Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Изучение метода лазерной спектроскопии в целях использования для индификации L-форм бруцелл

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ БРУЦЕЛЛЕЗА И ТУБЕРКУЛЕЗА ЖИВОТНЫХ

0*1 На правах рукописи

' . ? УДК 619:616.981.42:577.152.301

БАРАБАНОВА

Елена Борисовна

изучение метода лазерной

спектроскопии в целях использования для индикации ь-форм бруцелл

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

ОМСК 1996

Работа выполнена п лабораториях бруцеллеза мелкого рогатого скота и физико-химических -м его дои исследования Всероссийского научно-исследовательского института туберкулеза и бруцеллеза животных

Научные руководители: Доктор ветеринарных наук, профессор, засл. деятель науки РФ

Кандидат ветеринарных наук

Официальные оппоненты: Доктор ветеринарных наук, старший научный сотрудник

Кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник

Игорь Андреелич Косилон Владимир Иванович Околелоп

Сергей Константинович Димов

Иван Порфирьевич Никифоров

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский институт стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (г. Москва)

Защита диссертации состоится

м

июни 1996 г. в 13 часов Ца

заседании диссертационного совета Д. 020.23.01. л Институте экспериментальной, ветеринарии Сибири н Дальнего Восток а СО РАСХН но адресу: 633128, Новосибирская область, л. Краепообск,, ИЭВСиДВ, конферензал.

С диссертацией можно ознакомиться п ЦНСХВ СО РДСХН

Автореферат разослан "__ Н>% I'.

Ученый секретарь '.

ДМСССрКШИОНПО! (! сошмя,

доктор ипсринариых наук'- ' А.Д.Самоловов

ОЬЩЛЯ ХЛРЛКТШ'ИСТКА РАБОТЫ Актупдьцость проблемы. Ирупсллез до настоящего премени 'имеет широкое распрострапаение но многих странах мира. Проблема бруцеллезной инфекции, наносящей большой экономический ущерб и имеющей роциалыюе .'ina'icime , пссъма актуальна и спи:;и е напряженно!) эпизоотической обстановкой и отдельных регионах страны.

За последнее время доказано, что [„-трансформации является достаточно чистой формой сущестяонапия бактерий и природе (С.Ц.Црозороиский и др., 1981). '

Имеющиеся данные (П^А.Трилепко,1976; И.Л.Ьакулол, Т.Я.Зслснцоиа, 1980; В.Г.Ощецкоя, 1990; П.Л.1 lallon, S.li.Sulkin, 1968; J.li.Kelniy, 1978) дают осиошшис предполагать, что одной из причин длительного сущсстноиания эпизоотических очагов и низкой эффекты ии ости оздоровления стад является трансформация S- и К-форм позбу дителн н L-формы.

Однако отсутствие достаточных знаний об условиях образования и свойствах L-форм, а также надежных методой, способов их иыяялопия ' и идентификации не позволяют пока оцепить истинное значение этих форм » эпизоотическом процессе.

I) комплексе протипобруцедлезпых мероприятий важное место за нимает совершенство лап и о методой диагностики бруцеллеза. Существующие методы распознавания бруцелл, их видов и биоварои весьма трудоемки и при изменчивости возбудителя не надежны. 14 этой связи весьма 4K'jyaJ)bhb)m является разработка и внедрение и i;ci ери парную практику .ijojiux, чувствительных методов биодетекции и идентифика-' нии бруцелл, оенонацных.на изучении структурных компонентов микробных клеток, обеспечивающих простоту исследований с высокой информативностью и автоматизацией процесса иесследоиапий.

Особенно иерснектищшм в 'этом отношении, яиляется метод резонансной спектроскопии комбинационной) рассеяния е возбуждением и ультрафиолетовой области - УФ РКР (II.Кори, 1985). 5>тот метод высокочувствителен, дает возможность наблюдать спектры л водных расгио-рах, цри этом сохраняется целостность и функциональные возможности клеток. .-.'.'

С номошыо УФ. РКР изучались живые бактериальные культуры, принадлежащие к разным родам и видам - li. coli, хромоОиктсрии, микобактерии и др. (В.И.Околелой, Л.А.Татаринои, li.С.Мартынова, 1990, 1991; J.A.Dallerio.W.^.Nekoi) cl а I., 19.87; К.Л.ПгШап с[ al, J988), полученные спектры достаточно специфичны, чтобы идентифицировать микроорганизм).).

