Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Иммунобиологические свойства вакцинного штамма "СГ" и эффективность специфической профилактики инфекционной бурсальной болезни кур

На правах рукописи

Г О Д И 3 О В . Петр Харитонович

УДК 619:612.017Л:615.371:616.9-084;636.5 Иммунобиологические свойства вакцинного штамма "СГ" и эффективность специфической профилактики инфекционной бурсальной болеэни кур

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, 8ПИЭООТОЛОГИЯ, иммунология и микология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

На правах рукописи

Г О Д И 3 О В Петр Харитонович

УДК 619:612.017.1:615.371:616.9-084;636.5 Иммунобиологические свойства вакцинного штамма "СГ" и эффективность специфической профилактики инфекционной бурсалъной болезни кур

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, иммунология и микология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском ветеринарном институте птицеводства и лаборатории вирусологии Всесоюзного научно-исследовательского института особо чистых биологических препаратов Министерства биологической промышлен кости СССР.

Научный руководитель - кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Ф.С.Кудрявцев.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных нвук, Герман кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник, заслуж ный деятель науки Эстонской ССР Аавер Э.А.

Ведущее научное учреждение: Азербайджанский научно-ислед вательский ветеринарный институт. ,

Защита диссертации состоится " 3. " 1990 г.

в {¡'^ часов на заседании Специализированного совета К 120.33 при Эстонской сельскохозяйственной академии (адрес: 202400, г.Тарту, ул.Рийа, 12, зал заседаний).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Эстонской сельскохозяйственной академии.

Автореферат разослан " " 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук, доцент /. ¿¿^^{^ Я.В.Алаотс

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

I.I. Актуальность проблемы. Птицеводство, как скороспелая отрасль сельского хозяйства, позволяет быстро, относительно с небольшими затратами, получить значительное количество высококачественных продуктов питания.

Однако, дальнейшему развитию отрасли и повышению ее эффективности препятствуют различные заболевания, среди которых инфекционная бурсальная болезнь (ИББ) причиняет значительные потери, связинные с гибелью молодняка птиц (5-4055), снижением продуктивности и увеличением процента браковки птиц и тушек, особенно в хозяйствах бройлерного направления ( I.D.Armstrong, 1981; Ф.С.Кудрявцев с соавт., 1984; А.С.Алиев, 1989).

ИББ - высококонтагиозное вирусное заболевание молодняка птиц 2-15-недельного возраста. Болезнь может протекать в клинической и субклинической форме. Клиническая форма у восприимчивой птицы характеризуется внезапным появлением, кратковременным течением, резким повышением и снижением смертности. ИББ приводит к обширному разрушению лимфоцитов, особенно в клоакальной сумке, вследствие чего у цыплят, переболевших в первые дни жизни нарушается нормальная функция иммунной системы ( «.Mackenzie, et al, 1981; А.С.Алиев, 1990).

Вирус ИББ снижает эффективность специфической профилактики против многих инфекций в условиях птицеводческих хозяйств. Вследствие разрушения вирусом В-клеток резко снижается иммуно-реактивность организма птиц в ответ на любое антигенное воздействие. Инфекция представляет серьезную опасность для хозяйств как бройлерного, так и яичного направления.

В основе профилактики и ликвидации ИББ лежит применение специфических средств и проведение общих ветеринарно-санитарных мероприятий.

Для специфической профилактики болезни применяют живые и инактивированные вакцины (J.J.Giambroneet al., 1977).

Для изготовления живых вакцин используют вакцинные штаммы, [тредставляющие собой аттенуированные полевые вирусы.

Трудности создания аффективного препарата при ИББ связаны зо сложностью ослабления иммунодегтрессивного действия полевого . штамма, не снижая его иммуногенной активности

(А.С.Алиев с соавт., 1985).

Кроме того, основным свойством вакцинного штамма является его генетическая стабильность, исключающая возможность как реверсии вируса в патогенный, так и его дальнейшей спонтанной ат тенуации.

В этой связи всестороннее изучение генетических маркеров, связанных с вирулентностью и иммуногенностыо, а также условии культивирования и хранения вакцинного штамма вируса болезни ИЕ предлагаемого для производства вирусвакцинн имеет важное практ ческое значение.

1.2. Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований являлась разработка и испытание экспериментальной вирус-вакцины против ИББ, способа ее изготовления и применения.

В связи с этим для разрешения были поставлены следующие задачи:

1. Изучить иммунобиологические свойства вакцинного штамме "СТ" вируса ИББ.

2. Разработать регламент изготовления и контроля вирус-вакцины.

3. Изготовить и испытать вирусвакцину из штамма "СТ" в лг бораторных условиях.

