Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Новые физико-химические методы и способы их применения в ветеринарии

2 * ФЕВ 1ЯЯ7

Па правах рукописи

ОКОЛЕЛОВ Владимш» Иванович

НОВЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ В ВЕТЕРИНАРИИ

16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология н иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Новосибирск 1997

Работа пыио/шена во всероссийском научно-исследояаельскоч институте бруцеллеза и туберкулеза животных Сибирского отделения Российской академии сельскохозяйственных наук

Научные консультанты: доктор ветеринарных наук, профессор,

член-корреспондент РАСХН А. С. Донченко

доктор физико-математических наук,

профессор В. 3. Пащенко

Официальные оппоненты :

доктор ветеринарных наук Н. А. Шкиль

доктор ветеринарных, профессор Г. А. Ноздрин

доктор медицинских наук, профессор В.Ю.Куликов

Ведущее учреждение: Институт ветеринарной медицины Омского государственного аграрного университета

Защита состоится 14 марта 1997 г.

в------часов на заседании Диссертационного совета Д.020.23.01 при Институте

экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН (633128, Новосибирская область, п. Краснообск, ИЭВС и ДВ)

С диссертацией можно ознакомиться в ЦНСХБ СО РАСХН Автореферат разослан ", Ж- февраля 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор ветеринарных наук

А.А.Самоловов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1. Актуальность проблемы В комплексе мероприятий по оздоровлению неблагополучных хозяйств от хронических инфекций ( туберкулез, бруцеллез, лейкоз крупного рогатого скота н др.), важное место занимает совершенствование методов диагностики, изыскание новых приемов лечения, специфической профилактики и способов контроля эффективности санитарных мероприятий с учетом экологии внешней среды.

В этой связи весьма перспективными являются разработка и внедрение в ветеринарную практику современных методов, способов и методик лабораторного исследования, которые в настоящее время традиционно основываются на проведении целого ряда исследований, включающих изучение культурально-морфологических, биохимических, тинкториальных, антигенных и других биологических свойств возбудителен различных инфекций, что весьма громоздко,требует значительных затрат времени, материалов и труда , а в отдельных случаях при глубокой изменивостп микроба ( на примере L-транс-формации бруцелл ) они не обеспечивают надежной их индикации и идентификации.

Существенную роль в решении данной проблемы могут играть новейшие физико-химические методы биодетекции разных форм микроорганизмов, которые бы совмещали простоту исполнения методики и возможность автоматизации процесса исследований с повышением чувствительности и специфичности способов идентификации.

В последние десять лет в биохимии и молекулярной биологин появилось несколько новых ускоренных и чувствительных методов химического анализа, которые легко выполнимы за счет использования новых приборов и компьютерной обработки результатов (Pay B.W.,Kilburn J.O., Ш7, Винаров АЛО. и др., 1987, БенсассонР., ЛэндЭ., 1987). Соединение достижений в применении технических средств с процессом в изучении химической систематики микроорганизмов, особенно бактерий, способствует развитию экспресс-методов детекции и идентификации, основанных на молекулярных свойствах (Nelson W.H., 1985; Вилков Л.В., Пентин Ю.А., 1987). Особое место среди них отводится колебательной спектроскопии, и в частности, высокоспецифическим методам спектроскопии комбинационного рассеяния света ( Кэри П., 1985).

Появление нового поколения KP-спектрометров, высокочувствительных систем детекции и надежных лазерных источников, позволяющих возбуждать спектры KP в диапазоне от вакуумного ультрафиолета до инфракрасной области, резко повысило возможности метода, и предопределило его применение для решения широкого круга задач в молекулярной биологии, биотехнологии й генной инженерии (Kelly P.B.et al.,1987).

Существенно расширил возможности метода СКР разработанный в последствии метод спектроскопии резонансного комбинационного рассеяния света (РКР). Резонанс в данн случае означает близость или совпадение частоты возбуждающего света с частотой одт го нз электронных переходов молекулы. Наблюдаемый эффект РКР не имеет аналога в других методах оптической спектроскопии. В этих условиях значительно увеличиваютс интенсивности отдельных линий в спектре КР, так что их абсолютная интенсивность может возрастать на 3...5 порядков.

В настоящее время развивается метод РКР с возбуждением в ультрафиолетовой области (УФ РКР). Он нашел широкое применение за рубежом в исследовании структуры свойств биологических молекул - ароматических аминокислот, белков, нуклеиновых кн лот и отдельных клеток (lohnson C.R. et al.,1984; ZigelenL.D. et al.,1984; BritonK.A.,1988

Одно из главных преимуществ рассматриваемого метода заключается в возможное наблюдать спектры в водных растворах - естественной среде обитания микроорганизме исследовать живую клетку и получать информацию о хемотаксономнческих маркерах i

ее дополнительной дезинтеграции и использования при анализах дорогостоящих реакти вов. К началу настоящей работы информация по изучению возбудителей хронических инфекций, методические подходы по их идентификации методом УФ РКР и отечественные экспериментальные установки отсутствовали.

Не менее актуальным остается изыскание новых препаратов для борьбы с туберкул зом, бруцеллезом и другими заболеваниями в животноводстве ( Клебанов М.А., Ротов. А.Т., Богаевский А.Т. и др. 1965, Хайкин Б.Я., Власова Е.Е., 1985, Красиков А.П., 1996 Начальным этапом оценки нового препарата являются исследования in vitro, в процессе которых определяют его эффективность по наличию или отсутствию роста определенно вида возбудителя заболевания на питательных средах с добавлением исследуемого преп рата н острой токсичности в эксперименте на белых мышах. Однако получаемая инфор мация не позволяет оценить степень функциональных изменений, например микобактс-рий после воздействия определенного препарата. Судить же о таком свойстве, как изменение вирулентности можно только по результатам биопробы.Но и этн данные недостаточно полно раскрывают механизм действия предлагаемого препарата и степень взменч вости бактерий в зависимости от его дозы. Таким образом, необходим метод, использов ние которого позволит с достоверностью оценить эффективность изучаемых препарате! на основании знания механизма действия, включая структурно-функцинальные изменения, возникающие в клетке под их действием.

В системе ветерннарно-санитарных мероприятий, проблема обеззараживания и

утилизации навоза является одной нз важнейших с учетом охраны окружающей среды. Хотя к настоящему времени предложены и используются различные способы обработки и контроля эффективности обеззараживания навоза и жидких стоков животноводческих ферм и комплексов, эта проблема является далеко неразрешенной ( Поляков А.А.,1969, Романенко H.A., 1977, Симонов А.П., 1978, Майоров А.П. и да., 1979, Черепанов A.A., 1985, Колычев Н.М., 1992).

Кроме того, при оздоровлении хозяйств от хронических инфекции в системе органн-зацнонно-хозянственных мероприятий предусматривается создание изолированных ферм по выращиванию телок и формирование здоровых дойных гуртов, которые по ряду' причин круглый год находятся без выпасов и прогулок, что приводит к различным заболеваниям, особенно в послеродовой период (Нежданов А.Г.,1990, Шипилов B.C., 1991, Иноземцев В.П., 1992, Никоноров П.Н. и др., 1992, Юшков Ю.Г., 1995 ).

В настоящее время для лечения н профилактики болезнен у коров разработано много средств, методов и схем, включающих: этиотропную и новокаиновую терапию, гормональные н витаминные препараты, дезинфицирующие растворы, грязи, аутогемо- и тка-нетерапню, в том числе и физиотерапию. Одним нз ее направлении является - злектро-нейростимуляция, которая широко применяется в медицине за счет разработанных там способов лечения и профилактики различных заболеваний,т.к. она рефлекторко действует на весь организм н его системы, а также локально на отдельные органы, повышает защитные и адаптационные способности организма, улучшает кровоснабжение, оказывает противовоспалительное, болеутоляющее, спазмолитическое и нейротропное действие В ветеринарии, к началу наших изысканий в этом направлении, проводились только поисковые работы.

1.2. Цель и задачи исследований Цель исследований - разработать методические подходы к использованию ультрафно- . летовой резонансной спектроскопии комбинационного рассеяния ( УФ РКР ) для биодетекции и идентификации возбудителей хронических инфекций, разработка новых физико-химических методов и способов определения противотуберкулезной активности хн-миопрепаратов, контроля эффективности обеззараживания навозных стоков, электроней-ростимуляции животных.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: - разработка методики исследования живых культур мнкобактернй н бруцелл УФ РКР с использованием экспериментальной установки на основе отечественного приборостроения, получение воспроизводимых спектров разных видов возбудителен туберкулеза и бруцеллеза животных;

- провести селективное исследование основных хемотаксономнческнх маркеров мнк бактерий и бруцелл (белкового ц нуклеоидного компонентов) in vitro;

- выявить характерные линии спектров и вкдоспецифическне области для создания банка данных с последующей идентификацией микобактерни и бруцелл на разных ста днях изменчивости ( R-, L-), сравнить УФ РКР с другими методами исследования;

- разработать метод определения противотуберк^езной активности химиопрепара-тов in vitro с помощью элекроиной микроскопии;

- разработать способы контроля эффективности обеззараживания навозных стоков

- разработать способ электронейростнмуляцни для сельскохозяйственных жнвотны

1.3. Научная новизна

Представлен для изучения и идентификации возбудителей хронических инфекций метод нового поколения - лазерная спектроскопия ультрафиолетового резонансного комбинационного рассеяния ( УФ РКР ).

На базе созданной в лаборатории физнко-хнмическнх методов исследования ВНИ-ИБТЖ экспериментальной установки УФ РКР - отработаны методические подходы при менения спектроскопии УФ РКР для изучения биообъектов, разработана методика иссл« дования микобактерий и разных форм бруцелл in vitro.

Впервые получены спектры УФ РКР разных видов микобактерий и бруцелл, установлены высокоспецнфичёскне области спектров для идентификации культур.

Установлена закономерность изменений спектральных характеристик нуклеотидно го компонента в зависимости от возраста микобактерий и стадии R-, L- трансформации бруцелл.

Впервые проведено исследование структурных перестроек белкового и нуклеотидно-го компонентов клеток микобактерий с помощью УФ РКР и изучена молекулярная структура белков после Y-облучения.

Разработан метод оценки противотуберкулезной активности химиопрепаратов in vitro с помощью электронной микроскопии.

На уровне изобретений разработаны два способа и устройство для контроля эффективности обеззараживания навозных стоков.

Получен патент РФ на способ элешроиейростамуляции животных.

1.4. Теоретическая и практическая значимость

Теоретическая ценность работы заключается в том, что установлена уникальная воз-"ШЯШостьТФ .РКР для изучения электронно-конформацнонных характеристик биомолекул в составе живой клетки, что позволяет исследовать любые микрооргаизмы в различ-

пых физиологических состояниях, оценивать воздействие лекарственных н дезинфекционных средств, направленно отбирать штаммы или их фрагменты для создания новых даагностикумов и вакцин.

Практическая значимость работы состоит в том, что предложенные методические подходы использования спектроскопии УФ РКР для биодетекции и идентификации г.оз-будителей хронических инфекций находят применение при разработке нового экспресс-метода диагностики инфекционных заболеваний животных, который позволяет качественно, С высокой достоверностью за счет автоматизации процесса исследований с помощью ЭВМ определять видовую и внутривидовую принадлежность возбудителей инфекций в ветеринарной практике и медицине.

Кроме того, разработанная методика открывает возможности использования УФ РКР для идентификации и изучения любых бактериальных культур, независимо от их морфологических и функциональных особенностей, в том числе стадий изменчивости (К, Ь-форм бруцелл).

Предлагаемый метод определения противотуберкулезной активности химиопрепаратов с помощью электронной микроскопии позволяет уже на начальных этапах испытаний новых туберкулостатиков по ультраструктурным изменениям клеток микобактерий и результатам оценки токсичности проводить отбор наиболее перспектвных препаратов.

Разработанные способы контроля эффективности обеззараживания навозных стоков используются на к-рупных комплексах н фермах промышленного типа.

Внедрение в ветеринарную практику страны нового направления в физиотерапии -электронейростимуляции животных, позволяет ирофилактировать и сокращать различные заболевания в послеродовой период, уменьшать наполовину расходы на применяемые медикаментозные препараты. Способ доступен специалистам всех уровней, может быть использован в условиях крупных ферм и мелких фермерских хозяйств.

