВОЗ по бруцеллезу <6-й доклад, 19В6).

Определение вирулентных свойств культур еруцелл лрово-

- ь -

дили в опытам на 60 морских свинках и на 480 мышах линии FC 37 BL6XCBA/Lac в соответствии с "Методическими рекомендациями по определению вирулентности штаммов бруцелл на лабораторных животных" (В.И.Мельниченко, 1984). Для ио учения вирулентных свойств в опыты были отобраны штаммы бруцелл, проявившие повышенную чувствительность к пенициллину и вритрито-лу> В.abortus шт.шт. 1371, 550, 335 и В.suis шт.шт. 09, 011, 002. В качестве контрольных использовали культуры В.abortus шт.19 (вакцинный) и В.abortus шт.54 (вирулентный). О степени вирулентности культур судили по количеству павших мышей в каждой группе путем определения летальной дозы, вызывающей гибель 50У. животных в группе (ЛД50), вычисленной по методу Рида и Менча. К вирулентным относили культуры с ЛД50 " 1x10® (1 тыс.) м.к. и менее. Для культур с пониженной вирулентность», а также для вакцинных штаммов, бруцелл втот показатель должен составлять не менее 2x10* (20 тыс.) н.к.

Метод определения вирулентных свойств бруцелл на морских свинках основан на установлении индекса веса селезенки у зараженных животных на день окончания опыта и количественного содержания бруцелл в данном органе.

В опыте использовали 60 самцов морских свинок массой 330 - 400 г., которым подкожно вводили суспензии двухсуточных агаровых культур, отобранных после изучения на мышах штаммов бруцелл, в дозе 2 х 10» м.к. (по 10 морских свинок на каждый штамм, включая контрольных, вакцинированных В.abortus шт.19, зараженных культурой В.abortus шт.34, а также интактных животных).

CnycTij 35 дней после начала опыта морских свинок опытных и контрольных групп взвешивали и проводили убой. После ■скрытия от животных отбирали селезенки с соблюдением правил асептики. Селеа.енку от каждой морской, свинки очищали от жировой и соединительной ткани, взвешивали, переносили в стерильный гомогенизатор и добавляли двойное (по отношению к массе селезенки) количество (в мл.) аабуоеренного Физиологического раствора рН-7,2. После этого селезенки гомогенизировали в влектрическом гомогенизаторе в стерильных стеклянных стаканах (пробирках) с те«лоновыми пестиками. Верхнюю часть iрубки и гомогенизатора закрывали стерильным рукавом из по-

ливтилена. Гомогенизацию селезенок проводили в'течение 0,5 -1 мин. при оборотам вала 4 тыс./мин. По окончании процесса гомогенизации гомогенаты селезенки разводили стерильным 0,85 Х-ным раствором хлорида натрия до концентраций НЮ, II100 и It 1000.

Из каждого разведения делали еысев (по О,1 ил) материала на поверхность питательного агара в чашках Петри, распределяя его по всей поверхности среды. Посевы инкубировали в термостате в течение 4-х суток при 37=С и затем проводили подсчет выросших колоний еруцелл.

Индекс веса селезенки определяли путем деления показателя массы органа, выраженного в мг., на массу морской свинки (в граммах).

Отработку метода идентификации бруцелл по степени гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК осуществляли в реакции ДНК-ДНК гибридизации на нитроцеллшлозных мембранах (НЦМ Фирмы "Mi 11ipore") с диаметром пор 0,45 мкм.

Мембраны перед нанесением проб размечали на квадраты 10x10 мм. Мембраны, предназначенные для подращивания посевного материала, предварительно стерилизовали в автоклаве, после чего накладывали на поверхность питательной среды (МППГГА) в бактериологических чашках. На поверхность каждого квадрата мембраны наносили по одной стандартной бактериологической петле взвеси агаровой культуры или по две стандартные петли осадка от центрифугирования бульонной культуры. В последующем этот препарат обрабатывали ливоцииом, проназой и додецилсульФатом натрия <для лизиса бактериальных клеток, выделения и денатурации ДНК) и выдерживали в аназростате под вакуумом при температура +В0«*С в течение 2-х часов <для связывания ДНК с материалом мембраны, на которой затем проводили гибридизации).

