Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Нетрадиционные методы идентификации и дифференциация бруцелл

г гз сз

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ГОРЧАКОВА Наталья Григорьевна

УДК 543.545:619:616.981.42

НЕТРАДИЦИОННЫЕ МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ БРУЦЕЛЛ

16.00.03. — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

03.00.07 — микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1993

• Работа выполнена в Нижегородском СХИ, НИВИ НЗ РФ, хозяйствах и госветучреждениях Рязанской, Архангельской, Нижегородской и Ростовской областей РФ.

Научные руководители:

Доктор ветеринарных наук, профессор, член-корреспондент Россельхозакадемшг, заслуженный ветврач РСФСР В. В. Сочнев

Кандидат ветеринарных наук,

старший научный сотрудник Н. П. Старунова

Официальные оппоненты:

Доктор ветеринарных наук, профессор К. В. Шумилов Кандидат биологических наук, доцент Т. И. Морозова

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной, ветеринарии им. Я. Р. Коваленко

Защита состоится «................................... 1993 г.

в «........................» час. на заседании специализированного совета

Д 120.20.02 при Санкт-Петербургском ветеринарном институте (196084. Санкт-Петербург, Московский проспект, 112).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского ветеринарного института.

Автореферат разослан « » ............ 1993 года.

Ученый секретарь специализированного совета

М. В. ШУСТРОВА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

Актуальность теки. Б натоящее время животноводство России не молшт успешно и элективно рззьиватькя без создания апияоо-тического олагопслучия хозяйств по многим инфекционным оолознян. Снижение потерь от заболеяаемости и гибели аивотмых яэлнмтоя одной из глазных задач витеркиарной науки и практики,.

Мировой зеторяиарнои к биологической науками созданы надежные сродства и способы защиты животных от ряда оологжей. Б то as время отдельные оолдзни изучены ес,е недостаточно, на разработаны кадсдние методы их диагностики, профилактики и льчения. К таким болезням «одно отнести и бруцеллез.

По мнении E.G.Орлова (1976), В.П.УрОцна (1979), П.С.Улисв-вича (Ï96J), К.3.Шумилова (1984), П.А.Вераиловои (1!.«с>). .'.А. Косилова (1976,19Й6), О.И.Ддупины (Î9<J7), В.Ь.Сочнем (Г-'сИ), А.А.Новицкого (19о9) к др. трудности в борьбе с бруцеллезом связаны с несовераенстБОм его диагностики. О неооходнмост.к со-верпекствовакия прижизненной диагностики оруцеллоза сообщали и d.ôchonharr (1975). ji.&oIakClS^I)« G.JS/ооли U9o5).

Ьайнсе место в системе протнвобруцеллезных мероприятии занимают вопроси лабораторной диагностики бруцеллеза различных видов ливотних, связанные с выделением Оруцелл, изучением их морфологических, тинкториальных и биологических свойств. Суще-ствуюдие методы распознавания бруцелл, их видов и типов весьма трудоемки и но всегда эффективны. Исследователи едины во мнении с необходимости изыскания нетрадиционных методов идентификации С'^уцелл, основанных на изучении структурных хокпонентов микробных клеток.

РазраОотка биохимических критериев дифференциации микроорганизмов, основанных нгд определении сходства и различии в спектрах белковых систем клетки, а так&е а спектрах лирных кислот а использованием методов элахтро,[еретического анализа и газолкд-костноа хронатографип прадставлнет собой новое раэв.шап«оеоя направление в'диагностике болезни.

Широкое распространение бруцеллеза животных на территории Российской федерации, ухудшение зпиэоотичссхои ситуации по ору-целлезу крупного рогатого скота в ряде регионов, отсутствие надежных способов диагностики и 'дифференциации бруцелл определи-

ли выбор напраменил исследований.

Поль работы. Усовершенствовать методы эпизоотологическои диагностики бруцеллеза, разработать основные элементы нетрадиционных методоь идонтиф'лквцлк и дифференциации оруцелл, основанные на комплексном сопоставлении сходства и различий состава белковых ¡1 *ирнокислотных систем млкроонои клетка.

В задач/, исследований входило:

1. Разработать схему получен,« из бактериальном массы оруцелл белковых фракции: мембранных, пьриплазматических белков

и белков экзопродуктов (внеклеточных белков).

2. .'зучпть элоктрофоротическив свойства белковых фракций различных итаммоъ бруцолл и иерсинии с использованием электрофореза е р.алиакриламидиом геле (ЗЬ-ПААГ-ДОН).

3. Изучить д-ирнолиолотныи состав различных штаммов оруцелл и иерсиний. •

Определить таксономическое значении применения методов злектрофоретичеоксго анализа и газовой хроматографии для дифференциации различных ытаммоь бруцелл и иарсинии.

Научная ноьизна. 1) настоящей работе впервые методами '£> ПААГ-Д^Н и ГиХ изучен белновый к лирнокислотный составы референтных и эпизоотических штаммов оруцелл и иерсиняи, выделенных от крупного рогатого скога и условиях лесостепной и степной зон Российской федерации,

Ьпервые в сравнительном аспекте дана характеристика белкового и дирнокислсгкого составов различных родов микроорганизмов (бруцелл и иерсиний) и определена возможность их использования для идентификации микроорганизмов. Определены основные подходы использования эткх методов в биологии и практической ветеринарии.

Практическая ценность. Нв основании результатов исследования разработаны нетрадиционные методы межродовой и видовой идентификации микроорганизмов (бруцелл и иерсиний) о использованием ГаХ и Э^-ПААГ-ДОН. Показана научная и практическая ценность методов научного поиске в этой области знаний.

Выдвинутые на основании проведенных исследований пололе-ния волли в рекомендации по дифференциальной диагностике бру-

целлеза и иерсиниоза и мерам по их про.¡¡ила,".тике, утьорлденныо . НТО Госагропрома 5Ь РФ Ь от ¡¿З.иь/.иг») и Методические

указания по использовании нетрадиционных увтодов иденгифпкации бруцеллеза, одооренные секцией инфекционных и инпизионних болезней животных Российском Академии сельскохозяйственных наук (.пр.» 3 от

Основные полодекил, выносимые на защиту;

I. ¿оворвсиствованне методов получения из (ттвричльнри массы ору целя л передни»! белковых Фрьлнлк.

¿лектрофоротичоские свойства оолкошх фракции Ору к ел л и иерсинии и их таксономической значение.

'3. ¿..ирнокиилотики состав ору пил л и иерсинии п их таксономическое значение.

Пут_и_р_еадизации. Результаты исследовании могут оить использованы при разработке научно-совснозанноп спите'/!, по диагностике, профилактике и мерам оорьби о бруцеллезам и другими инфекционными болезнями с.-х, анвотных.