1.5. Апробация работы Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены: на заседаниях Ученого совета Всероссийского НИИ бруцеллеза и туберкулеза животных ( Омск, 1980-1997 ), на рабочей комиссии ОНКвет ВАСХНИЛ "Профилактика бруцеллеза и туберкулеза животных" ( Москва, 1989 ), Всесоюзных и Всероссийских координационных совещаниях по проблеме бруцеллеза и туберкулеза с.-х. животных (Омск, 1980-1996, КуетанаЯ, 1986, Новочеркасск, 1989, Новосибирск, 1985,1988,1992 ), Всесоюзной научно-теоретической конференции по биотехнологии в животноводстве ( Новосибирск, 1991 ), 1-ом Междуна-

родном конгрессе по биофизики и биотехнологии ( Турция, 1991 ), на Практическом семинаре в Институте спектроскопии Гумбольского университета ( Германия, 1991), научной конференции, посвященной 70-летию лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики туберкулеза н паратуберкулеэа ВИЭВ ( Москва, 1992), научной конференции преподавателей Омского ветеринарного института ( Омск, 1992 ), на заседании секции "Инфекционная патология животных" отделения ветеринарии РАСХН (Москва, 1993), научно-практической конференция по проблеме туберкулеза и бруцеллеза ( Новосибирск, 1995 ).

1.6. Публикация результатов исследований По теме диссертации опубликовано 43 работы в сборниках научных трудов СибННВИ, ВНГПШТЖ, ВНЭВ, ШВС и ДВ СО РАСХН, в журналах "Ветеринария", "Сибирский вестник с.-х. науки", "Прикладная спектроскопия", материалах Всесоюзных и Республиканских научных конференций и других научных и научно-производственных изданиях, описаниях к Авторским свидетельствам СССР .

1,7. Объем и структура диссертации Диссертация изложена 305 страницах, иллюстрирована 19 таблицами, 60 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной и методической части, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений н приложения. Список литературы включает 612 источников, в том числе 340 отечественных и 272 иностранных.

1.8. Внедрение результатов исследований Научные данные, касающиеся новых методических подходов к использованию спектроскопии УФ РКР для биодетекции и идентификации возбудителей хронических инфекций, используются в учебном процессе на кафедре биофизики Биологического факультета МГУ и на кафедре эпизоотологии Института ветеринарной медицины Омского государственного аграуниверситета

Методические рекомендации по оценке противотуберкулезной активности препаратов, рассмотрены и одобрены экспертной комиссией Отраслевого научного комплекса по ветеринарии ВАСХНИЛ н рекомендованы для научно-исследовательских учреждений, занимающихся вопросами испытания хишопрепаратов при туберкулезе.

Разработанные способы для контроля эффективности обеззараживания навозных стоков, учтены при разраЬотке~Пунктоц 2.2 И О""-!!иструктсш-по-пабораторпому■ пои. тролю очистных сооружений на животноводческих комплексах" ( утв. МСХ СССР,1980'

Рекомендации по применению электроненростнмулятора ЭТИС-100-1В (утв. ГУВ МСХ СССР, 1991 ) и в настоящее время идет внедрение этого способа профилактики и лечения животных через областные и районные вет.станцин по борьбе с.-х. животных в зоне Урала, Сибири, Алтайского края и Дальнего Востока.

1.9. Основные положения, выносимые на защиту

Методические подходы использования спектроскопии УФ РКР для бнодетекции и идентификации возбудителей хронических инфекций на примере туберкулеза и бруцеллеза животных и возможность селективного исследования структурно-функциональных особенностей биологических компонентов в составе целой клетки.

Методика исследования и результаты изучения микобактерий, S-, R- и L-форм бру-целл разных видов с помощью спектроскопии УФ РКР.

Метод оценки противотуберкулезной активности хнмиопрепаратов in vitro на основе электронной микроскопии.

Способы контроля эффективности обеззараживания навозных стоков.

Способ электронсйростимуляции па животных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнялась в лаборатории физико-химических методов исследования ВНИ-ИБТЖ (г.Омск), на кафедре биофизики Биологического факультета МГУ (г.Москва) и лаборатории инструментальных методов анализа Института бноорганнческон химии им.М.М.Щемякина РАН (г.Москва).

Для разработки методики получения спектров УФ РКР микобактерий и бруцелл провели изучение спектров модельных соединений ароматических аминокислот, полипептк-дов, моно»дезоксирибонуклеотидов фирмы Sigma ( США ), учитывая, что клетки бактерий содержат определенное количество вышеуказанных компонентов и при сопоставлении со спектрами изучаемых культур, появится возможность использования интерпретация получаемых результатов.

Для получения спектров УФ РКР были использованы 20 культур музейных и полевых штаммов микобактерий 8 видов, полученных из государственного контрольного ннстлута (УУГНКИ): М. tuberculosis ( 2 штамма), М. bovis ( 6 штаммов), М. kanxasn, М. gordone, М. avium (б штаммов), М. infracellulare ( 2 штамма), М. smegmatis, М. pblei. 4 штамма музейных культур М. tuberculosis, М. bovis и М. avium исследовали на трех стадиях роста - (логарифмической, стационарной и стадии отмирания) и 12 культур вакцинных,

референтных и вирулентных штаммов бруцелл 4 видов, из них 7 штаммов изучали на разных стадиях L-трансформации: В. abortus ( штаммы 19, 82, 104М, 54, 544), В. melitensis ( Рев-1,16М, Н-102), В. suis (61, 1330), В. о vis (424/2, 424/4).

Для получения спектров УФ РКР культуры выращивали на жидкой питательной среде Сотона, собирали бактериальную массу и трижды отмывали ее стерильным 0,85% раствором хлорида натрия, охлажденным до температуры +4*С с промежуточным центрифугированием в течение 30 минут при 6000 об/мин. Осажденную бактериальную массу ресуспендировалн 0,05 М фосфатным буфером с добавлением 0,2 М сульфата натрия в качестве внутреннего спектроскопического стандарта. Концентрацию микроорганизмов в образце доводили до 0,1-1 млрд. микробных клеток в 1 мл но оптическому стандарту мутности ГНШ1СК им.А.А. Тарасовича.

Для работы первоначально использовали импортную экспериментальную установку для получения УФ РКР, состоящую из плавно перестраиваемой в диапазоне 630-217 нм лазернойной системы, фирмы Physics, модель EMG1Q3MSC (Германия) и многоко-нального PK спектрометра, фирмы Dilor, модель OMARS 89-UY (Франция), которая функционировала в лаборатории инструментальных методов анализа ИБОХ. Для безопасности работы, бактериальную массу изучаемых культур подвергали гамма- облучению из кобальтовой пушки ( мощность дозы 200 Гр'ч). Выбор суммарной дозы (15 кГр) определялся подавлением способности к росту (контролировали посевом облученной культуры иа твердую питательную среду) при минимальных изменениях в клеточны структурах (по данным электронной микроскопии).

В дальнейшем для работы использовали экспериментальную установку, созданную совместно с научными сотрудниками биофизики МГУ в лаборатории физико-химически методов исследования ВНИИБТЖ на основе приборов отечественного производства: лазерной системы - АПАГА-1312 и ЛТИ-403, спектрометра ДФС-52М, микро-ЭВМ -ДВК-ЗМ, со спектральным диапазоном - 930-190 нм.

Перед изучением образцов проводили юстировку лазерной системы и калибровку спектрометра излучением ртутной лампы высокого давления по линии 253,6 нм. На ЭВ? загружали математическое программное обеспечение, которое позволяло скорректироват зарегистрированные спектры микобактерий и бруцелл, учесть и вычесть сигнал воды и следовых количеств питательной среды, а также сравнить полученные спектры с таковыми других культур, хранящихся в памяти ЭВМ. Безопасность работы с живыми куль T^nMu-iLi^nn-r^^r..^^^ ™м1гтруцровав герметич-

ную бактериальную камеру, из которой суспензию бактерий перистальтическим насосо?

подавали в кварцевую кювету, на которую затем направляли расфокусированный лазерный луч со средней мощностью 3-6 мВт.

Средняя длительность одного импульса 10-15 не при частоте повторения импульсов 160 Гц. Для селективного исследования молекул измерения проводили при длине волны 216-270 им.

Фоторазложение клеток под лучом лазера предотвращали, используя систему прокачки и тсрмостатировашш суспензии.

Регистрировали спектры УФ РКР исследуемой культуры. При количественном сопоставлении их измеряли относительную интенсивность линий. Последнюю оценивали по отношению к интенсивности линии 981 см -1 от вклада внутреннего репера сернокислого натрия на единицу клеточной массы в мг/мл.

После математической обработки и нормировки спектров УФ РКР, устанавливали область специфического профиля разных ендов мнкобактернй и форм бруцелл, специфичность отношения интенсивности линий от вклада разных составляющих компонентов клетки и заносили в банк данных.

Банк данных спектров УФ РКР микобйетернй и бруцелл формировали путем получения стабильных, постоянно повторяющихся спектров (40-50 повторных спектров в минуту) и занесения их в память ЭВМ.

Сравнительные исследования микобактерий проводили согласно ГОСТ 26072-84 "Животные и птица сельскохозяйственные", "Наставление по диагностике туберкулеза животиых"(198б).

Дифференциацию и идентификацию микобактериальных культур с целью отбора штаммов для исследования методом УФ РКР проводили в соответствии с методическими рекомендациями "Бактериологическая и биохимическая идентификация микобактерий" (Т.Б.Ильина, 1980).

Культурально-морфологнческие и дифференциальные свойства бруцелл в S-форме, а также полученных L-форм изучали в сравнительном плане методами, рекомендованными Подкомитетом по таксономии бруцелл Международного комитета по номенклатуре бактерий и Объединенного комитета экспертов ФАО/ВОЗ по бруцеллезу (1986).

С целью изучения субмикроскопической организации исследуемых микобактерий и бруцелл, оценки противотуберкулезной активности препаратов, колонии культур обрабатывали по методике Ryter, Kelletiberger (1958). Полученные блоки с колониями микобактерий и бруцелл после 14-дневной выдержки ультратомировали на ультратомах УМ-ТИ-4 и УМТИ-5 по общепринятой методике (Уикли Б.,1985). Срезы помещали на электролитические сеточки с формваровой подложкой (по методу Пиз Д., 1963). Срезы на се-

точках контрастировали 3% раствором уранилацетата на 30% этаноле в течение 3-4 часов и цитратом свинца no Reynolds (1963). Исследование образцов и получение электроно-грамм осуществляли в электронном микроскопе ЭМВ-100Б при ускоряющем напряжении 75-100 кВ.

При разработки новых способов определения эффективности обеззараживания навозных стоков на разных стадиях очистки и электронейростимуляции животных использовали аналоги и прототипы существующих способов у пас в стране и за рубежом.

Для биометрической обработки цифрового материала, полученного в экспериментальных исследованиях, применяли математическую обработку, реализованную на языках програмирования ФОРТ и МАКРО-11. Набор материалов диссертационной работы осуществляли по программе Windows-95.

Часть исследований была проведена совместно с научными сотрудниками Инст итута биоорганической химии г.Москва (доктор химических наук И.Р.Набнев, кандидат физико-математических наук А.В.Феофанов), МГУ г.Москва ( доктор биологических нак, профессор Ю.Б.Кудряшов, кандидат физико-математических наук А.А.Чурнн), ВГНКИ г.Москва (старший научный сотрудник, к.б.н. В.С.Тырина), а также с сотрудниками ВНИИБТЖ г.Омск (с.н.с., кандидат физико-математических наук А.П.Татарииов, кандидаты ветеринарных наук Б.Й.Коган, Е.С.Мартынова, Е.Б.Барабанова,Е.Е.Миронеико, н.с. Т.А.Пакусина, Т.С.Сшшцкая, О.А.Сидоренко и инженер КПП О.Е.Жигалкин).

Автор выражает глубокую признательность и благодарность за поддержку нового направления в науке, академику РАСХН В.П.Шишкову, докторам ветеринарных наук, профессорам И.А.Косилову, Н.П.Овдиенко, Б .Я.Хан кину, А.А.Новицкому, научным консультантам, доктору ветеринарных наук, профессору, члену-корреспонденту РАСХН А-С.Донченко, доктору физико-математических наук, профессору В.З.Пащенко, а также всем упомянутым соисполнителям за консультации, методическую и практическую помощь в проведении исследований.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1.Мстоднческие подходы К использованию спектроскопии УФ РКР для биоаетекиии и идентификации микобактерий И бруцелл

На современном этапе систематика микроорганизмов развивается в двух основных направлениях - феносистематике и геносистематике. Используя современные методы ТйпУЬцццр.ч-ч.ш rnn-jlll.iv •и.-рпеРИМеПТОВ УСТаНа-

влнвает внутреннее строение клетки: аминокислотного н углеводного состава клеточных

ггенок, состава белков, жирных кислот и липидов, отдельных ферментов и т.п. До настоящего времени комплексного исследования клеток одновременно всеми имеющимися в распоряжении методами пока не сделано, и дальнейшее стремление феносистематиков связано именно с получением полного комплекса признаков.

