Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Липосомальная форма вакцины против инфекционного ларинготрахеита птиц

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ВЕТЕРИНАРНЫЙ ИНСТИТУТ ПТИЦЕВОДСТВА

На правах рукописи

рг5 од

НОВОСАДЮК Татьяна Владимировна

ЛИПОСОМАЛЬНАЯ ФОРМА ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИНФЕКЦИОННОГО ЛАРИНГОТРАХЕИТА ПТИЦ

Специальность: 16.00.03 - ветеринарная микробиология,

вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Санкт-Петербург 1998

Работа выполнена в лаборатории фармакологии и токсикологии Всероссийского научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства.

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук,

старший научный сотрудник Придыбайло Н.Д.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных

наук, профессор А.Я. Батраков, кандидат ветеринарных наук, доцент Л.Н Соколова.

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии

Защита диссертации состоится ¿V? 1998 г. в 11

часов на заседании диссертационного Совета Д 120.20.02 в Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины по адресу: 196084, г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, д. 5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины.

Автореферат разослан 1998 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор ветеринарных наук, доцент М.В.Шустрова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Инфекционный ларинготрахеит (ИЛТ) — контагиозная вирусная болезнь шнц, характеризующаяся поражением слизистых оболочек верхних дыхательных путей и глаз. Эпизоотический процесс в хозяйстве во многом зависит от технологии содержания, кормления и комплектования птицы. Снижение потерь от заболевания достигается строгим соблюдением ветеринарпо-санитарных мероприятий и проведением специфической профилактики.

Для вакцинации чаще всего используют сухую вирусвакцину из штамма "ВНИИБП". Основной способ ее применения в шицехозяйствах промышленного типа — аэрозольный. Однако после первой вакцинации у цыплят возможна повышенная реактогенность, которая обусловлена им-мунодефицитпым состоянием, вызванным плохими условиями содержания и кормления, а также респираторными инфекциями — колибактери-озом и микоплазмозом. В этих условиях для повышения иммунного ответа на вакцину рекомендуется применять иммуномодуляторы ганппшн (Придыбайло НД. с соавт., 1992) и эфирное масло БАВ-2 (Красников Г.А. с соавт., 1990).

Альтернативным путем повышения иммуногенности и снижения ре-актогенности вакцин является использование липосом. В экспериментальных исследованиях показаны преимущества липосомальнон формы вакцин против инфекционного бронхита, синдрома снижения янцепос-кости-76 и респираторного микоплазмоза (Barbour Е.К., Nevman Y.A., 1990). А недавно в США выдана лицензия на липосомальную инактиви-рованную вакцину против ньюкаслской болезни н реовирусной инфекции, в состав которой включен нммуномодулятор мурамиддипешид (Kumar S., Wallach D.F.H., 1992).

Липосомы — искусственные липидные оболочки, которые благодаря своему сродству с липидной мембраной клетки способны транспортировать в. нее различные антигены, лекарственные вещества, иммуномодуляторы и др.

В то же время имеются данные, которые показывают, что вирус не обязательно заключать в липосомы, а можно ввести одновременно с ним параллельной инъекцией. Эффективность введения обоих вариантов вакцины будет равнозначной или даже выше при параллельной инъекции (Davis D., Gregoriadis G., 1988).

В качестве основного компонента для построения липосом используется фосфатндилхолии (ФХ), который получают из желтка диетических яиц, фосфатидного концентрата сои, микроорганизмов или синтетичес-

ким путем (авридин). В то же время для его наработки может использоваться и более дешевое сырье, а именно желтки от вынужденно убитых птиц или желтки куриных эмбрионов, высвобождаемые в процессе изготовления вирусвакцин для птиц и человека.

Фосфатидилхолип является повышенным источником перскиспого окисления лшшдов (ПОЛ), продукты которого являются токсичными веществами как для макро-, так и для микро-биосистем. Так, повышение концентрации малонового днальдегида (МДА), вторичного продукта ПСШ, значительно снижает эффективность химиотерапии липосомалъными препаратами (Хамитов P.A. с соавт., 1993). В связи с этим система контроля за качеством и эффективностью липосомалышх препаратов должна включать определение содержания в них продуктов ПОЛ.

