Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Лабораторный контроль при проведении противотуберкулезных мероприятий в стадах крупного рогатого скота

гаврилова галина антоновна

На правах рукописи

лабораторный контроль при проведении противотуберкулезных мероприятии в стадах крупного рогатого скота

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

автореферат

осертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

новосибирск 1996

Работа выполнена в лаборатории туберкулеза сельскохозяйственных шотных Дальневосточного зонального научно-исследовательского ветеринарного института ДВО РАСХН,

Научные руководители-.

1.Доктор ветеринарных наук Макаров Юрий Анатольевич

2.Доктор ветеринарных наук,профессор,член-корреспондент

РАСХН Донченко Александр Семенович

Официальные оппонента-.

1. Доктор ветеринария наук Ишь Ккшай Алексеевич

2.Кандидат ветеринарных наук,доцент Кисленко Виктор Никитович

Ведущее учрехдение: Всероссийский научно-исследовательский институт зксперикентальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко

Зацита диссертация состоится ' & 5' сс^-с^ Л-___1996

года в I ^ часов на заседании диссертационного совета Д.020.23.01 в Институте зксперикентальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока СО РАСХН по адресу: 633128, Новосибирская область. п.Краснообск, ИЗВСиДВ, кон$еренцзал,тел.48-44-62; 48-19-13.

С диссертацией кохно ознакомиться в ЦНСХБ СО РАСХН. Автореферат разослан ' Яй/" _1996г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор ветеринарных наук

А.А.Саноловов

О В 5А Я ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми.Бактериологическое исследование является одних из основных ;тодов диагностики туберкулеза сельскохозяйственных животных.Используя этот ке->д,мохно контролировать состояние стада по туберкулезу путей исследования биона-;риала от убитых с диагностической целью животных,имеющих аллергические реакции 1и характерные для туберкулеза патологоанатомические изменения.Особо вахное знание бактериологический метод приобретает при установлении диагноза в зонах,где ¡гистрирувтся аллергические реакции на введение туберкулина без характерных для 'беркулеза порахений органов и тканей,а гакхе поражений,носящих локальный харак-;р(В.Е. Юревсюв, 1970,19Й0,1981; В. Я. Урбан, 1980,1984; И. Й.Овдиеш, 1986.1989,1990}.

Однако эффективность бактериологических исследований в больвинстве случаев не >евааает 40-50%.Между тем исследования,проведенные Э.Н.Зубхицш(19&1), Е.Кно-енг(1968,1969.1978), А.И.Кузиным(1977,1987), А.С.Донченко(1980),11.А.Сафннын(1980, 181,1985,1986), И.А.Коваленко(1986,1989), В.А.Макарова^ 1993),показали,что эффектность лабораторной диагностики можно повысить до 65-80$, а иногда до 90-100%. |Полнив диагностический комплекс лшинесцентносерологичесш методом, а такхе ес-I при исследовании биоматериала учитывать измененные (Л-) Форма возбудителя.

В настоящее арекя диагностика туберкулеза лшинесцентносерологичесш методом ветеринарии практически не проводится.Между тем метод универсален,поскольку обсуживает как корпускулярные, так и Фиксированные растворимые антигена,отличается остотой методических приемов и быстротой получения результатов. Другие преимуще-ва метода заклвчавгся в возможности обнаружения антигенов как живых, так и керт-х бактериальных клеток, в индикации измененных Форм и Л-вариантов микобактерий.

Сущность его зашчается в использовании люминесцентного варианта реакции "ан-ген-антитело",происходящей при соединении антигенов бактерий с соотвегствувщими ецяфичесши антителами, меченными Флворохрокон.Зтой особенностьв обьяснявтся огие преимущества данного негода по сравнения с другими.

Метод лиминесцирувщих антител позволяет наблвдать реакций специфического свя-

3

ззеання антигенов бактерий с антителами какроорганизма на одной микробной клетке. Чувствкгельносгь его равна 1*10а-5* 1О^никробних клеток в 1 «л,а обычные иммунологические реакции требуют содержания в 1 кл г?зе»си 5»10"- 2,5» 1 о" микробных клеток^. Черрн,Ч.Рейкер.1974).

В связи с этим повынение эффективности лабораторной диагностики туберкулеза за счет лшнесцентного метода, а такхе учета Л-Форм микобактерий имеет болыое практическое значение.

Цель н задачи исследования.Цель исследований - изучение закономерностей проявления эпизоотического процесса при туберкулезе крупного рогатого скота и оптимизация лабораторной диагностики этой инфекции.

На разрешив ставились задачи:

- изучить эпизоотическую ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота в хозяйствах Амурской области;

- установить эффективность использования непрямого метода ихмунофлюоресценции в комплексе с бактериологическим посевом в лабораторной диагностике типичных и измененных Форм микобактерий в биоматериале шотных из хозяйств с различной эпизоотической ситуацией по туберкулезу;

- изучить вознохность применения культурального и иммунофлворесцентного методов для контроля аллергических реакций у вакцинированных БЦХ хквогннх.

Научная новизна.В результате проведенных исследований изучена некоторые вопросы эпизоотологии туберкулеза крупного рогатого скота{интенсивные к экстенсивные показатели эпизоотического процесса,связь заболеваемости и повторяемости диагностических туберкулиновых исследований).