Второе направление, на которое также возлагаются большие надежды - геносистема-ика, изучающая состав генома. Идея построения естественной систематики на основе изучения ДНК весьма привлекательна, поскольку состав азотистых оснований нуклеиновых кислот, являясь общей характеристикой генома, представляет собой стабильный признак, не зависящий ни от возраста, ик от условий культивирования, ни, наконец, от лдельных переустройств хромосомы.

Создание естественной системы классификации микроорганизмов несомненно лежит 1а пути объединения этих двух направлений.

Идентификация различных форм возбудителей хронических инфекций, в том числе уберкулеза и бруцеллеза, существующими физико-химическими методами связана, как равило, с деструкцией образцов и специальной подготовкой объекта, при которой его вонства подвергаются определенным изменениям. В связи с этим, весьма перспективным редставляется возможность использования метода нового поколения - спектроскопии омбинационноп» рассеяния света с возбуждением в ультрафиолетовой области (УФ КР) для изучения биодетекции и идентификации различных бактерий. Суть эффекта, положенного в основу данного метода, заключается в том, что при облу-:шш биологического объекта лазерным светом в рассеянном излучении появляется свет частотой, пропорциональной собственным молекулярным частотам данного образца. Одним из главных преимуществ рассматриваемого метода является возможность се-ктивного возбуждения спектров УФ РКР белкового или иуклеотидного компонентов ■кроорганнзмов за счет изменения длины волны возбуждения резонансно усиливать лебания отдельных групп биохромофоров, и таким образом, одновременно изучать как но-, так и генотипические признаки.

Анализ спектров поглощения бактерий н изучение спектров модельных соединений казал, что оптимально использовать длины возбуждения равные 210-230 нм и 250-270 . Такой вывод определяется следующими соображениями:

- на длине волны 250-270 нм происходит селективное резонансное усиление сигнала 1ебателы)ых мод нуклеотидного компонента при минимальном уровне сигнала УФ Р ароматических аминокислотных цепей белков;

- на длине волны 210-230 нм селективно возбуждается белковый компонент клеток минимальном сигнале иуклеотидных оснований.

Таким образом, выбранные длины волн возбуждения позволяют получать информацию об особенностях строения генома микроорганизмов и составе и структуре белков.

3.1.1. Спектры модельных соединений бактериальных компонентов.

. Для интерпретации спсктрсв микобактерий и бруцелл при возбуждении на выбранных длинах волн, нами получены спектры модельных соединений: основных ароматических аминокислот и нуклеотидных оснований (тирозина, триптофана, фенилалашша, ДНК тимуса теленка, полинуклсотидов и липидов ). Соотнесение отдельных линий в спектрах УФ РКР определенным колебательным модам биохромофоров проведены по Rava R.P. (1989).

Результаты изучения спектров модельных соединений показали, что при возбуждении на определенных длинах волн наблюдается увеличение интенсивности линий, которые соответствуют различным колебательным модам биомолекул, что подтверждает возможность использования метода спектроскопии УФ РКР для селективного исследования сложных молекулярных структур.

3.1.2. Спектры УФ РКР белкового и нуклеотндного компонентов микобактерий и бруцелл разных видов.

В настоящей работе впервые методом спектроскопии УФ РКР исследованы 20 культур микобактерий, относящихся к восьми разным видам и 12 музейных и полевых штаммов бруцелл четырех видов в стадии стационарного роста. На рис. 1 изображены спектры УФ РКР микобактерий M.tuberculosis, шт.192 и Dt/St, М. bovis, вакцинный штамм BCG, М. avium, urr.61 при возбуждении на длине волны 252 и 230 нм.

Спектры УФ РКР при возбуждении излучением на длине волны 252 нм характеризу-' югся сходным набором линий и отличаются по их относительным интенсивностям. Сравнение спектров культур микобактерий со спекрами модельных нуклеотидов позволяет заключить, что преимущественный вклад в спектр дают ДНК и РНК различных типов, а также свободные нуклеотиды. Оценка вклада белка в спектры клеточных культур по интенсивностям линий ароматических аминокислот в области 757 см-1 (Tip), а также 1175 см-1 м дублета Ферми 830V850 см-1 (Туг), позволила заключить, что он относительно мал. '

Рис. 1 Спектры УФ РКР микобактерий М. tuberculosis шт. 192, Dt/St, М. avium шт.61, М. bovis шт. BCG при возбуждении на длине волны 252 (А) и 230 (Б) ид».

Основные линии РКР клеточных культур локализован в области 1200-1700 см-1 и представлены тремя группами линии: 1 - 1300-1400 см-1,2 - сильная линия при 1490 см-1, 3 - 1570-1700 см-1.

В спектрах УФ РКР микобактерий при возбуждении на длине волны 230 им нуклео-тидный компонент имеет минимальный сигнал, за исключением вклада аденин-гуанино-вой компоненты. Основные линии в спектрах микобактерий принадлежат колебательным модам белковых молекул: аминокислотам, пептидным колебаниям и другим. В спектрах преобладают линии тирозина и триптофана (1618,1553,1260,1206,1177,1016, 763 см-1). Аденин и гуанин представлены линиями средней интенсивности (1490,1370 см-1), цитозин представлен линией при 1303 см-1, тимин - линией при 1382 см-1. На длинах волн возбуждения < 230 нм происходит резонансное усиление колебаний Амид-1 пептидных связен, а также возрастает енгнал лнпндов (1660 см-1).

При сравнении спектров УФ РКР культур бруцмл разных видов при возбуждении на длине волны 216 и 270 нм выявили следующие особенности. Выявлены индивидуальные

линии, характерные для каждого вида бруцелл, а в целом, спектры характеризуются сходным набором линий, но отличаются также относительными интенсивиостями. На рис. 2 изображены спектры УФ РКР бруцелл штаммов 19, 82, 544 вида - abortus, Рев-1 вида - melitensis, 1330 вида - suis, 424/2 вида - ovis.

Рис. 2. Спектры УФ РКР B.abortus 19 - 1, 82 -2, 544 -3; B.melitensis Pev-1 -4; B.suis 1330 - 5; В. ovis 424/2 - 6 при возбуждении на длине волны 270 и 216 нм

При сопоставлении полученных спектров бруцелл со спектрами модельных соединении ароматических аминокислот и иуклсотидиых оснований было установлено, что в спектрах бруцелл штаммов 19, 82,104М, 54, 544 В. abortus на длине волны 216 нм из нуклео-тидных оснований значительный вклад дает адешш (1350-1355 см-1), на длине волны 270 нм его дополняют ураци.1 (1628-1636 см-1) и цитозин (1504-1530 см-1), а из аминокислот в спектрах преобладают линии триптофана (на 216 нм - 1335-1325, и на 270 нм - 14001458 см-1).

В колебательных спектрах штаммов Рев-1, М16, Н-102 В. melitensis, постоянно повторяются линии триптофана, аденнна и цнтозина.

к ».«H^ifftuman^^^^i^pW^WMmm^ "Ий и» - 1Ч7П

см-1, на 270 нм - 1490 см-1), урашиа (270 нм - 1464 см-1), цитозина (270 нм - 1412 см-1),

триптофан дает вклад только на 216 им -1231-1230 см-1.

В спектрах В. ovis, штаммы 424/2 и 424/4 отмечаются колебания гуанина в области 1367-1360 см-1 при длине волны 216 нм и аденина с триптофаном в области 1348-1340 и 1245 см-1.

Проведенные исследоваия показали принципиальную возможность изучения нативных макромолекул в составе целой живой клетки (микобактерии, бруцеллы) и получения как количественной, так и качественной информации. Продемонстрирована возможность изучения нуклеотидиого и белкового компонентов при изменении длины волны возбуждения. Зарегистрированные данные были использованы для разработки методических подходов применения спектроскопии УФ РКР для биодетекции и идентификации микобактерии и бруцелл.

3.1.3. Исследование относительной концен трации макромолекул микобактерии и бруцелл как показателя специфичности культур

Изучение микобактерии и бруцелл современными физико-химическими методами показало, что относительное содержание ароматических аминокислот, нуклеотидных основании и липидов в бактериальной клетке высокоспецнфично от культуры к культуре. Для того, чтобы проверить возможности спектроскопии УФ РКР регистрировать отличие в концентрации этих биомолекул для культур разных видов мы измерили относительную интенсивность линий РКР от вклада колебательных мод компонентов клетки. При этом мы исходили из того факта, что интенсивность линий хорошо коррелирует с концентра^ цией биомолекул. В качестве реперов были выбраны интенсивные и хорошо разрешенные линии. В спектрах УФ РКР микобактерии (I = 230 нм) интенсивная линия 1660 см-1 (валентные колебания С = С ) отражает значительное содержание липидов, линии 1609 см-1 н 1550 см-1 отражают относительное содержание тирозина (Туг ) и триптофана (Тгр), соответственно. Относительная интенсивность реперных линий была измерена в спектрах УФ РКР 8 штаммов микобактерии двух видов М, bovis ц М. avium. Вычислив отношения интенсивностей линии 1660 см-1 липидов к линии 1609 см-1 Туг и сравнив эти значения для исследованных культур, микобактерии М. bovis u М. avium были разделены на две группы: I.M. avium,9,12,14; U.M. bovis,8,361,BCG; 111. M. bovis, 14, 622 и BCG.

В другом случае, сравнив вычисленные отношения интенсивности линии 1550 см-1 Тгр кшгтенсивноси линии 1609 см-1 Туг, мы смогли разделить культуры натри группы: I. М. avium, 9,12,14; II. M. bovis, 8, 361, BCG; III. M. bovis, 14, 622.

Таким образом, очевидна корреляция между относительной интенсивностью линий ароматических аминокислот и липидов в спектре УФ РКР клетки и видом микобактерий.

Во втором случае М. Ьото разделились на две группы, что является отражением внутривидовых отличий исследованных штаммов.

Селективное возбуждение нуклеотидного компонента микобактерий ( длина волны 252 нм) позволяет по спектрам УФ РКР измерить относительные интенсивности отдельных линий нуклеотидных оснований. Многие исследователи при идентификации микроорганизмов по нуклеотидному составу ДНК используют значение суммы гуанина и цито-зина в молекулярных процентах (мол.% С + С). Мы использовали критерии специфичности в виде отношения С/Т исходя из того, что линии, соответствующие колебаниям этих оснований, разнесены в спектре УФ РКР. Полученные данные были сопоставлены для разных штаммов микобактерий и представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Относительная интенсивность линий гуанина (1603 см-1) и тимина (1670 и 1238 см-1) в спектрах УФ РКР микобактерй разных видов при возбуждении излучением с длиной волны 252 нм.

N/N : Наименование культуры : Отношение интенсивностей линий : : G (1603) /Т (1670) : G (1603) /Т (12380)

1. M. (uberculosis, 192 1,12 3,25

2. M. tuberculosis, dt/st 1,04 3,18

3. M. bovis, BCG 1,01 3,08

4. M» bovis, 8 1,06 3,00

5. M. bovis, 14 1,24 2,48

6. M. bovis, 622 1,28 2,36

7. M. bovis, Vallee 1,27 2,71

8. M. bovis, OP 1,12 2,83

9. M. ka&iasii 1,10 2,56

10. M. gordone 1,17 2,48

11. M. avium, 61 1Д4 2,86

12. M. avium, 12 1,11 3,03

13. M. avium, 2282 0,98 2,38

14. M. avium, 14 0,90 2,70

15. M. intracellulare, 111 1,19 2,90

.16. M. smegmatis 1,32 2,20

_1J_ \f rM»; 7 1.S0 3,51

Установлено, что для атипичных микобактерий М. smegmatis u М. phlei определенно выделяется более высокое значение отношения G(1610)/T(1660). Отношение G(1610)/T (1238) отчетливо выделило в отдельную ipynny культуры М. tuberculosis. Для М. bovis это отношение несколько больше, чем для М. avium. Следовательно, относительная интенсивность линий G (1610) и Т (1238) может служить дополнительным критерием при идентификации микобактсрий.

Аналогичную работу провели с культурами бруцелл отдельных штаммов на длине волны возбуждения 216 им. Для изучения спектров УФ РКР бруцелл на специфичность, мы вычисляли относительную интенсивность линий аденина и цитозина, которая составляла соответственно 1309 и 1290 см-1 и являлась специфическим показателем видовой принадлежности бруцелл.