Апробация раоотн. Материалы диссертации дслолечы и обсуждены на научно-техническом сонету Госагропрома И ) РФ ч! на заседании секции инфекционных и инвазионных болезной с.-х. животных Россельхозакадемии (1>:Л). на научно-пропзнодетвен-ных конференциях (.Я.Новгород, 1)92, Смоленск, 1':>Э2), на медка-федральнон заседании кафедр эпизоотологии и микробиологии, патологической и нормальной анатомии Нижегородского СХ/, (.1991, 1992).

Материалы диссертации опуОликозаны в Ь научных статьях, рекомендациях и Методических указаниях, научных отчетах.

Бкедрокяе. Результаты исследования в Т9П9..,19У?гг. под авторским надзором внедрены с пололитедьиь.м эффектом в хозяйствах Архангельской и Рязанской областей. Подгоюмены, рас-" смотрены и утверждены НТО и изданы рекомендация "Дифференциальная диагностика бруцеллеза и иерсиниоза и мери по их профилактике? (1991) л Методические указания по использованию нетрадиционных кетодои идентификации Оруцелл, одобренные секцией инфекционных и инвазионных болезнен.животных Россельхоз-академии (1991).

Структура и 00 1,ем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных юсдедовани!', обсуждения полученных результатов, выводов л списка использованной литературы; изложена на [65 страницах машинописного то.х-ста, иллострирована 26 таблицами и 19 рисунками, описок литературы включает 332 наименования, в том числа Пй зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЕЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Интернат и методы исследовании.

Работа выполнялась о 19о7 по 1992гг. в лаборатории по изучение бруцеллеза животных Научно-исследовательского ветеринарного института Нечерноземной зоны Российской федерации, в хозяйствах и ветеринарных лабораториях Архангельской, Ростовской и Рязанской областей, ь Нилзгородском сельскохозяйственном институте.

С целые выяснения характера эпизоотического процесса при бруцеллеза животных в хозяйствах различных регионов, из которых поступали культуры оруцзлл, были проанализированы и подвергнуты статистической обработке:

- данные, полученные во время многолетних оиологических и зпизостологических исследовании в различных регионах Российской федерации, отчеты и статистические обзоры отделов ветеринарии и ветеринарных лабораторий, материалы и протоколы заседаний бруцеллезных экспедиций по выяснению эпизоотической ситуации по бруцеллезу животных.

Провиден анализ противоэпизоотических мероприятий с учетом идентификации и дифференциации полученных культур бруцелл, выделенных от сельскохозяйственных ливотных, изучено и идентифицировано 3'» штамма бруцелл, из них 2и - эпизоотических, полученных из СКЗНЯВИ (г.Новочеркасск), 1и - референтных, полученных из ВИЗЕ (г.Москва) и 4 вакцинных, а такле 5 референтных штампов иерсиний, подученных из института "Микроб" Сг.Саратов).

В работе использован комплексный эпизоотологическии метод, окопериментальные исследования, эпизоотологический «статистические, газохроматографический и олектрофоротическнй анализы»

Выделение белковых компонентов различных субклеточных структур микроорганизмов проводили в условиях лаборатории по изучению бруцеллеза НЯЬЛ НЗ Pi- и 'JK3Hiïb-I. Культивирование бруцелл о цольо получения бактериальной мнеиы проводилось на эритрит-агаре часов при температуре 37°С, иерсинкй - на МП А '♦й чаооа при 27°0. Затем Oaswaecy омывали физраствором СрН 7,2} и убивали формалином ^до конечной концентрации 2'i> формальдегида) при экспозиции I час. Клетки отмывали стэ-рильнык физрастзором и иысуаизвли ацетоном по методу в».1,. Hucwon (1975). Ь дальнейшей работе использовались сухио ацетоновые порозхи клеток бруцелл и иерсинкй.

Зкзопродукты бруцелл и иерсиний получали путем выращивания культур на целлофановой мембране на поверхности твердой питетельной сред» при 37°0 чдля бруцелл) и ?.7°С (для иеремнии в течение W часов (в.тгая! > l'Jàd).

для отработки методов фракционирования субклеточных структур использовали ьахциннки станм вг.двагьии Â3.

Ьелки наружных мембран г оделяли по методу ц.увглгваб» (1962), а та к«g при экстрагировании клеточной массы noptjat-

паа (1967). Перип/аэкатичосхие бедки выделяли экстракцией хлороформом по методу a.G .¿.-'¿rre-Lu^i (19о<0 в нолей . модификации и методом многократного заморадявания-оттаива-ния по з .Gruisst (1935) ,

Количественное содержание белка в препаратах клеточных экстрактов определяли стандартным методам по o.Lcvrj (155^), а в образцах, гэде.г.ацих тритон Х-1С0 - модифицированным методом noMOuley (1975), ^одер/.ание угловодол определяли колоримвтричзским методом no;,;.put)oij (I9b5).

Определение ииркокислотного состава клеток микроорганизмов проводи»,!; путем газовой хроматографии, испсльзу.ч метиловые офиры жирных кислот, приготовленные с поиоцьв гидроокиси тбтраиотклакмония (ГТМА) по^ао go0 ь модификации Л.В.Андреева и А.И»Скли$сс (1977). ГазохроаатографичесхиЯ анализ осуществляли на газозпм хроматографе! "цват~152" и использованием пламенио-иокизациокного детектора. Определяли процентное содержание ;:ихоа ¿ирных кислот нз хрематограмчах, проводили визуальное сравнение дирнакислотного профиля»

"^акционирование белков клеточных 1-кст )актов бактерий

на основе их молекулярной массы проводили с помощью электрофореза в полнакриламидном геле с использованием додецилсуль-фата натрия (ДОН) по и.K.Laenmli (1970). Ь качестве разделяющего геля исиользовали 10,»- и 15,*-1шй полиакриламидные гели (.ПААГ); концентрирующего -3,1>-ный ПААГ, электродного буфера - трис-глициновый (0,025 М трис, 0.UI92 Н глицин,

рн а,э).

Вертикальный гель-элалтрофорез проводили в аппарате, изготовленное экспериментальной лабораторией "ХИНУ КАЛУР" (Таллин), на пластинах размером 115x115x2 мм. Решш электрофореза: 10 минут по 2 иА (миллиампера) на кармашек, затеи - 4 мА/'карнашек при комнатной температуре. Длительность электрофореза 3-4 часа.

По окончании разгонки гели вынимали, фиксировали и одновременно окрашивали по р.jalonan (I9c¿7) просителем Ку-масси бриллиантовым голубым СИЗ ^-250.

Электрофоретичоскуо подвижность (кг ) и молекулярные массы полипептидиых целая расчитывали по методу к .water, М.сиьагп (1969), Молекулярные иассы исследуемых полипептидов определяли также по калибровочным кривим, построенным по стандартным белкам С известной молекулярной массой.

Вычисление показателей подобия белковых спектров проводили по методу Дегтевой Г.К. и Блохиной íl.H, (1972).