Установлено на разнообразном биоматериале.что использование метода непрямой икмунофлворесценции в комплексе с методом посева повывает специфичность и информативность микробиологической диагностики туберкулеза.обеспечивает надехный контроль за эпизоотическим состоянием стад крупного рогатого скота по туберкулезу.

Практическая значимость.ца основании результатов исследований дополнена схема

¿ораторной диагностик» тубврлуаеза крупного рогатого скота и даны рекомендаций ее применении. Внедрение предлохенной схему позволяет своеврекенно диагност««?-ть и надежно контролировать эпизоотическое состояние хозяйств по туберкулезу.Дк-ностячесг.ий тест мохет бить использован з условиях ветеринарных лабораторий при •слеловаш биоматериала от хнвотнах ка туберкулез.

Апробация работы.Материалы диссертации долохены на областной научно-практичес-й конференции "Ветеринарная наука на слухбе АПК" (Благовеценск.1988); на регко-.льной научно-производственно!} конференция "Профилактика и ликвидация основных лезней сельскохозяйственна* хивотных на Дальнем Востоке°(Благовеценск,1989!; на .седании 0НКвет{Лост,1990); на секции хивотноводства и ветеринарии Президиума ■О РАСЩХабаровск,1991); на научно-практической конференции "Основные научные следования по проблеме туберкулеза и бруцеллеза сельскохозяйственных хквот-х,профилактика и организация мероприятий по ликвидации болезней в регионе Сиби-" (Новосибирск, 1995); ученых советах ДальЗНИВИ(1986,1987,1988,1990).

Публикация результатов исследований.По теме диссертации опубликовано 8 научных атей, 3 рекомендации.

Обьен х структура диссертации.Диссертация излоша на 105 страницах шинопис-го текста,состоит из введения,обзора литература,собственных исследований,обсух-ния полученных результатов, выводов, практических предлохений,списка литература и илохения.Список литература содерхит 158 источников,в том числе 38 зарубехных.Ра-та иллюстрирована 14 таблицами к 10 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ НАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в 1986-1990 гг. в лаборатории туберкулеза сельскохозяйствен-х хивотных Дальневосточного зонального научно-исследовательского ветеринарного

статута и в хозяйствах Амурской области по задании О.сх.61.02.02.02.ДИ.Д16."Ва-гь Госагропрому СССР рекомендации по применения усовершенствованных и новых

5

средств,методов и способов диагностики туберкулеза хивотных".

Для реиения поставленных задач изучали статистические данные мясокомбинатов области,результаты аллергических исследований скота в 28 хозяйствах пяти районов. Проводили аллергические исследования крупного рогатого скота на туберкулез в хозяйствах Серыкевского района области.Ветерккарно-сакитарной экспертизе подвергли 322 туви крупного рогатого скота.реагкровааиего и не реагировавшего на туберкулин. Биоматериал исследовали от 507 хивотных, в том числе от 21 хивотного с различными сроками давности вакцинация БЦ1.Проведено 2656 посевов биоматеркала на наличке мккобактерий туберкулеза и Л-формы.

Параллельно с посевом проводили непрямую иммунофлюоресценцкв,всего сделано 480 постановок с различным биоматериалом.

Для работы использованы стандартные тнни мккобактеркй й.Ьоу]з(уа11ее), МЛи-Ьегси1оз)з(В1М),М.ау1ив(Ф-83),К.капзаэ! 1 (11-Ф).полученные из музея хивых культур Всесоюзного научно-контрольного института ветеринарных препаратов, вакцинный втамм БЦХ (серия 539,контроль 1482}.сферопласта нккобактерий М.ЬоУ1з(уа11ее), Я.1иЬегси-1оз)з(01М). Н.аукт!Ф-83), Н.капэаз 11 {11-Ф).полученные по методике й.В.Коваленко (1989) в модификации Ш.А.Макарова(1993). Использовали иммунные кроличьи сыворотки против бактериальной формы и сферопластов мккобактерий К.Ьоу1з(уа11ее), Н.ЬиЬегси-1оз1з(БЬ/эЬ),М.аУ1ит(Ф-83),М.ЗсапзаБЗН11-Ф).полученные по методу Б.Е.Кнорннг(1976); диагностическую сыворотку против глобулинов кролика,меченную изоцианатом флворес-цина,выпускаемую КИИЗМ им.Гамалек; альбумин,меченный родамином, выпускаемый НИИЗМ им.Гамалеи и предназначенный для контрастирования неспецифического свечения.

Для культивирования бактериальных Форм микобактерий туберкулеза использовали плотные питательные среда Левеяжтейна-Иенсена,Фкнн-2 к хидкую среду Согона.Для шьтяваровання Л-форм никобактернй готовили полумдкув среду Ёкольниковой по методике , разработанной И.Р.Дорохковой(1984),

Биояатернал от реагирующих на туберкулин хквотных брали нз лимфатических узлов

я паренхиматозных органов крупного рогатого скота и лабораторных мвотнах. Отбор бшатерша и ввдешяе кккобакгерн^ туберкулеза яршшя срглмйр '[{шшшй по диагностике туберкулеза шотшЧШбЬнссдедовше на Д-Форяв согласно 'Кето-дичесш рекомендациям по выделение Л-Форм микобактерий туберкулеза из патологического .чатерналан(И.Р.Дорогкова.3.Н.Кочекасова.М. 8.Дахно, 19801,Выделенные прк посеве или полученные в результате реверсии культуры микобактерий изучали согласно полохенив "Об унификации микробиологических исследований яри туберкулезе"(19781.