Походя из нышсйздоженного вытекают цели и задачи проподимых исследований. . ' 1

А1Сйк_и_ЗШи)НИ.истедявйша.-. ' ICJIWÓ исслсдоиапий янлялась разработка методики по идентификаций L-форм бруцелл методом лазерной спектроскопии УФ РКР.

Для решения этого «опроса былм пост,-шлемы следующие задачи: , - получить L-форМЫ розимх'нидои бруцелл И изучить их биологичсс -кис споИстоа и сралшспии с исходными штаммами;

- разработать регламент иелсдоиания жиных культур бруцелл, находящихся и S- и L-формс, с помощью лазерной спектроскопии УФ РКР;

- получить «оспроизиодиМыс спектры S- и L-форм бруцелл с исиользоианисм экспериментальной уста.нонки УФ РКР.lia ochoijc Отечественного приборостроения;

- 11ЫЯ1ШТ1. характерные линии спсктрои и пидоспсцмфцчсскис области для создания банка данных с последующей идснтификацией L-форм бруцелл на ЭВМ;

- пронести селектиппое иселедопапис оспошшх хемотаксономи-чсских маркеро» (пуклеотидпых компопептои) ¡11 vivo;

» пронести сравнение лазерной спектроскопии с другими методами мселедоиапия L-форМ бруцелл.

, Научная поиизпа.

1. На базе созданной и лаборатории физико-химических мегодои иеследонапия ВНИИЬУЖ экспериментальной устнионки нмннлепы принципы, па основе которых разработана методика исследования бруцела a S-, L-формах ni vivo методом лазерной спектроскопии.

2. Методом лазерной спектроскопии (УФ !'К I') изучены культуры бруцелл разных нидои и процессе 1< рансформации. Вмиилснм инти-мальпые услонии применения метода, уста поклеим ииеокоспецифичес-кие области спек трон для идентификации бруцелл.

3. Уетаполлспа закономерность нзмепеппй спектральных характеристик пуклеотидных компонентом бруцелл и зависимости о т стадии I,-трансформации. . .

4. lio спектрам УФ РКР иыяшнпы родовые п'иидопые признаки бруцелл.. '•..*

Шхштичсская иРезультаты проведенных исследований сиидстсльствуют о возможности применения лазерной спектроскопии для идет ификации L-форм бруцелл на, разных стадиях трансформации. .

• 5

Показаны возможности метода УФ РК.Р для изучении электрон-ноконформацирппых характеристик биомолскул u составе ж н no ri клетки.

Предложены подходы использования спсктросмцши УФ 1'КР дли изучения лидоспсцифичсски'х признаков бруцелл независимо от морфологических и функциональных особенностей, что находит применение при разработке методики для индикации возбудителей бруцеллеза, находящихся il разных стадиях изменчивости.

Основные положения,виноецмие па защиту:

- Материалы по получению L-форм бруцелл и изучению их биологических и физико-химических споисти;

- Методика исследования S- и L-форм бруцелл с помощью лазерной спектроскопии УФ РК(\ . •

Апробация подучеиых результатов. Основные положен и л диссертации доложены н составе годовых отчетов лаборатории физико-химических методов исследования на заседаниях Ученого совета 1ШИИБТ-ЛОза 1992-1995 г г., научно-практической конференций по проблеме туберг ■ худела и бруцеллеза (Новосибирск, 1995), на Всероссийском координационном совещании по бруцеллезу и туберкулезу животных (Омск, 1494): '

Публикация полученных■ результатов. По теме диссертации опубликовано 2 работы, 1 находится в печати. .

Об1.ем и структура диссертации. Диссертации изложена на 106 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собстиенных исллсдоваций, заключения, выводов, практических предложений и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 22 рисунками и 6 таблицами. Список литературы включает 205 источников, в том числе 76 - иностранных.

СОБСТВЕННЫЦ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований. 1'абота выполнена в лабораториях бруцеллеза мелкого рогатого скрта и фи з и к о - х н м и чес к и х методов исследования ВНИИВТЖ. Для изучения спектров были нспользоицы исходные культуры 7 штаммов бруцелл в S-форме 3 »идоп:

вакцинные - И.abortus 19 (е.4), 104-М, B.inelitcnsLs ('ев-1, референтные В.abortus 544, В. suis 1330 и вирулентные В.abortus 54 и B.mèlitcnsis H-102. .

