Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Лабораторная оценка производственной пригодности штаммов вируса ящера (на примере семи штаммов типа SAT-1)

-----------; ----- ^ министерство сельского хозяйства"" ""

■И ПРОДОВОЛЬСТВИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

всероссийский научно-исследовательский

— . институт ЗАШИТЬ! ЖИВОТНЫХ

На позе»* рукоп"С" УДК 619:576,858.43:576.8.09?.

РАХМАНГУЛОВ Михаил Таусонович

ЛАБОРАТОРНАЯ ОЦЕНКА ПРОИЗВОДСТВЕННОЙ ПРИГОДНОСТИ ШТАММОВ ВИРУСА ЯЩУРА (На примере семи штаммов т.^па ЗАТ-1)

18,00.03 - еетеримарная микробиология, вирусология, эпизоотология, . микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой стенени

кандидата ветеринарных наук

Владимир -1993

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных, г.Владимир.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ; доктор ветеринарных наук, профессор Ю .А.Черняев.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

- МИЩЕНКО Владимир- Александрович - доктор ветеринарных гаук, старший научный сотрудник (Всероссийский научно -исследовательский институт защиты животных, г.Вла-

оимир;;

- ЧЕВЕЛЕВ Сергей Федорович - кандидат ветеринарных иау.<, старший научный сотрудниц (Всероссийский научно-исследовательским институт ветеринарной вирусологии и микробиологии, г,Покров).

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: Научно-исследовательский ветеринарный институт (г. Казань).

Защита состоится 1 апреля 1993. года в ЛО_ час. на заседании специализиро )го совета К 120.60.01 по защите диссертации-на соискание ученой степени кандидата наук при Всероссийском научно-исследовательском институте защиты животных по адресу: 600900, г.Владимпр, п/о Юрьевец, ВЬШЗЖ.

• С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан" та 1993_ года. -

Учстг.) секретарь спеанализн-роьннхдго соссы, доктор ветери-нирных\шук, про фес сор

В. Л.Уз юмов

1___________-------------------------------

------------------------- Г. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

■Актуальность темы. Исследовали«, направленные" на соеершенствование и удешевление прэ.изоодстеа средств специфической противоящурней гтроФигмктики (s частности, резервных .вакцин против экзотических типов вируса) язляегс» еажней задачей прикладной-ветеринарной вирусологии.

Пвоиесс- изготвмеиия вакцины -включает з " себ* зсхййных агам» тея«. как: ,еыОор антигена, его наработка, составление препарата и испытание на нммуногениос.ть. При этом выбор перспективного производственного штамма вируса, оценка вирусного сырья на любом из перечисленных этапов и оценка конечного продукта представляют собой достаточно ¿ложную научну» задачу, которая предполагает ыоде-лирование основных производственных процессов и метоцо-логкческое обоснование избранных подхчдос. О'^еидно, что :яа;;!ым принципом, «аучнкх разработок такого ролл я-даст -•0?. создание достаточно надежных и экономически гффркгиь-Jb« яаоос-j терны« мзтссов. ¡3 связи с этим нроЗлема ллбера-;ооной оценки производственной пригодности штаммов вируса ящура является актуально«.

Обоснс шие направленна послеяотний. Опыт ис-v-еаовательской рабогы'(П\уеуегпати М.М. el al„ 1973; Pay T.W.F., Thaimann G, et al,, J987) показывает, что конкретный . соусный материал, в -аспекте-производственной-пригодности, хеяет быть охарактеризован со следующих позиций:

;}t Стабильность структурного состояния-антигена (соот-. Бетствие структуры капсида завершенному еириону-и сохра-ее.целостности при воздействии различных Физико-хи--.^'i..ikv'x факторов, обусловленных технологией проиаводст-

Эффектность иммунного воздействия единицы антигомологичной иммунной - реакции организма ливоткого на единицу массы антигена).

2 . .

3, Эффектность гетерологичных иммунных реакций снугри данного таксономического типа вируса (свойство антигена индуцировать возможно более широкий спектр гете-ролсгичных иммунных ответов).

Главным условием реализации перечисленных требований была бы разработка надежных лабораторных методов, позволяющих' получать достоверные опосредованные оценки, где могут Сыть выделены следующие основные направления: а) оценка антиген-обусловленных факторое, влиявших на иммучиыи ответ; б) выбор параметров иммунных реакций организма, доступных к количественной регистрации.

По сесему морфологическому составу вирусная популяция неоднородна (Сооко А.И. и др., 1974; Hardy М.М. el а!., 1901; Doe! T.R. fit а!., 1982). Наиболее иммуногенчыми являются вирусные частицы завершенной структуры ■ (Криво-ва Т.С., 1972; Doei metal., 1982).

Широко известными . методами оценки концентрации й' структурного состояния антигена являются: проточная спектро-фотометрия, количественная РСК и электронная микроскопия. При этом последний представляется менее трудоемким и более перспективным.

Учитывая зависимость иммунного ответа от структурной ' целостности антигена {Brown F,, 1978), исследования, направленные на оценку устойчивости вируса к воздействию физико--хкмических факторов, обусловленных технологическим процессом изготовления вакцин {оценки терморезистентности, резистентности к эмульгированию и сохраняемости зарезервированного вируса), являются важными {Anderson Ь,С. et al„ 1082; Михалишин B.D. и пр..