Целью настоящей работы явилось получение липосомальпой формы сухой вирусвакцины из штамма "ВНИИБП" и применение ее в сочетании с иммуномодуляторами для профилактики ИЛТ.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи :

1. Провести биохимический анализ фосфагидилхолипа, полученного из разных источников сырья : фосфатидного концентрата сои, желтка 9-суточных эмбрионов кур и диетических яиц;

2. Провести сравнительный анализ липосом различного состава в тесте на термостабильностъ по результатам определения продуктов ПОЛ;

3. Изучить влияние иммуномодуляторов тималина, тимогена и гапглиина, инкорпорированных в липосомы, на инициацию процессов ПОЛ при хранении в течении 20 суток при 37,5 ;

4. Дать оценку влияния липосомальпой формы иммуномодулятора, выбранного нами по результатам исследований ПОЛ, на активность лимфоцитов кур ;

5. Изготовить и испытать в экспериментальных и производственных условиях опытную партию липосомальпой формы вакцины из штамма "ВНИИБП" с иммуномодулятором прошв ИЛТ и выдать исходные требования на получение опытной партии вакцины.

Научная новизна. В настоящей работе впервые получены новые данные:

- обоснованное использование липосом с целью усовершенствования сухой вирусвакцины из штамма "ВНИИБП" против ИЛТ;

- изучены биохимические свойства фосфатидилхопина из различных источников сырья и определено его оптимальное соотношение с

другими компонентами в составе липосом;

- с целью прогнозирования в липосомах продуктов ПОЛ предложен

тест ускоренного "старения";

- разработан технологический регламент и получена липосомальная форма опытной партии сухой вирусвакцины из штамма "ВНИИБГГ, которая обладает повышенной иммунологической эффективностью и аре-актогенна, по сравнению с базовой вакциной, изготовленной согласно ТУ 9384-001-00495674-96.

Практическая значимость. Разработалы технологический регламент па получение опытной партии липосомальной формы вакцины и времен-пое наставление по ее применению, утвержденное директором ВНИВИП от 01.04.97 г.

Липосомальная форма вакцины с положительным эффектом испытала на крупнейшей птицефабрике яичного направления.

Апробация работы. Основные положения и результаты исследований заслушаны па итоговых заседаниях методического совета отдела вирусологии и опухолевых болезпей птиц и ученого совета ВНИВИП (1993-1998 г.г.), па межрегиональном научно-производственном коор-дипациоппом совещании "Проблемы ветеринарной профилактики в промышленном птицеводстве" (Петрозаводск — Санкт-Петербург — Ломоносов, 1994 г., Сапкт-Петербург —Ломоносов, 1997-1998 г.г.).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовало 4 научных работы, одна принята в печать в Материалы 10-н Европейской птицеводческой конференции (Иерусалим, Израиль, 21-25 июня 1998 г.).

Структура н объем работы. Диссертационная работа изложена на 118 страницах машинописного текста, содержит 12 таблиц, 3 рисунка и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, собственных исследовании, обсуждения полученных результатов исследований, выводов, практических предложений, списка использованной литературы п приложения. Список использованной литературы включает 139 источников, в том числе 58 иностранных.

обоснование применения липосом для усовершенствования вакцины против ИЛТ, исследован основной компонент построения липосом -фосфатидилхолии, получаемый из различных источников, получена липосомальная форма вакцины из штамма "ВНИИБП" и показаны ее преимущества по сравнению с вакциной, нарабатываемой по утвержденной технологии.

-42. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛВДОВАНИЙ

2.1. Материалы и методы исследований

Диссертационная работа выполнялась в 1992 — 1997 г.г. Она являлась фрагментом Российской научно - технической программы фундаментальных и приоритетных прикладных исследований "Ветеринарная медицина", подпрограмма 03, задание 03.02. 18М "Разработать липосомаль-ную форму применения иммуномодуляторов для повышения эффективности вакцин в птицеводстве" (до 1996 г.) и задание 03.07.М "Разработать технологию изготовления липосомальпой формы вакцины против инфекционного лариншграхеига с иммупомодулятором для повышения эффективности вакцинопрофилактики в птицеводстве" (с 1996 г.).

Основная часть экспериментальных исследовании проведена с участием автора в лаборатории фармакологии и токсикологии и в производственном отделе ВНИВИП, а отдельные фрагменты в лаборатории жировых эмульсий Российского НИИ гематологии и трансфузиологии (РНИИГиТ).

В опытах были использованы 9 - 10-суточные куриные эмбрионы в количестве 1200 шт., цыплята разных возрастных ipynn яичных кроссов "Заря-17" и "П-46" в количестве 87534 головы, в том числе в производственных условиях крупной птицефабрики - 87200 цыплят яичного кросса "П-46" .