Оптическую плотность отдельных полипептидных полос в гелях определяли с помощьо регистрирующего микрофотометра Mi-4 с электронным автоматическим потенциометром

ЭПП-09 МЗ.

В проведении ряда исследований принимали участие Лазовская А.Л., Григорьева Г.И., Рачкова О.Ф.. Пинчук Л.М.. Сафронов В.П., Сочнев В.В., Старунова Н.П., Тебвкин А.Б., которым автор искренне благодарна за оказанную помощь.

о

Результаты Н^ЛВДОЬАН.Ы

Эпизоотическая ситуация по оруцеллезу крупного рогптого скота в оазоных регионах Российской федерации.

ъруцоллез крупного рогатого скота до сих пор регистрируется во многих регионах России, а в отдельных - имоет широкое распространение. Трудности оздоровления хознпс'тл во многом обусловлены несовершенством згызоотологическои диагностики, отсутствием надежных спосоеон идентификациии дифференциации позОу-дителя Оолезни, выделяемого от аичотннх л зпиэот ических очагах.

Нозологический профиль инфекциошшх болезней крупного рогатого скота в Российской федерации по данным статистических ооэоров представлен 'II нозологическом сдпницеи. I руцолл«:) в нозологическом профиле занимает 10-е мрсто по количеству неблагополучных пунктов и 2-е по уровни заооленаемлстп, В целом в России происходит сни,»ение напряженности эпизоотического процесса бруцеллеза крупного рогатого охота, ?и последние 30 лег темп нарастания новых неблагополучных пунктов сократился в г>, 4 рази, за атот период оздоровлено ? неблагополучных пунктов по оруцеллезу.

Отмечена неравномерность территориального распространения болезни в Оазовых ооластях: на п]отяяении всего исследуемого периода хозяйства Архангельской области оставались олагополуч-ными по данной оолезни. В то ле время до Г);1// годя отмечалось неблагополучие хозяйств по Оруцеллезу крупного рогатого скота в Рязанской ооласти, риск возникновения я распространения оолезни здесь сохраняется и до настоящего времени. Напряженном остается эпизоотическая обстановки по бруцеллезу в хозяйствах Ростовский ооласти. Территория России по степени ¡¡иска возник-

новвния и распространения оруцеллиза крупного рогатого скота разделена на ^ зоны: максимального, повышенного, среднего и минимального риска.

Эпизоотическая ситуация по оруцеллозу хозяйств, из которых доставлены культуры Оруцелл на идентификаций.

Изучая эпизоотическую ситуации по бруцеллезу в хозяйствах, из которых доставлены культуры возбудителей на идентификацию, установили, что в основном они выделены от животных в хозяйствах, расположенных в зоне повышенного риска и прилегающей к ним угрожаемой зоны. В 90^ случаев культуры возбудителей выделены от крупного рогатого скота, в большинство из плодов аоортировав-ших коров и нетелей и в отдельных случаях из патологического материала при диагностическом убое реагирующих на оруцеллез животных. В 10/ь случаев культуры выделены из плодов депортировавших овец в благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйств.

Установили, что вспышки (свелие Очаги) болезни связаны с завозом животных из хозяйств неблагополучных по бруцеллезу, а также с контактом восприимчивых животных на пастбищах с поголовьем неблагополучных и оздоравливаеиых от бруцеллеза хозяйств.

В '♦7,1^ случаев культуры возбудителей выделены от молодых животных *.нетелей), что подтверждает вовлечение в эпизоотический процесс бруцеллеза новых групп восприимчивых животных и выраженную недостаточность мер по купированию бруцеллеза в первичных очагах. В ряде случаев культуры возбудителя выделены от животных, иммунизированных противобруцеллезными ъакцинами, в т.ч. и вахцкной из штамма Вт.аЪоггиа ь2. Это подтверждает переливание вакцинных атаммов Оруцелл в организме иммунизированных животных.

Изучение кирнокислотноп) состава микроорганизмов.

Оценку хроматограмм лшрнокислотного состава исследуемых штаммов бруцелл проводили путем наложения хроматограмм эталонных лирных кислот, либезно продостявленных нан профессором А,Л,Лазовской и к.м.н. Л.К.Пинчук.

лирные кислоты изучаемых штаммов бруцелл имели от до 19 углеродных атомов и в основном представлены мириотиновой (011):0), пентадекановой пальмитолеиновой па-

льмитиновой циклопропаногой - метиденгексвдекйновой

гвптадвкановой оле>,нопой ^'¡о'Р' с*°яриновой

^10:0^' Цикл°пропановой - метиленоктадекаиовой ки°ло-

• ТЙМИ.

У штаммов бруцелл пяти видов во всех случаях устанавливали наличие палимитиногои, стеариновой, мсгиленоктадпкэноиой кислот, составляющих основно;! рисунок хроматогрвмм Оруцалл. Мирно-' тиновая, пентадекановая, пальчитолвиновая мирные кислоты такде инели мосто у всех атамков оруиолг, но в незначительных количествах, а у некоторых «тамж>а ( ег .аъогьив в? ~ ^15:0»

Зг .пэНгипат " ^ 15; 0' Лг.мЩя 1330 И ?ц..^аа14 н

следовых количествах.

Мирные кислоты с 17 углеродными атомами и 017.й) у

разных видов и штаммов бруцелл инделялизь в незначительных (следовых) количествах или не выявлялись совсем. Отдельные штаммы бруцелл кроне постоянных" хнрка?. кислот характеризовались наличием дополнительных пиков на хроматогрякках. ¡¡ринвдломность этих пиков к определенный »ирньц кисдо?пч и;-' установлена,

. Количество различных дирмых кислот у «.'следованных видов и атакиоь бруцелл не одинокого. Так короткопэлонеччно лирные кислоты (от С£/ -ДО С16) у Ег.айаппда ооотвгяявт - 23,3*2,2 ,

y №iguli - 24,4.2,9 i. Несколько выше доля короткоцепочечных жирных кислоту видов iMliteiwla, ovi^, cania , соответственно: 33,1+6,9 , 46,1»'.),7 , 32,1+0,9 процентов.

Наибольшее количество длинноцепочечных лирных кислот выявлено у Вт .bboi-tus- 76,b+2,2 , у Br.iuis -75;£>+2,9 , несколько ниже у Вт .aalltabdliä - 66, 9+6, й , Вт.canta- 67,9,6 , вг .ovi^ü,

Установили, что содержание насыщенных, ненасыщенных и цик-лопропановых жирных кислот у разних видов бруцелл также не одинаково. Коэффициант соотношения насыщенных и ненасыщенных »ирных кислот у бруцелл видов В^ .aticx-tu* - 1,3 » Br.suls U,9 , Bc.ovLa - 3,1, Br.üualii- 2,1. У штаммов вида Вт .nalttenaie он варьировал от 0,3 ( Кг .квииаиги -I6M) до 2,3 Br.malltan--Ю2-Н).