Установлено, что для создания определенного уровня гомологичного иммунитета в отношении различных типов вируса требовались .неодинаковые дозы -соотеететьующих антигенов (Ефимов Н.И., 1987; Uebermsnn Н. el а!.. 1383; Pay T.W.F. et а!., 1983). Оозмбжко, что различия величин удельной иммуноген-иосги сакци«*, в :'ом числе и е«у?ри таксономического типа

вируса, могут бытьобусловлены - свойствами^"конкретных" - штаммов (Pay"T.W.F., 1985; Eslerchuysen J.J. ei al„ Ш). Поэтому исследование иммунной, индукции однотиповыу штаммов в сравнительном аспекте представляется актуальным.

Опосредованные оценки защищенности животных, основанные на нейтрализующей способности антисыворотки, считаются наиболее важными (Amado?) M, eî al., 1984; Thalinarm G. el al., 1987) и в некоторых странах выступают в качестве референтного показателя иммунного статуса вакцинированных животных (Capsiick Р.В„ 1931; Thaîmann G. et al., 1337).

В связи с стим представляют практический интерес исследования, направленные на изучение сравнительной эффективности иммунного воздействия одинаковых доз однотиповых антигенов как на стадии первичной клеточной реакции (тест бласттрансформации лимфоцитов), так и на стадии развитого гуморального иммунитета (тесты иммуноферменгный и сс-роредукиии бляшкэорразсваний).

'Весьма перспективным представляется использование оценки величины нейтрализующего действия цельной антисыворотки, которая может быть вычислена на основании регрессионной модели реакции сероредукции вирусных'б ля-. шек (Кулаков В.Ю., 1987) и позволяет прогнозировать развитие инфекционного процесса в иммунном организме (Гнева-шевВ.М. и др., 1991).

В рамках перечисленных общих положений была поставлена : цель исследований и Сформулированы конкретные задами.

Цель исследований. Обоснование лабораторных методов, позволяющих произвести предварительный отбор штаммов вируса ящура для использования их "в производстве и.нактивированных вакцин. •• • Задачи:

1. Провести сравнительное исследование нескольких штам-' мсв по сохраняемости вируса в составе зарезервированных ра'еплодок, терморезистеитностм м резистентности, к процедуре эмульгирования.

2. Усовершенствовать методику оценки концентрации вириоиоз с помощью электронной микросколии для более точного определения . массы иммунизирующего антигена (структурного белка вируса) в единице об'ьема,

3. Произвести* сравнительную оценку иммунного ответа лабораторных животных на' одинаковые дозы исследуемых антигенов.

3.1. Срг:2нит.ь гомологичную антиген-зависимую степень активации спленоцитов мыши по количеству ассимилированное 3|Н]-тимидин Сй-метки в тесте бласттраисформации,

3.8. Провести сравнительную оценку гуморального иммунного ответа морских свинок в серологических тестах.

3.2.1. Сравнить гомологичную антиген-ассоциативную, эффективность антксывороток . в иммуноферментном тесте.

• Обосновать принцип оценивания теста. .

3.2.2. Сравнить гомологичную нейтрализующую эффективность антисыворотак в тесте сероредукции вирусных бляшек. 8 качестве .результирующей оценки использовать показатель ожидаемой эффективности реакции цельной антисыворотки.

3.2.3. Определить'корреляцию резупьтатов, полученных в тестах БТ,"ИФ и СБ.;,' * •

3.2.4. Сравнить гетерологичную нейтрализующую эффективность'. антисывороток в тесте сероредукции вирусных бляшек, Обосновать "показатель антигенного спектра, штамма как-статистическую оценку контраста соответствующих гомо- и гетерологичных реакция? ' •

4. Изучить возможность применения обобщенного показателя (формулы); отражающего антигенные свойства штамма с учетом ожидаемого гетерологичного эффекта' внутри данного таксономического типа вируса.

5. На основании проведенных исследований произвести предварительный" отбор наиболее перспективного штамма вируса и рекомендовать его для использования а прокз-еодйтье резервймх инеути^фоваипых вакцин против ящура типа 5АТ-1.

--------Научная -.мюягпагВ "срйнйтёльном аспекте были изучены- антигенные я' некоторые физико-химические свойст&а семи штаммов вируса ящура типа 8АТ-1, . ' " ! В процессе исследований был модифицирован ряд известных и разработаны новые методы: •

1. Хсовершенствован метод оценки ксиценграц/',; ькрчо-ноз средствами. элехгроннои микроскопии, позволяющий рассчитать удельную массу антигена.'

2. Предложен способ оценки резистентности вируса к процедуре эмульгирования. Целостность вирионов в'эмульгированных' пробах может быть точно измерена по остаточной бляшкообразующеи способности вируса.

3. Предложена процедура обработки результатов титрования антисыворотки в непрямом твердофазном иммунофермент-ном тесте с иммобилизованным антигеном (регрессионная модель реакции). •

4. При известной иммунизирующей лозе в тесте сероре-дукции вирусных бляшс-к установлена оценка гомологичной нейтрализующей аффект иьности цельной ¿птисывор'ожи, которая мохе г быть ислолозоеана в качестве показателя относительной антигенности штамма.