4. Испытать вирусвакцину из штамма "СТ" в производствен?«, условиях в неблагополучном по ИББ хозяйстве, определить протиг эпизоотическую и экономическую эффективность.

1.3. Научная новизна. Изучена способность вакцинного ттаи "СТ" вируса ИББ к репродукции в первичной культуре фибробластс эмбрионов кур (ФЭК), перевиваемых клетках млекопитающих и СПФ эмбрионах кур. Найдена высокопродуктивная система для культим рования вакцинного штамма и определены оптимальные условия егс накопления.

Дана оценка чувствительности рязчичных методов титрован!» вакцинного штамма "СТ". ГЬказана стабильность основных иммунобиологических свойств штамма "СТ" при длительном пассировании культуре ФЭК, безвредность его для цыплят различного возраста, штамм "СТ" вируса ИББ обладает выраженной иммуногенностью, об< печивает 100% защиту иммунизированных СЩ-цыплят при эксперим< тальном заражении.

Изучено влияние различных защитных сред на инфекционную t

иммуногенную активность штамма "СТ" при его лиофилиэации и хранении.

1.4. Практическая ценность. Разработана технология изготовления вакцины против ИЕБ из штамма "СТ" методы ее контроля и условия применения. Изготовлены две опытные серии сухой вирусзак-цины против ИЕБ из штамма "СТ", которые использовались для профилактики болезни в неблагополучном хозяйстве.

Результаты диссертационной работы использованы в нормативно технической документации на "Вирусвакцину против инфекционного бурсита кур", утвержденной директором ВВДЕИП для опытно-промышлонного производства указанного препарата.

1.5. Апробация работы. Материалы диссертации доложены, обсуждены и одобрены на ХХХП Всесоюзной конференции молодых ученых и аспирантов по птицеводству (г.Загорск, 1989 г.), Всесоюзной научно-практической конференции "Комплексная система ветеринарных мероприятий в птицеводстве - резерв повышения эффективности производства" (г.Ленинград, 1989 г.), на заседании Ученого Совета ВНИЕИП (1990 г.), на методических советах отдела вирусологии ВНИВИП (1988, 1989, 1990 гг.).

1.6. Публикации. По теме диссертации опубликованы 3 научные статьи.

1.7. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 172 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 13 рисунками. Список использованной литературы включает 350 источников, из них 330 иностранных.

1.8. Положения, выносимые на защиту.

1. Основные иммунобиологические свойства вакцинного штамма

"СТ":

- патогенность вируса для СПФ-эмбрионов кур;

- иммуногенные свойства вакцинного штамма "СТ";

- культивирование вируса ИББ в культуре клеток.

2. Иммунодепрессивное действие штамма "СТ" на цыплят.

3. Разработка технологического регламента изготовления вакцины против вируса ИББ.

4. Противоэпизоотическая и экономическая эффективность специфической профилактики ИББ вакциной из штамма "СТ".

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 1987-1990 гг. в отделе вирусологии Всесоюзного научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства и лаборатории вирусологии Всесоюзного научно-исследовательского института особо чистых биологических препаратов Министерства биологической промышленности СССР и в одном птицехозяйстве ВПНО "Союзптицепром".

В исследованиях использовали эпизоотический штамм "27/94", выделенный ст.научн.сотр.А.С.Алиевым в 1983 г., эталонный вирулентный штамм ""52/70", полученный из Англии в 1986 г., а также вакцинные штаммы "СТ", "Дюкерт", реиэолированные из коммерческих вакцин, вакцина производства ГДР Гумбо-вак "Дессау".

Вирус культивировали в первично-трипсинизированной культуре и перевиваемых культурах клеток млекопитающих ( vero и ВСМ-70).

Пересев перевиваемых культур клеток проводили каждые 3-4 дня после образования сплошного монослоя. Посевная концентрация клеток составляла 600-700 тыс/мл. Наличие вируса в культурах клеток определяли по появлению цитопатического эффекта. Количественную оценку вирусной активности проводили путем титрования по бляшкам под агаровым покрытием и цитопатическому эффекту.

Для изучения биологических, антигенных и иммуногенных свойств вируса ИББ в опытах использовали СПФ-эмбрионьг и цыплят, полученных из Прибалтийской зональной ветеринарной лаборатории и цыплят, полученных из благополучного хозяйства по ИББ ПШЗ "Нагорный".

С целью выделения вируса из органов зараженных цыплят отбирали пробы клоакальной сумки: печени, селезенки, почек, тимуса. В опытах по изучению биолог, "-'Еских сноГ-.-в вируса на CTlí-цыпля-тах патматериалом служил го»:огенат эмбрионов, хориоаллантоисная оболочка (XA0) и аллантоисная жидкость.