Установили итаммовые различия соотношения насыщенных и ненасыщенных жирных кислот у бруцелл одного вида. У высоковирулентных итанмов коэффициент соотношения значительно выше. У Кг.аьог-■ tua -544 это i показатель составил 1,4 , у Br.melitejwia 237 -2,1. Общее количество циклопропанових жирных кислот (мэтилен-гаксадакановой - С^у и меткленоктадекановой - С^) различно не только у разных видов, но и итаммов оруцелд. У видов Вг.аЬог-этот показатель варьирует от 42,6> до 51,5^ , у Br.malitaa-от 1.Э* ДО ЧЬ.гё , у Br.dulá ОТ 2tí,5¿ до 37,9>, Вт .ovia -lö..Gi2,2r«. у hc.euaia - 42,2¿.

На основании проведенных исследований референтных штаммов различных видов Оруцелл составлена схема основных характеристик хиркокислотиого состава (табл. I).

Изучили жирнокислотный соотав бактериальна* клеток эпизоотических итекмов бруцелл, выделенных от животных в эпизоотических очагах болезни. Методом прямой, косвенной и инверсивной

Таблица I

Оснмжые характе^летлки спектра »и^ных кислот уеф&рбнтпах штаммов оруцслл, а *

! 1 "'Г'\:';о 11а аПО } Ни 1.1-

■ ! 19 » С<1 ! 21-Ъ ! -.4 ! I кии. |Л1ТйрпйЛ | 'ДДЧ -ЧИДЬ 1^-Н" £37 1 1бМ интервал ич БИ 13

1 " и г ^ и,7-1,3 '-.0-1.1 1-1.3 >1,6-1.3 сл.-2,6 2-7, 7 сл.-2,0 0Л.-7.7

I,--I,а ,..,7-;. о 1,7-2,7 и,3-2.а 11.7-17,7 А, !-*>, 1 " 3 сл.-17,7

и ¿-'"'Л ¡.Ч-О -.7-3.а г.'»-о 1.3-'.4 1.4-Е.г г 1-Ъ.Ъ 0-2,3 о, с—»

" ; -< о ».г-21.7 \-J.3-i7.v. , с э 17 е-3ч..7 7^-17.6 7,'3'-3и,7

•э ° 1? >> 1 . , ОЛ.-^ й.4-12,4 ол.

{ 1.о-г.7 „,(--:. 1 О-г.г о.^-'-'с, 7 ^.г-г.г сл.-;,2 о.З^.'.о ОЛ.-2.2

? 11, п.6-33.г 11, [1.0—■.•'.0 11.^-14.3 и 7-31,7 67,с-<Л.З

7,<-..„„ (-.7 -ил 4..--Г-.1 Ч.Ь-ч! 7.3-7.е 3.7-6.2 3,7-1,

,7-^7, о 36.3-12.0 сл.-;1.» сл.-1.7, в

',, 1 " , 3-т .7 чЗ.е-Т!.!! ' "ь>3,е'-7,:). I Ч..ь-г ..3

-.--'..г к-.э-г.д 2.9-^.1 г.^-г.1 с.ь - -.VI-,;. 03

>.-,7.3 51.7-30,1 - '."'-З-1, - 1г.:,, ......... ' •4 [ .3-1Г.5 -'1С, У

-'г гГ-1» . IV. !■->.;> 1;,3-23.1 ',3. ъ 31 1-33, •) 1 '.'.'-Х-.З

.ь-г- -'7. 2-1) ■,-.(! 21. ;-■>-. з 22 -.2-2.а

Сс ,^ '¿.к: Г"-«..' ,-ЛН . . \ С! >-1.7 ■'.о-:,5 1.3-1,(> ■ и.ь-гл V. 1-..7

прслолленке тайд.» 1«

* Квэувсие К й СЛОЯ-' 1 ! "Ги^С11^ -эЦи \rucoJlu ¡

пкка • „ 1ззо ; ~ тй ! 1« ; ь !пок:Г;атель ¿1 ДЛЯ НИДЕ. 1; 1 0? 64 или вид а

0,4-1,6 1.7-3.9 4.5-3.6 2.3-3,0 4.5-3,9 и,9-1.6 2,5~7,5 и, 9-6.0 2 1-3.2 и,9-6,0

2 г. <1-\ 9 с.1.-7,г I.4-6, э «.-7.2 2,4-11,9 1.7-9,4 1,6-13,0 7 ,2-15,6 1,6-15,6

\ Ct.-l.ll СЛ.-5, 1 1.7-2.4 3.1-11.9 с-л.-5. I сл.-1.4 сл.-1.4 сл.-7.1 I Ь-3,5 сл.-7,1

4 7.7-В.6 0.»-14.7 П.5-19. к 16.6-21.6 б. 11-21, 6 7.7-оД- '19.0-22.9 1». '-32.5 23 6-27.7 16.7-32.5

Ъ сл.-4,3 - сл. гл.-о,4 2.3-3.2 сл.-3.2 с.г.0,3 сл.1,5 4.4-10.3 5 4-6,4 4.4-1и.З

* сл.-2. 1 сл.-4, 4 сл.-и, и. '-I.7 сл.-4.4 С.!.-2,1 сл.-1.5 1.6-5,4 2 4-3,4 1.6-3.4

7 31.5-3е,2 29.1-1)0.1 23.0-34.1 34.5-32. 1 23,4-110.1 31.5-3в. 2 16,6-19,5 13.7-25,7 13 7-1о.Э 13.7-25,7

О Й. й-10, и 5.6-12.9 9.3-Ю.б о.4-1и,3 5.0-12.9 о,а-1и,о 6.6-7,1 9.0-12.1 10 4-14,6 9.и-14.Ь

С г ........ - 35,6-43, С- II. 1-1«, ^ 35. 7-3^.9 Ь.З-З"). I -11,4-10.3 37,и-46.2 3.2-42.7 ' 11 3-17,4 3.2-ч2, 7

1и Ьеопр. о,9-1,3 сЛ.-1.4 - - сл.-1,1 ' 0,9-1,3 - еа. СД. 5 4-7.3 с».-7,3

74.4-76.2 /59.5-ог.з 5о,7-74.и -46.0-67.2 16,о-б2.3 74.4-76,2 40.6-65.7 22,9-59.1 25 0-35.7 ¿2.9-59,1

и1о:1 lz.S-I.-ll 1.4-1.6 1,2-1.1- 4.5-1.1 и. VI. ь 0.9-1,4 5.2-2.4 0.1-2.6 и.гМ.О и, 1-2.6.

