Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммунобиохимическая характеристика крови птицы при применении инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза

□ □3

ОРЕХОВ ДМИТРИЙ АНДРЕЕВИЧ

на правах рукописи //

ИММУНОБИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КРОВИ ПТИЦЫ ПРИ ПРИМЕНЕНИИ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ КОЛИБАК ГЕРИОЗА

Специальности 16 00 03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология 03 00 04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

О 6 МАР 2008

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 2007

003165034

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии и кафедре биологической химии ФГОУ ВПО "Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины"

Научные руководители:

доктор биологических наук Сухинин Александр Александрович доктор ветеринарных наук, профессор Конопатов Юрий Васипьевич

Официальные оппоненты:

доктор биолошческих наук, профессор Розенгарт Евгений Викторович докгор ветеринарных наук, профессор Калишин Николай Михайлович

Ведущая организация - ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный инеттут птицеводства»

Защита диссертации состоится «22» февраля 2008 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220 054 03 при ФГОУ ВГ10 "Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины" по адресу 196084 Санкт-Петербург, Черниговская ул, 5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО "Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины"

Автореферат разослан

года и размещен на сайте

ЬПр //spbg'dvm ги « » '¿ь&уа 2008

I

Учёный секретарь диссертационного совета докгор биологических наук, профессор

Ьелова Л М

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИС1ИКА РАБОГЫ

Актуальность темы. Колибактериоз птиц - инфекционная болезнь всех видов и возрастов птиц, которую в большинстве случаев можно охарактеризовать, как септицемию Возбудителем является патогенная Escherichia colt (Кэлнек Б У , 2001)

Болезни, вызываемые энтеробактериями, являются одной из ключевых проблем иромьшпенно! о птицеводства Концентрация огромною числа особей в одном помещении приводит к стрессовым состояниям, что усиливает вирулентность }словно-патогеннои микрофчоры, и, как следствие, развитие инфекционного процесса (БочкарЬв ВН, 1992, Виноходов ВО 2000, Соколова ЛН и др, 2005, Кузьмин В А и др , 2006, Джавадов Э Д, 2006, Борисенкова А Н , 2007)

В комплексе мер борьбы с инфекционными болезнями, включающими соблюдение петеринарно-санитарных правил, усчовий содержания и кормления, вакцинопрофилактика занимает ведущее место (Соколов В Д, 1989, Садовников Н В , 1995, Бурдейныи В В , 1998, Бакулин В А , 200о) Для профилактики колибактериоза в настоящее время применяются вакцины инактивированная вакцина против колибактериоза птиц вакцина инактивирочанная сорбированная против колибактериоза птиц, ассоциированная инактивированная сорбированная вакцина проз ив колибактериоза и пастереллеза птиц (Романов Е А, 2005) Имеется много сообщений об успешном приготовлении и применении инактивированных вакцин против колибактериоза тип из серошпов 078 К80 и 02 K1 (Aip L Н, 1987, Lynne А М et al, 2006, Виноходов В О , 2000)

В технологии изютовления инактивированных вакцин одно из главных мест отводится блокированию инфекционной активности микроорганизмов С этой целью наиболее широко применяется формалин Однако, одним из возможных подходов к решению вопроса инактивации возбудитетя может быть использование азиридинов, а именно аминоэтилпиленимина (АЭЭИ) (Бородина ОВ, 2005, Ширяев ФА, 2005, 1'усалеев В С , 2005)

При изготовлении инактивированной вакцины против колибактериоза в качестве адъюванта применяют гидроокись алюминия, которая наряду с положительными показателями имеет и ряд недостатков В тоже время многочисленные исследования показали целесообразность использования о качестве адъюванта липосом, так как вакцины на их основе обладают более выраженной безвредностью, антигенной и

иммуногенной активностью (Шанская А И и др,1997, Сухинин А А, 2003, Придыбайло Н Д и др , 2006)

Цель исследований - разработка инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза кур и изучение иммунобиохимических характеристик крови при ее применении

Для достижения цели были поставлены следующие задачи -разработать режим инактивации Е coli, используя аминоэтилэтиленимин, -изготовить эксперименгальчые образцы ииактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза кур,

-сравнить биологические характеристики инактивированнои липосомальной вакцины и гидроокись алюминиевой формолвакцины против колибактериоза чур,

-определить иммунизирующую дозу, напряженность и про, юл ж иге т ьн ость иммунитета после применения вакцины на цыплятах,

-определить влияние инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза кур на иммунобиохимические показатели сыворотки крови к\р

Научная новизна работы. В результате проведённых исследований нами впервые определены оптимальные параметры и режим инактивации Е coli аминоэти чэтиленимином

Впервые разработана экспериментальная инактивированная липосомапьная вакцина против колибактериоза птиц с использованием штамма Е colt К°389 (078) полученного из ФГУ "ВГНКИ" Показано, что данная вакцина безвредна, обладает выраженной антигенной и иммуногенной активностью Установлено, что после вакцинации липосомальной вакциной содержание общего белка, гамма-гтобулинов, а также титр специфических антител в сыворотке крови цыплят увеличивались в динамике и были достоверно выше, чем при иммунизации гидроокись алюминиевои формолвакциной Получено положительное решение формальной экспертизы по заявке на патент РФ № 016893 от 11 07 2007 (приоритет от 25 04 2007) Практическая значимость работы.