Для выделения вируса использовали 10—II суточные СП5-эмб-рионы кур. Перед заражением готовили IC$-!iyn суспензию по общепринятой методике с добавлением антибиотиков (стрептомицин и пенициллин) из расчета по 100 ВД/мл. ВируссодержадиП материал'ино-кулировали на XA0 в объеме 0,2 мл. Инкубирование зараженных эмб-

рионов проводили в термостате при.З?°С и дважды в день овоскопи-ровали. Наблюдение за эмбрионами вели в течение 6-7 дней, погибших в течение 24 ч после заражения не учитывали.

При вскрытии эмбрионов учитывали отставание в росте, наличие кровоизлияний в области головы, шеи и конечностей. Для выделения вируса ИББ материал пассировали 3-4 раза на СПФ эмбрионах кур. Биологическую активность вируса определяли титрованием ка СПФ-эмбрионах кур.

Титрование вируса в культуре клеток проводили с использованием первично-трипсинизированной культуры фибробластов эмбрионов кур. Для этого клетки засевали в стерильные пробирки в концентрации 600-700 тыс. в I мл. После образования монослоя, готовили десятикратные разведения вируса от до Ю-' на среде 199 с убавлением антибиотиков. На каждое разведение вируса использовали по 4 пробирки с культурой клеток. Адсорбацию вируса на клет-гах проводили в течение одного часа при 37°С; после чего в пробирки вносили по 2 мл поддерживающей среды. В контроле оставля-[и 4 пробирки с незараженной культурой.

Учет результатов проводили по выявлению и развитию специфи-еского цитопатического эффекта. Антигенную активность вируса ценивали в реакции вируснейтрализации и реакции диффузионной реципитации.

Реакцию нейтрализации ставили в культуре клеток по обще-ринятой методике.

На всех этапах исследований вируссодержащий материал пропряли на стерильность путем высева по 0,25 мл вируссодержащего сериала в две пробирки с мясо-пептонным агаром (МПА), мясо-!птонным бульоном (МПБ), мясо-пептонным печеночным бульоном под »зелиновым маслом (МППБ) и среду Сабуро. Питательные среды с юевами выдерживали в течение 10 суток в термостате при 37-38°С реду Сабуро - 20-24°С).

Контроль на микоплазмы проводили на специальных питатель-х средах в отделе микробиологии ВНИВИП.

Проверку вируса на отсутствие контаминации гемагглютинирую-ми вирусами проводили путем постановки реакции гемагглютинации эритроцитами петуха.

Проверку вируса на отсутствие контаминации вирусом инфек-эиного бронхита и аденовирусной инфекции проводили заражением

в аллантоксную полость СПФ-эмбрионов кур 9-10-дневной инкубации в объеме 0,2 мл. Все эмбрионы, погибшие со 2 по 10-й день, а также оставшиеся в живых через 10 дней после инокуляции исследуемого материала, вскрывали и просматривали на наличие изменений, характерных для возбудителя инфекционного бронхита и аденовирусной инфекции.

Контроль на отсутствие вируса оспы и инфекционного ларин-готрахеита проводили путем заражения Ю-П суточных эмбрионов на ХАО смесью вируса с иммунной сывороткой в объеме 0,2 мл. Контроль на отсутствие вируса болезни Марека и энцефаломиелита проводили путем заражения 5-7 дн эмбрионов в желточный мешок смесью вируса с иммунной сывороткой в объеме 0,2 мл. Зараженные и контрольные эмбрионы инкубировали в течение 10 дн при темпера туре 37,5°С.

Электронномикроскопические и гистологические исследования проводили совместно со старшим научным сотрудником ВНИВИП В.А.Бакулиным. Препараты для изучения в электронном микроскопе готовили на формваровых опорных пленках методом негативного кон растирования.

Для проведения патоморфологических исследований кусочки клоакальных сумок фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина и готовили парафиновые срезы, Гистосрезы окрашивали геыотоксилин-эоэином.

Оценку иммуногенной активности вакцинного штамма "СТ" проводили на СП'2-цыплятах путем определения 50%-ной иммунизирующе дозы. При этом учитывали клинические признаки, патологоанатоми ческие изменения, бурсальный индекс у цыплят в опытных и контрольных группах после заражения их вирулентным штаммом "52/70"

Для определения 50%-ной имцунизирующей дозы (ИМД 50) на СПФ-цыплятах 14-дневного возраста использовали пять групп цыплят по 20 гол в каждой. Девятикратные разведения вакцинного пп ма выпаивали цыплятам соответствующей I руппы. На 14-й день пос иммунизации цыплят опытной группы, и 20 цыплят контрольной (ж вакцинированные) заражали интраназально вирулентным штаммом "52/70" в объеме 0,2 мл, содержащей 100 ИД^/мл. Наблюдение а птицей вели-в течение 10 дней. По количеству защищенных цшля высчитывали 505Ь-нуп иммунизирующую дозу.