В опыт были взяты 10 штаммов бруцелл оидоа abortus, me-lltenais и suis, 6 культур исходных и полученых из них L-Форм бруцелл (НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи), 26 неидентиФициРО-ванных культур микроорганизмов из Казахстана и от экспериментально инфицированных ёруцеллами телок. Контролем служили культуры, сходные по Фенотипическим и антигенным свойстаам с вруцеллами «Y.enterocolttica, P.haemolytica и S.typhi murium).

Бактериальную массу смывали с питательной среды буферным Раствором рН 0,0, включающим 0,3 И NaCl и 0,1 .М вти-лен-диамин-твтрауксусной кислоты (ЭДТА). Бактериальные клетки лиэировали путем их обработки ли-воцимом, пронааой и додецилсульФатом натрия. ДНК из лизатов выделяли по методу Marmur <1961).

Определение концентрации и степени очистки препаратов ДНК проводили на спектрофотометре "Specord М-40", анализируя спектры поглощения растворов ДНК в области 210 - 320 нм.

Подобие нуклеотидных последовательностей ДНК исследуемых культур определяли в реакции ДНК-ДНК гибридизации по модифицированному методу P.Denhardt <1978).

В качестве реперной использовали ДНК референтного штамма В.abortus 544, биоаар 1, которую метили тритием методам "ник Трансляции" <Т.Маниатис, 1984). 1

Индикацию бруцелл в биоматериале от экспериментально зараженных животных с помощью реакции ДНК-ДНК гибридизации проводили б опыте на 24 морских свинках массой 350 - 400 г. Две группы по 5 голов были заражены высокими дозами вирулентного штамма В.abortus 34 <1 млрд и 25 млрд м.к.). Свинкам третей группы ввели одну-минимальную инфицирующую дозу -10 м.к., четвертой группы также 10 м.к. с последующей обработкой животных иммунодепресантом (циклоФосФан). Пятую груп-. пу (4 гол) составляли не зараженные морские свинки (контроль).

Морских свинок убивали через 30 дней после заражения. Высевы из лимфоузлов и паренхиматозных органов проводили по общепринятой методике на МППГГБ <по одной пробирке) и на МППГГА <по две пробирки). Параллельно проводили высев материала на поверхность стерильных нитроцеллюлозных мембран, . расчерченных на квадраты <1x1 см) и наложенных на поверхность плотной питательной среды <МППГГА) в чашках Петри. Посевы инкубировали при температуре 37"С до появления роста исследуемых микроорганизмов <3-5 суток).

Идентификацию культур, выделенных из материала от зараженных морских свинок, проводили путем определения в реакции ДНК-ДНК гибридизации степени подобия нуклеотидных последовательностей ДНК. В качестве реперной использовали ДНК реФе-

рентного штамма б.abortus 544,

Статистическую обработку полученных данных проводили на микрокалькуляторе МК-56 в сойтветствии с методическими рекомендациями "Применение программируемых микрокалькуляторов для биометрических расчетов" (Ю.К.Баюн, 1989).

Достоверность различия средних при сравнительном изучении ДНК по показателям нуклеотидного состава вычисляли по критерию Стьюдента (Л.З.Румишинский, 1971), .

Результаты исследований

Фенотипические свойства бруцелл различных видов, «иоввриантов и штаммов

Изучение культурвльно-морФологических, тинкториальных и некоторых биохимических свойств 120 штаммов музейных культур бруцелл показало, что хранение в лиоФилизированиом виде в запаянных ампулах под вакуумом в течение продолжительного времен!" <до 40 лет,) не повлияло на изменение их основных Фе-нотипичееких показателей, отраженных в паспортных данных.

В связи с тем, что 27 штаммов культур, хранящихся в музее, не имели полных характеристик свойств и по этой причине не были отнесены к тому или иному виду или биоварианту бруцелл, мы восполнили этот пробел. По результатам изучения 13 vi» »тих штаммов отнесены к бруцеллам вида abortus <5-1 в/в, 3-3 «/в, 1-5 б/в, 2-7 б/в и 2 - 9 б/в), 13 штаммов соответствовали виду suis (3-2 б/в и 10 - 4 б/в) и один штамм - Ö.ovis. На основании полученных данных недостающие характеристики были внесены в паспорта этих штаммов.