По этому признаку выделили четыре группы бруцелл: I - В. abortus ( штаммы 54, 544), В. suis (1330, 61); II - В. melitensis (16М, Pev -1, Н-102); III - В. ото (424/2, 424/4 ); IV - В. abortus (19,82, 104М).

Таким образом, измерение относительной интенсивности реперных линий в спектрах УФ РКР может быть использовано для биодетекции и идентификации микобактсрий и бруцелл разных видов.

3.1.4. Определение положения и интенсивности основных линий в спектрах УФ РКР для идентификации микобактерий и бруцелл Предыдущие исследования показали, что спектры УФ РКР микобактерий и бруцелл разных видов отличаются по положению и интенсивности основных линий. Особый интерес представляет область спектра с центром ~ 1340 см-1, в которую вносят вклад колебания нескольких мод разных компонентов клеток. Любое изменение в интенснвности или частоте какой-либо составляющей моды сильно меняет очертание этой группы линий ( Dalterio R.A., Spiro T.G., 1987), которые высокоспецнфичны для каждого отдельного вида микроорганизмов. Для выяснения возможности использовать эту особенность спектральных характеристик для идентификации микроорганизмов, мы исследовали специфику микроокруасения "хромофоров" в составе нативных клеточных культур.

В эксперименте были изучены спектральные характеристики шести штаммов двух видов микобактерий М. bovis u М. avium (рис. 3). Профиль группы линий имеет специфические очертания для каждого вида микобактерий. Для M.bovis (рис.3. Al,2,3) характерно наличие четырех пиков примерно равной интенсивности с преобладанием центрального

пика (1340 см-1). Для М. avium (рис.З.Б1,2,3) это интенсивная линия в центре, резко поднимающееся коротковолновое плечо и более пологое с ддиноволновой стороны.

Одной из главных причин специфического профиля этой группы линий, очевидно, является неповторимость упаковки биомолекул клетки. Сечение рассеяния колебательных мод нуклеотидных оснований ( аденина, гуанина, тимина и цитозина ) и ароматических аминокислот ( тирозина и триптофана ) зависят от локального микрос:;ру:кг::ия хромофоров, которое в свою очередь, определяется структурой макромолекулы. Поэтому от упаковки макромолекул зависит величина вклада колебательной моды в область спектра

Рис. 3. Спектры УФ РКР мнкобактерий в области 1300-1400 см-1 при возбуждении 230 нм.М.Ыгш 1А - шт-ВСв, 2А - шт.8, ЗА - шт. 14; М.атаца 1Б - шт.61, 2Б - шт.9, ЗБ • шт. 12

1300-1400 см-1.Кроме того, известно, что при возбуждении спектров УФ РКР бактерий на длине волны 216 ни у величивается интенсивность колебаний амидных связей полипептидов (Кэри П., 1985). Частоту и интенсивность линий от вклада этих колебаний используют при установлении вторичной структуры полипептидной цепи. Вторичная структура белков имеет конформацию типа а-спирали или В-слоя. При активации клеточных процессов наблюдают преимущественное содержание белковых глобул с а-спнральной вторичной ТГТКТУР""- Это объясняется функциональной активностью молекул в данной конформацнн. Руководствуясь этим положением, мы провели измерение положения

ачидных связей полипептидов (Амид-1, Амид-2, Амид-З ) в спектрах УФ 1'КР ряда культур бруцелл и вычислив отношение шггеисивностей линии, соответствующих разным конформацням белков, установили, что культуры бруцелл имеют молекулы в обоих типах структур (табл.2)

Таблица 2.

Положение линий амидных связей полипептидов в спектрах УФ РКР бруцелл

Культура, штамм (форма)

Частота колебаний, см-1

Амид-1

Амид-2

Амид-З

В. abortus, 19 (S) 1679-1653 1579-1551 1278-1259

(0,88) (0,92) (1,08)

В. abortus, 82 (R-S) 1653 1570-1549 1260-1248

(1,0) (0,8)

В. abortus, 54 (S) 1660-1645 1572-1560 1263-1248

(0,88) (0,91) (1,35)

В. melitehsis, Pêv-1 (S) 1683-1666 1566-1547 1270-1242

(1,04) (1,6) (1,0)

B. suis, 61 (S) 1670-1647 1566-1551 1254

(0,88) (1,03)

B. suis, 1330 (S) 1650 1572 1269

B. ovis, 424/2 (R) 1673-1649 1553-1540 1258-1247

(1,06) (1,03) (0,980)

Примечание: В скобках указана относительная интенсивность линий при разных конформациях.

В белковых молекулах относительное содержание а-спиральных участков выше у В. abortas (штаммы 54, 544,19, 82,104М), В. raclitensis (16М, Pev-1, Н-102), В. suis (61,1330 ). У В. ovis (424/2,424/4) преобладали молекулы с В-структурными участками.

Полученные данные свидетельствуют о том,что конформация белковых молекул бруцелл в S-форме занимает среднее положение между L-и R-формами. Существует корреляция между R-и S-формами бруцелл и относительной интенсивностью линий Амид. При S-форме преобладают линии,соответствующие а-спиральной структуре белков, а R-форме-В-слойной структуры. При равномерном присутствии линии в виде конформацнн беспорядочного клубка следует считать,что культура находится в смешанной SR- форме.

Следовательно, более функциональная а-спнральная структура соответствует интактной 8-форме бруцелл. При - К - Ь-трансформации клеток происходит перестройка белков клеточной стенки, а также изменяются положение и интенсивность линий Амид в спектрах УФ РКР бруцелл.

Таким образом, в качестве перспективного направления использования спектроскопии УФ РКР для биодетекции и идешификацип микроорганизмов можно выделить уникальную возможность исследовать упаковку нативных биомолскул клетки по специфическому микроокружению биохромофоров.

3.1.5. Изучение молекулярной структуры белков после V-облучения микроорганизмов.

При анализе патогенных микроорганизмов спектральными методами обычно проводят их предварительную инактивацию. Наиболее часто применяемые методы тепловой и химической инактивации вызывают значительные структурные изменения компоненов клетки. Поэтому при разработке методики регистрации спектров УФ РКР микобактерий мы провели поисковые эксперименты для выяснения границ применяемости современного способа - У- инактивации.

Были зарегистрированы спектры УФ РКР ряда культур микобактерий при длине возбуждения 230 нм после воздействия разных доз У-облучения (от 2,5 до 30 кГр, .мощность источника составляла 2,5 кГр/час), анализ которых показал, что интенсивность и частота некоторых спектральных линий изменяется пропорционально дозе облучения. Из практических исследований ( НШиЬгап<И Р.С., 1988) известно, что линия от вклада колебаний амидных связей ( ~ 1660"см-1) и колебаний бензольного кольца тирозина ( ~ 1556 см-1 ) являются своеобразными спектроскопическими индикаторами внутриклеточных перестроек белков. Сравнение относительных интенсивноетей и частот линий показали, что увеличение дозы У- облучения до 30 кГр приводит к возрастанию количества полипептидных участков в а-спиральной вторичной структуре н уменьшению водородных связей тирозина в белках. Происходит переход белков в свободное состояние за счет изменения физико-химических характеристик внутриклеточной жидкости, например рН. Эти выводы согласуются с результатами параллельного изучения эффективности роста облученных бактерий на питательных средах и анализа ультраструктурных изменений в морфологии облученных клеток по данным электронной микроскопии и экспериментальными данными, полученными в других исследованиях- (Кудряшов Ю.Б., 1982, Аксенов С.И., 1990 ). Следовательно, изучать спектры УФ РКР микроорганизмов после инактивации можно, но необходимо учитывать дозу оолученииТИГ котирей-зовнеит-интенсивность и частота спектральных линий.

3.1.6. Спектры УФ РКР микобактерий и бруцелл на разных стадиях роста.

С целью выяснения влияния возраста культуры микобактерий и Ьтрансфорчации бруцелл на спектры УФ РКР были проведены следующие эксперименты.

Исследованы культуры М. tuberculosis (шт. 192, Dt/St), M. bons, шт. BCG и M. avium, шт.61 на разных стадиях роста: логарифмической (1), стационарной (2) и стадии отмирания (3) при возбуждении спектров на длине волны 252 им, где спектры УФ РКР бактерий представляют собой суперпозицию сшналов ДНК и РНК различных типов, а также свободных иуклеотидов ( Spiro T.G., 1986). Из практических исследований нуклео-тндных оснований (там же) известно, что при переходе нуклеотидных молекул во вторичную структуру понижается интенсивность колебаний круговых пуриновых и пиримиди-новых мод за счет известного эффекта пшохрочизма резонансных электронных переходов.

Результаты исследований представлены на рис.4, где также отмечены масштабные единицы, которые позволяют оценить изменения интенсивностеи 1(п) колебательных мод в расчете на единицу клеточной массы в зависимости от возраста колоний.

Из сравнения спектров и анализа гистограмм изменений отдельных колебательных мод отчетливо прослеживается изменение линий как по относительным, так и по абсолютным шггенсивностям. В спектрах М. avium u BCG на первой и второй стадиях роста пики РКР в области 1550-1700 см-1 пракически полностью перекрываются сигналом иуклеотидного компонента, причем число пиков значительно больше, чем для пятинедельных культур, тогда как, для М. tuberculosis, шт. 192 и Dt/St этот сигнал возрастает со временем.

В процессе роста клеток культур в спектрах РКР значительно изменяются частотные характеристики и интенсивность линий в области 1300-1390 см-1. Одной из причин, вызывающих многие из этих отличий, является изменение с возрастом соотношения массы между нуклеотидным компонентом и всеми другими компонентами клеток. Спектральные возрастные отличия связаны с изменением состояния клеток в процессе активного роста колоний по сравнению со стадией отмирания с преобладанием старых неде-лящихся клеток.

В результате анализа спектров УФ РКР микобактерий на разных стадиях роста установлено, что значение частоты (линии гуанина и цитозина) коррелирует с уровнем активности клеточного метаболизма.

BOG

fw

,4 J

i f

All,CM"1

Рис. 4 Спектры УФ PKP микробакгерий М. bovis шт. BCG u М. avium шт. 61, М. tuberculosis шт. 192 и Dt/St на трех стадиях роста 1-логарифмической, 2-стационар-ной, 3-отмирания при возбуждении на длине волны 252 нм

Так, при переходе клеток из состояния замедленного роста (третья стадия) в состояние пролиферации (первая и вторая стадии) наблюдается увеличение количества спектральных линий с отличающимися частотой и интенсивностью.

По характеру изменений интенсивности линий нуклеотидного компонента по абсолютной и относительной величине показано, что при переходе клетки из состояния покоя в состояние активного роста концентрация данных макромолекул в расчете на клетку меняется незначительно. Установлено, что динамика перехода молекул ДНК и РНК в новую структуру, а также скорость образования новых молекул имеет индивидуальный для каждой культуры характер. Например, микобактерни вида апит, имеют более резкий по времени переход от стадии пролиферации к стадии покоя.

Анализ спектров УФ РКР показал также, что при изменении состояния клетки происходит изменение свойств внутриклеточной среды ( ионной силы, рН и т.д.), причем более резкие изменения наблюдаются при переходе между второй и третьей стадиями.

Обнаруженная зависимость между возрастом культур микобактерий и интенсвностью -гч.г.1-1д-1.1.у1.-1и.пт1лнпт ь-пмппиента может СЛУЖИТЬ ДОПОЛНИТеЛЫЮИ информацией ДЛЯ

идентификации клеток, и в тоже время, требует стандартизации приготовления образцов культур для идентификации и свидетельствует о необходимости полного учета различн-ных факторов, способных вызвать спектральные изменения.

Для изучении L-трансформацин с помощью УФ РКР были взяты семь штаммов трех видов бруцелл на трех стадиях роста. На рис. 5 представлены наиболее характерные области спектров трех штаммов бруцелл : В. sborfus 19, В. melitensis Pev-1, В. suis 1330 при возбуждении на длине волны 270 нм, а также масштабные единицы, которые позволяют оценить изменение ннтенснвностеи I (п) колебательных мод в расчете на единицу клеточной массы в зависимости от L-трапсформации .

Установлено, что у всех штаммов бруцелл независимо от их видовой принадлежности L-трансформация отражается на изменении относительной интенсивности линии в области 1628-1666 ем-1. В данной области для бруцелл в L-форме относительная интенсивность линий в спектрах УФ РКР увелнчнна на 30-50%, по сравнению с относительной интенсивностью линий в спектрах бактерий в S-форме.Эта закономерность дает возможность определять трансформацию клеток.