Просмотр окрашенных препаратов осуществляли с помочью микроскопа марки МЛ-2 с использованием возбухдавцих Фильтров Т-2.1.объектива -х 50,апертуры -1,25,окуляра -7 или 10,силы тока -4,5А.

Для черно-белой микрофотографии использовали фотоаппарат "Зенит" и Фотопленку 32 и 250 ЕД.

Способ приготовления препаратов из биоматериала для иммунофлюоресценции и методика их окраски непрямым методом Флюоресцирущих антител излохены в методических рекомендациях "Обиарухение типичных и измененных Форм микобактерий губеркуле-за"(1993).Интенсивность свечения оценивали по плюсовой системе.Специфичность иммунологических реакций в мазках из микобактерий устанавливали дополнительной постановкой контрольных опытов.

Лекарственнуп чувствительность микобактерий и культур ревертаатов определяли методом абсолптных концентраций на среде Левентйна-йенсена и оценивали по общепринятым критериям.

Цифровой материал обрабатывали по методике,описанной Л.С.£аминским(1964).

РЕЗУЛЬТАТУ ИССЛЕДОВАНИЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭПИЗООТИЧЕСКОЙ СИТУАЦИИ ПО ТУБЕРКУЛЕЗУ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В АМУРСКОЙ ОБЛАСТИ

В Амурской области в 1986-1989 гг. туберкулез крупного рогатого скота регистрировался в 46-ти пунктах 28 хозяйств пяти районов.По уровня распространения забо-

7

левания среди хиаотных большинство неблагополучных хозяйств относилось к категории пунктов с массовый распространение« туберкулеза.Наиболее вкрокое распространение туберкулеза крупного рогатого скота в области отмечено в 1986 году в Серагевс-ш.Завитинскок и Бурейскок районах.

Во интенсивности и экстенсивности эпизоотический процесс был наиболее выражен в Серввевском районе.Заболеваемость и неблагополучие в хозяйствах района за 1986 год сосшш соответственно 36,2 и 28,0%.В 1987 к 1988 гг. интенсивность порахе-ния крупного рогатого скота туберкулезом снизилась к заболеваемость составила соответственно 21,0 к 22,3%.Число пунктов за згк годы увеличилось,з показатель неблагополучия возрос соответственно до 48,0 и 49,0%.

В Завитинско.ч районе пик заболеваемости и неблагополучия среди хивотных установлен в 1987 году к соответствовал 8,7 и 33,3%.В этот период в районе насчитывалось 13 неблагополучных пунктов.В 1986 и 1988 годы показатели интенсивности и экстенсивности эпизоотического процесса были нихе,заболеваемость по годам соответствовала 2,3 и 7,3%,а неблагополучие - 8,1 и 23,6%.Заболеваемость и неблагополучие в хозяйствах этого района связана иехду собой.С увеличением одного показателя увеличивается другой.Кроме того.прослехивается динамика эпизоотического процесса: с началом лодьена заболеваемости в 1986, стабилизацией в 1987 и периодом снихения в 1988 году.

В Бурейском районе наивысвий показатель (3,3%) заболеваемости крупного рогатого скота был установлен в 1986 году.В 1987 и 1988 годы он снизился и соответствовал 1,7 и 1,9%.Показатель неблагополучия находился все три года почти на одно« уровне - ежегодно в пределах 24,8%.

Таким образом,интенсивность эпизоотического процесса по туберкулезу крупного рогатого скота в Акурской области с 1986 по 1988 годы по заболеваемости хивотных возросла на 0,3%,однако в отдельных районах она находилась на различных уровнях.

Экстенсивность эпизоотического процесса по туберкулезу крупного рогатого скота

по области в 1988 году снизилась в сравнении с 1987 годом на 2,5%.Однако она оставалась вале,чем в 1986 году.Показатель неблагополучия по районам различен.В Сера-гевском районе он с 28$ в 1986 году возрос до 49* в 1988 году,в Завитинском - снизился на 9,7$ в 1988 году по сравнение с 1987 годом,однако остался вине,чем в 1986 году.В Михайловском районе указанный показатель остался неизменным.

При определении территориальной приуроченности туберкулеза крупного рогатого скота в области бал использован средний показатель заболеваемости хивогннх по районам за 1986—1988 годы.Заболеваемость была разбита на три группы.В первую группу отнесли района с заболеваекостьв 0,3 - 2,3?;ко второй - район с показателен 2,3 -7,3?; к третьей - район с показателем заболеваемости от 22,3 до 36,21.

Установлено,что туберкулез крупного рогатого скота в Амурской области приурочен к вхной и центральной природно-хозяйственнак зонам с наибольвей интенсивности эпизоотического процесса в центре.

В 1986 году в 11,3% хозяйств области у крупного рогатого скота были зарегистрирована парааллергическне реакции на ИД-туберкулиа для млекопигащх. При этом установлена закономерность заболеваемости и проявления парааллергических реакций. Крупный рогатый скот различных возрастов,сенсибилизированный атипичными кико-бактериями, реагировал на туберкулин от 0,3 до 13,Заболеваемость в неблагополучных пунктах и показатель сенсибилизации коров бвли выае.чем молодняка.

Более обстоятельные исследования по туберкулезу крупного рогатого скота были проведена в зоне наивасией интенсивности эпизоотического процесса - в хозяйствах Серыгевского района.