Для экенриментальных и производственных исследований цыплят подопытных и контрольных групп подбирали по принципу аналогов. Птиц в условиях вивария института содержали в клеточных батареях типа БКМ-ЗБ. Кормление осуществляли согласно рекомендациям по нормированному кормлению сельскохозяйственной нтицы (МСХ СССР, 1983г.).

Обобщение и анализ итоговых результатов экспериментальных и производственных исследований выполнены автором самостоятельно.

Основной компонент липосом — фосфатидилхолип (ФХ) получали из желтка 9 —10 суточных куриных эмбрионов, которые были использованы в производственном отделе для наработки культуры клеток куриных эмбриональных фибробластов, и диетических яиц (ФХЯ), а также из фосфатидного концентрата сои (ФХС) по методу этанальной экстракции, разработанному в лаборатории жировых эмульсий РНИИГиТ. Здесь же совместло определяли основные биохимические характеристики ФХЯ и ФХС.

Качество ФХ, полученного методом лшшдной этапольной экстракции, сравнивали с требованиями Минздрава СССР, предъявляемыми к этому препарату, полученному другими методами (A.c. N 773993).

При построении липосом кроме ФХ использовали также холестерин (ХС), изготовленный заводом медицинских препаратов АООТ "Самсон" (г. Санкт-Петербург), и антпокспдапт а-токоферол, производства фирмы "Serva" (ФРГ). Соотношение ФХЯ и ХС составляло 77,8:22,2%, а при добавлении к ним а-токоферола с целью стабилизации ПОЛ 75,0:23,9:1,1%. Лнпосомы, приготовленные пз ФХС, содержали кроме этого кислые фосфолипиды (КФ), что сразу придает им окисленпуто форму. Их состав по ФХС, КФ, ХС и а-токоферолу был следующим : 67,4:9,5:22,0 и 1,1%.

Липосомы получили в стерильных условиях пленочным методом (Шанская А.И. с соавт., 1994).

Отдельно готовили липосомы, в которые вместе с сорбит-фосфатным буфером добавляли иммуномодуляторы тималин, шмоген и ганглиин в количестве 8; 0,8 и 20 мкг/мл соответственно.

Тималин и тимоген изготовлены заводом медицинских препаратов АООТ "Самсон" (г. Санкт-Петербург), а гапглиин — НПО "Биомед" (г. Пермь).

Приготовленные липосомы, не содержащие а-токоферола и иммуно-модуляторов, были контрольными ("пустыми").

В связи с повышенной окисляемоегью липосом при длительном хранении, а также включением в них нммуномодуляторов, проводили определение на спектрофотометре СФ-16 показателя D для первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов (ЦК) при длине волны 233 пм, коэффициента окисленпости (Кок), определяемого соотношением D 233/ 215 или D 268/215 и выраженного в ед., и вторичных продуктов ПОЛ — малопового диальдегнда (МДА) при D 535пм (Владимиров Ю.А., Арча-ков А.И., 1972).

Стабильность липосом изучали по ускоренному тесту термоинактивации, рекомендованного экспертами ВОЗ для оценки биопрепаратов. С этой целью липосомы хранили в термостате при 37,5®С различные сроки, определяя в них уровень ДК, Кок и МДА, а в случае включения вируса ИЛТ - только его биологический титр.

Оценку влияния липосомальной формы ганглнина, который по результатам определения ПОЛ был лучшим, на иммунный ответ проводи-

ли in vitro Iio E-POK. (A.c. N 1585948).

В экспериментальных условиях были получены 2 микросерии липо-сомальной формы вакцины нротив ИЛТ из штамма "ВНИИБП" по разработанной нами технологии.

Лиофилизацию лнпосом осуществляли на установке ТГ-16 после предварительного замораживания в жидком азоте путем выпаривания водной фазы растворителя под вакуумом до получения сухого порошка через 59 - 62 часа.

Первый вариант вакцины состоял из лнпосом и вакцинного вируса, во втором — кроме этих составляющих включеп иммуномодулятор ran и шин.

Контролем служили две промышленные серии вирусвакцины (N61 и N 62), которые были лиофшшзированы в условиях, идентичных наработке экспериментальных микросерий вакцины. Биологическая активность всех вариантов вакцин до и после термостатирования была определена в трех повторностях.

В экспериментальных условиях изучена антигенная активность и им-муногенпые свойства приготовленной микросерии липосомальной формы и контрольной вакцин против ИЛТ на цыплятах 35-дневного возраста кросса "Заря-17'-'. В опыте находилось 154 головы, которые были разделены на 8 групп. Апробированы различные варианты их применения, включая и иммуномодулятор ганглии.