В спектрах бруцелл начального этапа трансформации наблюдается увеличение интенснвностеи аденин-гуашшовых линий в области — 1490-1412 см-1, а в спектрах L-форм наблюдается уменьшение относительных ннтенсивностей линий в этой области по сравнению с относительной интенсивностью в спектрах S-форм. Отмечалось также уменьшение полушарий линий нуклеотиднои компоненты ~ 1628,1594,1578 см-1, что подтверждает структурно-функциональные перестройки при трансформации клеток.

В результате проведенных исследований установлено, что при L-трансформации бруцелл происходит изменение относительной интенсивности линий. Однако частота линий, характерных да я каждого штамма бруцелл не меняется, что позволяет идентифицировать их, независимо от стадии трансформации.

Кроме того, проведенные исследования структурных изменений макромолекул в составе целых клеток методом спектроскопии УФ РКР продемонстрировали уникальные возможности метода для анализа натнвных структур микроорганизмов в различных функциональных состояниях. Такие возможности основаны на чувствительности метода к состоянию и микроокружению связен карбонильных и амидных групп нуклеотидных оснований.

3.1.7. Специфические особенности спектральных характеристик разных видов микобактерий и бруцелл.

Для разработки методики идентификации микроорганизмов по спектрам УФ РКР были использованы 12 культур музейных штаммов микобактерий и 12 культур бруцелл.

Рис.5 Спектры УФ РКР В. abortus 19 -I, В. melitensis Pev-1 -II, В. suis 1330 -III на трех стадиях роста в S- форме (1), L - форме - начальной стадии (2), L- форме (3) при возбуждении на длине волны 270 им.

Проведенный анализ спектральных данных- выявил специфические группы линий, характерные для каждого вида микобактерий н бруцелл (табл. 3-5). Соотнесение полученных спектров УФ РКР со спектрами модельных соединений клеточных компонент, позволило соотнести отдельные линии в спектре определенным колебательным модам биомолекул.

Установлено, что вклад в спектральые характеристики дают колебания лнпидов, аденина, тимина, цнтозина, гуанина, триптофана и тирозина (табл. 4).

Спектры УФ РКР микобактерий характеризуются сходным набором линий, близких по частоте и ингенсивости, что подтверждает их родовую н видовую близость. Спектры М. tuberculosis имеют несколько смещенную линию от вклада липидов (1658 см-1) в коротковолновую область, по сравнению со спектрами других изученных видов микобактерий, за исключением только М. kaniasäi. В спектрах М. bovis, как и М. avium липидная полоса доходит до 1670-1665 см-1, благодаря большой концентрации липиднои компоненты в клетках. Положение линий триптофана и тирозина в области 1640-1600 см-1 специ-

фично для каждого отдельного штамма. Полоса в области 1590-1570 у М. 1иЬ)гси1о51я имеет два пика.

Таблица 3

Индивидуальные линии в УФ РКР спектрах культур мнкобактернй при возбуждении на длине волны 252 нм

Шмамм : Часто т а, см-1

М. tuberculosis, Dt/st 1658 1628 1590/1579 1490 1425 1381 1332 1245

М. bovis, 8 1663 1625 1587 1495 1425 1345 1271 1239

14 1665 1633 1604/1586 1490 1431 1334 1240 1205

622 1668 1623 1604/1580 1493 1416 1369 1345 1235

Valí ее 1660 1612 1582 1493 1436 1340 - 1247

BCG 1663 1630 1582 1493 1425 1340 - -

М. kanzasii 1657 - 1578 1487 1447 1348 » -

М. gordone 1668 1631 1567 1485 1426 1377 1345 1248

М. avium 12 1670 1623 1578 1487 1431 1337 1318 1248

М. intracelluläre 111 1660 - 1580 1493 1434 1334 1307 1245

М. smegmatis 1660 1636 1578 1482 1426 1372 1342 1299

М. piilei 7 1660 1609 1577 1483 - 1375 1355 1226

У М. bovis частота колебаний в этой области занимает промежуточное положение между М. tuberculosis и остальными изученными видами. Для остальных видов мнкобактернй, частота этой области лежит ниже 1580 см-1.

К видовым особенностям относится положение самой интенсивной лнннн - аденин-гуаниновой компоненты • 1495*1480 см-1. Для М. bovis характерна частота линии более 149Ö см-1, а для М. tuberculosis менее ~ 1490 см-1. Спектры М. kanzasii, М. avium u М. intracellulare, имеют близкие частоты колебании 1578 и 1487 см-1, однако спектры резко отличаются по положению линии 1447 и 1431 см-1, а также на более коротких линиях -1348 и 1337 см-1. Для М. gardone характерна еще более низкая частота ~ 1485 см-1, и самая низкая частота линий у микобакгерий М. smegmatis u М. phlei ~ 1482 см-1.

В области 1380-1200 см-1 наблюдается характерное соотнесение спектров определенным видам микобактерий, в силу своей неповторимой индивидуальности.

Таблица 4

Соотношение линий в спектрах УФ РКР микобактерий и бруцелл при возбуждении на длине волны 252 им и 216 нм

п/п : Спектральная область, (см-1) : Соотнесение линий

1. 1670 - 1655 Липиды, Тимин, Цитозин

2. 1640 - 1600 N1!), Туг

3. 1590 - 1570 Аденин, С, Тгр

4. 1495 - 1480 Аденин, в

5. 1450 - 1420 Адешш, в

6. 1380 - 1360 с, Тимин

7. 1350 - 1330 Тгр, Аденин С

8. 1250 - 1220 Тимин, Тгр, и

Условные обозначения: Тгр - триптофан, Туг - тирозин, I! - урацил, в - гуанин

При сравнении спектров УФ РКР культур бруцелл разных видов при возбуждении на длине волны 216 нм, также выявили индивидуальные линии, характерные для каждого вида бруцелл (табл. 5), хотя в целом, спектры характеризуются сходным набором линий, но отличаются относительными интенсивностями. Сопоставляя полученные спектры бруцелл со спектрами модельных соединений ароматических аминокислот и нуклеотид-ных оснований, позволило соотнести отдельные дискретные линии в спектрах.

Из нуклеотидных оснований большой вклад дает аденин (1350-1355 см-1), из аминокислот в спектрах преобладают линии триптофана (1335-1325,1237-1231 см-1). . Проведенный анализ частот колебаний в спектрах УФ РКР изученных микобактерий и бруцелл выявил характерные особенности в родовых, видовых и внутривидовых отличиях. Установлено, что у каждого штамма бактерий имеется свой специфический профиль группы линий. Можно предположить, что одной из главных причин специфичности этой группы линий является неповторимость конформациоиного построения биомолекул -4сл;тк::.-Ссчг1П12-рсссг^!:!11,с:ч:слебгтслы!ых-мсд иуклгст1^:ы;;-оспсаал1:и-н-£ромат11нс— ских аминокислот зависят от локального микроокружения хромофоров, которые, в свою

>чередь, зависят от пространственной структуры макромолекулы. Поэтому, вполне веро-1тно, что от упаковки макромолекулы зависит величина вклада отдельных колебатель-!ых мод и соответственно определенных частот колебаний.

Таблица 5.

Индивидуальные линии в спектрах УФ РКР бруцелл при возбуждении на длине волны 216 нм

Штамм : Частота, см-1

В. abortus, 19 1365 1350 1305 1292 1237

82 1354 1335 1303 - 1231

1044 1353 1325 - 1285 1235

54 1357 1331 - 1295 1236

544 1352 1333 - 1288 1235

В. melitcnsis, Pcv-1 1370-1360 1330 1311 1290-1245 1230

М1б 1370 1355 1329-1312 1290 -

Н-102 1372 1328 1304 1242 -

В. suis, 61 1374 1333 1305 1288 1231

1330 1370 1345 1308 1292 1230

В. ovis, 424/2 1367 1348 1312 1297-1245 1236

424/4 1360 1340 1310 1294 1245

3.1.8. Сравнительная идентификация мнкобактерий и бруцелл общепринятыми методами с УФ РКР Для сравнения эффективности применения спектроскопии УФ РКР с общепринятыми методами идентификации культур микобактерий и бруцелл были проведены исследования по комплексу признаков, который включал изучение тннкториальных, культураль-но-морфолоппеских, субмикроскопических, биохимических и патогенных свойств.

Получены следующие результаты. При изучении скорости роста М. bows - б штаммов, М. tuberculosis - 2 шт., М.avium - б шт., М. intracellularae - 2 шт., М. smegmatis - 1 шт., М. phlei -1 шт. отмечали более быстрое появление видимого роста в музейных штаммах М. bovis, по сравнению с полевыми изолятами. Просмотр мазков, окрашенных по Цилю-Ннльсену показал, что все изучаемые культуры однородны представлены кислотоустойчивыми палочками, отличающимися по размерам и форме в зависимости от видовой при-

иадлежиости. В мазках из М. smegmatis u М. phlei отмечали наличие некислотоусгочи-вых палочек. Все музейные штаммы по морфологическим, тинкториальным и биохимическим свойствам вписывались в параметры, описанные для данных видов.

Эдектронко-мккроекопнческое изучение интактиых клеток микобактерий разных видов показало, что все они обладают четко выраженной трехслойной клеточной стенкой, трехслойной цитоплазматической мембраной, цитоплазмой с наличием в ней мембранных структур, рибосом, полирибосом и различных включений. Нуклеоид микобактерий располагается как правило в центральной части клетки и представлен зоной, содержащей фибриллы ДНК.

Установлено, что микобактерии разных видов отличаются между собой по размерам, форме, строению нуклеоида, цитоплазмы, толщине клеточных стенок и отдельных ее слоев, однако эти отличия не являются постоянным признаком и во многом зависят от стадии роста культуры в момент фиксации и других факторов, в связи с этим, можно сделать вывод, что с помощью электронной микроскопии можно получать лишь вспомогательную информацию при изучении и идентификации микобактерий.

При подкожном заражении свинок микобактернямн туберкулеза бычьего вида у всех животных продолжительность жизни после заражения составляла 28^37 дней.

Вутривенное заражение кроликов как музейными, так и полевыми штаммами М. bovis, вызывало развитие генерализованной формы с обширными поражениями легких и последующей гибелью животных ь течение 25-35 дней.

Внутривенное введение культуры М. tuberculosis кроликам не вызывало гибели животных. После убоя, произведенного через три месяца после заражения отмечали отдельные туберкулезные очажки в легких.

_ Подкожное введение морским свинкам микобактерий птичьего вида вызывало у них местную воспалительную реакцию в виде абсцессов, которые со временем подвергались рубцеванию, и наблюдали увеличение регионарных лимфоузлов. Гибели животных не происходило, в то время, как для кур все исследуемые культуры М. avium были патогенны при введении бактериальной суспензии в подкрыльцовую вену, в также для кроликов при внутривенном заражении.

При введении морским свинкам, кроликам и курам культур М. intracellularae, М. phlei u М. sniegniatis не вызываю у животных развития патологического процесс3

В результате проведенных исследований становится очевидным, что для идентификации микобактерий, нн один в отдельности из проведенных тестов не может быть использован исключительно для определения вида микобактериальной культуры, необходимо

проводить весь вышеуказанный комплекс исследований, на который затрачивается три н Солее месяцев.

Аналогичную работу по идентификации возбудителен бруцеллеза провела Е.Б.Бараба-нова (1996), которая отметила, что культуры, находящиеся в Б-форме, можно дифференцировать набором различных тестов, рекомендованных ФАО/ВОЗ, но при ¡^-трансформации этих же культур, утрачивается возможность индикации бактерий как при проведении комплекса исследований культуралыю-морфологических, субмикроскопических, антигенных, агглютнногенных и тннкторпальных свойств, так и при испльзовайин такого чувствительного и специфического метода, как биопроба с последующим применением серологических и бактериологических исследований.

Следовательно, использование спектроскопии УФ РКР позволяет проводить в короткие сроки (до 10 минут на одну культуру) идентификацию микобактерий и возбудителей бруцеллеза на разных стаднх трансформации, благодаря высокой чувствительности метода, основанного на молекулярных свойствах и компьютерной обработки результатов.

3.2. Оценка противотуберкулезной активности химиопрепаратов ¿а уИго с помощью электронной микроскопии Начальным этапом оценки любого предлагаемого химиопрепарата являются исследования ш уйго, в процессе которых определяют его эффективность по наличию или отсутствию роста микобактерий на питательных средах с добавлением препарата и опреде-. ленне острой токсичности в эксперименте на белых мышах. Но этих данных недостаточно для расшифровки механизма действия нового препарата и степени изменений микобактерий в зависимости от его дозы.