Изучение отношения культур бруцелл к ингибчрумщему Действию пенициллина и i-эритритола на рост на питательных средах позволило отобрать 3-штамма В.abortus tNNe 1371, 550 И 333) и 3 штамма В.suis б/в 4 (NN" 09, Oil и 002), обладающих повышенной чувствительностью' к этим препаратам даже при их довольно низкой концентрации в среде (0,5 ед/мл пенициллина и 1 - 2 мг/нл вритритопа). По этим показателям культуры отобранных штаммов были близки к вакцинному штамму В.abortus 19. Результаты изучения 6 штаммов бруцелл "in vitro" послу-

«или основанием для дальнейшего определения их вирулентных свойств в опытах на лабораторных животных.

Изучение вирулентности отобранных штаммов бруцелл в опыте на мышах

Сравнительное изучение Ь штаммов бруцелл, обладающих повышенной чувствительностью к ингибирующему действию на рост о присутствии в среде пенициллина и вритритола, » опыте на линейных мышах показало, что ик вирулентность была значительно ниже, чем у контрольного вирулентного штамма.В.aboi— tue 34. Показатель вирулентности по отношению к вакцинному штамму B.abortue 19 был ближе у кул! тур B.abortue 333 и ЗЗО, В. suis 09 и 002- (табл. 1)

Таблица 1

Соотношение степени вирулентности испытуемых штаммов бруцелл по показателям lg LD50 и LD50

1 1 |NNj 1 л/п 1 1 1 1 ! 1 1 1 Штамм Показатели изучаемого штамма в со штаммами! 1 сравнении |

В.abortus 19 (вакц) В abortus 34(вирулент)I

lg Ld50 LD50 lg LD50 1 I 1 LD50 J

1 В. abortus 333 < в 1,4раза < в 0,браза > в 1,8раза |>в162,1разI

I2- в. suis 09 < в 1,1 < в 3,8 > в 1,7-"- |>в 64,3-"-(.

¡3. в. abortus 350 < в 1,2 -"- < в 5,6 -"- > в 1,6-"- |>в 43,6-"-1

|4. в. suis 002 < в 1,3 -"- < в 18,1-"- > в 1,4-"- |> в13,5—"—1

|5. в. suis 011 < в 1,5 -"- < в 43,3-"- > в 1,3-"- |> в 3,4—"—1

|6. 1__ в. abortusl371 < в 1,7 - < в 114,4—" — > в 1,1-»- |> в 2,1-"-1 J— . _,. . 1

Примечание! показатель lg LD50 шт.19 по отношению к шт.

34 выше в 1,9 раза, a LD50 > в 244,7 раза.

Учитывая, что для культур с пониженной вирулентность» летальная доза, вызывающая гибель 30 X мышей (1-0во) должна

- n

составлять не ниже 2иЮщ (20 тыс м.к. ), для дальнейшего изучения вирулентных свойств в опыте на морских свинках использовали штаммы В.abortus 335 и 550, В.suis 09.

Изучение остаточной вирулентности трех штаммов бруцелл в опыте на морских свинках количественным методом

Метод заключается в установлении числа еруцелл в селезенке морской свинки через 35 дней после подкожного ведения взвеси изучаемой культуры в дезе 2 млрд м.к. в 1 мл Физиологического раствора. При stom для вакцинных штаммов число бруцелл в селезенке к указанному сроку не должно превышать 5x10я м.к. при индексе веса селезенки 1,4 - 1,6.

В опыт было взято 60 морских свинок, которых разделили на 6 групп по 10 голов. Животным групп NN 1, 2 и 3 вводили соответственно по 2 млрд м.к. изучаемых штаммов В.abortus 335, В.suis 09 и В.abortus 550, морским свинкам 4-й группы -В.abortus 19, 5-й,В.abortus 54 и 6-й - Физиологический раствор.