иные кислоты - гг.о-гз.з 17.7-4j.lt 23,6-39.6 20,0-40,9 17.7-10,9 21.Г-23.3 31,0-46,4 53,2-6Ь, 4 50.6-59.2 54.6-6(5.4

венагишенные кислоты *я, 5-40,2 - _эи,и-:'Ь,и - 21,6-36,1 34,1-30.3 24,7,за.э 31.3-40,2 46.6-20,5 ' 1>.г-34.1 17. 2-20,2 н.-г-з^л

*и|/нье опанрдыг кислоты 35,7-44,3 20.8-37,1 2о,о-4й,3 35,6-ч3,0 37,и—47,7 ¡4,7-Хо.4 16. 3-23.й 14,7-23,0

Соотношения насыш./ненвсыя. дурных КИСЯОТ .-'.б—-Он"« й.7-l.fr 0. и,3-1,6 4,6-4.7 1.6-г.й 1.6-5.2 2.5-3.4 1.6-5.2

верификации с использованием традиционных методов изучения культурально-морфологических свойств установили видовую принадлежность этих штаммов.

дирные кислоты изучаемых сароваров Т»епсегосоШ;1са имели от II до 19 углеродных атомов и в основном представлены унде-кановои додекановой тридекановой ни-

ристолеиновой мириотиновоИ пэнтадеценовой

С015{1). пентадекановой лальмитолеиновой С^к,.])» паль-

митиновой (С^.д). матиленгексадекановой олеиновой

^18'Р* стеаРииовой ^18:0^* мвтиленоктадекановой С^^д^) кислотами.

У всех сероваров иерсиний установили наличие палимитолеи-норой,пальмитиновой, метиленгексадекановой, олеиновой и а незначительных количествах - ундекановой, додекановой, ииристино- • вой, пентадеценовой» пентадекановой, стеариновой, метиленокта-декановой «ирных кислот. Непостоянно или в следовых количествах выявлялись тридекановая и миристолеиновая жирные кислоты.

Отмечены незначительные колебания содержания различных групп *,ирных кислот у разных сероваров иерсиний. Так количественный показатель иарьщеннцх жирных кислот варьировал от 39,0 +0,9^ до 45,0+4,ОД ( в среднем для вида у.аиЪагосоШ;1са -- 41,9+1,2/0, ненасыщенные лирные кислоты составляли от 24,5+ 2,2/6 до 37,2+3,С в среднем 29,7+2,5/в), циклопропановые жирные кислоты составляли от 23,8+3,52 до 31,7+3,9% (и среднем 28,411,6;?) от общего количества «ирных кислот.

Коэффициент соотношения насыщенных и ненасыщенных «ирных кислот для иерсиниа составил в среднем 1,4+0,1;!, У разни» сероваров этого вида он был почти одинаков и имел значения от 1.0+0,1* до 1,7+0,32 .

Изучение белкового состава микроорганизмов. Оптимизация способов фракционирования клеток бруцелл.

С этой целью испытали общепринятые методы лизиса бактериальной клетки, провели оерйю опытов по обработке бактериальной массы бруцелл растворами различных химических веществ при различных условиях воздействия. Установили, что общепринятые методы лизиса бактериальной клетки без применения протеиназ с целью выделения нативиых мембран для бруцелл неприемлемы.

Во время испытания различных методов воздействия на клетки бруцелл установлено, что клетки легче фракционируется после предварительной обработки 5^-ным раствором трихлоруксусной кислоты (ТХУ) с большим выходом фракций.

Изучение влияния.различных методов инактивации бактериальной массы бруцелл на процессы экстрагирования и лизирования показало, что при инактивации бруцелл раствором формальдегида в дальнейшем затрудняется экстракция и ли.оис клеток бруцелл, Б то же время инактивация бруцелл ацетоном или 70^-ным этиловых спиртом улучшает процессы экстрагирования и лизиса клеток бруцелл. Выход фракций в этих случаях в 1,7-2 раза выше.

Исследованиями по оптимизации режимов получения наружных мембрвн бруцелл установили высокую устойчивость клеток бруцелл к химическим реагентам. На основании проведенных исследований отмечено, что при экстрагировании 2л—ним раствором ДОН выход фракций белков наружной мембраны бруцелл возрастает при предварительной обработке бактериальной массы раствором 6 К мочзвины при высокой температуре. Метод экстрагирования в растворе триса (6 М мочевина, 2*-ный ДОН, О,4) М трис-Н«, рН нами избран

как наиболее приемлемый для далынемад работы по фракцлонирова-

нив клеток бруцелл.

Проведены исследования по испытание »-етода экстракции клеток бруцелл с применением хлороформа в различных условиях. Установили, что при использовании этого метода экстракции париг плазматической фракции болъиий выход этой фракции получен при тепловой хлороформной обработке с удлинением срока экстрагирования. В то же время метод замораживания-оттаивания при получении периплазматической фракции менее эффективен, более длителен по времени, а для достаточного накопления фракции требуется 3-4-х-кратная его экспозиция.

Полученные результаты исследований позволили разработать схему выделения фракций различных структурных уровней клетки бруцелл, с последующим осаждением белков для биохимического аналит за и электрофоретического исследования, а такле схему выделения белко^х фракций наружной и внутренней меноран с прямым разделением электрофорезом.(Рис.1, 2).

Изучение белковых фракций бруцелл методом электрофореза в полиакриланидном геле (3? ПААГ-ДСН).

С целью оптимизации методов идентификации и дифференциации бруцелл изучили их белковый состав с использованием ПААГ-ДОН, ■ используя различные субклеточные структуры и экэопродукты.

Установили, что белки экзопродуктов бруцелл и иерсиний отличаются по количеству фракций и молекулярной массе. У различных видов бруцелл имеотся вырадэнные сходство и различия белковых фракций, общее их количество варьирует от 9 до 2о, из них по 24 крупных. В спекгре внеклеточных белков иерсиний количество фракции болыве, чек у бруцелл (16-32), но только по 1-2 крупных фракций.

Ьзктернальная масса бруцелл ", ' " ЧВ1*" Г обриботкв 4% ТХ» Л

т

Центряфугированио И минут при 50и0 об/ник.

Центрифугирование Ухнут при 1000 об/мин, ^рг* ■ ■

I

С'СЙДОК клоток

¡Обработка! Ь К мочевина,

г/к /¿Н. . ил и трио, рн е. в

при 100 С 1(5 ккчут

Центрифугироиание НО кинут при 1ЧХЮ об/кин.

('СппОотка! 2* ТПИТ.'Н Х-;ии I I. г:ри - 11? час, I П*

или при 100Г1У - 5 мин• !

ИентрЩугиррванио 40 минут'при 1">000 пб/мин.

Нпдоспдпчнен ЖИлКОСТЬ-— ми лнутреннм менбран«>-*

0!Л атки. клеток

Рис. 1

ихема фракниониргмнив рттчних структур')»/ уровней клутки оруиел". с огзкдвнием белков-

Изучение «ирнокислотного состава микроорганизмов.

. Оценку хроматограмм жирнокислотного состава исследуемых штаммов бруцелл проводили путем наложения хрочатогрвмк эталонных яирных кислот* либезно предоставленных нам профессором А.Л.Лазовской и к.м.н. .'¡.М.Линчук.