Распыление вакции осуществлялось генератором САГ-1 в экспериментальной камере объемом 10 м^.

Техника аэрозольной и окулярной вакцинации и расчет рабочего разведения вакцин проведены в соответствии с наставлением по применению сухой вирусвакцины из штамма "ВНИИБП" против ИЛТ, утвержденной ГУВ МСХ СССР от 12.11.91 и Департаментом ветеринарии МСХП РФ от 09.10.96.

Для оценки гуморального иммунитета в сыворотке крови, взятой до и через 14 суток после иммунизации, перед заражением полевым вирусом, а так же у контрольной птицы, определяли титр в реакции нейтрализации (РН) и реакции непрямой геммаглютинации (РНГА). РН осуществляли на куриных эмбрионах по общепринятой методике, РНГА - с эритрощтгарным диагностикумом, изготовлегашм в Институте экспериментальной клгаш-ческой ветеринарной медицины УААН.

В процессе проведешм опыта учитывали реакцию на введешь вакцин и полевого вируса ИЛТ, клшшческое состояние, заболеваемость и гибель

по группам, с последующим патологоапатомическпм исследованием павшей птицы.

Через 14 суток после вакцинации цыплят всех групп заражали вирулентным штаммом "24а" вируса ИЛТ в дозе 1000 ИД50 в 0,2/ мл иптра-трахеальпо.

Об эффективности липосомальной формы вакцины против ИЛТ отдельно и в сочетагаш с иммуномодулятором судили по показателям РН, РНГА и устойчивости к заражению вирулентным вирусом, которую оценивали коэффициентом корреляции (г) и уровнем достоверности (р).

В комиссионном опыте по исследованию иммупогеппости полученной липосомальной формы вакцины, проведенном по программе, утвержденной приказом директора ВНИВИП N 38 от 11.09.95г., использованы 9 групп цыплят 35-дневного возраста яичного кросса "Заря-17", по 20 шлов в каждой группе. Методика его проведения и учета результатов исследовании соответствовала вышеописанпому лабораторному эксперименту. Дополнительно на 7 - 8 и 14 - 15 сутки после вакцинации исследовали клеточный иммунитет методом Е-РОК и неспецифическую резистентность по показателям фагоцитоза.

После проведения комиссионных испытаний в производственном отделе ВНИВИП были изготовлены опытная партия липосомальной формы вакцины (N1 от 21.07.97 г.) и промышленная серия вакцины (N105 от 22.04.97 г.).

По решению Департамента ветеринарии МСХП РФ N134-22 от 11.10.96 г. на АОЗТ птицефабрика "Синявинское" Ленинградской области в период с 12.08 по 5.10.97 г. проведен комиссионный опыт на 87,2 тыс. цыплят яичного кросса "П-46". Методика исследований в производственных опытах была идентична вышеописанной при проведении экспериментального и комиссионного опытов в виварии института.

Статистическая обработка результатов исследований включала вычисление средней арифметической величипы (М), ошибки средней арифметической величины (т), границ доверительных интервалов, уровня достоверности - р (Плохинский H.A.., 1980).

2.2. Сравнительная характеристика ФХ,

полученного из различных источников сырья

В сравнительном аспекте изучили основные биохимические характеристики ФХ, полученного из желтка 9-10-суточных эмбрионов кур и диетических яиц, которые использованы для наработки культуры клеток, а также из фосфатидного концентрата сои (табл. N1).

Таблица 1.

Качественный и количественный состав фосфатидилхолнна,

полученного из различных источников сырья

Наименование Требования к ФХ, утвержд. ФХЯ ФХС

показателей Минздравом СССР Эмбрионы 9-10-суточные Диетические яйца

Выход ФХ из фосфолипи-ДОВ,% Содержание фосфора,% 65,0-75,0 3,2-3,8 70,0 3,64 69,5 3,65 68,9 3,5

Содержание азота,% 1.5-1,9 1,5 1,5 1,5

Перекнсное число йода,"??) 0,02-0,14 0,05 0,08 0,1

Содержание кефадина,% 12,0-16,0 15,5 69,5 16,2

Содержание остаточного ацетона,% Поверхностное натяжение, дин/см2 Содержание свободных жирных кислот, мк экв/г Жирнокислотньш состав, отсутств. отсутств. 21,3 1,5 отсутств. 22,9 1,5 отсутств. 15,2 1,4