Разработана эффективная экспериментатьная инактивированная липосомапьная вакцина против колибактериоза на основе штамма Е coli N°389 (078)

На основании полученных результатов разработана нормативно-техническая документация по изготовлению и контролю инактивированной липосомальной вакцины против кочибактериоза кур

Материалы диссертации используются в учебном процессе по курсу "Ветеринарная микробиология и иммунология" и курсу "Биологическая химия" в Ф1ОУ ВПО 'Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины"

Апробация работы Основные материалы исследований диссертационной работы дочожены и обсуждены на

I Всероссийской научно-практической конференции "Ветеринарная медицина -

теория, практика и обучение" (Санкг-Петербург, 2006, 2007), 1 _ Научно-практической конференции "Болезни птиц в промышленном птицеводстзе Современное состояние проблемы и стратегия борьбы" (Санкт-Пегербург, 2007),

J Международном научно-практическом конгрессе "Актуальные проблемы ветеринарной медицины" (Санкт-Петербург. 2007) Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ Основные положения, выносимые на защиту-

1 Способ инактиьации Е сок аминоэтилэтиленимином

2 Использование липосом при конструировании вакцины против кочибактериоза кур

3 Влияние инакпивированной липосомальной вакцины против колибакгериоза на иммунобиохимические характеристики крови цыплят

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах и содержит следующие разделы введение, обзор литерагуры, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения Список использованных литературных источников включаег 224 наименования, в том числе 100 рабог зарубежных авторов Работа иллюстрирована 7 рисунками и 12 1аблицами В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих резучьгаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Экспериментальна часть работы была выполнена в течение 2004 - 2007 гг на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунолотии и кафедре биоло1 ической химии ФГОУ ВИО "Санкг-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины"

Штамм микроорганизма. В работе использовали штамм Escherichia colt №389 (серовар 0-78), полученный из Ф1*У ' ВГНКИ" (г Москва)

Подопытные животные В экспериментальных исследованиях были использованы ?8-сут цыплята кросса "Ралонит" Определена безвредность, антигенная и иммуногелнал активность инактивированной пипосомальной вакцины проанализирована динамика изменений содержания общего белка и белковых фракций в сыворотке крови птицы после вакцинаций

Вирулентность культуры Е colt определяли пугйм постановки биопробы на белых мышах в соответствии с методическими указаниями Минсельхоза России (2000)

Питательные среды, кратки При проведении исследований применяли общепринятые питательные среды и краски Для культивирования кишечной палочки использовали МГ(А, МГ1Б

Проведение инактивации. Для отработки режима инактивации возбудителя Е coh аминоэтилэтиленимин вносили в бактериальную суспензию, исходя из концентрации бактерий в определенном объеме, а также процентного содержания основного активного вещества в водном растворе инактиванта.

Характеризуя кинетические закономерности гибели микроорганизмов, производили расчет постоянной (константы) скорости инактивации (к) но формуле экспонент ы (Мейнелл Д, Мейнелл Э 1967)

К- константа скорости инактивации (ч"1).

Т- время инактивации (ч),

Хо- исходная концентрация живых микробных клеток (Ig KOE/cmj),

X, - остаточное количество живых микробных клеток КОЕ/см3), отсюда

к = 2,3/1х — X,

С учетом показателя к производили расчет времени инактивации микробной суспензии (0 до определенного уровня остаточного вирулентного материала по формуле (Мейнелл Д , Мейислл Э , 1967)

2,3^(дг„р /х0)

»=-----, 1де

к

К- константа скорости инактивации (ч"'), Т- время инактивации (ч '),

Х0— исходная концентрация живых микробных клеток С1ц КОЕ/ом3), - про] нозируемая концентрация живых микробных клеток после инактивации (I® КОЕ/см3),

Определение концентрации микробных клеть-. Количество КОЕ в бактериальных суспензиях определяли визуально по стандарту (эталону) мутности, ч соответствии с инструкцией по применению, и путём выееча на плотные питательные среды