мирные кислоты изучаемых штаммов бруцелл имели от 1!1 до 19 углеродных атомов и в основном представлены миристиновон (О^.д). пентадекановой (^¡^.р! пальмитолеиновой (С^.р, пальмитиновой циклопропановой - метиденгекседекановой С017г). Гептвдекнновой олеинопой (^.р. стеариновой ^18:0^' и1!КЛОГ|Р°паковой - метиленоктвдакановой (^¡дР кисло-.Тами.

У штаммов бруцелл пяти видов во вС(зх случаях устанавливали наличие пзлимитиногои, стеариновой, метиленоктадеканоноя кислот, составляющих основной рисунок хроматограмм бруцелл. Мирис-тиновая, пентадекановая, пальчитолеиноиая жирные кислоты также имели место у всех штампов Орунолз, но в незначительных количествах. а у некоторых штаммов ( вг .аЪотЬив " "Х'цО* ^15:0« Вг.пеИЬигыав ^ " ^15:0* 1330 и ^ 15апи п

следовых количествах.

Мирные кислоты а I? углеродникч атомами (Отуи и Отумр у разных видов и штампов бруцелл выделялись в незначительных (следовых) количествах или не выявлялись совсем. Отдельные штаммы бруцелл крона постоянных"жнрких кислот характеризовались наличием дополнительных пиков на хроматографах. Принадлачность этих пиков к определенным «ирны< кислота'« ну установлена.

Количество различных «ирннх кисло? у исзледованикх видов и итакмоь бруцелл не одкнакоЕО, Так короткоцэлочечные мирные кислоты (от С14 до 016) у вг.аьэ^иа осстагчявт - 23,3*2,2 ,

y Bu.eu^g - 24,1н2,9 lo. Несколько впив доля короткоцепочечпых жириых кислоту видов из líteosla, ovIj, aania , соответственно: ЭЗ.ЬЬ.Э , 4£>,Ij,'j,7 . 32,I>ü, 9 процентов.

Наибольшее количество длинноцепочечных жирных кислот выявлено у Br.&bartus- 76,e¿2,2 , у Вт .¿ule —75;Ь+2,9 , несколько ниав у Be .наlitábale - 66, 9+6, tí , Br.cuila- , Вт .ovla^t^d^.

Установили, что содержание насиненных, ненасыщенных и цик-лопропановых лирных кислот у разных ьидов бруцелл также не одинаково. Коэффициент1 соотношения насшюнных и ненасыщенных жирных кислот у бруцелл видов gr.аЬсгъи* - 1,3 » Ег .auie U,9 , Ke.ovla - 3,1, Вт .ct»nl«¡ - 2,1. У штаммов вида Вт .melitecsls он варьировал от 0,3 ( рг .ивШ;вп41й -№М) до 2,3 С Br.maliteu-- Ю2-Н),

Установили итвммовые различия соотношения насыщенных и ненасыщенных лирных кислот у бруцелл одного вида. У высоковирулентных штаммов коэффициент соотношения значительно выше. Увг.аьог-• tus 3T0Í показатель составил 1,4 , у Вт .malltecald 237 -2,1.

ООэдев количество циклопропанових лирных кислот (метилен-гексадекановой - и метиленоктадекановой - различно

не только у разных видов, но к штампов Оруцелл. У видов Вт.аьас-tu-з этйт показатель варьирует от 42,&¡í до 51., у Вт .malltaa-

от 1,3* до 2¿ , yBr.duü от 2b,5¿ до 37,9>, Br.ovis -ló,0¿2,2.¿, у iur.oaali - 42,2¿.

На основании проведенных исследований референтных штаммов различных ьидов бруцелл составлена схека основных характеристик киркокислотаого состава (табл. I).

Изучили лирнокислотный состав бактериальных клеток эпизоотических итаммов бруцелл, выделенных от нивотних в эпизоотических очагах болезни. Методом прямой, косвенной и инверсивной

верификации с использованием традиционных методов изучения культурвльно-иорфологических свойств установили видовую принадлежность этих штаммов.

жирные кислоты изучаемых сероваров т.эпсегоооШ;1са имели от II до 19 углеродных атомов и в основном представлены унде-кановой С^ц-и)» додекановой О^лР' тридеконовой С^^.у). ни-риотолеиновой (^¡¡х). мириотиновой О^.у)« пэнтадеценовой

понтадекановой С^^.о)» пальмитодеиновой С^хб:!^* паль~ ми.тиновой метиленгексадекановой олеиновой

0,геаРи»овой ^18:0^' метиленоктадекановой С^д,,) кислотами,

У всех сероваров иерсиний установили наличие палимитолеи-новой,пальмитиновой, нетиленгексадекановой, олеиновой и в незначительных количествах - ундекановой, додекановой, ииристино- • вой, пентадеценовой, пентадекановой, стеариновой, метиленокта-декановой «ирных киолот. Непостоянно или в следовых количествах выявлялись тридекановая и миристолеиновая жирные кислоты.

Отмечены незначительные колебания содержания различных групп мирных кислот у разных сероваров иерсиний. Так количественный показатель наращенных »ирных кислот варьировал от 39,0 +0,9,6 до 45,0+^,ОД ( в среднем для вида у,аы1;егосо1Н1.сц -- 41,9+1,2а), ненасыщенные лирные кислоты составляли от 24,5+ 2,2А до 37,2+3,8* ( в среднем 29,7+2,5*), циклопропановые жирные кислоты составляли от 23,8+3,% до 31,7+3,9^ (в среднем 28,4+1,61) от общего количества жирных кислот.

Коэффициент соотношения насыщенных и ненасыщенных жирных кислот для иерсиниа составил в среднем 1,4+0,1£. У раани» сероваров этою вида он бил почти одинаков и имел значен:'* от 1,0+0,1%.до. 1,7+0,П

Изучение белкового состава микроорганизмов. Оптимизация способов фракционирования клеток бруцелл.

С этой целью испытали общепринятые методы лизиса бактериальной клетки, провели серии опытов по обработке бактериальной массы бруцелл растворами различных химических веществ при различных условиях воздействия. Установили, что общепринятые методы лизиса бактериальной клетки без применения протеинаэ с цельп выделения натипных мембран для бруцелл неприемлемы.

Во время испытания различных методов воздействия на клетки бруцелл установлено, что клетки легче фракционируется после предварительной обработки 5^-ним раствором трихлоруксусной кислоты (.ТХУ) о большим выходом фракций.

Изучение влияния.различных методов инактивации бактериальной массы бруцелл на процессы экстрагирования и лизирования показало, что при инактивации бруцелл раствором формальдегида в дальнейшем затрудняется экстракция и лизис клеток бруцелл. Б то же время инактивация бруцелл ацетоном или 70^-ным этиловым спиртом улучшает процессы экстрагирования и лизиса клеток бруцелл. Выход фракций в этих случаях в 1,7-2 раза выше.