Здесь определили две группы хозяйств.К первой отнесена хозяйства,где установили туберкулез как патологоанатомически.так и лабораторными методами исследований (выделена культура мякобактерий бычьего я человеческого видов).В зш хозяйствах а 1986-1987 годы было установлено 11 неблагополучных пунктов по туберкулезу крупного рогатого скота. Ко второй группе были отнесена хозяйства,з которых при убое у реа-

гирувщ на туберкулин хивогннх отсутствовали порахения, характерные для туберкуяе-

9

за.йри иседедсааш бкоматерша от пш шотш был?, еадедева атшчвае кнко-бактерин.Показатели заболеваемости среди коров в неблагополучных хозяйствах Сера-яевсвого района вие.чех среди молодняка.Разница мегду этими показателями составляла 11,7 - 78,6%.

В процессе исследования установлено,что туберкулезный процесс у крупного рогатого скота з хозяйствах Серывевского района имеет корреляционную связь с количеством исследований: если инфекционный процесс находится в стадии развития,наблюдается прямая зависимость кехду частотой диагностических исследований и заболеваемостью. Так. где туберкулезный процесс потерял остроту течения,зависимости от кратности туберкулинизации не наблюдалось.При этом в ряде хозяйств она была прямая,а в некоторых - обратная со стабильным туберкулезным процессом.Зависимость заболеваемости к частоты диагностических исследований позволила более точнее определить ситуацию по туберкулезу крупного рогатого скота в хозяйствах района.

Наряду с хозяйствами Серывевского района в 1986 году были выявлены некоторые закономерности проявления парааллергичесш реакций у крупного рогатого скота в хозяйствах Благовещенского к Ивановского районов.Корова и молодняк реагировали соответственно в 7.6 к 2,5$ случаев.В 1987 году число реагирующих на туберкулин хивотных снизилось в обеих возрастных группах.В 1988 году количество реагирующих коров незначительно возросло (на 0,5£),у молодняка аллергические реакции на туберкулин не зарегистрированы.В хозяйствах Благовещенского района наибольвее количество хивотных с парааллергией было выявлено в 1987 году.В 1986 году коровы реагировали в 0.5* случаев,у яолодняка реакция отсутствовали.В 1988 году сенсибилизация хивотных в обеих возрастных группах была одинакова (0,9%).хотя у коров во сравнении с 1987 годом она снизилась на 1,2%,а у молодняка осталась на том хе уровне.В хозяйствах.. Серавевского,. райова количество реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота с 1985 по 1988 года имело тенденцию к росту с незначительным снихением (на 1,5%) в 1957 году.У иолодняка этот показатель ехегодно увеличивался. Ю

Установлено,что у крупного рогатого скота различных возрастов,сенсибилизкро-анкого атипичными микобактериями,показатель сенсибилизации хивотных колебался от ,5 до 13,«.

С цельп специфической профилактики туберкулеза крупного рогатого скота в хо-яйствах области с 1984 года начали применять вакцину БЩ.На период проведения сследований вакцинировано более 100 тысяч голов молодняка крупного рогатого ско-а. Вакцинация в ряде хозяйств ослогнялась длительности поствакцинальных реакций у архивированных хивотных на туберкулин.Безусловно,в связи с этим больной интерес в тоошеском плане представляло изучение причин продолхительной гиперчувстви-гльности замедленного типа у вакцинированных БЦ1 хивотных,а такхе исключение ин-щрования хивотных возбудителями туберкулеза.

Внедряемые противотуберкулезные мероприятия в Амурской области в основном Зеспечивавт полный обьем профилактики и ликвидации этой болезни среди стад крупно рогатого скота.Однако .реализация программа оздоровления затрудняется тем,что зи проведении лабораторных исследований не в полной мере учитывавтся биоморфоло-(ческие Форма возбудителя,недостаточно совераенны средства и методы диагностики 'беркулеза.Зто и предопределило проведение дальнейвих исследований.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИНДИКАЦИЯ БИОМОРФОЛОГИЧЕСКИХ ФОРМ МИКОБАКТЕРИЙ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИМ И ИММУНОШОРЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДАМИ

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОМАТЕРИАЛА ОТ ЖИВОТНЫХ,РЕАГИРУЮЩИХ НА ТУБЕРКУЛИН БЕЗ П0ДТВЕР1-НИЯ ТУБЕРКУЛЕЗА НА ВСКРЫТИИ

У 85 голов крупного рогатого скота из вести хозяйств Сериевского и Ивановско-районов,убитого как реагирующего на туберкулин,исследовали лимфатические уз-.ЛимФондная ткань значительного числа лимфатических узлов была гиперплазирована в пяти случаях содержала очахки некроза размером с просяное зерно.

Лаборатории« исследование« биоматериала методами посева и непрямой имнунофлюо-ресценции получены следующие результаты.Культуральным методом Л-Формы были выделены у пяти(8.6%) хивотных.из них у четырех(6,й)-в сочетании с бактериальными.Икиу-нофяворесцентный анализ обнарухил ¿¡-трансформированные варианты у 11(12,8*) хивот-ных.

Совпадение результатов культурального и иммуноФлворесцентного методов при выявлении Л-вариантов отмечено в одном (1.7%) случае.Исключительно с помощью метода непрямой иммунофлюоресценции Л-Форма внявленв'у 10 (11,6%) хивотных.