Оценку состояния клоакальной сумки.цыплят до и после гак

тции и контрольного заражения проводили по индексу - показателю ¡оотношения массы сумки к массе тела цыпленка и рассчитывали по юрмуле:

Ш « —Мс ¿г/-----1000

Мт/г/

чде: Мс - масса клоакальной сумки,

Мт - масса тела.

Устойчивость штамма "СТ" вируса ИББ к воздействию темпера-'уры изучали путем титрования вируссодержащей культуральной кид-•ости на культуре ФЭК после хранения ее в холодильнике при плюс ;-б°С, в термостате при 37°С, в водяной бане при +56°, +60° и ■70°С в течение 0,5 и I ч и в замороженном состоянии при -35°С.

Определение устойчивости вируса к различным значениям рН :реды проводили по общепринятой методике.

В качестве защитной среды при лиофилизации вакцинного штам-1а "СГ" вируса ИББ использовали лошадиную сыворотку, обезжирен-юе молоко и сахарозо-желатиновую среду с пептоном.

Статистическую обработку результатов собственных исследова-1ИЙ проводили по методикам, описанным в руководстве И.П.Ашмари-1а и А.А.Воробева (1962).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Патогенность вируса для СПФ-эмбрионов кур.

При культивировании на СПФ-эмбрионах кур различных по прохождению штаммов ("52/70", "СГ" и "27/94") вируса ИББ установи, что все они успешно репродуцируются и накапливаются в ор-•анах и тканях указанных эмбрионов.

Максимальное накоплений вируса при заражении эталонным и шизоотическим штаммами установлено через 72 ч после заражения, 'итр вируса в гомогенатах зародышей и ХАО достигая 10®» ; Ю^'^ [ Ю5,5; Ю5'0 ЭИДдо/мл, соответственно. Для штамма "СТ" харак-■ерен более поздний подъем титров в исследуемом патматериале. [аксимальный титр вируса (10®' ) наблюдали через 96 ч при тит->ации гомогената эмбриональных зародышей, зараженных штаммом СТ". В аллантоисной жидкости концентрация вируса во всех слу-[аях была минимальной и не превышала значения 10*' ЭИЛ^д/мл.

3.2. Патогенность вируса для цыплят

При заражении цыплят эталонным (52/70) и эпизоотическим 27/94) штаммами наблюдали типичную картину заболевания через

36-40 ч. При этом отмечали диарею, вялость, общее уп,чтение ^ части зараженной птицы (30-40/5), несколько позднее наступала сонливость, птица сидела скученно, нахохлившись, с втянутой г туловище головой и опущенными крыльями. Развитие клинических признаков болезни у 80-100% зараженных цыплят отмечали на 5-С сутки, после чего состояние цыплят резко улучшалось. Смертное среди цыплят, зараженных эпизоотическим штаммом составила - ^ а при заражении эталонным штаммом вируса - 40%.

Вакцинный штамм "СТ" не вызывал клинических признаков эг левания у цыплят в течение 15 сут наблюдения. Птица была под1 на, охотно поедала корм.

При вскрытии павших и убитых цыплят из групп, где для зг жения использовали штаммы "52/70" и "27/94", наиболее выраже! изменения обнаруживали в лимфатических узелках клоакальной сз ки. У всех вскрытых цыплят сумка резко увеличена, отечна и нг пряжена. Слизистая оболочка усеяна точечными и пятнистыми кре воизлияниями.

Результаты титрации гомогенатов, полученных из материал« разных органов показали, что максимальный титр штамма "52/70" был установлен в сумке через 72-96 ч после заражения и соста] Ю6'2 ЭЩ/ш.

При заражении цыплят штаммом "СТ" клинических проявлени! заболевания не наблюдали, вирус удалось выделить из клоакалы сумки с 3-го по 6-Й день после заражения. Пик накопления вир; в бурсе был установлен на 4 сутки и составил п/мл. !

ме клоакальной сумки, вирус у зараженных цыплят.был выделен I селезенки с 4 по 6-е сут опыта и максимальный титр ого при : составил Ю2'5 ЭИД50/мл.

При гистологическом исследовании клоакальных сумок зараз ных цыплят были выявлены некрозы во многих лимфотическйх узе. что указывает на наличие остаточной вирулентности у данного I ыа.

Дальнейшее изучение ¡¡ггамма "СТ" на реверсибельность пою ло, что после третьего пассажа на СПФ-цыплятах отмечаются сл; выраженные патологоанатомические изменения, характерные для ]

В связи с этим предстоял выбор генетического маркера дл оценки патогенных свойств штамма, так как'случайные поиски в риантов вируса со сниженной патогенностью малоэффективны.