О вирулентности штамма кишечной палочки для мышеи и кур судили по /..Оте и выралсали в КОЕ/мл Бетых мышей заражали подкожно, а кур вИугрибрюшинно в объеме 0,5 см3 десятикратными разведениями (Ю'-Ю 9) суточных бульонных культур кишечной палочки в забуферном физиологическом растворе

Световую микроскопию бактериальных клеток проводили под окуляром микроскопа марки МБИ-15 "Биолам" при увеличении х700 раз в мазках, фиксированных на предметном ст екле и окрашенных различными методами

Электронно-микроскопическое исследование нативных и инактивированных бактерий проводили методом позитивного окрашивания уранилацетатом Препараты просматривали в трансмиссионном электронном микроскопе ШМ-100С (1ЕОЬ, Япония) при ускоряющем напряжении 100 кв

Методы бактериологических исследовании.

С целью выделения микроорганизмов рода Escherichia, после заражения вакцинированных и не вакцинированных тип, проводити морфологические, культуральные, иммунобиохимические, серологические иссчедования куль'ур Е coh в соответствии с «Методическими указаниями по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) живошых» (2000)

Методы получении и контроля лабораторных серий шмкггивированной вакцины.

Опытные серии жидкой формы моновалентной инактивированной лииосомальной вакцины были приготовлены из антигенов клеток Е coli штачма Мв389 (078), инактивированных формальдегидом, или 2% раствором аминоэтилэтиченимина, в течение 24 часов при температуре 37°С и соединенных с адъювангом - липосомамч или гелем гидроокиси алюминия Липосомы смешивали в различных сочетаниях с инактивирозанными бактериальными антигенами (1 5, 1 10, 1 20)

Сыворотку крови получали от всех ныплят подопытной (п = 10) и контрольной групп (п = 10)

Контроль качества липосом. Контроль качества стерильности лнпосомальных суспензий осуществляли в соответствии с ГОСТ 28085-90 'Препараты биологические Методы бактериологического контроля стерильности"

Стабильность вакцины определяли по характеру изменений иммуно1енной активности вакцинных препаратов при хранении в различных режимах при температуре 37°С в течение 30 суток и при 2 - 4°С в течение 6 и 12 месяцев

Определение стерильности готовой вакцины и полноты инактивации бактериальных суспензий проводили в соответствии с ГОСТ 28085-90 "Препараты биологические Методы бактериологического контроля стерильности При проверке на бактериальное загрязнение проводили посев на среды Эндо, МПА, МПБ, МППБ, а при исследовании на грибную контаминацию - на среду Сабуро О стерильности судили по отсутствию роста микроорганизмов на питательных средах

Испытуемые образцы вакцины проверяли на контаминацию микоплазмами путем высева в пробирки со средой Эдварда (жидкая, полужидкая и плотная) Об отсутствии роста микоплазм в среде судили по сохранению цвета среды

Определение безвредности. Безвредность вакцины определяли по ОСТ 9380076-00008064-96 ' Препараты ветеринарные Методы определения безвредности Основные положения" Сущность метода зактючается в выявлении реактогенного действия вакцины на привитых цыплятах по клиническому состоянию и сохранности подопытной птицы

Антнгенную активность вакцины оценивали методом серологических исследований сыворотки крови иммунизированных птиц Напряженность иммунитета оценивали с помощью реакции ai глютинации (РА) С этой целью через определенные интервалы времени от иммунизированных птиц брали кровь, получали сыворотку и исследовали на содержание антител

Иммуно! енные свойства инактивированных вакцин изучали в лабораторных опытах ira белых мышах и цыплятах Животных иммунизировали однократно Через 21 сутки после вакцинации всех иммунизированных и контрольных (не вакцинированных) животных заражали Е coli штамм №389 (078) Об уровне специфической защиты судили по отсутствию у привитых птиц клинических признаков, характерных для колибактериоза.

Влияние вакцинации па биохимические показатели сыворотки крови изучали в лабораторных опьиах на цыплятах Вакцину вводили птице внутримышечно, однократно Для выявления иммунобиохимических реакций организма у птиц брали кровь до кормления, непосредственно перед иммунизацией, а затем через 5, 10, 15 и 25 дней после вакцинации

В сыворотке крови вакцинированных цыплят определяли концентрацию общего белка биуретовым методом, соотношение белковых фракций - нефелометрическим методом по Очлу и Маккорду

Статистическую обработку полученных результатов проводили методом математической статистики, предложенным Ашмариным И П (2000) и с помощью программ Microsoft Excel 97 и Statistika/W v 5 773, SPSS v 7 58

Цифровой материал диссертации обработан по критерию Стьюдента для проверки достоверности различий Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при Р < 0,05 (Лакин Г Ф , 1990)

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Инактивация клеток Escherichia coli

В качестве исходного материала использовали суспензию клеток Е. coli штамм №389 (0'78) с концентрацией 2хЮ10 КОЕ/см3. И наш ивацию осуществляли при температуре в режиме постоянного перемешивания. Концентрацию микробных клеток определяли при помощи стандарта мутности ГИСК им. Л.А. Тарасовича.