Миристиновая Миристолеиновая Пальмитиновая Пальмитоле ино вая Олеиновая Линолевая Линоленовая Арахидоновая Докозагексаеновая С14=0,5 С15_о следы с16=о=42.1 С = 4,7 48=1-33,3 С18=2=10,4 С |8=з следь| С20=4=5-2 С22=б=3,9 с14=о,з С,5=0,1 С16=0=40,2 С]8=0=4-6 С18=1=35'5 С18=2=1°.4 С^-з следы С20=4=4,8 С22=6=3,5 С16=0=16.5 С18=0=3>2 С18=1=6,0 с18=2=65'5 С18=3=8'8

По большинству изучаемых показателей ФХ из желтка яиц и эмбрионов (ФХЯ) и фосфатидного концентрата сои (ФХС) имели равнозначные показатели, которые соответствовали требованиям, предъявляемым Минздравом СССР к получаемому ФХ. В то же время величина межфазового поверхностного натяжения (дин/см^) и жирнокислотньш состав (%) у ФХС и ФХЯ имели значительные различия, что сказалось на качестве получаемых липосом.

Показатель межфазового патяжения у ФХЯ был выше (21,3 п 22,9 дин/см^), по еравпешпо с таковым у ФХС (15,2 дин/см^), поэтому для получения сравнимых по диаметру везикул на основе соевого и яичного ФХ в случае последнего необходимы более жесткие условия ресуснен-дирования плепки и последующего диспергирования. В свою очередь это может приводить к значительному окислению фосфсшиппдов яичио-го желтка, которые являются весьма лабильными соедиепнями из-за своей более высокой непасыщенпости.

По данным проведенного апализа жирнокнслотного состава фосфо-липидов желтка 9-10-суточных эмбрионов и диетических яиц в состав тех и других входят арахидоновая (С2о=4) и дскозагексаеновая (С22=б) кислоты, значительно увеличивающие аутоокисляемость фосфолипидов. В ФХС они отсутствуют.

Особенно высокий уровень в ФХС приходится на липолевуго и лино-леновую кислоты (65,5% и 8,8%), в то время как в ФХЯ их количество ие превышает 11%. Накопленный экспериментальный материал свидетельствует об исключительной важности этих кислот для живых клеток (Рабинович АЛ., Ршшатти П.О., 1994).

На оспове анализа литературных источников для работы были выбраны лнпосомы следующего состава: в первом варианте ФХЯ, ХС и а-токоферола в соотношении 75,0:23,9:1,1%, во втором варианте ФХС, КФ (кислые фосфолипиды), ХС и а-токоферол - 67,4:9,5:22,0 п 1,1%.

2.3. Получение и исследование липосомальной формы

иммуномодуляторов

Важным подготовительным моментом для конструирования линосом па основе ФХС и ФХЯ явился подбор дисперсионной среды. Были испытаны физиологический раствор и сорбит-фосфатный буфер (СФБ). Исследования продуктов ПОЛ до термостатирования и после па протяжении 21-суток при температуре 37,5®С показало, что при использовании физиологического раствора, несмотря на высокий уровень в его составе а-токоферола (2,4%), количество ДК начиная с 2-6-х суток увеличивалось в 2-3 раза, в то время как при применении СФБ с 1% а-токоферола этот показатель до конца исследования оставался стабилъ-пым. В отличие от ДК, уровень МДА для физиологического раствора возрастал в 3-5 раза, а СФБ без а-токоферола в 1,5 - 2 раза.

Последующее приштовлише штосом проводили только на СФБ. Включение в лнпосомы на основе ФХЯ и ФХС иммуномодуляторов тамалина, тимогена и гапглнина соответственно в количестве 8; 0,8 и 20 мкг/мл приводило к изменению показателен ПОЛ. Изначальный уровень ДК и Кок в липосомах на основе ФХС был в 1,5-2 раза выше, чем в липосомах

па основе ФХЯ. Показатели МДА были равнозначные, за исключением опыта с ФХЯ, в котором в них пе включали а-токоферал. В этом случае концентрация МДА для всех иммупомодуляторов возрастала в 7-10 раз. Но при хранении более стабильны липосомы на основе ФХС.

По результатам термостатирования липосомальной формы иммуно-

модуляторов при температуре 37,5^С в течение 20-и суток установлено, что добавление к соевому ФХ гангаиина в присутствии а-токоферола приводит к увеличению ДК и Кок (р<0,05) на 10- и 20-е сутки, а МДА — только на 20-е сутки (р<0,01). Тималин и тимоген но всем изученным показателям вызывают значительно большее их увеличение. Поэтому для включения в липосомы, содержащие вирусвакцину ИЛТ, бьи выбран ганглиин.