В работе использованы жидкие, полутвердые и плотные питатель ные среды (M III 115, МПИГГЛ), M 1111Л с добавлением оемтмЧескп?

стабилнзатороп - сахароза, сернокислая магнезия, хлорид натрия и 15г 20% смноротки крупною рогатого скота, И качсетт- индуцирующего фактора применяли калиепую соль бензилпепицнл липа, Дозу И кратность которого устапанлипали »о методике И;■)M им.. И.Ф.Гамалеи (11.1 (.Остроискал с еоаит., |972) с учетом результант собстисш/ых исследоианий.

КуЛЬтураЛЫЮ-МОрфоЛОГИЧССКИе И Дйффсрспцйм.ш.иыс СИОЙС')'»!1 бруцелл и S-формс, а также полученных L-форм изучали н сраипйтсльном iiJüiiic методами, рекомендованными. 11одкоМитетом но 'таксономии бруцелл Международного комитета по номенклатуре бактерий и Объединенного комитета икспсртои ФА()/ПОЗ но бруцеллезу (1986).

Морфологические спойстии бруцелл изучали па препаратах, окрашенных по методам Козлоиского п Грамм. Кулътуральпые сиойетна определили по характеру роста микробом На Mllllli и МППГГА.

1'ост бруцелл в присутствии тиопипа и фуксина (1:50000, 1:100000), ллзис фигами S- Тб и R - (1?-2) изучили lui мисопсчспочимх средах. Образование сероводорода устанавливали.!! процессе роста, микроб«» lia MilllA общепринятыми методами (ЛльтоН, Джонсон, 1968).

.Серологическую дифференциацию культур бруцелл проводили путем постановки IuiiicthiimutoU и объемной 1'Л с мопосиецифичеекими Л- (1:10) и М- (1:10), стандартными бруцеллезными агглютинирующими S-, К- ( 1:10) сыворотками , гинериммуппыми S-, и. 1-сывОротк:1мй аптиабортус. Активность и специфичность гипериммунных сывороток изучали il объемной РА. 11 качестве антигене» применяли стандартные препараты и нри готовленные « лабораторий института взвеси из S-и L.-шТаммов Hrueella abortos.

Изучение субмикроеКонической организации исследуемых бруцелл и S-и Ь-формах■проводили совместно с к.иль, u.c. »ПИЙВТЖ

b.И.Коганом. С этой целью колонии культур.обрабатывали по метод и »-ке KyiCT, KelIcnhciRcr (1958). .

Материалы пропитывали оноксМдпыми смолами..I (олученые блоки

c, колониями бруцелл после 14-дпсвной выдержки ультратмнровали на ультрамикротомах УМ'Ш-4 и УМТП-5 .ио. общепринятой методике (1>.Уиклн, 1985). Срезы помещали на элсктолитичеекне сеточки с формваровой подложкой (но методу Д.IIиз, 19(i5). Срезы па сеточках контрастировали 3% раствором урапилацетата па 30% отапо'ле и течение 3-4 часон и цитратом свипц» по Ucniioltü; (19(i3). . .

Исследование образцов и получение элсктроппограмм осуществили и электронном микроскопе ЭМИ - 100U при ускоренном напряжении 75-1 ООкI!. •

Работу по лазерной спектроскопии проводили солместно со с.л.с. И Н ИИ ВТХС, кандидатом фи.'1Ико-математических паук А.П Л'атарипопым.

Дли получения си'сктроя УФ t'KP били использошшы штаммы иышеуказаппых культур бруцелл. Культииирошпже S-форм бруцелл с целью получения бактериальной массы процедили на плотной пита тельной среде и течение 48 часом при. температуре 37°С. Для получения L-форм бруцелл использплали питательные среди, состаилсппые но рецептам' отечсстаспных аиторои и « собстисцпых модификациях.

Бактериальную массу образной собирали па -трех стадиях роста: исходную - ¡S-форму, »начальной стадии L-трансформации и L-формы а режиме стационарного роста. Полученную бактериальную массу трижды отмыкали стерильным 0,85% растиором хлорида натрия, охлажденным до температуры -t"4°C с промежуточным цептрифугирошшисм и течение 30 минут при 6000 об/ мин. Осажденную бактериальную массу рассуспендироноли 0,05 М фосфатным буфером с добаллеписм 0,2 М сульфата патриц л качестис инутрсппсго спектроскопического стандарта. Концентрацию микроорганизмов п образце доподили до 0,1-1 млрд. микробных.клеток и 1 мл по оптическому стандарту мутности ГНИИСК им А.Д.'Гарлсснича.