3.3. Культивирование вируса ИББ в культуре клеток

Методика выращивания вируса в клеточных культурах - один из элективных способов сравнительного изучения различных вирусов или штаммов одного и того же возбудителя, их аттенуации и селекции.

В целях определения чувствительности клеточных культур к изучаемым штаммам вируса ИЕБ мы пассировали их в первичной культуре ФЭК и ПЭК и в перевиваемых клетках VERO и BGM -70, с применением сред и сывороток отечественного производства.

При этом установлено, что штаммы ("52/70", "ОТ" и "27/94") вируса ИЕБ во всех 5 пассажах в культуре ФЭК и ПЭК размножались с выраженным цитопатическим эффектом и накапливались в высоких титрах.

Наиболее выраженное цитопатическое действие и максимальный титр вируса - 10®'® ТЦДзд/мл в минимальнее сроки (48 ч) установлен в опытах, где культуру ФЭК заражали штаммом "СГ".

Таким образам, при изучении различных видов клеток для накопления и титрации вируса ИББ установлена возможность использования культуры ФЭК и ПЭК для проведения подобных исследований, однако доступность и экономичность культуры ФЭК делают ее наиболее выгодной для этих целей.

Специфичность ЦПД вызываемого разными штаммами вируса ИББ,_ была подтверждена в реакции нейтрализации действия вируса с положительной сывороткой.

В опытах по изучению динамики накопления вируса в зависимости от кратности заражения установлено, что при меньшей кнфи-цируюшей дозе инфекционные титры вируса через 24 ч были ниже, чем после введения наибольшей дозы. Наиболее выраженное накопление вируса 10°'5 ТЦД^о/мл происходит через 24 ч и достигает максимума Ю6,0 ТЦДд0/мл через 48 ч при кратности заражения 0,01 ТЦЦеф/клетка. Введение высоких доз вируса хотя и вызывает сокращение времени максимального накопления вируса до 24 ч, но при дальнейшем пассировании данного вирусного материала наступает снижение титра вируса на 1-2 ig . .

При изучении популяции v.ipyca ИББ была выявлена ее неоднородность по признаку образования разных размеров бляшек под агаровым покрытием. Частота распределения бляиек различного диаметра была такова, что приблизительно 70% составляли бляшки диамет-

ром 0,5-1,5 мм и около 30% - диаметром 1,5-3 мм, т.е. вирусная популяция имела, в основном, мелкоблятечную характеристику.

С целью изучения корреляции между размером бляшек, образуемых вирусом под агаровым покрытием и патогенностью его для цыплят было проведено клонирование вариантов вируса ИББ, образующих крупные и мелкие бляшки.

При этом установлено, что крупнобляшечные варианты, как правило, вызывают поражения клоакальной сумки, которые выявляются при вскрытии зараженных цыплят в 10% случаях и около 60% случаев при гистологическом исследовании. Варианты вируса ИББ, образующие мелкие бляшки, под агаровым покрытием оказались апатогенными для СПФ-цыплят,

3.4. Разработка технологического регламента изготовления вакцины против ИББ

К вакцинным штаммам, предлагаемым для производства живых биологических препаратов, предъявляют определенные требования. Они включают'? контроль штамма на стерильность, контаминацию ми-коплазмами, гемагглютинируюиими и другими вирусами, определение генетической однородности, биологической активности, безвредности, иммуногенности и контроль на реверсибельность, а также стабильность всех его свойств при длительном культивировании, хранении и транспортировании,

3.4.1. Изучение контаминации штамма "СГ" посторонними микроорганизмами и вирусами

Для проверки штамма "СГ" на отсутствие контаминантов и изучение иммунобиологических свойств был накоплен вируссодержащий материал, который после проверки на биологическую активность раз лили в ампулы по I мл и хранили при минус 20°С.

Проверка образцов вируса этой серии на стерильность и отсутствие- вирусов-контаминантов проводили по методикам, изложенным в разделе "Материалы и методы".

Проверка показала, что вакцинный штамм "СГ" вируса ИББ стерилен и свободен от посторонних вирусов и биологически активен.

Свободную от контаминантов вируссодержащую массу использовали для проверки на реверсибельность.

3.4.2. Изучение реверсибельности мелкобляшечкого штамма "СГ вируса ИЕБ

Проверку стабильности апатогенных свойств штамма "СТ" проводили на СП'З-цыплятах.

Результаты проведенных'исследований показали, что на протяжении 8 пассажей на СПФ-цыплятах мелкобляшечный вариант вируса не вызывал клинику и патологоанатомическую картину заболевания у подопытной птицы, т.е. пассирование вируса на чувствительной птице не привело к усилению его вирулентности.