Исследованиями по оптимизации режимов получения наружных мембран бруцелл установили высокую устойчивость клеток бруцелл к химическим реагентам. На основании проведенных исследований отмечено, что при экстрагировании 2я~ным раствором ДОН выход фракций белков наружной мембраны бруцелл возрастает при предварительно« обработке бактериальной массн раствором 6 М мочзвины при высокой температуре. Метод экстрагирования в растворе триса (6 М мочевина, 2*-ный ДОН, 0,5 К трис-Н«, ?Н нами избран

как наиоолее ггриемяькый Для двльйвйаай работы по фракциокирова-

нип клеток бруцелл.

Проведены исследования по испытание 1'втода экстракции клеток бруцелл с применением хлороформа в различных условиях. Установили, что при использовании этого метода экстракции периг плазматической фракции болъаий выход этой фракции получен при

тепловой хлороформной обработке с удлинением срока экстрагирования. В то де время метод эаморакивания-оттаивания при получении периплазматической фракции менее эффективен, более длителен по времени, а для достаточного накопления фракции требуется 3-'(-х-кратная его экспозиция.

Полученные результаты исследований позволили разработать схему выделения фракций различных структурных уровней клетки бруцелл, с последушцим осаадением белков для биохимического аналит за и электрофоретического исследования, а такла схему выделения белко;.\*х фракций наружной и внутренней мембран с прямым разделением электрофорезом.(Рис.1, 2).

Изучение белковых фракций бруцелл методом эле'ктрофореза в полиакриламидном геле (Й ПААГ-ДСН).

С целью оптимизации методов идентификации и дифференциации бруцелл изучили их белковый состав с использоьанием ПААГ-ДОН, . используя различные субклеточные структуры и экэопродукты.

Установили, что белки экзопродуктов бруцелл и иерсиний отличаются по количеству фракций и молекулярной массе. У различных видов бруцелл имевтся выраженные сходство и различия белковых фракций, общее их количество варьирует от 9 да 2а, иг них по 2-^ крупных. В спек-гре внеклеточных балкон иерсиний количество фракции Оолыве, чей у бруцелл (16-32), но только п0 1-2 крупных фракций.

бактериальная часов бруцелл -

Г Обработка 5Л ТХ» Л _ "'¥"...... .- ...

Цеитри^угирояанио 14 минут при 50и0 об/нин.

Хлоро^сшк 0.1"5 М трио- нс1 . рН 0.0 37бС.. 30 ник.

Центрифугирование 15 нллут при ТОО об/мин.

1

гг

г-—1

1 Гюадск клотсж 1

Обработка: Ь К мпчеЕина.

г*

„ ил к трис. рН е-.а

при 100°С 10 кинут —-

Центрифугирокакке <Ю «кнут при 15о00 об/кйн.

ООрпбптхв! г% трит..н Х-1Ш

при 37^-1? час. | ¡1

ли при ЮСЯЗ - 5 мин

11Е'Нтрн.}угиртааняэ чО минут'при 1">00>3 об/кин.

Иалосядочная жидкостЕ [оелки тутрентЖ мембран»!,

Онтетки клеток

Рис. 1

ьхона фрнкпиомирпрпн'.'ч рпчличних структурчух уровней метки оруиелч с !,.>.-.. ,, 'ч огзаденнен белков

экстрагирование: трио- hoi • ДОН,

озтан минут

^-аеркаптозтанол Ю0°0, 10 mi

11'

Центрифугирование Iü минут при 50QÜ об/мин.

Надосадочм&я лидкоать (белкл внутренней мембраны)

Рис. 2,. í Охьма выделения СелхоЕыу ¿ракцаи

к&рулноя и ьн/грочкёй мембран кичт/./. Срупчдд

примам эъметодом Г)Лг;ларг,-*/,г.|Г;э& •„без

Установлены не только видовые, но и штаммовие различия фракций внеклеточных белков бруцелл. Так все штаммы оруцелл вида Br.aula имеит по Ц крупных белковых фракций: у штаммов lit1 .duls-6 и -1330 их расположения на электрофореграмме идентично, а у штамма Br .aula -161 С Вт .raugtrerl -Ш) кроме общих, две индивидуальные крупные фракции ( нг и 59.). Аналогичные сходства и различия установлены у штаммов видов Вт.о vis-02 и ^¡t, Br .abortua-54 и Br .nalitenais -237 и-1о2-Н. Полу-

ченные нами данные позволяет сделать заключение, что крупные белковые фракции экэонродуктов Оруцелл определяют их видовую специфичность, а минорные компоненты является индивидуальной птаммовой характеристикой.

Установлена возможность идентификации бруцелл и иерсиний по пептидному составу экзопродуктов, Пептидный спектр экзомродуктов бруцелл имеет значительное количество крупных пептидных фракций с широкой зоной и< распределения в геле. Крупные пептидные фракции иерсиний по молекулярной массе более гомогенны, зона их распределения в геле занимает уэкуо область относительной подвижности {^-ЧЭ.г.ЧЗ).

На примере референтных штаммов бруцелл при изучении спектра белков наружных мембран установили полипептидный состав, насыщенность и место расположения основных фракций в геле . Установлены видовые и даже штаммовие отличия бруцелл по количеству белковых фракций. Так, Оруцеллы вида Br.abortus имеют 6, а Вт .о-/1 -24 белковых фракции. Отличия в расположения основных фракций установлены и у бруцелл видов Br .aula и Rr.oanld. у Оруцелл вида Br .ovIsb отличии от других видов на электрофореграмме ярко выражены две пептидные фракции с кг и 90. У штаммов № •тоИеешяв в отличии от других видов уста-

12 51 5 ь 7 в 9 Ю 11 12 15 п 15 16 17

Ми ߣ

Рис. 3

спектры внеклеточных оолков (экзопродуктов)

I- Rr .cunto , j- i¡r .Jala l>3>0, з- íü-.ouii Q, 4- Jír. Jul d 181'» 'Ч' . o vi ö 02, b-ir .ovU Vi, 7- Re .aborWJ jíf, 8- Hr .aber tu ó

9- Вт .laslltOiiJld Ц7 , ю- Tir .nßllLorjJiJ IG2-H,

II- Смесь референтных белков,

12- ï.antarQoolltica Со, 13- 'i .enterocoltticь otj , 14- Y .eut л* oc ol L К i с u (. j, 15- y .enU;r uc oi U i.r,a 08, 16- Y.eiiterocolttica cj , I7-Омесь референтных белков

повили множественные мелкие фракции оелков в геле в зоне относительной подвижности 75...85 в виде диффузно окрашенной области. Штаммы Вт .atiortus имеют обцув фракцию белков с ¡jr 94, но штамм Br.abortud- имеет отличительнуd крупнуо фракции с

ВХ 86.