Наряду с этим следует отметить, что при первичном исследовании биоматериала от хивотнвх из хозяйств Ивановского района как методом посева,так и методом непрямой икмунофлюоресценции получили отрицательный результат.Только последующие,а именно двух- и трехкратные лабораторные исследования биоматериала позволили выделить и обнарухить культура микобактерий.

По результатам биохимических,культуральвых к серологических исследований установлена прннадлехность выделенных культур к комплексу М.ауш - М.ШгасеПииге, М.5шедта11з.М. {ог1и11иа,Н.рЫе! ,К. воасЬгоюодеп1сию-1еггае1г1У1а1е.

Всего культуральнай метод позволил выделить микобактерни у 17,2% хивотнвх,одновременно проведенный инмунофлворесцентный анализ позволил увеличить число находок до 27,9% от хивотных,реагирующих на туберкулин.

Таким образом, если при ветеринарно-санитарной экспертизе внутренних органов и лимфатических узлов порахения,типичные для туберкулеза отсутствуют или носят локальный характер,необходимо учитывать типичные,атипичные и измененные формы микобактерий.

Комплексное, использование культурального к иммунофлюоресцентного методов ускоряет диагностику,повивает точность к информативность микробиологической диагностики туберкулеза,обеспечивает.надехный контроль эпизоотической ситуации по туберкулезу. 12.

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОМАТЕРИАЛА ОТ ЖИВОТНЫХ НА ТУБЕРКУЛЕЗ ИЗ ХОЗЯЙСТВ С РАЗЛИЧНЫМ ЭПИЗООТИЧЕСКИМ СОСТОЯНИЕМ

Исследование бионатериала от животных из хозяйств с различной степень» неблагополучия по туберкулезу показало,что в хозяйстве со значительна« (до 25) процентом заболеваемости у большинства (85%) животных поражения носили более тяжелый характер с распространенными формами процесса.3 основном преобладали животные с очаговый и инфияьтративнан течением туберкулеза (67,5%).

В хозяйстве с ограниченны« (10%) течением заболевания процент животных с поражениями составлял 58,9%.

Биоморфологкческая характеристика культур микобактерий,выделенных из биоматериала животных сравниваемых хозяйств после первичной аллергической диагностики,бала не одинакова. В хозяйстве с ограниченным течением туберкулеза в 30,7% случаев выделены бактериальные Форма никобактерий.из них у семи животных с очаговым,у четырех с инфильтративнам туберкулезом и у одного - без поражений.Ассоциация бактериальных и Л-форм микобактерий выявлена у 15,3% животных с очаговым и инфильтра-тивнын туберкулезом.Л-формы выявлена в 12,8% случаев от трех животных,не имеющих туберкулезных поражений и от двух с поражениями очагового характера, из них в 7,7% случаев - только методом непрямой имхунофлворесценции.

В хозяйстве со значительным процентом (25) заболеваемости от животных,реагиру-щх на туберкулин,бактериальные Форма микобактерий обнаружена в 20% случаев.В этом числе у животных с очаговым и диссеминированннн 'течением туберкулеза и не имевцих поражений туберкулезного характера.Из них у 10% животных бактериальные Форма обнаружены только методом непряной инмунофлворесценции.Л-формв вегетировали у двух больных животных с инфйльтратявнам и у двух - с диссеминированным туберкулезом (10%).Ассоциация бактериальных и Л-Форм микобактерий выявлена у 25% животных с йнфильтративнам и крупно-очаговым туберкулезом внутренних органов.

Через 60 дней провели повторнуп тубершинкзацив.Реагирувщ животных убили на

13

мясокомбинате.Туберкулезные изменения в тканях и органах носили несколько иной характер. В хозяйстве с ограниченным течением туберкулеза количество хивотных с пора-гениями очагового и инфильтратнвного характера уненьшось на 32,71 при увеличении количества хивотных без порахений.В хозяйстве со значительным распространением туберкулеза произоило уменьшение количества хивотных с очаговой и кнфкльтратквной Формами течения туберкулеза на 33,3% при увеличении количества хивотных без пора-хеккй.У двух хивотных зарегистрирована порахенкя крупно-очагового характера.

Следует отметить,что в обоих хозяйствах после вторичной туберкулинизацкн произоило увеличение в 2,3 раза количества хивотных,у которых яе обнарухено туберкулезных изменений. После вторичной туберкулинизации была определена динамика бактериальной популяции в биоматериале от хивотных обоих хозяйств.Количество хивотных, от которых исследован биоматериал,было практически равнозначно количеству ранее исследованных хивотных.

Так,в хозяйстве с ограниченным течением туберкулеза от 38-ми хивотных,реагиро-вавш на туберкулин, при втором исследовании методами посева и непрямой иммуноФ-лворесценции произовло снихение выделения и выявления микобактерий как в классической Форме,так и сочетания бактериальных и Л-Форм микобактерий за исклвчением биологически измененных Д-вариантов микобактерий,которые выявлены только методом непрямой иммуноФлворесценции.

Аналогичная тенденция по снихенив выявления и выделения микобактерий туберкулеза отмечена в биоматериале от такого хе количества хивотных второго хозяйства. Бактериальные Формы,обнарухеннне обоими методами,составили 42,1*.Сочетание бактериальных и Л-Форм микобактерий отмечено у девяти (23,61) хивотных с очаговым, у двух (5,2%) с крупно-очаговым,у грех (7,8%) с инфильтративннм течением процесса и у 12-ти (31,5%) без макроскопических порахений органов и тканей.