Таким образом, существует необходимость в изыскании метода, позволяющего на первом этапе достоверно оценить эффекгивость нового препарата на основании знания механизма действия, включая структурно-функциональные изменения, возникающие в возбудителе под его воздействием.

Одним из методов, дающих точную информацию о морфологических изменениях возбудителя и механизме действия химиопрепарата, является электронная микроскопия.

Основываясь на предположение о наличии взаимосвязи между морфологическими изменениями возбудителя туберкулеза под действием туберкулостатиков и их функциональными проявлениями (в частности, патогенностью) была проведена серия опытов по изучению ультраструктуры микобактерий, выращенных на среде Левенштейна-Иенсена с добавлением разных доз туберкулостатиков и их патогености для лабораторных животных. Была установлена прямая зависимость между степенью структурных изменений

бактерий н изменением их вирулентности.

Для изучения был взят новый препарат - альдозон, а для сравнения, использовали широко применяемый как в медицинской, так и в ветеринарной практике - изониазид. В пи-тальные среды перед свертыванием добавляли растворы изониазида и альдозона, достигая конечных концентраций 0,9, 0,11 и 0,05 мкг/мл. При изучении других химиопрепара-тов, диапазон концентрации может быть изменен в зависимости от его предлагаемых свойств. В качестве контроля были использованы микобактерии, выращеные на среде без добавления препаратов. В работе использовали штамм 14 М. Ьоук(ВНИМПТЖ), патогенный для крупного рогатого скота, не обладающий лекарственной устойчивостью.

При изучении ультраструктуры клеток микобактсрии, мы их условно разделили на три группы в зависимости от степени изменений: 1- нормальные клетки, II - клетки со средней степенью повреждения и III - с сильной степенью повреждения.

I группа (норма). Клетки в зависимости от плоскости среза имеют палочковидную, округлую или овальную формы. Клеточная стенка и шггоплазматическая мембрана трехслойные, отделены друг от друга небольшой электронно-прозрачной зоной. Цитоплазма клеток неравномерной плотности, мелкозернистая, заполнена рибосомами и полирибосомами, по периферии четко определяются вакуоли. В цетгральной части большинства клеток выявлен обширный нуклеоид, представленный осмиофобной зоной с расположенными в нем фибрилами ДНК. Нередко фибрилы располагаются компактно в виде комка.

Рис. б. М. Ьоуш штамм 14 х 25000, I группа-контроль ( норма ). Округлая ( поперечные срезы), овальная формы клеток.

Рис. 7, M, bons s 110000, II группа ( средняя степень изменения).

кс - клеточная стенка, цм - цитоплазчатическая мембрана, и - иуклеоид, пп - пермплазматическое опространетво

II группа (средняя степень повреждения). У микоояктерий выявлены изменения в расположении поверхностных структур. Клеточная ci емка в виде одноконтурной структуры, неплотно прилегает к цитоплазматической мембране, образуя небольшое периплазмати-ческое пространство неравномерной толщины. Встречаются клетки с разреженной цитоплазмой, у которых содержимое протопласта выходит в образовавшееся пернплазматиче-ское пространство.

жшшш m >

Рис. 8. M. bovis х 110000, III группа ( сильная степень изменения ).

III группа ( сильная степень повреждения ). Значительные изменения субмнкроско-пической организации M. bovis, форма от округлой до звездчатой, клеточная стенка теряет трехслойное строение и выявляется как одноконтурная структура. Цитоплазматнче-ская .мембрана у клеток фрагментирована и не имеет четких очертаний. Цитоплазматиче-ская мембрана и клеточная стенка разделены обширным периплазматическим пространством, Цитоплазма клеток неравномерен плотности, разрежена. Плотный гранулярный компонент скапливается в разных участках клетки. Нуклеоид четко не определяется.

Процентное соотношение нормальных И поврежденных клеток определяли по результатам просмотра срезов колоний микобактернй полученных с 3-5 блоков. На выбранном срезе с помощью лейкоцитарного счетчика подсчитывали количество клеток трех групп (изучалось 1ÖÖ клеток с каждого из 5 блоков). На основании процентного соотношения определяли эффекгивность препарата но девятибальной шкале.

Результаты подсчета клеток микобактернй показали, что при равных концентрациях изониазида и альдозона, количество клеток по степени изменений было разным.

Так, при разведении изониазнда 0,9 мкг/мл количество клеток с сильной степенью изменений ( 3 группа) составила 99% от общего числа клеток на срезах, что соответствует 9 баллам. Это высший показатель эффективности препарата

Альдозон, соответственно, 25% с сильной степенью изменений клеток (3 группа) и 50% со средней степенью изменений (2 группа). Эффективность препарата в этой дозе 5 баллов Концентрация изониазнда 0,11 мкг/мл вызывет изменения во 2 группе у 20% и в 3 группе у 75% клеток на срезах колони, что составляет 8 баллов.

Альдозон в этом же разведении вызывает незначительные изменения ультраструктуры микобактерин у 20% клеток (2 группа). Оценка - 2 балла

Изониазнд в разведении 0,05 мкг/мл вызывает изменения у 50% клеток 2 группы н у 25% клеток 3 группы. Соответственно альдозон вызывает изменения по сравнению с контролем у 30% клеток, у которых не наблюдается клеточная стенка (2 группа), и у 70% популяций микобактернй ультраструктурное строение без изменений, что составляет 2 балла.

При параллельном проведении биопробы на морских свинках было отмечено, что у всех зараженных животных в месте введения культуры М. bovis, образовывались инфильтра--^ы с-течгн^гтггрБыг^-ЗТК'ДеЛЬТЧПечснисм времени в опытных группах 1 и 2 (0,9 и0,11 мкг/мл нзотшид, 9 и 8 баллов соответственно) инфильтраты рассосались и при убое, произведенном через три месяца после заражения у животных отсутствовали какие-либо изменения туберкулезной природы, культура из органов не выделена В группе 3 (изониа-

чид 0,05 мкг/мл , 5 баллов) и группе 4 (альдозон 0,9 мкг/мл, 5 баллов) наблюдали при вскрытии свинок единичные очаги в печени, незначительное увеличение паховых лимфоузлов, при посеве выделены микобактерии туберкулеза. Группы 5 и б (альдозон 0,11 и 0,05 мкг/мл по 2 балла) практически не отличались от контрольных животных, зараженных шггактной культурой. Опыты проводили в трех повторностях и во всех случаях результаты бнопробы подтвердили данные электронной микроскопии.

Обобщая полученные результаты, можно сделать вывод о существовании прямой зависимости между степенью ультраструктурных изменений, происходящих в клетках возбудителя туберкулеза и его патогеиностыо ддя лабораторных животных. На основании этого, методом ш \itro для оценки туберкулостатиков может быть электронная микроскопия ультраструктурных изменений в динамике при воздействии предлагаемых препаратов. Применение этого метода позволяет в более короткие сроки с большей достоверностью оценить хнмиопрепарат на основе полученных данных о морфологических и функциональных изменениях в возбудителе под действием туберкулостатиков и о механизме их действия.Целесообразность передачи нового препарата для практического применения, а также область его использования могут быть полностью выяснены только в результате оценки разных сторон его фармакологической активности в сопоставлении с лекарственными средствами, применяемыми в настоящее время. Сопоставляя данные электронной микроскопии с результатами изучения острой токсичности, выполненным!! совместно с Е.Е.Власовой (1989), можно уже на начальном этапе провести оценку препарата.

Таким образом, метод, основанный на этих двух параметрах позволяет достоверно эценить и отобрать для дальнейшего изучения наиболее эффективные химиопрепараты.

3.3. Способы контроля эффективности обеззараживания навозных стоков.

Охрана окружающей природной среды от загрязнения, в том числе от инфекционного I инвазионного начала, остается одной из актуальных проблем современности. У нас в тране серьезная проблема охраны н контроля окружающей среды возникла в зоне раз-!ещеиия животноводческих комплексов, в частности свиноводческих. На них при высота! концентрации поголовья на ограниченой территории и использоваия воды для уда-¡еия навоза из производственных помещений в течение суток образуется колоссальное олнчество животноводческих стоков да 10 000 кубометров в сутки, или более 3 млн. онн в год, которые содержат в больших количествах органические вещества и нередко осеменены патогенными бактериями (сальмонеллами, дептоспираии, микобактериями

туберкулеза и др.), яйцами гельминтов, длительное время сохраняющих жизнеспособность и вирулентные свойства.

líe менее важная роль в деле охраны окружающей среды от влияния животноводческих стоков принадлежит контрольной службе, осуществляющей государственный надзор за эксплуатацией систем очистки и использования жидкого навоза на полях орошения.

Существующие на вооружении санитарно-ветеринарной службы методы контроля эффективности обеззараживания жидкой и твердой фракции навоза имеют ряд недостатков, поэтому мы разработали новые способы, котоые позволили снизить трудоемкость, время контроля, и, главное, повысить качество исследований.

Учитывая, что на очистных сооружениях крупных свинокомбинатов бесподстялоч-ный навоз разделяют на твердую и жидкую фракции с последующей обработкой и обеззараживанием различными методами, мы решили разработать способы контроля на основных трех этапах его переработки.

Первый этап - твердая фракция навоза после центрифугирования вывозится на специальные площадки для бнотермнческого обеззараживания в буртах. Для оценки качества протекания бнотермических процессов, нами разаботан прибор д ля исследования биологических объектов в бурте навоза (Авторское свид. СССР № 647598 от 20.10.78.), который включает полый стержень, в верхней части которого закреплена рукоятка. В боковой поверхности стержня выполнены боковые прямоугольные отверстия (вырезы), расположенные на разной высоте, на равных расстониях друг от друга- Внутри стержня укреплены поперечные перегородки так, чтобы между перегородкой и нижней кромкой вырезов оставалась удерживающая кромка. В низкей части стержня укреплен конус. Тесто-объекты выполнены в виде цилиндрической капсулы, диаметр которых меньше ширины вырезов, а высота капсул меньше суммы длины вырезов и ширины кромки, ио больше длины вырезов. В боковой поверхности стержня и боковой поверхости капсул выполнены вентиляционные отверстия для создания внутри стержня и капсул микроклимата навозного бурта на всех уровнях нахождения тестобъектов.

Капсулы с исследуемыми биологическими объектами (любые виды микроорганизмов или яйца гельминтов) через вырезы вкладывают внутрь стержня и ставят на перегородки. Выпадение капсул предовращают удерживающие кромки. Взяв прибор за рукоятку, вводят его в навозный бурт, пронзая его с помощью конуса. По истечении определенного времени вытаскивают прибор из навозного бурта и извлекают из его часть капсул с тесто-объектами и проводят микроскопирование. В зависимости от сроков протекания биотермических процессов (летний или зимний периоды) контроль за выживаемостью биологических объектов продолжают или прекращают.

Второй этап - жидкая фракция навоза проходит несколько ступеней очистки, сначала тстаивается в первичных горизонтальных отстойниках, затем в аэротенки (на одних .•омплексах), на других сразу во вторичные вертикальные отстойники, затем проходят дополнительное обеззараживание различными методами.

На очистных сооружениях свиноводческого комплекса "Лузинский" впервые в тране была установлена опытно-производственная установка ИЛУ-б для обезззрзжнва-шя навозных стоков пучком ускоренных электронов. Для определения очистки на второй гтадиИ, нами разработан способ определения степени дегельминтизации навозных стоков Авторское свид. СССР Л» 836592 от 22.08.81.), который заключается в том, что заранее отовнтся биологическая камера, состоящая из двух полиэтиленовых полосок, сваренных хвойным швом с трех сторон, оставляя кромку, затем в полость камеры вносят необхо-щмое количество биологических объектов, герметизируют двойным швом четвертую сторону, после чего между листками кромки вкладывают балластную рамку из индиффе-рентого материала и края сваривают третьим швом. Затем биологическую камеру, содержащую взвесь определенного вида микроорганизмов или яиц гельминтов, устанавливают в начальной точке вершины наклонного лотка перед зоной облучения, включают

"Ускоритель электронов ИЛУ-6" с заданной дозой облучения, подают навозные стоки из накопительной камеры, которые увлекают за собой биологическую камеру по наклонному лотку, которая в толще навозных стоков попадает в зону облучения ускорителя электронов, при толщине слоя жидкости по наклонному лотку б мм и ширине потока 330 мм. Пройдя зону облучения, биологиеская камера попадает в приемную ловушку . После отключения ускорителя электронов н прекращения подачи навозных стоков из накопительной камеры, биологическую камеру извлекают из ловушки и здесь же в условиях производства исследуют под микроскопом биологические объекты, находящиеся в камере, для определния обеззараживания (дегельминтизации) навозных стоков.