Гистологические исследования клоакальных сумок, проведенные на 4 и 14-е сутки после каждого введения вируса, показали полную сохранность морфологической структуры органа, что позволяет исключить реперсибельность е" варианта (мелкобляшечный) штамма "СТ" вируса ИББ.

Все последующие исследования проведены с данным клоном вируса ИББ.

3.4.3. Реактогенные и иммуногенные свойства штамма "СГ" вируса ИББ

Введение СПФ-цыплятам вируса в дозе и 10^ ТЦДвд не вызывает каких-либо отклонений у них в течение 14 дн (срок наблюдения). Все цыплята, привитие штаммом "СТ" были устойчивы к контрольному заражению, тогда как невакцинированные - переболели с характерной клиникой заболевания и три цыпленка из 20 пали на 4 сут после контрольного заражения.

Известно, что пассирование вируса в культуре клеток может привести к снижению или полной потере его иммуногенных свойств. Поэтому, для изучения стабильности иммуногенных свойств при длительном культивировании, штамм "СТ" последовательно пассировали в течение 20 пассажей в культуре ФЭК. Вирус на уровне 5-, 10-, 15-, и 20-ти пассажей проверяли на инфекционную и иммуногенную активность.

Данные, полученные в ходе проверки стабильности иммуногенных свойств вируса, показали, что штамм "СТ" вируса ИББ сохраняет биологическую и иммуногенную активность в течение 20 последовательных пассажей в культуре ФЭК (срок наблюдения).

Исходя из необходимости создания "запаса прочности* для иммунизации птиц няиболее эффективной является доза Ю^'^ГЦДзд на цыпленка. ■

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что пггамм "СТ" является безвредным для СП\1-цыплят, обладает выражен-

ной иммуногенной активностью и стабилен при пассировании в культуре клеток.

3.4.4. Изучение условий лиофилиэации, хранения и влияния физико-химических факторов на вирус ИББ

В процессе работы по подбору наиболее эффективной защитной среды, для лиофилиэации вируса ИББ и разработки технологии изготовления вирусвакцины нами были испытаны лошадиная сыворотка, обезжиренное молоко и сахарозо-желатиновая среда с пептоном.

Результаты этих исследований показали, что титр вируса в лиофилизированном виде не снижается в течение года (срок хранения) и не зависит от состава защитной среды, что позволяет рекомендовать любую из указанных сред для лиофилиэации вируса ИББ.

При исследовании термоустойчивости вируса ИББ било установлено, что длительное хранение вируса в замороженном состоянии и при плюс 4-б°С не отражалось заметным образом на его инфекцион-ность в течение 3 мес хранения (срок наблюдения).

Вирус также оказался устойчивым при воздействии температуры 37°С в течение 24 ч, 56°С - I ч и 60°С - 0,5 ч. Некоторое снижение активности - 1,3 отмечено при воздействии 60°С при часовой экспозиции и на 4,5 при 70°С в течение 0,5 ч.

Воздействие жирорастворителей не вызвало снижения биологической активности, что указывает на отсутствие липидов в составе вируса.

Вирус был чувствителен к щелочной среде (рН 12) и устойчив в кислой среде (рН 3,0).

3.4.5. Имыунодепрессивное действие штамма "СТ" на цыплят

С этой целью разработан метод контроля, предусматривающий

введение вакцинного штамма "СТ" и вирулентного - "52/70" суточным СПФ-цыплятам, а затем вакцинацию их против ньюкаслской болезни в 14-дневном возрасте. По уровню антигемагглютининов в опытной и контрольной группах цыплят через 7 и 14 дней после вакцинации определяли степень нм/унодепрессивного воздействия вакцинного штамха на птиц.

Результаты исследований показали, что средний титр антиге-магглвтикинов в группе, где цыплятам ввели вакцинный штамм "СТ", составил 9,21о£2| чт0 несколько.ниже по сравнения с показателями э контроле, тогда как снижение иммунной реакции организма на введение вакцины "Да-Сота", в группе цыплят, зараженных штаммом

52/70" было выражено наиболее полно. Так, титр сывороток в ГЭГА цыплят после переболевашя ИББ составил - 3,4 logg, а в конт-ольной группе - 10,5 logg. Разница в титрах антигемагглютини-ов в сыг-оротке крови от цыплят опытной и контрольной групп ста-исгически достоверна.

Таким образом, в ходе этих исследований установлено, что акциннкй атамм "CT" вируса ИББ безвреден для цыплят.

3.4.6. Эффективность сухой вирусвакцины из штамма "CT" при «личных методах вакцинации

Для оценки эффективности вакцины при различных методах им-/низации были проведены опыты на СПФ-цыплятах с применением ин-эаназального окулярного и орального способов вакцинации.