Используемый нами тест "старения" липосом показал, что с его помощью можно прогнозировать изменения количества продуктов ПОЛ, тем самым проводить направленный подбор компонентов для их построения, включая и вирусосодержащий материал. Подобная методика контроля получаемых препаратов по количеству продуктов ПОЛ используется в последнее время и другими авторами (Порываев В Д., Зыкова Н.А., 1995).

Исследование иммупомодулирующих свойств липосомальной формы ганшиина показало, что одни липосомы пе вызывают увеличения количества Е-РОК. Ганшиин увеличивает это показатель. Еще боле выраженным эффектом (синерщцным) обладает его липосомальная форма.

2.4. Разработка технологической схемы производства

опытной партии липосомальной формы вакцины

При разработке технологической схемы получения экспериментальной микросерии и опытной партии липосомальной формы вакцины против ИЛТ за основу взяли утвержденную НТД для сухой вирусвакципы из штамма "ВНИИБП".

Технические условия при изготовлении липосомальной формы вакцины (внешний вид, правила приемки, проверка иммуногенности, стерильности, биологической активности и др.) были такие же, как при наработке сухой вирусвакципы из штамма "ВНИИБП". Принципиальным яляется замена принятой защитной среды высушивания на липосомы, включающие ФХС, КФ, ХС и а-токоферол в соотношении 67,4:9,5:22,0:1,1. В экспериментальные микросерии кроме того включали ганглиин в количестве 200 мг/мл вирусной суспензии.

Разработанная технологическая схема получения липосомальной формы сухой вирусвакцины из пггамма "ВНИИБП" представлена на рис. 1.

Рис I.

ТЕХНОЛОГИЧЕСКАЯ СХЕМА ПРОИЗВОДСТВА ОПЫТНОЙ ПАРТИИ

ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЫ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ИЛТ

Примечание: ВР - вирусологические работы, ТП - технологический процесс, УМО - упаковка, маркировка, отправка.

-122.5. Экспериментальные и производственные исследования липо-сомальной формы вакцины из штамма "ВНИНБП" против ВШТ

По вышеописанной схеме были наработаны две экспериментальные микросерии липосомальной формы вакцины. Они имели биологическую активность несклько ниже (на 0,38 и 0,21 ЭЙД5о/Ш1), чем обычная вакцина. После хранения при температуре 2 - в течение 1 года эта разница была еще меньше (0,2 и ОД ЭИДзод^). Испытания в ускоренном тесте "старения", рекомендованом ВОЗ для биологических препаратов, показали, что термостабильные свойства липосомальной формы вакцины были значительно выше (потеря титра на 0,43 и 0,84 ЭИД5о/№1), по сравнению с обычной вакциной (1,91 и 1,26 ЭЩ^о/цд).

Включение гангаиипа в обе вакцины снижало биологический титр вакцин, особенно вакцины, нарабатываемой для производственных целей.

Испытания липосомальной формы вакцины на цыплятах при однократной аппликации аэрозольным методом в дозе 3 ЭИД50 на голову, с последующим контрольным заражением эпизоотическим штаммом "24а" вируса ИЛТ, дают основание утверждать об отсутствии реактогенных свойств и наличии повышенной иммунологической защиты (г = -0,55), по сравнению с производственной вакциной (г = -0,42). Включение ганшиина в липосомальную вакцину не усиливает защитный эффект. Производственная вакцина при включении в нее на стадии изготовления галглиина вызывает иммунологический эффект на уровне липосомальной вакцины (г = -0,55), а при сочетанием введении с ганпшином окулярным методом и выше (г=-0,73). Индекс нейтрализации вакцинного вируса был самым высоким при введении липосомальной формы вакцины с ганглшшом (2,2 ед.) и промышленной вакцины, вводимой окулярным способом в сочетании с лип ос омами (2,5 ед.).

Проведенная комиссионная апробация подтвердила результаты вышеописанного эксперимента. При аэрозольном и окулярном методе введения г = -0,61 и -0,65. Включение ганшиина в липосомальную форму вакцины или его сочетанное введение с вакциной не изменяло показателя иммунологической защиты, в аналогичном случае для производственной вакцины он был несколько выше (г= -0,69 и -0,70).

Исследования гуморального иммунитета по уровню титров в РИГА и клеточного иммунитета по количеству Е-РОК (%) не выявило достоверных различий у сравниваемых вакцин и при различных методах их применения. В то же время при использовании липосомальной формы вакцины и ее в сочетании с ганглшшом у цыплят на 14-е сутки отмечены повышенный процент фагоцитоза, фагоцитарого числа и фагоцитарного индекса. В соответствии с исследованиями авторов, проведенными на других объектах (Гольбец И.И. с соавт., 1983, Часовикова Л.В. с соавт.