Таблица 2

Данные бактериологического исследования и индекса веса селезенки морских свинок (средние показатели по группам)

1-- j NN 1-------- -------- |Группы животных Количество ...... Количество 1 " " 1 Индекс веса]

¡групп | и штаммы м. свинок бруцелл в селезенки I

1 1 гол. селезенке,м.к.

1 | 1.Опытные

1 1' |В.abortus 335 10 1562 1,46 |

1 2" |B.suls 09 (олень 10 2036 1,42 j

1 3* |В.abortus 550 10 4274 1,58 |

| 2.Контрольные

1 4* |В.abortus 19 10 i012 1,34 j

I 5. [В.abortus 54 10 2,9 х 10у 3,88 |

1 6* (Физиолгич. р-р 10 0 0,96 I

(интактные животные)

Результаты исследования через 35 дней после инокуляции культур представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, количество бруцелл в селезенке морских свинок групп 1, 2 и 3 и значение индекса веса селезенки были в пределах, допустимых для вакцинных штаммов, тогда как в контрольной группе (шт.54) эти показатели были значительно выше (29 млн м.к. на одну селезенку и 3,88 - индекс веса органа).

Таким образом, по результатам исследований по определению степени чувствительности культур бруцелл к бензилпени-циллину и i-эритритолу (in vitro) и остаточной вирулентности в опытах на линейных мышах и морских свинках (in vivo) три штамма (В.abortus 335 и 550, В.suis. 09), из шести исследованных, можно рекомендовать для дальнейшего изучения с целью их использования в перспективе в качестве вакцинных.

Сравнительное изучение степени гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК разных штаммов бруцелл

При идентификации различных культур бруцелл (особенно полевых изолятов) использование общепринятых методик, основанных на определении их Фенотипических свойств, в ряде случаев приводит к получению ошибочных результатов (изучение культур бруцелл, находящихся на различных стадиях изменчивости или микроорганизмов, сходных с бруцеллами по ряду Фенотипических признаков). Кроме того рутинные методы, как правило, длительны и требуют больших материальных затрат.

Как показали проведенные ранее исследования наиболее достоверным методом ускоренной идентификации микроорганизмов рода бруцелла .является определение степени подобия нуклеотидных последовательностей их ДНК с использованием различных Физических и химических методов.

На наш взгляд наиболее информативным при идентификации бруцелл и дифференциации их от Фенотипически сходных микроорганизмов является метод определения подобия нуклеотидных последовательностей в реакции ДНК-ДНК гибридизации.

В связи с указанным мы провели изучение 45 культур мик-

роорганизмов в реакции ДНК-ДНК гибридизации с цепью подтверждения или исключения их принадлежности к роду Brucella.

В число изученных культур оходили!

- 10 штаммов бруцелл из музея лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики бруцеллеза ВИЭВ <5-, SR и R-Формы)i

- 6 штаммов бруцелл и 3 штамма других микроорганизмов, находящихся на различны!! стадиях изменчивости (диссоциация или трансформация из В в SR-, R- и L- стабильные и реверси-бельные формы)!

- 8 культур микроорганизмов, полученных из Казахского НИВИ, также находящихся на различных стадиях изменчивости <SR~, R-, L- Формы);

- 18 неидентиФицированных по Фенотипически'м свойствам культур микроорганизмов, выделенных от ревакцинированных и экспериментально зараженных вирулентным штаммом В.abortus 54 короэ. Эти животные находились в опыте по отработке схем иммунизации крупного рогатого скота против бруцеллеза вакцинами из штаммов 19, 104М и 82,

Таблица 3

Степень подобия нуклеотидных последовательностей ДНК музейных культур бруцелл с ДНК реперного штамма В.abortus 544