5. Предложен комплексный показатель "минимальной* ожидаемой эффективности гетерологичкой реакции, включающий . оценки * относительной, антигенности и широты' антигенного спектра, который- может быть использован в качестве знутритиповой характеристики антигенных свойств штамма.

Практическая значимость. Отобран и рекомендован . для использования в . производстве• инактивированных вакцин штамм вируса ящура 8АТ-1-813-2/53. .

^ Лабораторный метод- комплексной оценки произволетвен-•ноя пригодности штаммов вируса ящура позволяет отбирать наиболее перспективный производственный штамм и может быть рекомендован к использованию в научно-исследовательских учреждениях и ' на биопредприятиях, занимающихся ; изготовлением противоящурных инактивированных вакцин.

Усовершенствованная методика оценки концентарации ви-рионов и структурного белка вируса средствами электронной микроскопия позволяет достаточно точно определить концентрацию вирусных частиц и рассчитать массу структурного белка в единице объема.

Кроме этого данный метод представляется менее трудоемким и болей оперативным.

Регрессионная модель реакции в ИФ-тесте имеет достаточную адекватность и может быть рекомендована как для практических, т-v и научно:исспецовательских работ, сея-ааяных с необходимостью количественном оценки активности иммунных сыеоротс-;-: по отношению к различным антигенам.

АирэШт рзвоты. Основные материалы диссертации доложены.' на научно-теоретической конференции молодых .ученых ВИН ЯН (г.Владимир, 1990) и на научной конференции ВиИИВВиМ (г.Покро?, 1S&).

Публикация. Материалы диссертации изложены в 4 научных работах, опубликованных в 1990-1992 годах.

Обьсг! и структура работы. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста, состоит из зведения, обзора литературы,, собственны)? исследований, обсуждения результатов, еыводоз и практических предложений, иллюстрирована 10'таблицами я 7 рисунками. Список ислользобйн-ной литературы включает 176 наименований, из них 50 источников на русском языке и 128 работ зарубежных авторов. В приложении преде 1.авлены: таблицы, дополняющие -результаты отдельных эксперимент се; краткий обзор эпизоотологии ри-руса ящура типа SAT-1; 2 методики, обоснование штамма

Паложтш, выпоенные ¡;в защиту:

1. 'Результаты сравнительных исследований ангигенны) свойств и' неяок'ры;-: признаков, характериаукди'ич устойчи воет* с[руктурного сос("оянмя актами.- семи штам-юв сиру сй «аура типа SAT-} (НУ; SWA; SR; SA; №'86;;№ 1Ы?: № 383 к фи&ико-химичй- щж факторов.

, _ 7 :___________::____________________

------------¿."""Методические" подходы к сравнительному лабораторному оцениванию пригодности штаммов вируса ящура . для использования в производстве инактизиропанных вакцин.

3. Обоснование выбора штамма вирусз ящура SAT-Î-SR-2/58 как наиболее перспективного для использования в составе инактивированных вакцин.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Вирус. Штаммы вируса яшура типа SAT-1 (аз коллекции ВНИЯИ): RV 11/37; SWA 1/49; SR SA 13/61; № 96; № 155; ■ № 389 в виде расплодок в первичной культуре почек поросят. Инфекционная титр вируса выражали в бляшкообразуящих единицах (БОЕ) через 48 часов инкубации при +37°С.

Подопытные животные. Мыши - сичгенные половозрела особи линии BALB/c, массой 18 г; морские свинки - клики-чески здоровые животные массой от 350 до 5.00 г.

Культура илзток. Монослойная перзич!!о-трнпсинияир.ог,йп-язй культура клеток почек поросят (СП),

Растворы и реактивы. Типовые рас;воры для вирусологических исследований: î/!5 и 1/50 M фоефатко-буФерньш раствор, рН 7,4-7,6 (ФБР); 0,5% пшролизат лактальбумина на растворе Эрла или Хснкса, рН 7,4 (поддерживающая среда для культур клеток); агаровое покрытие для культур клеток, содержащее около 1,5% агара на поддерживающей среде (бакто-агар фирмы "Dilco"); полизтиленглнколь фирмы "Merck*, ' М-8000 (ПЭГ); аминозтилэтиленимин (АЭЭИ); ' чеполмй масляный апъхжам ВНИЯИ, серии 3310.

Onews сохраняемости инфекционного вируса яри ■y'fC. Прсбы культуральноя зирусссдержащея жидкости (ШО s объеме 20-30 мл выдерживали в герметична закрыть« флаконах (заполнение 2/3 флакона). Через фиксирован-

• _ " 8

ные интервалы времени {7< 17, 30, 45, 60 nnef¡) оценивали титр БОЕ вируса.

Оценка вируса ло признакам тармостабильности и резистентности к процедуре эмульгирования. Термостабильность вируса'определяли-в 1/50 М .ФБР при. +5о°С в течение 5. минут. Резистентность к процедуре эмульгирования оценивали при условиях," соотве-тствуюшкх технихе приготовления эмульсионных вакцин. Исследование данных признаков производили с инфекционным вирусом Сценками обоих тестов являлись значения лагарифмических разностей (А =■ Xj - ц) инфекционных титров в контрольной (х0) и обработанной- (Xj) гробах. -

Kcnusurpuposamie вируса, Вируссодержащую культураль-яую жидкость, очищенную последовательной обработкой поли-'этиленимином (0,'^í) и хлороформом (2%), концентрировали стандартным спосооом 10% ПЗГом в 50г70 раз.