Третий этап • поступление отстоенных стоков с очистных сооружений в пруды-накопители, где происходит их дальнейшая биологическая очистка, после чего их перекачивают на поля орошения. Существующие методы исследования сточных вод в санитарной гельминтологии очень трудоемки и продолжительны по времени, для устранения указанных недостатков предложено устройство - биологическая камера для исследования жизнеспособности гельминтов в водоеме (Авторское свид. СССР ЛЪ 1289464 от 22.01.85.), которая включает емкость, на ней посредством жесткого обода (каркаса) закреплено тканевое покрытие с держателем, выполненным в виде гибких тяг. В нижней и верхней части

емкости соосно расположены смотровые окна, которыми служат часовые стекла. На внутренней стороне емкости имеется полиэтиленовая аченка. Емкость имеет форму воронки. Держатель (гибкие тяги) закреплены на полиэтиленовом кольце. Полиэтиленовые кольца имеют углубление и наклонную поверхность. На держателе расположен противовес, выполненный в виде металлического кольца, а каркас имеет защелку для укрепления камеры на штативе.

Устройство работает следующим образом. В приготовленную биологическую камеру, емкость, вводят через тканевое покрытие и полиэтиленовую пленку взвесь определенного вида яиц гельминтов при помощи шприца с иглой. Камеру укрепляют на штативе при помощи защелки так, чтобы снизу на держателе находился противовес. Затем камеру опускают в водоем на нужную глубину и в определенные сроки проводят изучение жизнеспособности и развития яиц гельминтов непосредственно в производственных условиях.

Для этого достают из водоема штатив с укрепленной на нем биологической камерой, затем камеру переворачивают и фиксируют, давая возможность стечь жидкости, находящейся в камере. Жидкость вытекает между полиэтиленовым кольцом и полиэтиленовой пленкой. С током жидкости яйца гельминтов скатываются по наклонной поверхности на нижнее смотровое стекло. Затем совмещают смотровые окна и камеру помещают под микроскопом для исследования жизнеспособности яиц. После исследования камеру при необходимости вновь помещают в водоем. На весь процесс подготовки к работе и изучения биообъектов уходит не более 10 минут, вместо 5 часов, затрачиваемых ранее.

Предлагаемые устройства для контроля эффективности работы очистных сооружений, позволяют повысить точность исследований за счет сохранения первоначального количества введенного в капсулы (в буртах) или камеры (в стоках) исследуемого материала (микроорганизмы или яйца гельминтов), создания оптимальных условий для их жизнеспособности и исключения потерь биоматериала на стадии промежуточной очистки, в водоеме или в буртах твердой фракции навоза. Обеспечивается получение объективной^ оценки работы очистных сооружений свинокомбината, что очень важно для охраны окружающей среды.

3. 4. Электронейростимуляция животных в послеродовый период.

-ВТ|Ц^!сд;!г>гьр~>:5^-м~д;;ц;:::гксГ:-к-сст^ -физиотерапии - электронейростимуляция, которая рефлекторно действует на весь организм, так и локально на отдельные органы.

В связи с этим разработан новый способ лечения при атонии матки и задержания последа у коров с помощью электронейростимуляции. ( Авторское свид. СССР 1718973

от 15.11.91. и Патент Российской Федерации № 1718973 от 28.12.92.)

Сущность его заключается в воздействии слабыми импульсами тока на биологически активные зоны половых органов, выходящих на поверхность тела животного. В результате рефлекторного раздражения периферических нервных окончаний усиливается кровоснабжение полового аппарата, и в частности матки. Электронейростимуляция оказывает противовоспалительное^ болеутоляющее, спазмолитическое и нейротропное действие.

Для электронейростимуляции использовали прибор ЭТНС-100-1В - генератор импульсов с частотой от 5 до 100 Гц и амплитудой от 10 до 100 В и Дву мя электродами на матерчатом поясе. Это компактный прибор размером 7-3-12 см, массой 150 г, работает от батарей "Корунд" или аккумуляторного устройства. Он генерирует импульсы с регулируемой частотой следования от минимальном частоты не более 10 Гц до максимальной не менее 100 Гц. Выходные импульсы - биполярные с нулевой постоянной сост авляющей представляют собой последовательность отрицательного и положительного импульсов. Отрицательный импульс прямоугольной формы со спадающей вершиной, амплитудой не более 10 В и длительностью не более 3 мс. Положительный импульс - экспоненциально спадающий, с регулируемой амплитудой напряжения от 0 - 7 В до напряжения не менее 100 В и длительностью, измеренной на уровне половины амплитуды, равной от 30 до 70 мкс.

Электроиейростимулятор готовят к работе в следующей последовательности: накладывают матерчатый пояс с двумя электродами на шерстный покров, предварительно смоченный спиртом или его заменителями, в области 4-го крестцового позвонка на 5-7 см ниже гребня крупа коровы и подают импульсы с частотой 5-10 Гц и амплитудой 50-80 В в течение 3-5 минут. Как правило, при атонии матки через 2 минуты она начинает сокращаться (контроль ректальным исследованием), при внешнем осмотре наблюдают сокращение промежности. Если в течение 3 минут отсутствуют перистальтические маточные сокращения, то подается 2-3 импульса с частотой 20-30 Гц и амплитудой 30-50 В 2-3 с, после чего матка выходит из стойкой атонии.

При отсутствии сокращений ставится предварительный диагноз о патологии полового аппарата (киста янчиика, персистектвое желтое тело, воспаление яичника, скрытый эндометрит и др.). Ректальным исследованием предварительный диагноз с помощью предложенного способа подтверждается полностью.

Результаты экспериментов и производственных нспыташн в хозяйствах Омской, Курганской и Новосибирской областей на поголовье свыше 10 тыс. коров показали, что после электронейростимуляции коров с диагнозом атония матки 98,3% животных на 2-3 день приходили в охоту, из них 97,4*/» ©семенились плодотворно.

Эффективность использования приборов ЭТПС-100-1В в опытах для профнлактнк а лечения при задержании последа у коров по вышеописанной схеме в течение 10-20 ч: в сравнении с общепринятыми методами (контроль) через 6-8 ч после родов достигала 80%. При отсутствии отделения последа иинюрили мкшшулкцню через 3-4 ч, усслн'и: вали экспозицию до 30 мин и эффективность возрастала до 85%.

Установлено, что для профилактики субинволюции матки и развитя эндометритов необходимо проводить ежедневно в течение 5-7 дней стимуляцию полового аппарата, э позволяет снизить заболеваемость По сравнению с "контролем на 89%, а сервис-период сокращается до 45-50 дней.

Получены результаты но стимуляции оплодотворяемости коров при искусственном осеменении. За 20-30 мин перед осеменением проводили электронейростимуляцию в те ние 10 мин в обычном режиме и отмечали увеличение количества оплодотворенных ко после первого осеменения по сравнению с контролем на 21%.

Применение электронейростимуляции с помощью прибора ЭТНС-100-1В позволяет проводить лечение при атонии матки и задержании последа у коров, профилактироват субинволюцию матки и развитие эндометрэтов, стимулировать оплодотворяемость пр искусственном осеменении, сократить сервис-период, устанавливать предварительный диагноз на наличие гинекологических заболеваний у коров, снижать трудоемкость и г вышать санитарную культуру врача-пшеколога, уменьшать применение медикаменте пых препаратов на 50%.

ВЫВОДЫ

1. Разработанные подходы использования спектроскопии УФ РКР в области и робиологии позволили нам, с помощью сконструированной экспериментальной уста» ки, впервые провести бнодетекцню и идентификацию микобактерин и бруцелл в люб| стадии их изменчивости и роста

2. Результаты проведенных, исследований показали принципиальную возможн изучения нативных макромолекул в составе целой клетки (микобактерин, бруцеллы) получения как количественной, так и качественной информации. Доказана возможно изучения нуклеотидного и белкового компонентов клеток при изменении волны возбу дения для микобактерин 252 и 230 нм и бруцелл 270 и 216 нм соответсвенно.

3. Селективное возбуждение нуклеотидного компонента бактериальных клет< позволяет по спектрам УФ РКР измерять относительные интенсивности отдельных л шш нуклеотидных оснований микобактерин (отношение гуанина-1603 см-1 и тимина-1670-1238 см-1), буцелл (отношение аденнна-1309 с.м-1 и цитозина-1290 см-1), что моя быть использовано для биодетекции и идентификации микроорганизмов.

Л 1

4. Разрабптаная методика исследования живых культур микроорганизмов позволяет обосновать выбор оптимальных условий возбуждения и регистрации спектров, изучить белковые и нуклеотиднме компоненты бактериальных клеток, определить длины волн и тем самым получить информацию о белковой и нуклеотидных составляющих мн-кобактерий и бруцелл .

5. Исследование спектров 20 культур патогенных и атипичных микобактернй и 12 вакцинных, референтных и вирулентных штаммов бруцелл ш у](го позволило впервые обнаружить корреляцию между относительной интенсивностью отдельных линий в спектре УФ РКР и концентрацией бактериальных компонентов (ароматических аминокислот, нуклеотидных оснований, липндов), использовать эту закономерность для идентификации микроорганизмов разных видов. Выявлена, высокая специфичность тонкой структуры профиля группы линий в обласгн спектра 1400-1300 см-1 .гчя разных видов микобактернй и 1628-1412 см-1 для бруцелл.

6. Проведенный анализ частот колебаний в спектрах УФ РКР изученных мико-бактений и бруцелл выявил характерные особенности в родовых, видовых и внутривидовых отличиях. Установлено, что у каигдого штамма бактерий имеется свой специфический профиль группы линий. Установлена закономерность изменений спектральных характеристик нуклеотидного компонента в зависимости от возраста микобактернй и стадии I?-, Ь-трансформации бруцелл. При Ь-трансформации бруцелл происходит изменение относительной интенсивности линий. Однако частота линий характерных для каждого штамма бруцелл не меняется, что позволяет идентифицировать их, независимо от стадии трансформации. Увеличение относительной интенсивности линий в области 1626-1666 см-1 на 30-50% характерно для Ь-форм бруцелл независимо от стадии трансформации.

7. Изучение структурных перестроек белкового и нуклеотидного компонентов клеток микобактернй после У-облучения позволило выявить зависимость, между интенсивностью и частотой некоторых спектральных линий УФ РКР изменяющихся пропорционально дозе облучения и обоснованное дозы облучения необходимой для инактивации клеток.

8. Сравнительное проведение идентификации микобактернй и бруцелл традиционными методами, включающими культурально-морфологические, тинкториалькые, суб-мнкроскопические, биохимические, антигенные и биологические свойства изучаемых культур, со спектроскопией УФ РКР, показало преимущество последней благодаря высокой чувствительности метода, основанного на компьютерной технологии индикации и идентификации и создании банка данных полученных спектров возбудителей хронических инфекций.

9. Выявлена прямая зависимость между степенью ультраструктурных изменении, происходящих в клетке возбудителя туберкулеза под действием химиопрепаратов, и изменением их вирулентности для лабораторных животных, что позволяет предложить метод определения иршивигуберкулезкон а:ст;;с::гсти химиопрепяпятов с помощью электронной микроскопии и, уже на начальных этапах испытании новых туберкулостатнков по ультраструктурным изменениям и результатам оценки токсичности микобактернй, проводить отбор наиболее перспективных препаратов.

10. Предложенные ветеринарной службе три способа контроля эффективности обеззараживания навозных стоков на разных стадиях очистки, позволяют повысить качество и достоверность контроля, сократить сроки исследования за счет предварительно вводимых тестообъектов (микроорганизмы, яйца гельминтов) с помощью разработанных устройств в бурты навоза, в стоки очистных сооружений, в яруды-накопнтели, и получения объективной информации о работе очистных сооружений по результатам определения жизнеспособности биообъектов.

11. Разработанный и внедренный в ветеринарную практику способ электроней-ростимуляцнн животных позволяет профнлаетнровать и проводить лечение гинекологических заболеваний в послеродовой период, сокращает на 50% применение лекарственных препаратов, снижает трудоемкость выполняемой работы врачей-гинекологов. Способ экологически чист, экономически выгоден, доступен специалистам всех уровней, может быть использован в условиях крупных ферм и мелких фермерских хозяйств.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Прибор для исследования биологических объектов в бурте навоза Авторское свид. СССР X» 647598 от 20.10.78.

2. Способ определения степени дегельминтизации навозных стоков. Авторское свид. СССР Л"а 836592 от 06.02.81.

3. Биологическая камера для исследования жизнеспособности гельминтов в водоеме. Авторское евнд. СССРДЬ 1289464 от 15.10.86.