Установили характерный графический профиль спектра пери-плазматических белков бруцелл различных видов. На основании электрофореграмм и денситограмм составили основные характеристики этих полипептидов у различных атакмов и видов бруцелл. Отмечены видовые и штаммовые отличия периплазмагпческих белков оруцелл.

Б результате сравнительного анализа электрофореграмм и денситограмм разных еедковых систем бруцелл установили отличие белкового состава этих систем. Так, спектр белков каруднух мембран бруцелл отличался от спектров внеклеточных и перпплазмати-ческих белков по качественным и количественным показателям. Однако, спектр белков наружных мембран и спектр экзопродуктов иер'-синий имеют выраженное сходство по молекулярной массе и количественному соотношению отдельных фракций.

Установили, что спектр белков наружных мембран бруцелл имеет болыаус однородность, чем спектр белков экзопродуктов. Отмечается гомогенность белкового состава нарудных мембран видов Br.suis - Вт.orí» - Кг.cania и видов Rr .abortu* - Вт .melltaaais ПО характеру расположения крупных и средних белковых фракций. Экстракт оелков нарулиых меморан бруцелл имеет большее количество общих для всех видов бруцелл полипептидних фракций, чем прочие белковые системы.

Используя установленные характеристики электрофореграмм и денситограмм референтных итакмов Оруцелл в сравнительном аспек-

2 2

> '<> Ъ ь V а 9 'Ю 12^ I у^

"I М-я

! ко

I

1 I

И-

И* 10 20

!- 50 40 г 50

67 -

60 ■ 70 ИЗ 4- 8°

90 100

Рио. 4 Охема белкового спектра экстрактов

наружных мемйран референтных штаммов бруцелл

I- Вх- .оап1<з , 2- Вг.ои;Ы 131» р- Ь,

'I- Рх-..зиДз 5- Ъг.оу1о 02, Гг.этЫ ,

7- Пс 2^7, 6- ?.г .ri-jJ.ii; и п.; 1а 102-Н,

9- Кг .гюИЬепзъз , '1С- .ивсдчиз

11- Гк' .иЬогЪи.з ^ 1Р- ?х? .аЪсгьио 19, 1>- СмеСЬ

белков-референтов, 14 - Осноьние крупные фракции протеинов наружных мемйран оруцелл.

?

те изучили спектр белков эпизоотических штаммов бруцелл, выделенных от животных неблагополучных и оздоровленных от бруцеллеза хозяйств. Установили, что по количественному и качественному составу пептидных фракций эти втаммы обладает высокой степеныа сходства, а по характеру расположения пептидных полос имеют сходство со штаммом Br.abortus G2.

Сравнительный анализ белковых систем клеток бруцелл показал, что их электрофоретичаские профили позволяют проводить идентификации и дифференциации культур рода Brucella на различных уровнях классификации. Б ходе работы созданы теоретические и практические предпосылки для использования белковых спектров бруцелл в качестве таксономических критериев и эпи-зоотологических маркеров.

ВЫВОДЫ

1. Бруцеллез крупного рогатого скота широко распространен в животноводческих хозяйствах ряда регионов Российской федерации и занимает большой удельный вес (12,2;«) в нозологическом профиле инфекционных болезней животных.

2. Возникновение очагов бруцеллеза крупного рогатого с^та в благополучных хозяйствах связано с завозом зараженных бруцеллезом »квотных, а такле с контактом восприимчивых животных на пастбище с поголовьем неблагополучных по данной болезни хозяйств,

3. 'иоктр «ирных киолот разних видов бруцелл имеет общие признаки, позволклаие идентифицировать их на уровне роде.

Количественные показатели жирных кислот и соотношения их разных групп могут быть использованы для видовой дифференциации бруцелл.

Ларти-схемы и математические модели дирнокиолотного состава референтных штаммов оруцелл являются основой идентификации и дифференциации их эпизоотических штаммов.

6. При экстрагировании белковых систем инактивация бруцелл ацетоном или этиловым спиртом повышает в 1,7...2 раза выход белковых фракций, наиболее эффективным для получения фракций периплазматичеслих белков бруцелл является метод тепловой хлороформной экстракции с предварительной обработкой г>^,-нин холодным раствором трихлоруксуснои кислоты.

7, Олектрофоретические профили белковых систем бруцелл имеют выраженные родовые, видовые и штаммовые характеристики и служат основой их идентификации и дифференциации.

3, Использование методов газовой хроматографии и о1>~ПААГ--ДОН позволяет проводить идентификаций и дифференциацию бруцелл на родовом, видовом и внутривидовом уровнях.

9. эпизоотические штаммы бруцелл, выделенные от ливотных в хозяйствах, неблагополучных и оздоровленных от бруцеллеза, по количеству и качественному составу пептидных фракции идентична, а по расположению пептидных полос имеет сходство со штаммом Вт.аЬагсил 62.

Рекомендации "Дифференциальная диагностика бруцеллеза и иерсиниоза и керы по их профилактике" рассмотрены и одобрены на заседании НТО Госагропрома НЗ РОФОР (.1990 г.). изданы в 1991 г.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

ОПИООК 011У Б Ji Л К0БЛН HU X PALOT ПО MATî iP И A ЛАМ ДйОиЬРТАЦЛИ

1. Роль мелких млекопитающих в эпизоотическом процессе при некоторых инфекционных оолезкях в Архангельской ооласти/ /А.Б.Тебекин, В.Ь.1;очнев, Н.Г.Горчакова и др.//Профилактика и лечение заболеваний крупного рогатого скота и свиней: Об. нэуч.тр./НОХИ, Н.Новгород. 1991,- С. 27...34.

2. Дифференциальная диагностика бруцеллеза и иерсиниоза и меры по их профилактике/ В.З.Сочнев, А.Б.Тебекин, Н.П.Ота-рунова, Н.Г.Горчакова и др.//Рекомендации, М.: Г'осагропромиз-дат, 1991,- 27с,

3. ГорчаковаН.Г», Панятков М.А., Рачкова О.Ф, Нетрадиционные методы идентификации оруцелл//'Гез.докл.научно-практ. конф., Смоленск, 1992.- 0. 140*..141,

4. Горчакова Н.Г., Оочнев В.В. К вопросу идентификации и дифференциации бруцелл:Тез.докл.конф.. Н.Новгород, 1992.-

С. 12...13.

5. Григорьева ГЛ., Горчакова Н.Г. Фракционирование клеток бруцелл.: 'Гез.докл.конф., Н.Новгород, 1992.- 0.14.

6. Причины появления прлояительных реакций на бруцеллез в благополучном хозяйстве/ Н.П.Старунова, Ь.В.Оочнев, А.Б.Тебекин, Н.Г.Горчакова,К.П.Елезов// Тез.докл.конф., Н.Новгород,

1992.- 0.13.

Типография НОХЙ. Зак.¿у j ТирЛШ. îc?93