Всего было выделено и изучено 36 культур микобактерий в классической Форме,17 культур Л-форм микобактерий и 25 культур,представленных бактериальными Формами кк-

14

кобактерий я Л-форками.

При изучении куяьтурадьнах и биологических свойств культур хикобактеркй,находящихся в классической форме,выделенных из биокатериала от больных хивотнвх после первичной и вторичной туберкулинизации.все культура отнесли к микобактериям бычьего вида.Гибель кроликов свидетельствовала о вырагенной вирулентности выделенных культур.

Культурадьные свойства выделенных Л-Форк никобактернй изучали визуально в пробирках с посевами на средах Вшьниковой и Левенвтейна-Иенсена.Первичная генерация Л-колоний на первой среде появлялась обычно в конце второй недели в виде нех-ных,мелких как бы взвевеннах крупинок, варьирувщих в размерах от невидимого невоо-рухенным глазом до макового зерна.8 параллельных посевах на второй среде в некоторых пробах наблюдали рост точечных беловатых колоний,едва заметных невоорухенным глазом,вырастающих в больвом количестве.Они хорово просматривались с помощью луяа или микроскопа (БИ-51-21.

Кикроструктурные элементы Л-колоний,выросвих на плотной яичной среде Левенвгейна-Иенсена, больвей частью были представлена сферическими телами разного размера и оптической плотности и аморфными массами.При люминесцентной микроскопии препаратов Л-Форм,обработанных сывороткой к сферопластам,отмечено яркое периферическое и диффузное свечение части никроструктурных элементов микроколоний Л-форм.Встречались разнообразные клетки со светящимися гранулами преципитата в цитоплазме и ва-ровиднае образования с изумрудно-зеленая ореолон.

Первичные культура Л-колоний чаще всего состояли из обвирнах скоплений различных по Форме и размерам гранул с включением единичнах сферопластоподобнвх образований и варов.

Принадлехность выделенных культур к микобактериям определяли путем получения

ревертантов.Для этого взвесь Л-культур пассахировали через полухидкий агар Иколь-

никовой с одновременным ввсевом на среду Левенвтейна-Иенсена.Критерием.реверсии

¿5"

считали появление роста на среде Левш'тейна-йенсена.

Для получения реверсии приненили метод заражения морских свинок чистыми культурами Л-фори.Взвесь Л-форн в обьеме 0,5 мл вводилась подкожно или внутрибрввин-но.Через два месяца морских свинок убивали.При отсутствии патологических изменений в органах и отсутствии микобактерий в окраиеннах мазках-отпечатках проводили дополнительное заражение морских свинок и посевы на среды Левенвтейна-Иенсена и йшьнкковой. Методом биопробы на морских свинках было получено весть культур ре-верш тов.

Морфология клеток микобактерий ревертантов характеризовалась резко выраженным полиморфизмом.В одном препарате можно видеть отдельно лежащие зерна, очень короткие палочки, Фрагментирозанные или зернистые, иногда напоминавшие цепочки стрептококков. Классические микобактерии встречались редко, они неравномерно окраиивались по Цидь-Нидьсену, прячем зерна всегда были окрашена более интенсивно, чем палочки, что свидетельствовало о некоторой потере кислотоустойчивости.

Таким образом, исследование бкомагерша от реагирующего на туберкулин крупного рогатого скота из хозяйств с различной степенью поражения туберкулезом показало, что чем активнее проводились оздоровительные мероприятия, те« более разнообразнее измененные Формы микобактерий ваделявтся из биоматериала животных.При этом установлено, что в организме животных персисгирувг стабильные и нестабильные Л-Форны микобактерий.Наиболее характерной особенности возбудителя туберкулеза является выраженный полиморфизм, тогда как при диагностических исследованиях усилия практических работников направлена на выделение только типичных форм- возбудителя.

ПРИМЕНЕНИЕ КОМПЛЕКСА ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ В ЦЕЛЯХ КОНТРОЛЯ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ У ВАКЦИНИРОВАННЫХ БЦХ ЖИВОТНЫХ

Для изучения Форм и сроков перскстирования микобактерий БЦХ в организме животных и возможности дифференциации вакцинного гтанма Ш от полевых изолятов шя-

лексному микробиологическому,иммукофлворесцентному и биологическому исследовании подвергнута лнкФагкческке узди от 21 вакцинированного хивотного.реагирувщего на туберкулин,из пяти хозяйств области.В среднем возраст вакцинированных хивотных составил 4-5 лет, число реагирувщих на туберкулин от исследованного поголовья достигало 0,8%.

Морфологические изменения в лимфатических узлах носили характер гиперплазии лимФоидно-ретикулярной ткани. В них выявлялись единичные бугорки, имевщие теснув связь с расзиренной фиброзированной капсулой и состояние преимущественно из макрофагов.

При микробиологическом исследовании лимфатических узлов от вакцинированных с реакцией на туберкулин хивотных и органов зарахеннах этим биоматериалом морских свинок установлено следующее.В 16 наблюдениях были получены отрицательные результата. В одном из них при пассировании гомогената на морских свинках на пятом пасса-хе были выделены условно-стабильные Л-формы. Бактериальные Формы БЦ5 выделены в четырех (19%) случаях: в трех - из биоматериала от вакцинированных хивотных и в одном - из органов пассахных хивотных.В общей слохности выделено пять культур Л-Форм (23,8%),которые при последующих пассахах in vitro (в одном случае) и in vivo (в двух случаях) дали реверсию в бактериальные форма.