1------ JN.N Г Вид бруцелл и 1 1 | Характе-j Форма I ....... j Гомология 1 Принадл.|

|n\n| номер штамма |ристикаj колоний | ДНК, •/. к роду j

1 1 | штаммаj 1 1 М +_ м Brucella] 1

1 1 в abortus 870 реФ. 1 ! j вирул.| S- 100,0+6,2 1 + 1

1 в abortus С—68 ре». S- 91,0+9,7 + |

| 3. в. abortus 4004 3" 86,0+8,4 + j

1 4' в. abortus 104 М | вакц. | , 8- 85,0+7,2 + 1

1 5- в. abortus 82 1 " " " 1 SR- lOO,0+5,6 j + 1

1 в. abortus 19 1---1 в- 100,0+4,2; + I

1 7'1 в. melitensis К-56 1---i RS- 93,0+1,5] + I

1 В' в. melitensls Рев-1 1---I S- 90,0+3,9] + I

1 9-| в. sui 5 6 исходи. | вирул. | S- 100,0+1,2] + I

|10.| 1 в. euis 61 j вакц. j 1 1 S- . 1 100,0+0,4] 1 + i 1

Результаты исследования 10 музейных культур ¿руцапп по-показали, что степень гомологии нуклеотидных последовательностей их ДНХ, независимо от показателя их вирулентности или степени диссоциации,, была практически однозначной в пределах 83,0 - 100 X (табл.3).

Исходные референтные штаммы Б.abortus 870, 63/75 и вакцинный штамм В.abortus 82, и их L-ревертанты также имели высокий уровень гибридизации с ДНК реперного штамма В.abortus 544 (В6,0 - 100,0 %) . Эти данные свидетельствуют о тесном генетическом, родстве еруцелл и, что их L-трансФормация не приводит к значительным перестрйкам в геноме. В то же время в ДНК сенотипически сходных микроорганизмов P.haemolitiса, Y.enterocolltica и стабильной L-формы S.typhi murium общие нуклеотидные последовательности с ДНК микроорганизмов рода Brucella практически отсутствуют - степень их гомологии с ДНК бруцепл составила всего 0,1 - 0,5 '/..

Несколько мной была картина при исследовании культур микроорганизмов, которых изучением Фенотипических свойств в Казахском НИВИ отнесли к бруцеллам. В реакции ДНК-ДНК гибридизации 5 из 8-ми втих культур показали высокую степень гомологии ДНК с бруцеллами, а ДНК 3-х других культур (шт.шт. В.abortus 54(Ь), 54ML и "Сулак") имели очень низкую степень подобия нуклеотидных последовательностей с ДНК типичных бру-целл. Следовательно по втому показателю они не могут быть отнесены к микроорганизмам рода Brucella. Дальнейшими исследованиями установлено, что эти штаммы по показателям реакции ДНК-ДНК гибридизации относятся к одному из родов семейства ентеробактерий.

При проведении опыта по изучению различных схем иммунизации и реиммунизации крупного рогатого скота против бруцеллеза вакцинами из штаммов В.abortus 19, 104М и В2 возникли затруднения в определении по Фенотипическим свойствам принадлежности к бруцеллам 18 культур микроорганизмов, выделенных от коров после экспериментального их заражения культурой вирулентного штамма В.abortus 54. Реакцией ДНК-ДНК гибридизации установлено, что только Ю из них имели степень подобия нуклеотидных последовательностей ДНК, близкую к контрольным штаммам бруцелл (82,0 - 100 7.), а у остальных 8-ми

культур микроорганизмов этот показатель составил всего 0,2 -5,0 '/.. Поэтому, .несмотря на сходство последних с бруцеллами по отдельным Фенотипическим свойствам, все они были отнесены к посторонней микрофлоре.

Таким образом, полученные нами данные подтверждают, что характерной особенность» микроорганизмов рода Brucella является высокая гомологичность их ДНК и отсутствие гомологии С представителями других родов. При этом изменчивость бруцелл (диссоциация, трансформация и т.п.» не ведет к заметной дивергенции их генома. Следовательно метод ДНК-ДНК гибридизации не только дополняет общепринятую систему тестов идентификации бруцелл, но и во многих случаях является единственным достоверным показателем, подтверждающим или исключающим • ринадлежность микроорганизмов к роду Brucella.

Индикация бруцелл реакцией ДНК-ДНК гибридизации

в органах и тканях инфицированных морских свинок

В целях совершенствования бактериологического Метода диагностики бруцеллеза, в т.ч. и биологической пробы, проведены исследования по выявлению ДНК бруцелП в реакции ДНК-ДНК гибридизации путем нанесения биоматериала из лимфатических узлов, органов и других объектов непосредственно на нитро-целлюлозные мембраны с последующей инкубацией на МППГГА при 37-С.