Для инактивации клеток Е. coli использовали аминоэтилэтиленимин с конечной концентрацией 2% по активному веществу. Данные фиксировали через каждый час путём титрования отбираемых проб с чашек Петри со средой Эндо. Кинетическая кривая, построенная на основании данных эксперимента, наглядно демонстрирует процесс инактивации Е. coli.

J3

X л 12

го S о. "s о 10 -8

0) ш

f- о 6 -

С9

Ю О) 4

К ЗЕ 2 -

=Г о 0 --

те

о.

ь-X 5 -2 -

1) п -4

X

с -6 -

-8 1

Время, час

1 - Escherichia coli, штамм №389 (078); 2 - принятый предел инактивации, равный МО"1 КОЕ/см3

Рис.1. Жизнеспособность клеток Е. coli при воздействии 2% АЭЭИ. Прямолинейная форма её указывает на экспоненциальный характер гибели бактерий.

Константу скорости инактивации (к) определяли по формуле экспоненты (Д. Мейлелл, Э. Мейлелл, 1967).

Таким образом, константа скорости инактивации составила -2,95 час"'. Необходимо отметить, что величина эмпирического коэффициента является

справедливой только для 2% концентрации аминоэтилэтиленимина С изменением концентрации Е coli ¥>189 (078) в суспензии, равно как и инактизаша изменятся как продотжшельнссгь, так и консташа скорости инактивации

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что при изготовчении инактивированного антигена Е coli №389 (078) инактивацию микробных клеток целесообразно проводить 2% аминоэтшмгиленимином в течение 5-6 часов прн температуре 37°С

2 2 2. Вшяние аминоэтилэтиленимина и формалина на морфологию бактерии Е coli

Морфологические свойства ингакшых и инвктивированных бактерий исследовали с помощью световой и электронной микроскопии Сравнительный анализ методом световой микроскопии, окрашенных по Г раму препаратов нативных и ина'стивированных аминотпгт плени.чип культур Е coli №389 (078), выявил различия в форме и размерах бактериальных клеток В мазках, приготовленных из инактивированиых клеток, наряду с характерными для данного вида возбудителя палочками, отмечали структуры округлой формы более бтецной окраски, которые, по всей вероятности, представляли собой пустые «клеточные тени», оставшиеся после разрушения клеток

Результаты сравнительною электронно-микроскопического анализа морфотошческнх свойств клеток Е coli №389 (078) яо и после инактивации формалином и аминоэгилэгиленимином представлены на рисунках 2, 3, 4 соответственно

V становтено, что морфолен ические свойства клеток Е coli Л'е389 (078) в контрольных препаратах соответствуют норме (рис 2), о чем свидетельствует характерная форма и размеры клеток, а также наличие поверхностных структур часть клеток снабжена пилями и жтутиками Клетки не имели деструктивных изменений и большая часть популяции (около 97% клеток) находилась в физиологически активном состоянии

Рис.2. Морфологически интактные клетки Е. coli №389 (078). Увеличение х 20000.

Т'ие.З. Инактивированные формалином клегки Е. соП №389 (078). Контроль - увеличение х 20000.

Рис.4. Инактивированные

аминоэтилэтиленимином клетки Е.сой №389(078). Увеличение х 20000.

На электронограмме (рис.3) видны деструктивные изменения формы клеток, происходящие в результате сжатия белково-рибосомального компонента цитоплазмы

и ею преобразования в электронно-плотные включения Деструкция бактерий сопровождалась уменьшением размеров и повышенной агрегацией клеток

Морфологические свойства клеток Е coli N°389 (078), инактивированных амипоэгилэтилени^ином, свидетельствуют о потери ими физиологической активности и переходе в электронно-плотное состояние У большинства бактериальных клеток наблюдаются деструктивные изменения, что проявляется, в основном, в отслоении наружной и цитоплазмат ической мембран (рис 4)

Таким образом, посредством электронной микроскопии были выявлены различия в форме, размерах и ульграструстуре клеток Е coli N°389 (078), до и после воздействия ичактиванта

2 2 3 Изготовление моноваленгиои инактивированной чипосомалыюй вакцины против колибактериоза птиц