Методом иммуноФлворесценции Л-Формз были обнарухеяы в девяти (42,8%) случаях: в трех - из биоматериала от вакцинированных хивотных и в вести - в органах пассахных хивотных. Бактериальные формы выявлены в вести (27,6%) наблвденш.

Все выделенные' культуры микобактерий и ревертантов Л-Форк подвергали углубленным бактериологическим исследованиям,дополнив их методом непрямой иммуноФлворесценции. Необходимо было исключить среди них вирулентные бактерии бычьего вида, представителей атипичных микобактерий и доказать принадлежность культур и ревертантов к микобактериям БЦ1.Культура изучали с точки зрения их морфологических свойств,биологических особенностей,лекарственной чувствительности,вирулентности и

14

видовой прикадлехностн.

На среде Левенвтейна-Иенсена типичная культура росла в виде сухой морщинис колонии светлого цвета.Ори окраске по Циль-Ккльсеяу палочки были ккслотоуп нве, полиморфные,содерхали зерна.

Несть культур,отнесенных к категории измененных,получены из лимфатических лов привитых хивотных и органов морских свинок пятого и иестого пассахей и в ка стве ревертантов из нестабильных Л-Форм при пассировании кх на средах без Л-гра Формирующих агентов.На хидких средах отмечался рост в виде хгутообразных скоп ний.что указывало на наличие корд-фактора.Реакция нитратов была отрицательной, говорит о принадлехности всех исследованных культур к возбудителю бычьего вида.

Три культуры росли в виде вероховаш со светлым центром колоний свегло-кре вого цвета,при экспозиции на свету приобретали хелто-оранхевай пигмент (Фотохро генные). При окраске мазков по Циль-Нильсену они представляли собой смесь (кис то- и некислотоустойчивых) палочек.

По отновенкп к редукции нитратов, наличию корд-Фактора, характерной лека твенной чувствительности,слабой вирулентности для морских свинок они были отнес к пигментированный вариантам микобактерий БЦХ.

Две другие культуры,такхе отнесеннве к категории измененных,получены как вертанта нестабильных Л-Форм из биоматериала от хивотных 3-4-летнего возраста, культуральным и биохимическим свойствам они ничем не отличались от микобакте БЦХ. кроме наличия в их составе микробных популяций отдельных некислотоустойчи (синих при окраске по Циль-Нильсену) особей, сохранившей в процессе неоднокр ного субкультивирования культур.

Шестая культура,являющаяся такхе ревертантом нестабильных Л-форм,состояла смеси типичных, светло-кремовых и ярко-оранхевых колоний, представленных клетк кислото-и некислотоустойчивых микобактерий. Отмечалось почти полное соответст лекарственной чувствительности исследованных культур и контрольного втамма ми \ъ

бактерий БЦ1.

Наряду с бактериальными формами в пяти случаях били выделена микроорганизмы, отнесенные г. Д-Формам микобактерий туберкулеза, три из них оказались нестабильными я после 2-3 последующих пассажей без Л-трансФормируищих агентов давали реверсия в бактериальные форма микобактерий БШ. Ото послужило прямым доказательство!? их видовой принадлежности к никобактериям туберкулеза.

Применяемые в настоящее время рутинные методы исследования (бактериоскопия и посев), не всегда позволяют получить адекватную и быструю информацию об истинном наличии возбудителя в биоматериале животных.А поскольку отрицательный результат микробиологических исследований является в определенной степени критерием оценки специфичности туберкудинозой пробы,то выявление нерегистрируемах куяьтураяьннн диагностическим методом вариантов возбудителя туберкулеза имеет важное значение в эпизоотической оценке стад крупного рогатого скота по туберкулезу.

ВЫВОДЫ

1.В хозяйствах Амурской области с 1986 по 1988 гг. отмечена напряженная эпизоотическая обстановка по туберкулезу крупного рогатого скота.Туберкулез установлен в 46-ти пунктах 28-ми хозяйств пяти районов.По уровню распространения заболевания бодминстао неблагополучных пунктов отнесено к категории с массовым распространением туберкулеза (49%).Заболеваемость животных в пунктах достигала 36,2%,причем заболеваемость коров бала вале,чем молодняка.

2.В зоне наивысвей интенсивности эпизоотического процесса туберкулез установлен патологоанатомически и лабораторными методами исследований с выделением культур микобактерий бычьего и человеческого видов.

3.В ряде хозяйств области (11,3%) у крупного рогатого скота зарегистрированы парааллергичеше реакции.При убое реагирующих на туберкулин животных поражения, характерные для туберкулеза,отсутствовали.Бактериологическим исследованием би-

ÍÍ

оматериала выделена атипичные микобактерии.В таких стадах показатель сенсибилиз цик коров выей,чек молодняка и варьирует в пределах от 0,5 до 13,41.

4.В хозяйствах,где инфекционный процесс находится в стадии развития, кабдядае ся пряно пропорциональная зависимость .чехду частотой диагностических исследован и заболеваемость»!.В хозяйствах.гае квФекиошй процесс потерял остроту точ ния.зависимости заболеваемости от кратности туберкудинизации не отмечается.