Сравнительное исследование 200 объектов биоматериала от 20 морских свинок, зараженных культурой вирулентного штамма В.abortus 54 в дозах 25 млрд., 1 млрд., 10 м.к. и 10 м.к. с последующим введением через-,'24 часа иммунодепрессанта (цик-лоФосФан) общепринятым бактериологическим методом и в реакции ДНК-ДНК гибридизации показали следующие результаты. Бактериологическим исследованием через 30 дней после инфицирования морских свинок культуры бруцвлл выделены из 125 объектов от всех животных (3 - 10 культур от каждой свинки в зависимости от дозы). В то же время реакция ДНК-ДНК гибридизации была положительной в 150 объектах (4 - 10 объектов от каждого животного). Следовательно испытуемый метод оказался sanee чувствительным. Специфичность реакции ДНК-ДНК гибриди-

вации выла подтверждена отрицательными результатами исследования 40 объектов ¿¡ломатериалл от 4-и контрольных <Ие инфицированных) льготных.

Таким образом, метрд ДНК-ДНК гибридизации позволяет значительно сократить затраты средств и времени на проведение исследования, дает возможность исследования материала, контаминироаанного посторонней микрофлорой и не пригодного для бактериологического метода. Также установлено, что введение морским свинкам иммунодепрессанта (циклоФосФан) повышает &Ф»ективность биологической пробы на бруцеллеь как при исследовании бактериологическим методом, так и в реакции ДНК-ДНК гибридизации.

Разработка и апробация гибридизационного аонда для идентификации бруцелл

Для дальнейшего усовершенствования способа идентификации бруцелл реакцией ДНК-ДНК гибридизации проведены исследования по созданию ДНК-гиеридиэационного зонда, основу которого составляет рекомбинантная плазмидная ДНК рВ7С с нуклео-тидной последовательностью, гомологичной ДНК бруцеол. Данная плазмида получена путем.встраивания фрагмента генома В.аЬог— tue ¡¡44 размерен 7622 тыс. пар оснований, ограниченного сайтами рестриктазы EcoR t и имеющего внутри себя сайты рест-риктаа EcoR 1, Cla t, Hind It I, Bam HI, Nde I, Pvu II и плазмиду PUC 19, расщепленную EcoR I. Штамм E.coli B7C продуцент плазмиды рВ7С, . получен путем трансформации штамма E.coli Т6-1 данной плаамидой <А.С, N"1648069 с приоритетом от 12.05.89 г.).

Использование гибридизационного зонда для ДНК-гибРиди-аации исключает необходимость выделения тотальной ДНК репер-мого штамма бруцелл, что значительно снижает эпидемиологическую опасность при проведении исследований.

Специфичность гибридизационных зондов определяли путем Сравнения результатов реакции ДНК-ДНК гибридизации <при радиоактивном мечении МР и 3Н - по степени засветки рентгеновской пленки в авторадиографии, а при использовании метки С биотином - по интенсивности цветной Ферментативной реак-

ции) с выделенной на нитроцеллюлозной мембране ДНК бруцелл, а также взятых в качестве контроля ДНК Фенотипически сходных микроорганизмов не являющихся бруцеллами. Установлено, что зонды, созданные на основе тотальной ДНК бруцелл и на основе рекомбинантной плазмиды рВ7С оказались высокоспецифичными диагностическими препаратами.

Результаты сравнительного определения чувствительности гиеридизационных зондов, созданных на основе тотальной ДНК бруцелл и на основе рекомбинантной плазмиды рВ7С показали, что при использовании последнего чувствительность реакции повышается на один порядок <10в-10* м.к. для тотальной ДНК и 10*-10° для рВ7С в зависимости от метки).

При использовании еиотина в качестве метки чувствительность ганда оказалась равноценной с мечением изотопом 3Н и на один порядок ниже, чем при нечении радиоактивным изотопом аяР. Поэтому целесообразно в дальнейшем использовать зонд, меченый биотином, как более простой и безопасный в экологическом отношении.