Модельные соединения ароматических аминокислот, полипепти-доа, дезокеирибонуклеотидол фирмы Sigma (США), фосфорпо-кислый кылий и Натрий, сернокислый натрий категории ОСЧ использоиали бея дополнительной очистки.

Для работы использонали устаполку, созданную па оспоис приборои отечественного нроизьоДстла; лазерной системы (AI 1АГА - 1312 и Л ГИ - 403), спектрометра ДФС - 52М,' мИкро-5)ВМ ДВК - 3 М, со спектральным диапазоном 930 - 190 пм. На ЭВМ загружали математическое профцмиос обеспечение, которое нозполяст скорректнроиать з.чрегис-триропипиые спектры . Gpynejuij учесть и аычееть сигнал поды и следолых количеств питательной среды, па которой были иыращены исследуемые культуры, а также сралнить полученные спектры со спектрами других культур, хранящихся а памяти ЭВМ.

Для обеспечения безопасности работы с жипыми бруцеллами сконструирована герметичная бактериальная камера, из которой суспензия бактерий перистальтическим насосом подается а киарцеаую кюнету. Па находящийся п кюистс образец подаиали раефокуспропап-ный лазерным луч си средней мощностью 3 •• 6 мИг.

Средняя длительность одного имнульсп 10 ■■ I.1- пс при МПСТОТГ-полгарепия импулсои I - 60 Гц,

Возбуждение спектров проводили Па длине полны 270 ИМ, что позволило изучать структуру S- и L-форм на уровне молекул ароматических аминокислот и цуклеотидпых оснований.

Для предотвращении фоторазложепия клеток иод лучом лазера. Использовали систему прокачки и тсрмостатирошшие суспензии.

Проводили регистрацию спектров УФ РКР исследуемой культуры ; .

Для количественен о сопоставления спектров УФ l'Kl* измеряли -относительную интенсивность линий. Оценку относительной интенсивности линий проводили но отношению к интенсивности линии 981 см"' от вклада внутреннего реп<-,ра сернокислого натрия на. единицу, клеточной массы в мг/мл.

После математической обработки и нормировки спектров УФ 17К,Р бруцелл проводили анализ, устанавливающий область специфического профиля различных видов и форм бактерий и специфичность отношения интенсивности линий от в кладов различных составляющих.

После получения спектров определенного вида бруцелл n S-, L-форме или форме начального этапа (.-трансформации данные обрабатывали па ЭВМ и заносили в банк данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ '. ' '

Получение и изучение диффеунлчцирукмцих признаков L-napniin-XPJiJ^yue.jyi. I--формы бруцедд получали путем воздействия па исходную культуру возрастающих доз бспзилпепициллипа калиевой соли - от 0,5 до 10 тыс. 1.1Д/мл па жидких, полутвердых и плотных питательных средах.

L-вариапты бруцелл вакцинных, референтных и вирунептпых штаммов между собой пс имели существенных различий но культуральпым, морфологическим и типкториальным свойствам.

IIa ранних стадиях трансформации бруцелл ы вы ристали на 5 - 7 день в виде мелких (0,5 - 1,5 мм в диаметре), слегка уидощснпыЧ колоний, мутных при проходящем свете. Микроструктура таких колоний состояла как им типичных бруцелл,гак и увеличенных » объеме клеток, имеющих иид раздутых кокков или удлиненных па,почек. При •.ном все бруцеллм были грамотрпцатсльпыми, по Козловскому окра-' питались в красный цвет.

I

Дальнейшее увеличение, антибиотика в среде приводило к образованию с.паСюконтурированпых, удлиненных млн с четкими контурами и ) рапуднркымн включениями палочек (1,5-2 мкм), а' таю.с шаровидных ч •»лппсопидных клеток (1-6 мк.ч) разной оптической ifjiornoc.TTi с

зернистыми включениями. На полутвердом таре нии образовывали Мелкие, гладкие и матовые колонии или крупные (3-8 мм), матоиые, 'плоские с неровным краем.'

На поздних эта пах трансформации образовывались ги гантские элин-совидныс, шаровидные ва к у о л и з и ро пап н ы с или с мелкой зернистостью клетки размером 6-8 мкм. На плотной питательной среде они вырастали d виде магоиого крошковатого налета ни 2-3 день. В бульоне образовывали мелкозернистый осадок, иногда новерхпостпую пленку, вызывая при отом помутнение бульона. -

L-культуры сохраняли характерную дли бруцелл окраску но Граму, но утрачивали специфичность окрашивания по Козловскому - они " сганоиилцсь темно-коричневыми или бурыми.