Инактивнроааииа вируса. Смесь концентрата вируссодер-жашей суспензии и 0,05% АЭЭИ в режиме перемешивания выдерживали при +?7°С в течение 24 часов, контроль на авиру-лентность производили в культуре клеток СП. .

Оценка концентрации антигена {расчет массы структур-ноТо белка вирионоз). Согласно разработанной методике в «»активированных .препаратах средствами электронной' .мик-' роскопии- определяли концентрацию вирйонов и, рассчитывали массу антигена в единице объема.

Реакция Бюягёиспецифическоя пролиферации г мало гнч-¡ю-сепсибнлиниррштых лпмфоидных уж, ох ыи'ши. Оценивали пролиферативну» активацию (блаеттрансформацию} спленоци-тов мыши, презе^гироЬамиых fn то за 0 суток до эксперимента (иитргперитониалонпя инъекция равных _рб;.»мов .полного адъшаита Фрейнда я антигена в дозе 3,4!-Ю9 вириоНУмл,' т.е. .около '¿i na) и культивируемых е течение 3-х суток' ¡n vino о присутствии 10-кратного разведения гомологичною антигена по количеству ассимилированной клеточним

тггомом' "^Тимидйй бо-метлч. песенкой б преСы ->а ?А '•'•/"■з пс анализа (5?пий СЬ., 1873).

Величину' излучений Пр ^^-/.ТОВ куяь~'«-:<5ПровЗПМЙ шнняа го-л'лт!ЦП!1 клеток г.»тли ой-, кой блзс.'трансформирующего зюлгктя (?.'импуяьс,'у.'":}.

у:?.:а испытзкил к;; лого е кт;:г г иг1 ь к::;:!;;-'пг

¿¿/¡И 4-Х-ЖИВОТКЫХ.

Шм»»««»™ ¿ниш»*

ип я '

"„"."_ .....................п «:••-

,,гяо? "^ульс;:;;;;;;,;*. бс-лцкя вводили знутримышечно .з объеме 2 мя (поза - 3,41-109 вирион/мл, т.е. 23- пд). Для испытания каждого образца вшшны использовали по 3 животных).

Получение иммунных с ызов о тек {антиоийоро)он} морских сванок. Сыворотки иммунизированных животных, полученные на 40-й день после вакцинации, инактивировали при +5С°С 'з течение 30 минут.

г-гуг.г>ф':-у-:е:1:п№; И С "О¿О!1 1.'!". у ! ЧД,1р I Иг!'.'!

•л., с; г. г...- елномю.-с < л о гнн: „'■!:■■:■ т.и'-мму о^ф^оу

'•-■.уг-_ С "У: ■

■ограмем ^¿¡¡т::с:.: ас;,т.у

■.о;7; \о;:цен!ра. :;и с;--.;-то 1 яз лунчу, у ••сф;:.',липли ме- .»••>-й -поусялй'оН к;:ол>*ч .:итн --;ч;улиг! моро-:;х ссь'юк.

. Реакция сероредухшш вирусных бЛ№ех*Ш*щ<;%, п '/.г.:-; ^п"::;;,;; г.?г:-""-'и. ;'т;,т-

••/•*• С'с икфемшнность ви-

русз(оце»ивали по эффективности Оляшкообразования.

» Обработка результатов зхелеришвто?. В работе мс-гюя&йоааяи- типп?ыда се - •;••?£

«г»• срйала йдоеиоукмциу перемечи^'. тг.; - , мо..........сс ; к:-¿ясли»', ".орзгяпцаонву«* ч

у- (Диэдрии К.П., !зб2, Плохинсккя НА,

1070; Захс Л,, 1976; Поллард 1882; Мвллер П и др., МГУ). . • - . -

- . _ 10

2.2. Результаты исследований.

2.2.1. Контроль репродуктивных свойств штаммов.

В процессе наработки вирусного материала в культуре клеток СП на втором и третьем пассажах исследовали контрольные пробы культуральной вируссодержашей жидкости (КВЖ). Оценивали величину накопления инфекционного вируса и время наступления 76-100% цитопатического. зффек-. та (ИПЭ).

Из полученных данных следует, что репродуктивная способность изученных штаммов как на втором, так и на третьем пассажах имела опредленные различия (/><«0,05) Наиболее активным был штамм БП ()д БОЕ/мл 7,46*7,52; время .ЦПЭ 16,5*18,3 часа), а штамм Н* 389 (6,45-7,02; 21,2*22,8) наименее активен.

Коаффициенты вариации соответствующих оценок, полученных при повторных расплодках составляли около 15%. Это свидетельствовало о том, что в процессе исследований изучаемые штаммы достаточно стабильно сохраняли свойственны« им уровень биологической активности, .

2,2.2. Исследование свойств штаммов, отражающих . устойчивость вируса к внешним воздействиям

Используя инфекционной вирус исследовали резистентность мруктура йириояов к воздействию физико-химически* факторов.

Изучали сохраняемость инфекционного пируез пря- +4°С ь течение 60 дней, терморезиогептиоогь при -;550С и резне тентностгь к процедуре омулшфоеаиия.'