Получаемый вакцинный препарат представляет собой суспензию, содержащую инакгивированный аминоэтилэтиленимином антиген бактерии Е coli штамм Ks389 (078), адсорбированный на липосомальных везикулах Вместо штамма Е coli №389 (078) может быть использован и другой патогенный штамм Е coli, вызывающий колибактериоз птиц

Вакцину i ото вили по следующей методике 0 45 л суспензии клеток Е coli штамм №389 (078) с концентрацией 2 у Ю10 КОЕ/см3 смешивали при температуре 37°С в режиме постоянного перемешивания с 50 мл 20% раствора аминоэтилэтиленимина в течение 20 мин Полученный препарат содержал антиген и не содержал жизнеспособных клеток бактерий 20 мл препарата, содержащего антиген, смешали с 2 0 г суммарных фосфолипидов растительного лецитина, 0 5 г бутичоксианизола и 0 5 г лактозы Смесь i омогенизировали в течение 10 минут при скороои вращения 700 g и температуре смеси 22 - 24° С, после чего использовали для вакцинации

Препарат вводили внутримышечно в грудную или бедренную мышцу птицы в дозе 0,5 мл на 1 i олову

Вакцину проверяли на безвредность, антигенную и иммуногенную активность Напряженность поствакцинального иммунитета определяли через 7, 28, 45, 60, 90 суток после прививки в реакции агглютинации

2.2 4. Результаты сравнительной оценки мнактивнроваиной липосомальной вакцины и I идроокись алюминиевой формолвакцнны против колибактериоза

111 ицы

Установили, что липосомальная вакцина против колибакте-риоза птицы была безвредна и не вызывала патологоанатомических изменений в органах и тканях при введении 10-кратной дозы Она об задала выраженной антигенной активностью и индуцировала в организме иммунизированной птицы образование специфических антител Динамика формирования иммунитета представлена в таблице 1

Таблица 1

Уровень специфических антител в сыворотке крови вакцинированных цыплят (титры антител в 1о£2, М ± т)

Дни исстедований после иммунизации

№№ группы 7 28 45 60 90

1 6,1 ±0 2 9,5 ±0,3 9,9 ±0,2" 9,8 ±0,Г* 9,8 ±0,2"

2 5,4 + 0,5 7.7+0,5 7,4 ±0 5 7,2 + 0,4 6.8 + 0,3

3 Н/О Н/О Н/О 0,5 ±0,1 0,7 ±0,1

** По сравнению с контрочем вакцины Примечание Н/О - не обнаружено

Группа 1 - цыплята, вакцинированные инактивированной липосомальной вакциной

Группа 2 — цыплята, вакцинированные ГОА формолвакциной Г руппа 3 — контроль

Обе вакцины были антшенно-активными и формировали напряженный иммунитет у подопытной птицы в течение всего периода наблюдения

В сравнительном аспекте было изучено проявление местных тканевых реакций на внутримышечное введение вакцин (таблица 2, 3) Контроль клинического состояния птицы в ходе эксперимента не выявил существенных отклонений общего и местного характера Не обнаружено отклонений в ее поведении при введении 10-кратной дозы препарата

Таблица 2

Оценка места введения вакцин против колибактериоза через 10 суток после инъекции

(п=10)

№№ группы Вилимь.е изменения в местах введения вакцин, %

Степень поражения Следы вакцины Гранупемы Отечность

1 легкая Н/О Н/О 20

2 средняя 60 Н/О 40

Примечание

группа 1 - цыплята, вакцинированные инактивированной липосомальной вакциной,

группа 2 - цыплята, вакцинированные ГОА формолвакциной, Н/О - не обнаружено

Таблица 3

Оценка места введения вакцин против колибактериоза через 90 суток после инъекции

(п- 10)

№№ группы Видимые изменения в местах введения вакцин,%

Степень поражения Без видимых изменений Незначит кол-во вакцины Фибрин

1 техкая Н/О Н/О Н/О

2 средняя 40 60 Н/О

Примечание

группа 1 - цыплята, вакцинированные инактивированной липосомальной вакциной,

группа 2 — цыплята, вакцинированные ГОА формолвакциной,

Н/О - не обнаружено

После вакцичации в течение первых 5 суток проводили убой шиц и визуально оценивали место инъекции Установлено, что при использовании липосом местные реакции тканей были минимальными Нами установлено отсутствие воспаления и инкапсулированных остатков вакцины, лёгкое побледнение тканей на плошади 0 7 см в диаметре

В случае использования гидроокиси алюминия в качестве адъюванта регистрировали отёчность, побледнение окружающих тканей, гиперемию в зоне воспалительной реакции до 2 см в диаметре вокруг места инъекции, отмечали присутствие остатков инкапсулированной вакцины