Электронно-микроскопическое изучение интактпых клеток бру-' целл показало, что они имели овоидпую или палочковидную форму, на поверхности клетки, отчетливо выявлялась клеточная стенка, плотно прилегающая к цитонлазматической мембране. Нуклеоид, представлс'п-П1.1Й фибрилярным материалом, располагался в центральной части клетки. .,

При исследовании ультратопких срезов полученных L-форм бруцелл выражался ярко обозначенный полиморфизм. Размеры клеток в 3-!() раз превосходил и величину клеток исходных штаммов. Наблюдалось > отслоение, клеточной сгснки от цитоплазматичсской мембраны, ее дефектность, в большинстве клеток цитоплазма содержала обособленные участки, ограниченные или неограниченные ипутрицитоплазма-тичсскими мембранами.

, Полученые L-формы исследованы по диффсрснци:1льпым тестам, рекомендованным ФЛО/ВОЗ (табл. I).

L-формы утрачивали способность ' продуцировать сероводород, тогда как штаммы 54, 544, 19 и 104-М бруцелла абортус в S- форме выделяли сероводород в показателях 6,1-8,2 мм.

У всех L-культур отмечалась толерантность по о тношению к тиопи-. ну и фуксину (1:50000 и 1:100000)!

Полученные L-культуры изучаемых ш таммов не лизироиались Тб фагом, а также К-фагом (серил Г;-2).

Определение Л- и М- антигенных детерминантов у контрольных штаммов бруцелл в реакции агглютинации с Л- и М-мопорецситар-¡шми сыворотками показало, что культуры штаммов 544, 54, 19 и I СИ-ДО вида aborius и 1330 suis реагировали с Л-сыноротком » титре 1:320, а ш таммы Рои- J и Н-102 вида mclilcnsis с М-сывороткой и том же тигра.

Таблица 1

Сзойства Б-форм и полученных 1--культур бруцелл

! Наименование №4 Число Тионин Фуксин Пекиыиллин РА с сывороткой Лизис фагами

'штампе, культуры (ЕП) пассажей 1 :50000 1:50000 (ЕД/мл) То В.

А м 5 •КГ 10*4 КО

I ; й.аЬоггш 544 6,1 - - . од+-> -1. - - - -

I В.аЪотк .54. 6.2 - _ - ОД--) . - _ - - -

| В.аЬопш . 104-М 8Д | - + 0,5(-) ' : : .V ->- - - - -

Б.аЬогш* 19 7,2 - л. ' 0,5(--> - - - -

1 В.теИгехшв -Рев-1 ■ - - - - . 0Л-) - - - -

В.шс1йеп51$ Н- 102 - - J- 0Д~) - - - - -

В.зшэ 1330 , ' - 0Д+-) N ■: ' - -

16 . - 8000(~) - - - - - - -

- 16 8000(—) - - - - - -

■ 14- ' 10000(-) - - - - - - '

--:-4->т . . ■ | - | к ( - 10000(~) - - - - , - -

' ] - Г.- ' 15 8000(-) • - -- - - „

■ ■ -. 1 1.-К-102. -I 17 ' ^ - 10000(~) . -

- ; '17 - аооо(-) - - - . - - - -

Рсакцйя агппотшкщйи с Л- и М-монорсцспТорпыми -'выпоротками ■ L-форм культур изучаемых штаммов бруцелл бы л а нехарактерной: полное просвс'Мспис.ЖидкостН » верхней части, рыхлЫМ, студпеви "пмй, легко разбиигжнЦНЙся при встряхивании осадок, одинаковый »> есх разводе-» , ; itniix. При; yfo'i* специфичность утрачивалась - реакций у всех L-культур была как с А- , так И с M -см воротками. '

Сравпитсяьнбе изучение питигепоой cTpvktvwm. У всех L-парнпптоп бруцелл начального этапа трансформации сохранились антигенные комплексы S-форм, что if роя ил ял ось и l'A на стекле реакцией на ++ креста. . ■ , ". ' ■

Для L-вариантов позднего этапа трансформации характерца реакция са моаггл'ютипации с физйологйчеекйм раствором. При псрекрес-■ тпом серологическом анализе антисывороток бактериальных и L-форм, получейных от кроликов ( иммунизировали трехкратно внутривенно с интервалом 2-3 дня it возрастающих дозах) выявлено, что. культуры L-форм сохраняли антигенное родство с родительскими штаммами бруцелл. S-антигсны с гомологичными S-сыморгками реагировали в титре 1:640 - 1:1280, с L-сЬнюроТКами реакция сомнительная ( Н- в разведении 1:5-1:10).