Результаты опытов представлены в таблице I.I.

Как видно из приведенных в таблице данных „оптимальной дозой 1кцины, обеспечираюцей надежный иммунитет у цыплят является при сальном методе введения 10^'® 1ВДдд в 10 мл воды и ТЦЦдд

двух каплях *оды при интраназальном и окулярном методах. По-ченше данные показали, что в иммунологическом отношении за-тно выраженной зависимости эффективности вакцины от методов едения нет. Однако преимущество остается за оральным методом, особным обеспечить зпизоотологическую эффективность иммуниза-и.

3.4.7. Влияние уровня материнских антител у цыплят на эф-ктипность вакцинации против ИББ'

С этой целью проводили опыта на цыплятах 7-, 14-, 21- и 28-гочного возраста. Вакцину в разведении 1:250 выпаивали цыпля-л первой группы по 4 мл, второй по 5 мл, а цыплятам остальных г'пп - по 10 мл. В опытных и контрольной группах было по 30 1лят. Вакцину применяли оральным методом.

Перед вакцинацией у цыплят каждой.возрастной группы опре-1яли уровень пассивного иммунитета по наличию вируснейтрализую-: и вируспреципитирующих антител.

Полученные результаты исследования показали, что устойчи-ть к контрольному заражению имели 60% цыплят, вакцинирован-

в 7-суточном возрасте через 14 сут после иммунизации. Птица, унизированная в 14-сут возрасте имела защиту против патоген-о вируса ИББ в 65-70% случаях. . / ' '

Вакцинация.молодняка в 21- и 28-сут возрасте обеспечивала '

Таблица I.I

Изучение оптимальной дозы вакцины при энтеральном, интраназальном и окулярном методах иммунизации

!

вакцины

дение tвакцины

Щоза вак! ! Результаты конт-!цины на !Количест[рольного зараже-!цыпленка! во I ,ния_ Ьтт,п \ !цыплят 'заоо! <* !пя ' а тСВДДбр) ^ _1лело! * !падо! *

I. Энтеральный I 100 10^ 20 0 0 0

I 250 ю3»6 20 0 0 0

I 500 ХО3'3 20 2 10 0

I 1000 Ю3>° 20 3 15 I 1С

I 2000 ю2'7- 20 8 40 2 2С

2. Интранаэальный I Ю Ю5'0 20 0 0 0

I 25 Ю3'6 20 о' 0 0

I 50 ю3»3 20 0 0 0

I 100 I04'0 20 3 15 0

I 200 I03'7 20 8 40 0

3. Окулярный I :Ю 105,0 20 0 0 0

1:25 I03'6 20 0 0 0

1:50 Ю3«3 20 0 0 0

1:100 104,0 20 2 Ю 0

1:200 ю3»7 20 8 40 0

4. Контроль _ 20 20 100 3 3(

стойкий иммунитет у 70 и 90% цыплят соответственно.

Кроме того, результаты, полученные в ходе этих исследований свидетельствопали о том, что применение вакцины цыплятам с высоким уровнем пассивных антител вызывает низкий поствакцинальный иммунитет. Иммунитет на вакцинный штамм формировался при введении препарата цыплятам с 14-дневного возраста.

В литературе приводятся данные, свидетельствующие, что вакцинные иггаммы вируса ИББ, наработанные в культуре клеток и куриных эмбрионах различаются по иммуногенной активности. В связи с этим, провели сравнительное изучение иммуногекности на цыплятах разного возраста 14-, 21- и 28-дневного возраста вакцинного штамма "СТ" с биологической активностью 10^ ТЦДзд, вирусвакцины против ИББ производства ГДР и вакцина из штамма "Люкерт", адаптированного к СПЗ-эмбрионам.

Для этого была сформирована 21 группа по 20 цыплят.

Цыплят с I по б групп прививали вакциной из штамма "СТ" в дозе ЩЦзд. с 7 по 12 групп - вакциной из штамма "Люкерт"

в дозах 10^ и 10 ЭИДэд; с 13 по 18 групп - вакциной, производства ГДР, а цыплята в 19-20 и 21 группах оставались невакцини-рованными (контроль).

Результаты опытов, представленные в таб.1.2. показали, что вакцина против ИББ из штамма "СТ" вызывает иммунологическую перестройку в организме привитых цыплят и оказалась безвредной. Так, при однократной энтеральной вакцинации в дозе Ю^'® ЩД50 она индуцировала образование вируснейтрализуощих антител у цыплят 14-21- и 28-суточного возраста в титрах 1:32; 1:64 и 1:128 и создавала устойчивость к контрольному заражению у 65; 70 и 80% цыплят соответственно. В то время как при двукратной иммунизации поствакцинальный иммунитет вырабатывался у 80-90% цыплят, а титры вируснейтрализующих антител были 1:64 - 1:512.