Оцс-иивали регрессионный характеристики динамик! сохраняемости вируса и величин контрасте титров контроль ных и обрааогакных пруй в тестах 'терморезистентиости резистентности к'процедуре эмульгирования,

. .___________11 , , .. _______ , _____ _ _____

Установлено, что

1. В тесте на сохраняемость при т4°С на литром участке ,(45 дней) падения титров регрессионные коэффициенты инактивации вируса не имели существе:-. (р^0,05) различий; ''

2. Все исследуемые шгаммы относились к кат^ории тер-молабйльных, однако обладали статистически.равными показателями чувствительности к кратковременному проиеьанис при+55°С (ДТ55);

3. Оценки устойчивости вируса к процедуре эмульгирования (ДЭм) оказались весьма незначительными и при взаимном сопоставлении не имели существенных различий (р=£0,05) и для 4-х из 7 изученных материалов не были статистически значимыми, так как находились в пределах ошибки эксперимента.

Кроме этого, в отношении данного т;:ста важно отмерь, что вирусные частицы очевидно не были связаны с эмульсионными глобулами, поскольку при титровании способом последовательных разведений контрольные и эмульгированные пробы вирусных суспензий демонстрировали одинаковую линейную зависимость между величиной разведения я титром ВОЕ; ■

4. Коэффициенты корреляции соответствующих резуль-• -тагов, полученных е перечисленных тестах, составили (в

скобках дана стандартная ошибка коэффициента и число измерений): к и дт55 • 0,24 (0.19; 23); к и ДЭм - 0,50 (0,25; 23); ДТ55.И ДЭм - 0,03 (0,19; 28). Ни один из показателей статиити-- ческой значимостью 05) не обладал; ~

. 2.2.3. Оценка концентрации антигена (расчет массы •'■ , ......... структурного балка вирионов).

„,,.;... За основу была принята 'Методика определения количественного и качественного состояния вируса ящура с ло-, мощью электронной микроскопии*. (Пономарев А.П.. и др.,

1987) способом "отпечатка" на препаративной пленке-подложке жидкого вируссодержащего материала. .

В процессе работы методика была модифицирована: во-первых, процедуру "отпечатка" препарата заменили его высушиванием в заданном объеме (5 мкл) на плоскости-подложки; во-вторых, для получения оценочных характеристик исследуемой пробы поле обзора масштабировали по диаметру ви-риона {25 нм). - *

Общая формула оценки концентрации (титра) вирусных частиц имела вид:

'Г/мл - х-1/(аФ.с) ' ' . ' _ (1) гпс- Г/мл - титр вирусных частиц в мл (вирион/мл}; X - средне 'число вирионов. наблюдаемых в окулярном поле микро-ско.та; п, Ь, с - горизонтальные и вертикальные параметры .препарат единичного наблюдения в объективном масштабе (см).-

Практически, при окулярном размере вириона около 1,3 мм, масштабе окулярной рамки 60 * S0 мм,-расчеты производили, используя формулу 2.

Ig Т/мл * ig X + 8,852 (2)

где: 8,852 - Ig n/(a-b-c); а - 0,0001152; b.- 0,0001728; с = 0,0707355;Т, X-см. формулу 1.

Располагая -сценкой Т вирион/мл, на основании известного веса, структурного белка вириона (ш =. 0,95-Ю'11 мкг или ig и ® -11,02), по формуле 3 рассчитывали1'массу белка вируса ь единице объема. • ■ .

М (мкг/мл) = anlilg (ig Т -11,02) (3)

где М - масса структурного белка вируса в единице объема.

2.2,4. Исследование иммунологических свойстй

■ штаммов

Иммушг/о реахцию на изучаемые антигены бцечиз.^ш на лабораторных животных, аля которых соотсетстЕутцм;-акции считали адекватными естественно-восприимчивым жи-вотнам,иа клеточном и оргйниоме»ном уровнях,

Наиболее важным аспектом работы было сравнение воздействия одинаковых доз исследуемых антигенов.

Перед использованием в эксперименте все материалы приводили к одинаковой концентрации* которая составляла 3,41-109 вирион/мл. т.е. около 23 пд/мл.

2.2.4.1. Амтиген-заеисимый-эффект блаеттрянофор-

мации гомологично-сенсибилизиронакнмх еппенаиятов

МЬ'-ШИ.

В тесте бласттрансформации лимфоцитов (ЬТ-тест) на модели белой мыши производили сравнительные исследования реакции иммунскомпётеитных клеток на изучаемые антигены. Показателем специфической активации спленоцигов приняли величину контраста (АД ■» - £<>) остаточной радиоактивности между контрольной (0о) и опытной (3i) культурами.

Было установлено, что равные дозы' изучаемых антигенов индуцировали различную степень первичной, иммунной реакции организма. -Наименьшая пролиферативная реакция сплсноцитов 'была вызвана антигенами штаммоз RV (2,83) и SWA (4,08). Остальные штаммы обусловили большие, но статистически взаимно неразличимые показатели реакции, среди которых формально наибольшими 'Значениями обладали антигены SR (7,73) и SA (8,55). Крайние оценочные показатели различались приблизительно е3 раза (рис, 1).

■ ю4

ЙУ Н-1ББ №389 №АБ ЗЯ 8Л

Рис. 1. Распределение средних оценок показателей эффективности Сласттрансформации . гомологично-сексибилизкро-венных спленоцитов 'мыши соответственно изучаемым штаммам, полученных в БТ-тесте,

2.2.4.2. Поствакци'нальньш гуморальный иммунный • ответ морских свинок.