Введение'в организм Морским свинкам Ь-культур-шт.. 1'> и 544 В.abortus (10 млрд м.к.) ПокпзаЛо снижение их антигенных евцйстп. Реакции с биофабричпим S-апти топом были сомнительными в РА (1:5 - 1:10 на I или I I). В РСК антитела обнаруживались у отдельных животных в титре 1:5 (+) па 30-й день после заражения (табл.2).

Полученные субкультуры выделены в виде крупных элипсоидои разной оптической Плотности, коккоподобпых сферопластоп, т.е. в L-I|»ормс. Таким образом, При L-трапсформации утрачивается возможность индикации возбудителей бруцеллеза как при проведении комплекса исследований кул 1Лу inuii.no-морфо логических и биологичсс'ких свойств, так и при Использовании такого чувстпитепыюго и специфического метода, как бтнгроба. -

I! связи с чем, что комплекс исследований, включающий изучение ыпрфошн ических, /i nilкториаЛьПых, культуральмых, биологических свойств по ласт возможность идентифицировать L-формы бруцелл, во/шикает необходимость Изучения iioiibix, чувствитсл ьных Методов _ -б'иодстг.кцни'и идет ифнкации микроорганизмов.

' f"'I''К Iмtr^p.tiJ'х t;ócyt,rjirçl>t»ьг><. КЦМШФШШ»!. fto'i-буждсннс. í'iii'h'.i рои проводили lia ДЛ пне волны 270 мм, т.к., происходит . силе,!''¡шиш;' ц("!(1влш;н(>с, усНлсппс сигнала колебательных мод пукле-

Таблица 2

Агглютиногснные свойства L-вариантов В.abortus шт.544 и 19 в опыт? на морских свинках (разведение: 1:5, 1:10)

N° жив-ного Культура Реакция в РА с антигеном

биофабричный 544S. : 19L: 544L

1 544-L +-+.' + . ' \ ■ - г' '

2 544-L + ++ + - - -. .

3 544-L +•+ ++ -

4 544-L 1 + + + ■ - -

' 5 19-L ' + ft- •• -

6 19-Ь +- + + +

7 19-L + • ++ . - ;

8 19-V + - ". -

отидного компонента при минимальном уровне сигнала УФ РКР ароматических аминокислотных целей белков.

Для интерпретации разных форм бруЦелл при возбуждении па выбранной длине волны, нами получены спектры модельных соединений: основных ароматических аминокислот и нуклертидных оснований ( тирозина, триг|тофана, ДНК тимуса теленка, нодйнуклеотидоц). Соотнесение отдельных линий в спектрах УФ РКР определенным колебательным модам биохромофоров проведены но Rava R.p. (1984).

Результаты изучения спектров модельных соединений показали, что при возбуждении, спектров на определённой длине волны в спектре наблюдается увеличение интенсивностей линий, которые соответствуют различным колебательным модам бирмолекул! Этот эффект позволяет ' использовать метод спектроскопии УФ РКР. для селективного исследования сложных молекулярных структур.

Спектры Уф РКР бруне^л разных видов. Методом лазерной спектроскоп и (УФ РКР) исследованы достаточно полно изученные с микробиологической точки зрения штаммы бруцелл разных видов. На рцс. 1 изображены спектры УФ РКР бруцелл штаммов 19,104-М, 54, 544 вида abortus, Рев-1 и Н-102 вида melitensis и 133Q вида suis в.стационарной стадии роста.

В целом спектры характеризуются сходным набором линий, но отличаются их относительными интелсивностями.

Проведенный анализ экспериментальных данных и сопоставление их со спектрами модельных соединений ароматических аминокислот и нуклеотидных оснований позволяет заключить, что преимущественный

Рис, 1. Спектры УФ РКР В. abortus 19, 104-М, 54, 544, U, melitensis Peu-1, Н-102, В. suis 1330 при возбуждении на длине полны 270 hjU

-1

(клад 1> спектры бруцелл штаммои вида abortus дают урацил и цитозип, i из аминокислот преобладают линии триптофана.