4. Оценка противотуберкулезной активности препаратов (Методические рекомендации). Рассмотрены и одобрены экспертной комиссией Отраслевого научного комплекса по ветеринарии ВАСХНИЛ (26.09.88, протокол № 4).

5. Биофизическая методика получения УФ ръл' спёкТров-микобактерий-рйЗных-видов. Рассмотрена и утверждена экспертной комиссией Отраслевого научного комплекса по ветеринарии ВАСХНИЛ (15.12.89., протокол № 5).

6. Рекомендации по применению электронейростимулятора ЭТНС-100-1В для лечения атонии матки и задержания последа у коров.( утв. ГУВ МСХ СССР от 20.02.91.).

7. Способ массажа матки у корой при атонии. Авторское евнд. СССР Ла 1718973 от 15.11.91. и Патент РФ № 1718973 от 28.12.92.

8. Методические рекомендации получения спектров УФ РКР мнкобактерий и бру-целл разных видов. Рассмотрены и одобрены на заседании Ученого совета ВШШБТЖ (20.11.94., протокол №14). Находятся па рассмотрении в Департаменте ветеринарии МСХ и П РФ Jns 11-24 от 06.01.95.

9. Методические рекомендации получения спектров УФ РКР бруцелл на разных стадиях L-трансформацлн. Рассмотрены и одобрены на заседании Ученого совета ВНИ-ИВТЖ (03.11.95., протокол Ха 7). Находятся на рассмотрении в Департаменте ветеринарии МСХ и П РФ 201-01 от 22,04.96.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Околелов В.И. Санитарно-гельминтологнческая оценка очистных сооружений и полей орошения свиноводческого комплекса. В кн.: Профилактика заболевании с.-х. и промысловых ж.-х.//С6.науч.работ сибирского и.-и. вет. ин-та,Омек,1977, вып. 31.С.38-40.

2. Околелов В.И. Эффективность биотермической дегельминтизации твердой фракции свиного навоза в условиях Западой Сибири. Там же. - С. 73-75.

3. Околелов В.И. Прибор для исследования биологических объектов в бурте навоза // Описание изобретения к Авторскому свидетельству СССР от 20.10.1978.

4. Околелов В.И. Эффективность дегельминтизации сточных вод свиноводческого комплекса ускоренными электронами. В кн.: Паразитарные и незаразные болезни животных II Сб. науч. работ сибирского я.-и. вег, ин-та, - Омск, 1978, вып. 33. - С. 30-37.

5. Околелов В.И., Ростиков В.П. Выживаемость яиц гельминтов в почве земледельческих полей орошения (ЗПО). Там же. - С. 146-150.

6. Околелов В.И., Волков Ф.А. Гельминтологическая оценка систем переработки, хранения и использования бесподстилочого навоза на свиноводческих комплексах Западной Сибири. В кн.: Профилактика болезней с.-х. животных Алтайского края II Сб. науч. работ Алтайской НИВС, - Барнаул, 1978, вып. 4. - С. 141-144.

7. Обеззараживание жидкого навоза/Майоров А.П.,Овсянов H.H., Околелов В.И., Наумова K.H.II "Земля сибирская, дальневосточная", 1979, JVs 10. - С. 45-46.

8. Околелов В.И. и др. Установка для радиационного обеззараживания животноводческих стоков на евннокомбннате фирмы "Омский бекон"//Тезисы докладов Ш Все-

союзного совещания по применению ускорителен заряженных частиц в народном хозяйстве/ .HeniiHq>a,n, 1979. - С.63.

9. Окоделов В. II. Новый способ исследования биологических объектов В кн.: Незаразные и иаразш арные болезни животных и меры борьбы с ними II Сб. науч. работ сц -бирекого н.-и. вет. ин-та, - Омск, 1980, вып.38. - С. 111-115.

10. Околелов В.И. Способ определения степени дегельминтизации навозных стоков. //Описание изобретения к Авторскому свидетельству СССР № 836592 от 06.02.1981.

11. Околелов В.И. Обработка жидкого навоза ускоренными электронами.//В кн. Научно-технический прогресс в теоретической и клинической медицине.- Омск,1981. С.25

12. Околелов В. И. Обеззараживание животноводческих сточных вод ускоренными электронами .// В кн. Основные направления по охране окружающей среды в г.Омске (Материалы 2 городской науч.-практич. конференции), -Омск, 1981. - С.37-38.

13. Околелов В.И. Изучение загрязненности, сроков развития и выживаемости инвазионных элементов на свинокомбинате "Лузинекий".// В кн.: Незаразные и паразитарные болезни с.-х. животных./ СО ВАСХННЛ. Новосибирск, 1981. - С. 131-136.

14. Околелов В.И., Симонов А.П. Структурные изменения янц аскарид после воздействия ускоренных электронов. II Ветеринария, 1983. Xs 10. - С. 51-53.

15. Околелов В.И., Гежес Л.В. Подготовка яиц гельминтов для электронной микроскопии.// В кн.: Инвазионные и незаразные болезни животных и птицы./ СО ВАСХНИЛ. Новосибирск, 1983. - С. 46-48.

16. Околелов В.И., Симонов А.П. Изучение на улыраструктурном уровне механизма действия ускоренных электронов на яйца аскарид. II Науч.-техн. бюлл./ ВАСХНИЛ. -Сиб. отд.-ние.- Новосибирск, 1984, вып. 29. - С. 24-28.

17. Околелов В.И. Биологическая камера для исследования жизнеспособности гельминтов в водоеме./Юпис.ание изобретения к Авторскому свидетельству СССР № 1289464 от 22.01.1985.

18. Ультраструктура микобактернй бычьего вида после воздействия туберкулостати-ков /Околелов В.И.,Коган Б.И.,Мартынова Е.С.Датаринов А.П.//Методы диагностики и профлактики бруцеллеза и туберкулеза с.-х. животных/Сб. науч. трудов ВНИИБТЖ, ВАСХНИЛ, - Омск,1988. - С. 104-113

19. Ультраструкура микобактерий туберкулеза после воздействия композиции глута-рового альдегида и ПАВ.// Гежес Л.В.,Павлова И.Ь.,Коган Ь.иг,Ок'ЩТеЛшгВ.-Иг^Та>гк;й-С.113.

20. Ультр а структур а .микобактернй туберкулеза после воздействия дезинфицирую-

Iцсго препарата. Околслов В.И., Аржакоп H.H., Коган Б.И., Гежес Л.В. // Профилактика инфекционных болезней с.-х. животных / Сб. науч. трудов ВНИИБТЖ, ВАСХНИЛ, - Омск, 1988. - С. 25-29.

21. Оценка противотуберкулезной активности препаратов. ( Методические рекомендации) Околелов В.И., Коган Б.П., Мартынова Е.С., Власова Е.Е., Татаринов А.П. //ВАСХНИЛ. Отрасл. науч. комплекс по ветеринарии. ВНИИБТЖ. - Омск, 1989. - С. 16.

22. Околелов В.И., Кадочкин A.M., Каплун В.И. Формы изменчивости микобакте-рий туберкулеза в зависимости от сроков пребывания в почве // Туберкулез с.-х. животных / Сб.науч трудов ВНИИБТЖ, ВАСХНИЛ, - Омск, 1989. - С. 90-95.

23. Возможность применения кинетического метода регистрации нммунонреципнта-ции при туберкулезе./ Татаринов А.П., Мартынова Е.С., Синицкая Т.С., Околелов В.И. Там же. - С. 121-125.

24. Околелов В.И. и др. Действие препарата МИГИ-K при экспериментальном бруцеллезе морских свинок II Бруцеллез с.-х. животных / Сб. науч.трудов ВНИИБТЖ, ВАСХНИЛ, - Омск, 1989. - С. 84-88.

25. Оценка актнвноси туберкулостатнков с использованием электронной микроскопии / Околелов B.IL, Мартынова Е.С., Коган Б.И., Татаринов А.П.// Эпизоотология диагностика и профилактика туберкулеза и бруцеллеза животнх I Сб. науч. тр. ВНИИБТЖ, ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние,- Новосибирск, 1990. - С. 56-64.

26. Мартынова Е.С., Мироненко ЕЕ., Околелов В.И. Л-трансформация мнкобак-терий при лечении экспериментального туберкулеза морских свинок. Там же.- С.70-75.

27. Околелов В.И. и др. Диагностика и профилактика микобактериозов в специализированных свиноводческих хозяйствах Сибири. (Методические рекомендации) //ВАСХНИЛ, ВНИИБТЖ.- Омск, 1990. - С.24.

28. Околелой В.И., Татаринов А.П., Мартынова Е.С. Применение спектроскопии комбинационного рассеяния для идентификации микобактерий // Разработка средств и методов борьбы с туберкулезом животных: Сб. науч.тр. / ВАСХНИЛ. ВНИИБТЖ, - Новосибирск, 1990. - С. 33-44.

29. Околелов В.И. и др., Спектроскопия резонансного комбинационного рассеяния света в ультрафиолетовой области для определения нуклеотидных оснований разных штаммов микобактерий II Бюлл. ВИЭВ. -М., 1990, - вып. 73-74. - С. 66-70.

30. Татаринов А.П., Мартынова ЕС., Околелов В.И. и др. Ультрафиолетовые резонансные спектры комбинационного рассеяния микобактерий туберкулеза II Сибирский вест, сельхоз. науки,- 1990.-Да 4. - С. 61-66.

31. Околел on Б.И., Татарннов А.П., Мартынова Е.С. и др. Идентификация микобактерий лазерной спектроскопией II Ветеринария. -1991, - Лг 2. - С. 28.

32. Феофанов А.В., Околелов В.И., Татарннов А.П. и др. Селективный анализ нук леиновых кислот в составе микобактей по д,«1:иым спектроскопии резонансного КР

II Ж-л прикладной спектроскопии. - 1991. - т.55, № 3. - С. 410-417.

33. OkolelovB. U. et al. TJY- resonance raraan spectroscopy of mycobacteria II The 1-th Int. biophisics congress and biotechnology at GAP, Turkiye. - 1991, - Abstracts.- P. 109.

34. Коган Б.И., Околелов В.И. Субмнкроскопическая организация микобактерий // Система мер борьбы с туберкулезом с.-х. животных И Сб. науч. тр./ ВАСХНИЛ, ВНИИБТЖ, Новосибирск, 1991. - С. <53-70.

35. Оптимальные дозы гамма - инактивации микобактерий./ Татарннов А.П., Мартынова Е. С., Синицкая Т.С., Коган Б.и., Околелов В.И. Там же. С. 128-143.

36. Мартынова Е.С., Околелов В.И. Изучение белковой компоненты микобактерий /Современные методы борьбы с бруцеллезом и туберкулезом животных II Сб. науч.

тр. / ВАСХНИЛ, ВНИИБТЖ, Новосибирск, 1992. - С. 72-76.

37. Коган Б.И., Синицкая Т.С., Околелов В.И. Ультраструктура M.bo\is штамма БЦЖ, персистированных в организме животных . Там же. С. 77-82.

38. Околелов В.И., Борисова В.Г. Способ массажа матки у коров при атонии.

II Описание изобретения к Авторскому свидетельству СССР ЛЪ 1718973 от 15.11.1991.

39. Околелов В.И. Электростимуляция коров в послеродовой период II Ветеринария, - 1992. № 9-12. - С. 35-36.

40. Околелов В.Н. Новый метод лечения при атонии матки и задержании последа; коров II Ветеринария, 1992. № 9-12. - С. 37.

41. Характеристика биологических свойств бруцелл общепринятыми средствами в сопоставлении с электронной микроскопией./ Сидоренко О.А., Коган Б.И.,Околелов B.I Новицкий А.А. II Туберкулез и бруцеллез с.-х. животных: Методы и средства диагностики и профилактики: Сб. науч. тр. I РАСХН. Сиб. отд - ние. ВНИИБТЖ. - Новосибирск, 1994. - С. 36-43.

42. Барабанова Е.Б., Околелов В.И. Использование лазерной спектроскопии для индикации L-форм бруцелл. II Основные научные исследования по проблеме туберкулез и бруцеллеза с.-х. животных, профилактика и организация мероприятий по ликвидации болезней в Регионе Сибири (тезисы докл. науч. практич. конф.}НовосибйрсКТ"1995.~е^)0. . 43. Идентификация бруцелл лазерной спектроскопией ультрафиолетового резонансн го комбинационного рассеяния./ Околелов В.И., Татарннов А.П., Барабанова Е.Б., Сидоренко О.А. И Ветеринария. - 1996. - Л'а 7,- С. 23-26.