По результатам работы предложен для использования в профильных лабораториях НИУ и в практических диагностических лабораториях ДНК-гибридизационный тест-наёор для идентификации бруцелл и дифференциации их от сходных по Фенотипическим свойствам других микроорганизмов.

ВЫВОДЫ:

1. Подобие нуклеотидных последовательностей ДНК бруцелл является объективным критерием для отнесения изучаемых культур микроорганизмов к роду Br.ücella.

2. Не установлено заметной дивергенции генома_ бруцелл при R-диссоциации и L-Трансформации, что позволяет идентифицировать культуры таких 'микроорганизмов реакцией ДНК—ДНК гибридизации на любой стадии их изменчивости.

3. Методами генной инженерии получен штамм E.coli В7С продуцирующий рекомбинантную плаэмиду рВ7С с нуклеотидной последовательностью ДНК гомологичной ДНК бруцелл. Сравнительное изучение ДНК-зондав, созданных на основе тотальной ДНК бруцелл и полученной методами генной инженерии рекомби-

- IB -

НаНтмой плазмиды гВ7С показало преимущества последнего с использованием в качестве метки экологически безопасного нерадиоактивного препарата - бкотина.

4. Полученный на основе рекомбинантной плаэмиды рВ7С гибридизационный зонд - главный компонент разработанного ДНК-гибридизационного тест-набора для идентификации бруцолл - является технологичным и эпидемически безопасным. Его применение исключает необходимость наращивания бактериальной массы реперного штамма бруцелл и выделения тотальной ДНК для Последующей гибридизации, что в значительной степени снижает опасность заражения персонала, проводящего исследования.

5. Использование реакции ДНК-ДНК гибридизации для идентификации бруцелл, дает вполне однозначные результаты. Эта реакция рекомендована для научно-исследовательских и производственных ветеринарных лабораторий для установления в спорных случаях принадлежности выделяемых микроорганизмов К роду Brucella.

Ь. Кулетуральмо-морФологические и биохимические свойства бруцелл, хранящихся длительное время <более 40 лет) в музее культур бруцелл ВИЭВ в лиофильно высушенном состоянии (в запаянных под вакуумом стеклянных ампулах при температуре +2 - +4"С),'существенным изменениям не подверглись.

7. Полученные данные подтверждают, что способ хранения культур микроорганизмов в лиофильно высушенном состоянии в настоящее время наиболее приемлем для создания и поддержания коллекций полевых, вакцинных, селекционированных и производственных штаммов.

8. Отсутствие существенных изменений в основных свойствах бруцелл, хранившихся длительное время в лиофильно высушенном состоянии, позволило уточнить реальное таксономическое положение ряда культур согласно современной системе дифференциации.

9. На основании изучения вирулентных свойств. 6-ти культур Brucella abortus и Brucella suis in vitro (по степени чувствительности к натриевой соли бенэилпенициллина и к 1-эритритолу) и in vivo (в опытах на линейных мышах и морских свинках) отобраны 3 штамма с пониженной вирулентностью,

-Перспективных дли их использования в качестве вакцинных.

10. Использование ДНК-гибРидизационного тест-набора в значительной степени упрощает технику микробиологических исследований на бруцеллез, повышает.скорость, надежность и достоверность идентификации бруцелл,' дифференциации их от Фэнотилически сходных микроорганизмов, не являющихся бруцел-лами.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ

Рекомендованы к дальнейшему изучению в качестве перспективных в целях получения вакцинных препаратов для профилактики бруцеллеза культуры штаммов В.abortus 333 а 530 и В.suis 09.

Предложен для применения в профильных НИУ и практических ветеринарных лабораториях метод идентификации бруцелл а реакции ДНК-ДНК гибридизации с использованием разработанного нами тест-набора.