В колебательных спектрах штаммов Рсв-l и Н-102 ,В.melitensis юстояппо гин1т0ряк>тся линии триптофана, адснипа и цитозм па.; штам-ta 1 330 B.suîs - линий гуанина, урацила й цитозппа.

Проанализировав спстры бруцелл разных видов, мы установили;, то характерные группы линий находятся в области 1628-1412 см. Iместо с тем, у каждого штамма бруцелл имеется спой снсцифичевкмй рофиль групп линий (табл. 3).

Для всех штаммов В.abortus характерно наличие интенсивной инии .в области 1628-1636 см

Проведенные исследования показали принципиальную возмож-остъ изучения патииных макромолекул, в состве цсЛой живой клетки руцелл и получения количественной и качественной информации.. родемонстрировапа возможность изучения пуклеотидных компонен->в бруцелл. • ' ' : ■■

.Cite jci/pu УФ Р1СР бруислл на разных; стадиях ^трансформации. При »учении L-трансформации бруцелл с помощью лазерной спсктроско-ти (У<1> РКР) учитывали, что переход кдегок из одного состояния в

- • ■ 14

другое сопровождается изменением активности биоцолскул, которая связана с их структурной перестройкой, что в сиою очередь отражается на локальном микроокружении, хромофорои. К связи с эти меняется колебательных мод хромофоров" в спектрах РКР. '

На рис 2-3 представлены наиболее характерные области четырех штаммов б'руцедд на трех стадиях роста: )$.а1»о|4и.ч |9, 544',|1.п)е1Иеп81к Рец-1, Влет 1330 при возбуждении па длине полны 270 И1Ц.

Таблица 3

Индивидуальные линии и УФ РК Р спектрах (эруцелд при ьозбуждении ца длине полны 270 им

Штамм

ТГаБогЕй 19

104-М

54

544

1!.тс1|1слф Реи-1 Н-102 П.анк 1330

Частота, см-1

К>2» 1636 1628 1630

1666 1650

1666

1614 .1590 1504 ¡594

1638 16 Л Л

1648

153^ 1506 . 1412

1466 цзо 1416

1456 1442

151В 1510 145»

1600 )6Ю

1634

1442 142« 1444 1426

1590

1490

1440

1410 1406

1464

1412

На графиках также представлены масштабные единицы, которые аозиощЦатоцепить изменение и лтенси »постой I (и) колебательных мод в расчете па единицу клеточной массы в зависимости от Ь-траисформа-

1ши.

Установлено, что у всех ш таммов бруцелл I.-трансформации отражается на изменении Относительной иптспеиш|ости линии в, области-1628-1666 см И данной области дли бруцелл » . Ь-форме относительная интенсивность линий и спектрах УФ РКР увеличена на '30-50% цо сравнению с относительной интенсивность« линий в спектрах бактерий и Ь-формс. Эта закономрпость даст нозможноеть определять трансформацию клеток.

Отмечено, что и спектрах бруцелл начального птица. трансформации наблюдается увеличение интенсивпостей адс-пи п-гуапипоных линий п области ~ 1490-1412 см' , а в спектрах 1.,-форм наблюдается уменьшение относительных иптепсивпоетей линий и атой области но «.•равнению с относительной интенсивностью и спектрах Б-форм.

Отмечалось также уменьшение полушарий линий нуклсотИдной компоненты ~ 1628, 1594, 1578 см"" , что подтверждает структурно-вунКниошии.пме перестройки при трансформации клеток. В результате проведенных исследований установлено, что ири Ь-траиефорМ!1-ЦнИ бруцелл Происходит изменение, относительной иитс|кчппости

ЦП 1IW. . но»

16М teoo 15И

aAC«"1

Дом'1 '

1*нс.2. Характерные области спектров УФ РКР В. abortus 19 и 544 к S-формс (1), L-формс }1ачальной стадии (2), L-форме (3) '

5 1

• «

№00 )В» .

-', im

t л^рм1

¿АрМ'1 . .

Рпе,3. Характерные области спектров УФ РКР B.melitensis Рев-l и ¡'. suis I 330 п S-формс (I), L-форме начальной стадии (2), L-форме (3).