-131992), механизм повышенного защитного эффекта липосомалънон формы вакцины против ИЛТ можно связывать с усилением фагоцитоза.

Интересным является установлешшй факт усиления защитного действия обеих вакцин при сочетанном (раздельном) введении с иммуномо-дулятором ганглинном.

Особенно эффективным оказалось сочетанное введение обеих вак-цип с липосомами окулярным методом. Механизм повышеппой защиты при этом можно объяснить высоким содержанием фосфолипидов в оболочках глаза и ролыо местного клеточного иммунитета в слизистой верх-пих дыхательпых путей птиц (Vadalas et ol, 1989, Fahey K.Y., York Y.Y., 1990). Аналогичный результат, как известно, получен па примере использования липосом и столбнячного апатоксина (Davis D., Gregoriadis G., 1988).

Результаты производственного испытания липосомальной формы вакцины из штамма "ВНИИБП" против ИЛТ, проведенные в условиях круп-, пой птицефабрики, с последующим контрольным заражением эпизоотическим вирусом (пггамм "24а") в условиях вивария института представлены па таблице 2.

Таблица 2..

Сравнительная эффективность применения опытной партии липосомальной формы и производственной серии вакцины против ИЛТ

N Ватины К-во голов Заболело г Р

группь Всего В т.ч. пало

1 "ВНИИБП" 20 5 1 -0,65 <0,05

2 Линосомальная форма 20 2 -0,80 <0,05

3 Лнпосомальная форма + тималнн 20 2 -0,80 <0,05

4 Невакцинирован-ный зараженный контроль 20 18 3 -

Как видно из данных табл. 2, линосомальная форма вакцины дает повышенную защиту (г=-0,80), по сравнению с вакциной из этого же штамма (г=-0,65), наработанной согласно ТУ-9384-001-00495674-96.

Поствакцинальной реакции у цыплят, иммунизированных липосомальной формой вакцины "ВНИИБП", не наблюдали. В этих группах

вакцинация не влияла отрицательно на рост и увеличение живой массы цыплят.

Включение пммуномодулятора тималина в липосомальную форму вакцины пе приводило к усилению иммунологической защиты.

Полученные данные дают основание для разработки НТД на опытно-промышленную партию липосомальной формы вакцины из штамма "ВНИИБП" против ИЛТ.

ВЫВОДЫ

1. Источником получения фосфатидилхолина (ФХ) - основного компонента построения липосом, наряду с желтком диетических яиц может быть и желток куриных эмбрионов, оставшийся после наработки биологических препаратов. ФХ, полученный из фосфатидного концентрата сои, по сравнению с ФХ из желтков, имеет лучшие мицилообразующие свойства. Он содержит высокий уровень лшюлевой и линоленовой кислот (74,3% против 11% у ФХ из желтков) и в нем отсутствуют арахидо-новая и докозагексаеновая кислоты, обладающие повышенной аутоо-кисляемостью, что важно при технологии получения и хранения липо-сомальных препаратов.

2. Для прогнозирования в липосомах на основе ФХС и ФХЯ накопления продуктов ПОЛ (ДК и МДА) предлагается использовать тест ускоренного "старения" (храпение при t 37, в течение 21 суток).

3. Включение в липосомы иммупомодуляторов тималина,тимогена или ганглиина в количестве 8, 0,8 и 20 мкг/мл, с последующим хранением в термостате при t 37,5®С в течение 20 суток, приводит к увеличению ДК, Кок и МДА. При этом ганглиин, по сравнению с тималином и тимогеном, вызывает образование меньшего количества продуктов ПОЛ.

4. Ганглиин, заключенный в липосомы, обладает повышенными им-муномодулирующими свойствами, так как количество Е-РОК в лимфоцитах крови цыплят (in vitro) было значительно больше, по сравнению с применением одного ганглиина или липосом.

5. Разработан технологический регламент и получена опытная партия липосомальной формы сухой вирусвакцины из штамма "ВНИИБП" против ИЛТ. Хранение ее и сухой вирусвакцины из штамма "ВНИИБП", наработанной по утвержденной НТД, в течение года при температуре 2

не выявило существенной разницы в потере биологической активности (на 0,17 - 0,2 lg ЭИД50/МЛ, против 0,35 и 0,26 lg ЭИП.50/мл)- При испытании в рекомендованном ВОЗ тесте ускоренного "старения" после

7 суток храпения титр вируса у липосомальной формы вакцины снизился па 0,43 - 0,84 lg ЭИД5о/мл, а у вакцины, наработанной по утвержденной НТД, значительно больше (па 1,26 - 1,92 lg ЭИД50/11Л). Повышенная термостабильность липосомальной формы вакцины может иметь важное значепие для практики.