Разработаны и предложены для использования в профильных

НИУ«

- Методические рекомендации "Идентификация бруцелл реакцией ДНК-ДНК гибридизации" (одобрены Учёным Советом ВИЭВ 26.10.1987 г.,' протокол N«39 и ОНКВет ВАСХНИЛ 11.05.1988 г., протокол n"2)(

- Методические рекомендации "ЛиоФилизация микобактерий туберкулеза бычьего вида" (Одобрены Ученым советом ВИЭВ 26.10.1987 г., протокол N«»39) i

- Временная инструкция по изготовлению и контролю ДНК-гибРидизационного набора для идентификации бруцелл (уте.директором ВИЭВ 06.11.91 г.)|

- Наставление по применению ДНК-гибРидизационного тест-набора для идентификации бруцелл (утв. зам. директора ВИЭВ 10.12.90 г.>|

- Технические условия (ТУ 10.07.221-91) Днк-гибридиза-ционный набор для идентификации бруцелл (утв. Главным управлением ветеринарии МСХ СССР 13.11.1991 г.).

Список работ, опуБликозаниы:; по теме» диссертации«

1. Мельниченко Ъ.И„, Артншин С.К., Фомин Б.А., Тягунина Е.А., Кузьмиченок Л.П., . Толмачева Т.А. Идентификация L-форм бруцелл реакцией ДНК-ДНК гибридизации. // Билл. ВИЭВ., Вып. 64., М., 19Е37. , 75—70.

2. Артюшин С.К., Мельниченко В.И., Фомин Б.А., Куаьмиченок A.PU Использование реакции молекулярной ДНК-ДНК гибридизации для определения принадлежности атипичных культур к роду Brucella. // Тез. докл. Всесогсзн. конференции "Актуальный вопр-.сы профилактики бруцеллеза и организации медицинский п0мс4и больным". Новосибирск, 24-25 октября 1989 г., М., 19S9., 70-71.

3. Куаьмиченок А.П., Мельниченко В.И. Оптимизация метода идентификации ЁРуЦеЛл реакцией ДНК-ДНК гибридизации. // Тез. докл. Всесоюзн. конференции "Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организации медицинской помощи больным". Новосибирск, 24-25 октября 19В9 г., М., 1989., 71-73.

4. Мельниченко В.И., Тягунина Е.А., Куаьмиченок А.П., Артюшин CiK., Фомин Б.А., Газдарвв А.К., Гращук И.Н. Идентификация бруцелл методом ДНК-ДНК гибридизации. Методические рекомендации ВИЭВ., М.,.198S., 6 с.

5. Сосницкий А.И., Куаьмиченок А.П., Оадиенко Н.П., Горбатов В.А. ЛиоФилизация микобактерий туберкулеза бычьего

I

вида. Методические рекомендации ВИЭВ., М., 1990., 14 с.

6. Фомин Б.А., Артюшин С.К., Мельниченко В.И., Кузьмиченок A.n., Коромыслоа Г.Ф., Ромахов В.А. ДНК гибридизацион-ный вонд £ля идентификации бруцелл. // Материалы Всесоюзн. Научи, кон®, по с.-х. биотахнологии <тез. оыступл.)., Целиноград., 1991., 128-129.

1. A.C. N" 1646089 от 0a.01.91r. "Рекомбинантная плао-мидная ДНК Р07С - гибридизационный вонд для идентификации еруцалл и штамм бактерии Esherichi« coll, содархащий плав-кидйую ДНК РБ7С - гиёрид'лаационный вонд для идентификации бруцелл". Авт. ияобр. АртишимС,К., Короныслоэ Г.®., Сомин Ь.А., Куаьмиченок А.П., Мельниченко В.И.« приоритет от 1?.05»1989г.

О. Мельниченко В.П., Куз'ьмиченок А.П., Артюший С.К.,

Ефремов B.C., Ромахов В. Д., Коромыслов' Г;Ф. ДНК гиб*>идизаци-онный зонд для идентификации бруцелл. // "Проблемы изыскания, синтеза и производств» новых препаратов для ветеринарии" (тез. докл. научн. конф.), Узбекский НИИ ветеринарии., С;.1арканд., 1994., 66.

9. Кузьмиченок Д.П., Мельниченко В.И. Влияние сроков хранения музейных культур бруцелл на их Фенотипическую и генетическую изменчивость. // Тез. докл. научн.— практ. конф. СО РАСХН, ИЭВСиДВ "Основные научные исследования по проблеме туберкулеза и бруцеллеза с.-х. животных, профилактики и лик-' вмдацми болезней в регионах Сибири"., Новосибирск., 1993», 128—129.