. ■ . • ' ,16 ' в • ' линий, рдпако частота характерных для k¡P№m> щамма бруцелл

не меняется, что позволяет идент|П)>ицирриат1' ИХ, иезалис»1М0 от стадии

трансформации- '

, Нынилсмы. умикальцис «озможности метода УФ РКР для идентификации L-форм различных и идо и бруцелл и проведении анализа натии-пых структур MHKpoopráljHaivióii и различных фуцкциоладьпых - состояниях. Такие ирз^жиоети осноааны на чувствительности спектроскопии УФ Р&Р К состонншо и микроркружению сиязей карбонильных и амидпых групп нукл^отидпцхосцоицннй, ' .

' ВЫВОДЫ

|. Разработгцц» методика цо идентификации L-форм бруцелл методом лазерной спектроскопии удьтрафйолетрцргр pé.-ioпацепого комбинационного рассеяния '("УФ РКР '.'.'• , ' 2. И процессе ^-трансформации ju vitro воздействием попы-шеццых• доз цецрццллица nocjie 14,- (7 пассажей у фруцелл 1(роисходнт глубокие изменения основных биологических сцойств (морфологических, тинкторцальпых, куЛьтуральцых, .антигенные, щтдютииргсипых, нирулс/1ТП1.|х), что делает нса^адожцым их индикацию и идентификацию. оби(0г(риня.тыми, адикробиолог}П1сркими методами, рекомелдо-ианпыми ФЛО/ВСК5. .

3. У .Ь-фбрм' ноздиегр атапа Ь-траисформадии прсетапоаить нехоодные признаки/ и»(та1?П1ых , бруцедл как in vitro, тчк и in vivo практически не удается, Что дшцает козможности йецользриагь ренер-таиты дли индикации возбудителей бруцеллеза.

,4. Родерсин по типу ^S' '.Фч^фФрРН^'ИИ.у.бруцсдл ца питательных • средах при И.еюцочении 11епйдиллина наблюдается у культур промежуточных стадий После 4-? пассажа и ¡00% случае»,

5. Г1ри глубокой L-трацсформаиин бруцелл, псзыппсимо от цх исходной таксономической характеристики (ahnrms, inclilensis, .suis), а также ъирулентцостц (штаммы иакдинццс, референтные, аирулентпые) •происходят идентичные изменения биологических риойсти, приводящие , к потере родо^ИХ, вшфиых и ccpoiiaptiaiiTHWX сгрпзнакон.

6. Для .получения информации о цуклертидпой состацлякпц'ей бруцелл и процессе L-трапсфбрмации наиболее оптимальной длиной полны ыообуждепия «ил яств» 270 им.

7. Характерныые группы линии для разных ттаммои изученных ;руцелл находятся к иы'сокоспецифичпой для них области 1628412 см"1.

8. Увеличение относительной интенсивности линий в области 1626-1666 см на 30-50% Характерно для L-форМ бруцелл независимо от стадии трансформации.

9. Метод лазерной спектроскопии позволяет осуществлять индика цию и идентификацию бруцелл, находящихся как в ипт--п ном (S- . форма), та<с и измененном состоянии (L-форма).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании результатов проведенных исследований разработаны «Методические рекомендации получения УФ РКР спектров бруцелл на разных стадиях L-трансформации», рассмотренное и одобренные на заседании Ученого Совета ВНЙЙБТЖ от 3 ноября 1995 г., протокол N7 и направленные на утверждение в Департамент ветеринарии МСХ ИП РФ N 201-01 от 22.04.1996.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.

1. Барабанова Ё.Б. Биологические свойства L-вариантов бруцел, индуцированных пенициллином //Туберкулез и бруцеллез сельскохозяйственных животных: методы и средства диагностики и профилактики: Сб. науч. тр./СО РАСХН. -Новосибирск, 1996. -С. 55-58.

2. Барабанова Ё.Б'., ОколелоВ В.И. Использование лазерной спектроскопии для индикации L-форм бруцелл// Основные начнме исследования по проблеме туберкулеза и.бруцеллеза с.-х животных, профилактика и организация мероприятий по ликвидации болезней в регионе Сибири/Тез. докл. Новосибирск. 1995. -С.90-91.

3. Околелов В.И., Татариноп А.П., Барабанова 1г.Б., Сидоренко O.A. Идентификация возбудителей бруцеллеза методом-лазерной спек цюскойни /Ветеринария. -.1996.

Сдано в печать 27.04.96. Формат 60x84 Í/I6. Бум.тип. Л 3. Печать офсетная. Уч.-изд.л. 1,0. Тираж 100 акз. Заказ 161.

Типография ОмГАУ,. Оыск-8, Сидаковская, 4