Поствакцинальной реакции не наблюдали Все птицы бычи клинически здоровы

Коэффициент иммунологической эффективное ги инактивированной липосомальной вакцины при внутримышечном способе вакцинации цыплят, в лабораторных условиях спустя 28 дней после иммунизации составлял 100% При применении ГОА формолвакцины коэффициент иммунологической эффективности был -95%

От всех павших после заражения патогенными штаммами птиц была выделена исходная культура кишечной палочки

2 2 5 Влияние инактнвированиой липосомальной вакцины против колибакчерноза птицы на иммунобиохимичеснис показатели сыворотки крови цыплят подопытной и контрольной 1рупп

Исследования иммунобиохимических показателей сыворотки крови цыплят показали, что под впиянием липосомальной вакцины концентрация общего белка в сыворотке крови цыплят возросла на 4,31% по сравнению с контролем, под влиянием ГОА формолвакцины в тог >ье период этот показатель был выше контроля на 10,45% (Р>0,05)

В контрольной группе цыплят с возрастом отмечена тенденция снижения концентрации гамма - глобулинов сыворотки крови, тогда как в сыворотке крови вакцинированных цыплят установлено достоверное увеличение концентрации этой фракции общего белка начиная с 5-го дня посте вакцинации Так, концентрация ■амма - глобулинов сыворотки крови цыплят, вакцинированных ГОА формолвакциной, на 25 день составила 10 08 ± 0,93 1/л, против 6,96 ± 0,64 г/л - в конфоле (Р<0 05) Концентрация гамма - глобучинов сыворотки крови цыплят, вакцинированные инактивированной липосомалы.ой вакциной, оказалась максимальным в эют возрастной период - 12,23 ± 1,20 г/л (Р<0,05) Таким образом, под влиянием вакцин происходило перераспредетение фракций общего белка в сторону увеличения синтеза гамма — глобулинов (рис 5)

—♦--Липосомальная вакцина! --«— ГОА формолвакцина | —а— Контроль 1

10

15

20

25

30

дни исследовании после иммунизации

Рис. 5. Содержание гамма - глобулинов в сыворотке крови цыпля!

3. выводы

1 Разработан метод инактивации штамма Е coli №389 (078), обеспечивающии гибель бактерий при сохранении их антигенных и иммуногенных свойств Изучено в сравнительном аспекте влияние аминоэтилэгиленимина и формалина на морфологию клеток штамма Е coli №389 (078)

2 Установлено, что инактивация клеток штамма Е coli №389 (078) аминоэтилэтиленимином происходит прямолинейно, те с постоянной скоростью

3 Разработан метод изготовления инактивированной липосомальной вакцины против колибактерио ¡а кур Определена иммунизирующая доза, напряжённость и продолжительность иммунитета после применения вакцины на цыплятах

4 При использовании вакцины с адъювантом на основе липосом местная реакция тканей при иммунизации цыплят была минимальной, не наблюдались воспаление и инкапсулированные остатки препарата

5 Опытные образцы вакцин были антигенно-активными в течение всего периода наблюдения, иммунная реакция проявлялась на 7 день после вакцинации и достигала максимальных значений к 45 дню с момента иммунизации, стабильно удерживаясь в течение 3-х месяцев (срок наблюдения) Однако, инактивированная липосомальная вакцина обладала более выраженной антигенной активностью, индуцировала образование высокого уровня специфических антител, по сравнению с ГОА формолвакциной (Р<001)

6 Определена иммунобиохимическая характеристика крови цыплят при применении инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза Установлено, что в ответ на введение вакцин (липосомальнои и ГОА формолвакцины) происходит нарастание общего белка (Р > 0,05), которое в основном достигалось за счет увеличения фракции гамма-глобулинов При этом содержание гамма-глобулинов, а также титр специфических антител в сыворотке крови пгиц вакцинированных инактивированной липосомальной вакцинои были достоверно выше, чем при иммунизации ГОА формолвакциной (Р < 0,05)

4 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 Разработаны технические условия на инактивированную липосомальную вакцину против колибактериоза птицы, а также наставление по ее применению

2 Инактивированную типосомальную вакцину предлагается использовать для профилактики котабактериоза птиц в условиях птицехозяйств

3 Резулыагы исследований по изучению иммунобиохимической характеристики крови птицы при применении инактивированной липосомалыюй вакцины против колибактериоза используются в учебном процессе на кафедрах микробиологии вирусологии и иммунологии, и кафедре биохимии ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины», а также в ветеринарной практике

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Орехов Д А Применение формалина, теотропина и аминоэтилэтиленимина для инактивации возбудителя колибактериоза // Мат 60-й науч конф молодых учёных и студентов СПбГАВМ — СПб, Изд-во ФГОУ ВПО "СПбГАВМ", 2006 - С 84-85