Исследовали поствакцинальный гуморальный иммунный ответ морских свинок (группы по 6-8 животных) на одинаковые дозы изучаемых антигенов в составе эмульсионных масляных вакцин. Антиген-ассоциативную и вирусиейграли-, эуюшую эффективность ан.тисывороток I'л уШо считали^ характеристикой иммукного ответа на организменном уровне.

. 2.2.4.2.1. Гомологичная антиген-ассоциативная ; • - • эффективность антисывороток в иммуноферментном;.

тесте. ■ ллГ ~

Для нахождения и обоснования пригодных к сопоставлен-ни» количественных характеристик . (показателей эффективности) антиген-ассоциативного процесса, при титровании аи- • тисывороток произвели разработку формализованной моде- . ли реакции (рис. 2). Данная модель предполагала преобраг

соответствий.. с ьеличинами рагведекий актисьтороки (х. • гдэ Ео и'Еф • оценки "нижнего" и •верхнего'"' ппато соответственно.

о. Модель рга*>ш (эмпирический кнтервая. х^х^). Рбфзс-сия параметра опи^сского ответа (у|=1п 1я по пара-

метру ' 'концентрации ачтксыеоротх» (х). Точечная оцени2 37%-;>ф-фет ("титр" лчтясыгоротки).

Гамоло; ичная рэахция антясыйорстки, полученной иа штамм К У с соотаетстсувшш антигеном,

зоеание (формула 4) показат-еля эффекта (Е, оптические есииииы) взаимодействия в процент от максимальной- оценки рвении (Ео) в 'зоне полного насыщения8 и позволяла представить реакцию в виде линейного уравнения (формула 5), характеризующего регрессию ' параметра антиген-ассоциативной ¡эффективности антисыворотки (У|, оптический ответ) по параметру ее концентрации (х), .

У|«•!п 1п (1/(1-'Е|ГЕо)) . .(4)

где: В\ - показатель оптического ответа, установленный для заданного х$; Ео - оценка "верхнего плато" оптических единицах- величина разведения антисыьоротки (¡одг)-

Ч\ = уо + к х (5)

где: у] - ожидаемая. величина эквивалента оптического ответа- реакции для заданного х,; у$ и К - регрессионные коэффициенты..

Б качестве результирующего показателя реакции приняли точечную оценку "титра" антисыворотки (величину ее разведения), . соответствующую 37%-зффекту антиген-ассоциации, вычисляемую по формуле 6. . *

: х37»-([ Ш 1л 1/(1-0,37)]-у0)/к ■> (6) ЙФ-тест был использован только в гомологичных реакциях и позволил обнаружить, что одинаковые дозы исследуемых антигенов обусловили различные иммунные отклики (рис. 3). Антигены НУ (8,25) и БУМ (8,87) индуцировали существенно меньшее накопление антител, чем антигены БВ (11,26) и & 389. (11,38). "Крайние опенки титров - различались более чем в 8,5 раз, •

г

12 11

¡0 9-

М

V-

1

я

Ц

1

¿Г. Г7 11

и • £

£

ь к ■

Н- V к

ы ? В

н

в

и

Ч

8

п И

1

т

SWA ЗА (Ь 155 !Ь 96 Йй №389

Рис. 3. Распределение срэдних показателей (Х37) реакций гомологичной антиген-ассоциативной зффектисностм . антисм-вороток соответственно изученным штаммам, по пученных в ИФ-тесте.

Б

2.2.4.2.2. Гомологичная нейтрализующая эффективность антисывороток в тесте редукции вирусных бляшек (оценка относительной антигенности штамма),

Исследовали гомологичную вируснейтрализуюшую активность антисывороток по отношению ко всем изучаемым штаммам. • ' ' -

". Используя регрессионную, модель реакции (Кулаков 8.Ю, и др;, 1.987), оценивали л'инейный эквивалент (уо). пошатзля эффективности нейтрализации, численно соответствующего доле ненейтрализованмого вируса (Со =» 1- - 1/(зги!!п зпШп"уц}), ожидаемой при взаимодействии с цельной антисывороткой,

Соответственно ' исследуемым антигенам вычисляли среднегрунаовые оценки. (Уо), а "также величины их вариаций

ч Учитывая, что способность индуцировать в организме выработку антител определяется. как "ангигенность", • то го-, нелогичные оценки у, считали обратными- показателями относительной антигеиности штаммов (рис. 4).

**1 !СГ

0- -Р.613)

-1-

-г -14127)

-3-

-Ю.С18)

-е-

-е- • (0.013)

-7-

-V

Г

8\УА №166 ЗА а 303 м. зь еп

Рис. 4. Сравнительная оценка относительной антигенностч изученных штаммов. Распределение: значении Уо и С » <(Уо! (о), положение оценки у0 ( ) и интервала +<7у0 (заштрихован)..по

ОСИ у. '.'■.' .. - • \ - ' '•'

Было установлено, что при условии равенства иммуни: зирующих доз антигенные воздействия штаммов имели существенные -различия (р-^0,05).' Наименьшей относительной', анти--генностью обладал штамм ПУ (Уо -2,80, т.е. Со = 0,0590); наибольшую оценку продемонстрировали штаммы № 389 (-5,93; 0,0027); № 98 (-6,12;'0,0022); БЙ (-6,34; 0,0018). Таким: образом, антигенные свойства крайних штаммов различались в 33 раза. ' .