6. Липосомальпая форма вакцины из штамма "ВНИИБП" против ИЛТ является ареактогенной для цыплят при аэрозольном методе примепе-пня и повышает иммунологическую защиту при контрольном заражении эпизоотическим вирусом, штамм "24а" (коэффициент корреляции г с обратным зпачепием составил 0,51 - 0,65), по сравнению с вакциной, наработапной по утвержденной НТД (г=-0,42 и -0,43). Окулярное назначение липосомальной формы и обычной вакцины, а также их в сочетании с ганглшшом еще более эффективно (г=-0,65 и -0,70).

7. Механизм повышения иммунологической эффективности липосомальной формы вакцины из штамма "ВНИИБП" против ИЛТ заключается в усилении вируснейтрализующей активности и процесса фагоцитоза (процент фагоцитоза, фагоцитарное число и фагоцитарный индекс).

8. Липосомальпая форма сухой вирусвакцины из штамма "ВНИИБП", применнепная аэрозольным методом в крупном птицеводческом хозяйстве яичного направления в соответствии с утвержденной временной инструкцией и разрешением Департамента ветеринарии МСХП РФ, не вызвала у цыплят поствакцинальной реакции и после контрольного заражения в условиях вивария эпизоотическим вирусом ИЛТ гнтамм "24а", создает более высокую иммунпую защиту (г= -0,80), по сравпепию с вакциной из этого же штамма (г= -0,65), наработапной согласно ТУ-9384-001-00495674-96.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

На основании проведенных исследований предложены:

1. Технологический регламент на изготовление и временное наставление по применению опытной партии липосомальной формы сухой вирусвакцины из пгтаммма ВНИИБГГ* против ИЛТ, утвержденное директором ВНИВИП.

2. Липосомальпая форма сухой вирусвакцины нз штамма "ВНИИБП" с положительным результатом применена на большом поголовье крупного птицеводческого комплекса.

3. Предложенный состав и технология получения липосом могут быть использованы для наработки на их основе других биологических и хи-миотерапевтическнх препаратов, применяемых в ветеринарии.

ПУБЛИКАЦИИ АВТОРА

1. Придыбайло НД., Шанская А.И., Булушева Е.В., Яковлева Т.Е., Старицина H.H., Недачина H.A., Новоеадюк Т.В. Сравнительная характеристика лецитинов, получаемых из различных нсточников//Проблемы ветеринарной профилактики в промышленном пгацеводстве: Тезисы докл. межрег. научно-нроизв. коорд. совещ. Петрозаводск - Санкт-Петербург - Ломоносов, 1994. - С. 23.

2. Придыбайпо НД., Шанская А.И., Пучкова С.М., Булушева Е.В., Яковлева Т.Е., Новое адюк Т.В. Изучение липосомальных препаратов в тесте на термостабильность//Проблемы ветеринарной профилактики в промышленном птицеводстве: Тезисы докл. межрег. научно-нроизв. коорд. совещ. - Петрозаводск - Санкт-Петербург - Ломоносов, 1994. - с.24.

3. Шанская А.И., Придыбайло НД., Булушева Е.В., Пучкова С.М., Яковлева Е.Е., Новосадюк Т.В., Якушева Л.Н. Исследование иммуномо-дуляторов, инкорпорированных в липосомы// Проблемы ветеринарной профилактики в промышленном птицеводстве: Тезисы докл. межрег. научно-нроизв. коорд. совещ. - Петрозаводск - Санкт-Петербург - Ломоносов, 1994. - с. 26 - 27.

4. Шанская А.И., Придыбайло НД., Булушева Е.В., Пучкова С.М., Яковлева Т.Е., Новосадюк Т.В., Якушева Л.Н. Характеристика иммуно-модуляторов, инкорпорированных в липосомы//Проблемы ветеринарной профилактики в промышленном птицеводстве: Тезисы докл. межрег. научно-произв. коорд. совещ. - Петрозаводск - Санкт-Петербург - Ломоносов, 1994. - с. 31 - 32.

ТЪе liposome Vaccine against biid infectiouns laiyngotracheitis/lOth European poultry Conference Ierusalem, Israel, 21 - 26 June 1998. Принято к печати.