2 Орехов Д А , Конопатов Ю В , Сухинин А А Применение липосом при конструировании инактивированной вакцины против колибактериоза птицы // Ветеринарная медицина теория, практика и обучение Маг науч - нрактич конф - С пб, Изд-во ФГОУ ВПО "СПбГАВМ", 2006 - С 22-24

3 Орехов ДА Изютовление и лабораторные испытания инактивированнои липосомальной вакцины против колибактериоза птиц // Ветеринарная медицина теория, практика и обучение Мат Втор Всероссийской науч -прахтич конф -Спб , Изд-во ФГОУ ВПО "СПбГАВМ" 2007 -С 52-55

4 Орехов ДА Инактивация Fschenchia coli аминоэтилэтиленимином // Мат 61- й науч конф молодых ученых и студентов СПбГАВМ - СПб, Изд-во ФГОУ ВПО ' СПбГАВМ", 2007 - С 64-66

5 Орехов ДА Вакцинный препарат против колибактериоза птиц Тезисы докл научно-практич конгресса "Актуальные проблемы ветеринарной медицины" - СПб -2007 - С 164-166

6 Орехов Д А, Конопатов Ю В, Сухинин А А Инактивированная липосомальная вакцина и гидроокись алюминиевая формолвакиина против колибактериоза птиц // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук - 2007 - №4 -С 77-79

7 Орехов Д А, Конопатов Ю В, Сухинин А А, Рыбальченко О В Использование аминоэтилэтиленимина при конструировании липосомальнои вакцины против колибактериоза птиц // Ветеринарная патолотя - 2007 -№2 - С 66-69

8 Конопатов Ю В, Сухинин А А, Пилаева H В. Орехов Д А Иммунобиохимическая характеристика крови птиц при применении липосомальной вакцины против колибактериоза /«' Ветеринарная практика -2007 - №2(37) - С 22-26

9 Сухинин А А, Конопатов Ю В Орехов Д А Инактивированная липосочальная вакцина против колибактериоза птиц // Болезни пгиц в промышленном птицеводстве Современное состояние проблемы и стратегия борьбы Мат науч - практич конф, «освященной памяти академика Россе>1ьчозакадемии Р Н Коровина - СПб ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии ВВМ - 2007 - С 235-240

Тиражирование и брошюровка выполнены в учреждении «Университетские телекоммуникации» 197101, Санкт-Петербург, Саблииская ул , 14 Тел (812) 233 4669 объем 1 п л Тираж 100 экз

В настоящее время созданы и эффективно функционируют птицеводческие предприятия промышленного типа. Они отличаются целым рядом особенностей, важнейшей из которых является большая концентрация поголовья птицы на малых площадях. В. условиях искусственного климата птица лишена активного движения, свободного выбора корма, солнечного освещения. Поэтому любое нарушение условий содержания птицы действует как сильный стрессовый фактор, способствующий увеличению вирулентности условно-патогенной микрофлоры и, как следствие, развитию инфекционного процесса (Коровин Р.Н. и др., 1989; Виноходов В.О., 2000).

Среди болезней птиц бактериальной природы наиболее широко распространён колибактериоз, протекающий остро и хронически (Apajalahti J. et al., 2004; Nili H„ Mahjour A. A., 2005; Mojtaba Bonyadian, Hamb Allah Moshtaghi, 2007; Бакулин B.A., 2006; Виноходов В.О., Лысенко С.Н., 2006; Кузьмин В. А. и др., 2006; Борисенкова А.Н., 2007).

Согласно данным статистической отчётности Департамента ветеринарии Российской Федерации, эшерихиоз был зарегистрирован в 24 субъектах Федерации. Чаще болезнь регистрируется на территории Волго-Вятского, Центрально-Чернозёмного, Поволжского, Уральского, Западно-Сибирского и Восточно-Сибирского экономических районов. Удельный вес падежа птицы от эшерихиоза составил 71,3% из числа всех павших от заразных болезней (Ярёменко Н.А., 2002).

В комплексе мер борьбы с инфекционными заболеваниями, включающими соблюдение ветеринарно-санитарных правил, условий содержания и кормления, вакцинопрофилактика занимает ведущее место (Melamed D., Leitner G. and Heller E.D., 1991; Бурдейный B.B., 1998; Садовников H.B., 1995; Бакулин В.А., 2006; Джавадов Э.Д., 2007).

Считается, - что безопасность инактивированных вакцин достаточно гарантирована. Однако при их парентеральном применении возможно появление общей и местной воспалительной реакции на месте введения с последующим развитием локальных абсцессов и гранулем, гиперсенсибилизация организма и активация аутоиммунных процессов (Медуницин Н.В., 1999; Староверов С.А. и др., 2003; Edelman R., 1980; Vanselow В.А., 1987).