5.Комплексное исследование биоматериала от хивотных,реагирующих на туберкул без подтверхдения туберкулеза на вскрытии,бактериологическим и инмунофлюоресцен нам методами повивает результативность обнарухения бактериальных форм микобактер до 27,6%,а Л-форм - до 42.8%.

6.Применение культурального метода и метода непрямой иммуноФлворесценции в ц лях контроля аллергических реакций у привитых вакциной БИ1 хивотных позволяет у> тановить персистирование вакцинного втамма микобактеркй в различных биоморФолог ческих Формах и исключить инфицирование хивотных возбудителем туберкулеза.

7.Дополнение схемы микробиологической диагностики туберкулеза непрямым метод иммуноФлворесценции для обнарухения типичных и измененных Форм никобактерий тубе кулеза на 10,7$ повывает результативность диагностических исследований, значитель уточняет эпизоотическую обстановку и способствует активному проведению противот беркулезных мероприятий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ П Р Е Д Я О X Е Н И Я

1.Рекомендации "Дифференциация туберкулиновых реакций у крупного рогатого сю та'.Утверхдены Ученым советом ДадьЗНИВИ (протокол К 3 от 10 марта 1989г.).Одобре; НТО Агропромсоюза Амурской области(прогокол N 2 от 30 мая 1989г.).

2.Рекомендации "Бактериологический контроль при проведении аллергических иа ледований на туберкулез крупного рогатого скота".Утверхдены НТС Агропромсою: Амурской области (протокол N 2 от 26 ноября 1991 г.) и секцией ветеринарии Д!

¿о

PAGXH (протокол К 1 от 15 января 1591 г.)

3.Рекокендации "Выделение и индикация L-Форн микобактерий туберкулеза хивот-нвх". Утверхдены Ученый советол ДальЗНИВИ (протокол Н 9 от 14 ноября 1990г). Одобрена научно-технических советом Агропроксопза Амурской области ( протокол К 2 от26 ноября 1990г. I и секцией ветеринарки ДВО . PACXfi { протокол S 1 от 15 января 1991г.1.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ Р А В О Т

1.Макаров S.А.,Гаврилова Г.А. Особенности эпизоотической ситуации по туберкулезу крупного рогатого скота на Дальнем Востоке // Ветеринарная наука - на слухбе АПК: Тез. докл. областной научно-производственной конференции. - Благовещенск, 1983. С. 23-24.

2.Макаров 0.А.,8асхльченко Г.А..Гаврилова Г.Л..Мандро HJ. Результаты исследований на туберкулез в неблагополучном районе // Сб. науч. тр./ Инфекционная патология с.-х. хивотнах на Дальнем Востоке. ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние. ДальЗНИВИ.-Новосибирск,1988. С. 17-21.

3.Хакаров I.A..Гаврилова Г.А..Макарова И.И..Лещенко Г.В. Имнунофтресцентный метод при диагностике L-форм микобактерий туберкулеза //Сб. науч. тр./ Эпизоотология, диагностика и профилактика туберкул, и бруцелл. хивотнах. ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние. ЙЗВСиДВ. -Новосибирск,1990. С.76-77.

4.Макаров S.A..Гаврилова Г.А..Вашьченко Г.А.?Леценко Г.8. ^специфические туберкулиновые реакции в хозяйствах Дальнего Востока //Науч.-техн.бил./Вопроса эпизоотологии.диагностики к мероприятия по ликвидации инФек. болез. с.-х. хивотнах.ВАСХНИЛ. Сиб. отд-ние. ДальЗНИВИ.-Новосибирск,1990. Вып 1/2. С. 8-11.

5.Накаров в.А..Гаврилова Г.А..Вашьченко Г.А.Добяков A.C. Лабораторией контроль при проведении аллергических исследований хивотнах на туберкулез //Науч. -техн. бял./Инфекционная патология с.-х. хивотных и пчел на Дальнем Востоке,ле-

и

чение к профилактика.РАСХН. Сиб. отд-ние. ДальЗНИВИ.-Новосибирск,1991. - Вып. С.7-9.

6.Гаврилова Г.А. Выделение микобактерий из биоматерхала от реагирувда на беркулин хквотных без подтверхдения туберкулеза на вскрытии // Проблемы ветерин ного обеспечения хивотноводства Дальнего Востока : Тез. докл. науч. сес,- Благо ценск, РАСХН. Дальневост. отд-ние. ДальЗНИВИ,1995. С.13.

7.Васильченко Г.А..Макаров S.A..Гаврилова Г.А.Эпизоотология и основные напр ления научных исследований по туберкулезу крупного рогатого скота на Дальнем Bi токе //Проблемы ветеринарного обеспечения хивотноводства Дальнего Востока:Ti докл. науч. сес.- Благовеценск, РАСИН. Дальневост. отд-ние. ДальЗНИВИ,1995. С.И

8.Гаврндова Г.А. Определение микобактерий методом посева и инмунофлворесцен! из биоматериала от реагируврх на туберкулин хивотных //Основные научные иссле, вания по проблеме туберкулеза и бруцеллеза с.-х. хивотных,профилактика и органи: ция мероприятий по ликвидации болезней в регионе Сибири: Тез. докл. научно-пра1 конф. 12-13 ивля 1995 г.-Новосибирск,РАСХН. Сиб. отд-ние. ИЗВСиДВ,1995. С. 73-7'