-----Частные "опенки "" уо ~ отно"сит"елы1о" соо гветствующего

среднего значения Уо. имели достаточно симметричное распределение. При от ом, значение ау|} было зависимо от величины Уо, то есть увеличение "антигенного давления4 сужало диапазон индивидуальных реакции жийотных.

2.2.4.2,3. Сопоставление результате^ экспериментов.

Соответственно изученным штаммам сравнивали результаты, полученные а тестах ВТ, ИФ и Со. Соотношение показателей Д0, Х37 и ,у0 позволило считать, что во всех изученных тестах "наименьшим эффектом" устойчиво облздали штаммы НУ и ЪШ. Условное среднее положение занимал штамм 155. Штамм ЗП имел очевидную тенденцию к проявлению "наибольшего эффект". Шгаммы ЗА и № 389 показывали существенное изменение опенок относительно теста БТ. Однако между ИФ- и СЬ-тестами наблюдали очевидную связь, поскольку распределения штаммовых оценок были схожими. Коэффициент корреляция оценок Д£ и Х37 составип 0,60 (0,23; 14); ДД и уц - 0,67 (0,15; 28); У.ц и уа ' 0,78 (0.18; 14). Все

коэффициенты были статистически значимыми (р«;0,05). • •

2.2А.2А. Гетерологичная нейтрализующая эффективность антисьшороток в гесте редукции

вирусных бляшек (оценка аитигенногб . , • ■'. спектра штамма).

Антигенный-спектр штаммов изучали, используя антисыворотки, обладающие достаточно еысокои эффективностью в гомологичных реакциях, которые исследовали в Параллельном эксперименте с гомологичными и всеми гетерологичными штаммами Оцечкмяи величину контраста показателя уо в го-мо- и гетерологичных реакциях по типу Ду<> » у0 11еГ- ус Ьогс. При этом большее значение показателя (с учетом знака)

7 • . 20 ' • • ' - ' •

соответствовало меньшей относительной эффективности het- * реакции, т.е. Оольшему антигенному отклонению гетероло-гичного штамма.

-Для каждой антисыворотки, принимая нормальность рас- ' • пределения значений Ayo (исключай при минимальный

выпадающие показатели) определяли среднюю оценку конт- . раста (¿yo), характеризующую антигенный спектр соответствующего штамма и оценку дисперсии контрастов (^ДУо) как" показатель разнообразия гетерологичных реакции..

Выло установлено, что оценки' Дуо выраженными раэли-. чиями не обладали, т.е. относительные величины,- .характеризующие антигенные спешры штаммов практичецки не отличались.

2.2.4.3. Формула антигенкостн штамма.

" Принимая во внимание важность гуморального фактора в лротнеоящурном иммунитете и учитывая возможность непосредственного использования оценки ожидаемо« нейтрализующей эффективности цельной антисызоротки • (Уо) для прогноза защищенности организма, были выработаны следующие положения; _

1. В аспекте сравнения иммунных воздействий различ- . ных. антигенов, испытанных при одинаковых условиях, сред- ' нюю оценку нейтрализующей зффективности hom-реакции (Vq) антисыворотки считать характеристикой антигенного воздействий соответствующего штамма (показатель относйтель-ной антигенности штамма).'

2. Среднюю оценку контраста het-реакции (Дур) рассматривать как обратную характеристику величины иммун- ■ ' ного аффекта, обусловленного соответствующим антигеном (показатель антигенного- спектра штамма). В качестве оценки / разнообразия het-реакции использовать показатель €Уду0. : '

___________3. , Развернутой .„.характеристикой ^широты___ан î игенного__ _

спектра штамма считать оценку' ожидаемого максимального контраста hel-реакции, имеющую вид:

Дуо « Дуо + 2G&Уо

А*

Биологический смысл показателя Дуо состоит в том, что он. с вероятностью 5% ошибки (/^0,05) прогнозирует максимальную величину контраста гетерологичной реакции наиболее антигшш удаленного '• штамма (оценка, ультрагете-рологичного контраста),

Оценки относительной антигенноеги штамма (Уо) и максимального контраста hes-реакции (Дуо) при их соответствующем обьединении, позволили получить комплексный показатель, имеющий вид: " 9о - Уо + АУо.

где уд ' оценка ожидаемой (/>^0,05). минимальной эффективности het-рзакции (эквивалент оценки минимального ожидаемого гуморального иммунного ответа на данный антигеч в -рамках таксономического типа), .

Для изученной группы штаммов оценки, уо (рис. 5) имели следующие значения: 1,38 (RV); - 0,31 (SWA); - 0,60 № 155); - 0,96 (№ 399); -1,23'(SA); • 1,94 (№ 86); - 2,38 (SR).

Показатель уо, имеющий размерность доли (Cq » i (уо)).

полностью сохранял рассмотренные ранее "прогностические возможности. Ej биологическом смысле это означало, что при иммунизации антигеном RV ожидаемый гуморальный иммунный ответ на '"максимально11 удаленный гетерологичн.ьж штамм был наименьшим . (прогнозируемая- доля • свободного' вируса С0 > 0.90), в. свою очередь, антигены № 96 (С « 0J3) и SR (С ». .0,09), заданные в тех жё дозах, обусповипи существенно большее иммунное воздействие.