Поэтому не случаен поиск новых способов решения проблем иммунизации птиц, улучшения способа доставки антигена. Актуальной также остается разработка оптимальных лекарственных форм, позволяющих полностью снять негативные эффекты, наблюдаемые после введения препаратов.

Одним из возможных направлений решения данного вопроса является конструирование лекарственных форм вакцин на основе наночастиц, среди которых особое место занимают липосомы (Каплун А.П. и др., 1999).

Многочисленные клинические испытания липосомальных препаратов ; показали их безопасность для организма животных и человека.

Целью наших исследований являлась разработка инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птицы. Задачи:

-разработать режим инактивации Escherichia coli, используя аминоэтилэтиленимин;

-изготовить экспериментальные образцы инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птицы;

-сравнить биологические характеристики инактивированной липосомальной вакцины и гидроокись алюминиевой формолвакцины против колибактериоза птицы;

-определить иммунизирующую дозу, напряжённость и продолжительность иммунитета после применения вакцины на цыплятах;

-определить влияние инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птицы на уровень общего белка и белковых фракций сыворотки крови иммунизированных цыплят.

Научная новизна работы. В результате проведённых исследований нами впервые:

-разработана технология изготовления инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птицы;

-определены оптимальные параметры и режим инактивации Escherichia coli аминоэтилэтиленимином;

-установлена высокая антигенная и иммуногенная активность инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птицы; -определены иммунобиохимические характеристики крови цыплят при применении инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птицы.

Практическая значимость работы.

На основании полученных результатов разработана нормативно-техническая документация по изготовлению и контролю инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза птицы.

Апробация работы. Основные материалы исследований по диссертационной работе доложены и обсуждены на:

• Всероссийской научно-практической конференции "Ветеринарная медицина - теория, практика и обучение" (Санкт-Петербург, 2006, 2007);

• Научно-практической конференции "Болезни птиц в промышленном птицеводстве. Современное состояние проблемы и стратегия борьбы" (Санкт-Петербург, 2007);

• Международном научно-практическом конгрессе "Актуальные проблемы ветеринарной медицины" выставки "Ветеринария. Зоотехния. Комбикорма" (Санкт-Петербург, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 научных работ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Способ инактивации Escherichia coli аминоэтилэтиленимином.

2. Использование липосом при конструировании вакцины против колибактериоза птицы.

3. Влияние инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза на иммунобиохимические характеристики крови цыплят.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, приложение. Список использованных литературных источников включает 224 наименования, в том числе 100 работ зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 7 рисунками и 12 таблицами. В приложении представлены копии титульных листов документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработан метод технологии изготовления инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза кур.

2. Разработан метод инактивации штамма Е. coli №389 (078), обеспечивающий гибель бактерий при сохранении их антигенных и иммуногенных свойств.

3. Изучено в сравнительном аспекте влияние формалина и аминоэтилэтиленимина на морфологию клеток штамма Е. coli №389 (078).

4. Установлено, что инактивация клеток штамма Е. coli №389 (078) аминоэтилэтиленимином происходит прямолинейно, т.е. с постоянной скоростью.

5. При использовании вакцины с адъювантом на основе липосом местная реакция тканей при иммунизации цыплят была минимальной, наблюдалось отсутствие воспаления и инкапсулированных остатков препарата.

6. Опытные образцы вакцин были антигенно-активными в течение всего периода наблюдения, иммунная реакция проявлялась на 7 день после вакцинации и достигала максимальных значений к 45 дню с момента иммунизации, стабильно удерживаясь в течение 3-х месяцев (срок наблюдения). Липосомальная вакцина обладала выраженной антигенной активностью, индуцировала образование более высокого уровня специфических антител, пр сравнению с ГОА формолвакциной (Р < 0.01). •

7. В ответ на введение вакцин (липосомальной и ГОА формолвакцины) наблюдалась тенденция повышения концентрации общего белка (Р > 0,05), которое в основном достигалось за счёт увеличения фракции гамма-глобулинов. При этом содержание гамма-глобулинов, а также титр специфических антител в сыворотке крови птиц вакцинированных липосомальной вакциной были значительно выше, чем при иммунизации ГОА формолвакциной (Р < 0,05).

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработаны технические условия на инактивированную липосомальную вакцину, а также наставление по её применению. Предлагается для профилактики колибактериоза птиц использовать инактивированную липосомальную вакцину.

Результаты исследований по изучению иммунобиохимической характеристики крови птицы при применении инактивированной липосомальной вакцины против колибактериоза рекомендуем использовать в учебном процессе ветеринарных факультетов, а также в ветеринарной практике.