Отметим наиболее важное свойство комплексного in^-t- • зателя у0, котЗрое состоит в том, что его величина рааноза-

0--ВЯП)

-1->

-г -10*1171 -а--

•4' - ДОН!

-е

Ш'ОЗ]

7Й

№ 1ЛЛ/А Н 155 г* №Ш №Вв

ш Р1 га м т га

Ь'П 13!

Рнс. 5. Распределение средних оценок {»(-реакций-(-• ), показатель максимального ожидаемого контрасте ( <з ), ьияючзющий интервал средней ампвктуды антигенного отклонения (заштрихован) и отрезка 20дуо (незаштриховак) относительно показателей удельной ентигекности штаммов^* ).

висима как от первой (Уо), так к от второй (Ауо) составляющих. 8 практическом смысле это-означает, что необходимая эффективность' иммунного воздействия, вакцины может быть > достигнута как за счет увеличения значения Ур> т.е. повышения иммунизирующей дозы, так и за счет снижения величиям ¿Уо, т.е. выбором' штамма, обладающего наиболее широким; антигенным спектром. ; . - V,

"• •' \ ;.-.,:выводы

1. Разработанный комплекс лабораторных методов (включающий оценки антигенных свойств и некоторых признаков, характеризующих устойчивость структуры ' вириона к воздействию физико-химических , факторов), который позволил

______________________________________________23---------------'

опосредованно определить степень пригодности семи штаммов вируса ящура типа ЗАТ-1 (RV; SWA; SR; SA; № 96; № 155; № 389) к использованию в производстве инакмвированных вакцин.

2. Обоснован и предложен производственный штамм вируса ящура SAT-1"SR-2.'58 для производства мактивированикл противояшурных вакцин.

3. Предложен комплексный показатель 'минимальной" ожидаемой гетерологичнои нейтрализующей эффективности 'цельной аитйсыворотки" (уо; <?^0,05), включающий оценки относительной антигенности (у0) и антигенного спектра (Дус; р<0,05), который может быть использован в качестве характеристики антигенных свойств штаммов в аспекте мх производственной пригодности.

4. Предложен усовершенствованный метод сценки кон центрации вирионов средствами электронной микроскопии, по способу "высушенного препарата', позволяющий рассчитать удельную массу антигена,

5. Разраб01ан способ обработки результатов титрования аитисыеоротхи (регрессионна?, модель) в непрямом тсерпо-фазном иммунофермечтном тесте при постоянной дозе иммобилизованного антигена, который посволяет сравнивать антисыворотки, имеющие различную степень гомологичной активности реакции, для оценки антигенных свойстб штаммов вируса яш.ура.

4.: ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ • • "

1, Из коллекции штаммов вируса ящура типа SAT-t, находящихся б распоряжении ОНИИЗЖ, к испольооьанию в производстве инактивироваиных вакцин рекомендуется штамм SAT-1-5,4-2/58.

2. Комплекс лабораторых методов (включающий оценки антигенных свойств и некоторых признаков, характеризующие устойчивость структуры вириона к воздействию фиэикохими-

ческих факторов) рекомендуется. для предварительного от-Dopa штаммов вируса ящура по степени их пригодности для производства инактивированных вакцин!

• 3. Для использования в кау'чно-исследовательских и вирусологических лабораториях рекомендуются следующие методики: -. Метод. оценки концентрации вирионов и расчета массы антигена г единице объема средствами электронной микроскопии, по способу "высушенного препарата", . • ^ Способ обработки результатов титрования антисыворотки (регрессионная модель) в непрямом твердофазном .иммуно-фермснтком тесте. • . . ; * " . - Оценка внутритиповых .антигенных свойств штаммов на основании показателя "минимальной" ожидаемой гетерологичной нейтрализующей'эффективности "цельной антисыворотки".

Ь. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ '

•

1. Рахмакгулов М.Т., Кулаков • В.Ю;, Черняев Ю.А., .Котс-ва М.В„ Шипилоэ В;И., Быкова Т.Н., Перевозчиков 8.А. Способ опосредованного сравнения иммуногениосТи штаммов вируса ящура •// Акт. вопр. вет. вирусол. - Владимир, 1990.-С. 92-93. *

2. Рехмангулов М.Т., Кулакое В.Ю., Черняев ЮА,. Быко-' ва Т.В.,.Красоткина A.C., Глобенко Л.А., Маматкулсва ЛУ.

Сравнительная оценка, аитигенности семи штаммов вируса ящура типа SAT-1 // Вопр, вет. вирусол., микробиол. и эпизоотол. - Покров, .1992. -.4. II. С. 182-183. •

3; Кулаков В.Ю,,' Рахмангулов М.Т., Черняев -ЮЛ, Гнева-, шев В.М. Количественный метод сравнения имму^огеннос-: ти штаммов вируса ящура II К новой стратегии борьбы с ящуром: Междунар, конф, - Владимир, 1891. С. 80-61-. 4. БаОенко О .В., Кулаков В.Ю., Черняев ЮА, Манзелвя Г.СЧ Рехмаигулоа М.Т. Определение биологической активности штаммов вируса ящура Ii К новой стратегии борьбы с ящуром: Междунар. коиф. - Владимир, 1S31. - С. 144. .