При применении вакцины "Люкерт" в дозах Ю^-104 ЭВД^ получены аналогичные данные, хотя была отмечена низкая сероконверсия у цыплят и гибель 5% вакцинированной птицы при контрольном заражении. ' "

Вакцина из штамма "П-2" производства ГДР, как при однократном, так и при двукратном ее применении, создавала аналогичный по уровню напряженности иммунитет у 80-90/6 цыплят, но при этом отмечался низкий уровень антител, что подтверждается.гибелью 10-15% цыплят от числа заболевших при. контрольном заражении.

Сравнительное изучение иммуногенноЯ активности вакцин против ИББ

Таблица 1.2

-г

п/п|>

--р

Наименование? вакцин |

-1-1-Г

п n „ й 1Возраст¡Кратность I д 1 птицы jприменения Г

РДП

FH

^Результаты контрольного заражения

j зара-? Заболело 1 Погибло. ' жено Г всего! % ! всего! % "*"

Т

1

13 1

ioJ'Dnm50

4 1

1

1

8 1 9 1. 10 1 II 1 12

1.

2.

3.

4.

5. 5.

"СТ"

14 однократное 1/10 1:32 20 7 35

21 2/10 1:64 20 6 30

28 4/10 1:128 20 4 20

14 двукратное 1/10 1:64 10 2 20

21 3/10 1:256 10 2 20

28 5/10 1:512 10 I 10

7.

8.

9. 10. И.

12.

"Люкерт" Ю^ЭИДсг, 14 однократное 1/10 1:32 20 7 35

21 2/10 1:32 20 б 30

, 28 2/10 1:128 20 3 15

-КГЭИДрл 14 4/10 1:32 20 6 30

21 3/10 1:64 20 5 25

28 2/10 1:25б 20 2 10

13.

14.

15.

16.

17.

18.

Вакцина ГДР (П-2)

Согласно на- 14 ставления 21 28 14 21 28

однократное 1/10 1:32 20 4 20 3 15

4/10 1:64 20 3 15 I 10

6/10 1:128 20 2 10 I 10

двукратное 1/10 1:32 Ю 3 30 I 10

2/10 1:64 10 2 20 - -

4/10 1:128 10 I 10 - -

Г9. Контроль 20. 21.

Из данных таблицы 1.2 видно,чтопоиммуногенным свойствам экспериментальная вакцина из штамма "СТ" не уступает вакцине "Лю-керт" и эффективнее, чем вакцина производства ГДР из штамма "П-2".

Таким образом, проведенные исследования показали, что наиболее высокие показатели иммуногенной активности вакцин установлены при иммунизации 28-суточных цыплят. Вместе с тем, следует отметить, что и при применении препаратов цыплятам в 14-дневном возрасте процент защиты составил 65-70/5, что немаловажно в условиях неблагополучного хозяйства, где почти все время есть угроза возникновения заболевания.

В связи с этим считаем, что первую вакцинацию цыплят с пассивным иммунитетом необходимо проводить в 14-15-дневном возрасте и последующей ревакцинацией этой птицы через 10-15 сут в зависимости от эпизоотической ситуации в хозяйстве.

3.4.8. Оценка противоэпизоотической и экономической эффективности специфической профилактики ИББ

В экспериментальных условиях нами установлена безопасность и высокая иммуногенная активность вирусвакцины из штамма "СТ" против инфекционной бурсальной болезни. Для подтверждения результатов лабораторных исследований вакцина испытана в производственных условиях на неблагополучной по ИББ птицефабрике "Рязанская" Рязанской области. Опыты в производственных условиях проведены на 64381 цыпленке.

Цыплят первой группы в количестве 22951 гол вакцинировали двукратно в 15 и 25-дневном возрасте вирусвакциной из штамма "СТ".

Цыплят второй группы в количестве 21430 вакцинировали двукратно в 15 и 25-дневном возрасте вакциной производства ГДР.

Третья группа - 20000 цыплят служила контролем.

Вирус вакцину из штамма "СТ" выпаивали в дозе Ю3'5 ТЦДэд в 10 мл воды из стеклянных поилок емкостью 3 л.

Вакцину производства ГДР применяли согласно наставления.

Поствакцинальных осложнений среди привитых цыплят обеих прупп не отмечали.

За период выращивания в первой группе пало - 826 цыплят, зо второй - 1307 и с третьей - 1400. В среднем масса одного 5ройлера в первой группе при составила - 1676 г, во второй -

[621 г, а в контроле - 1610 г. Показатели среднесуточного привв-:а соответственно, в I, 2, 3 группах были - 34,2; 32,1 и 31,3 г. -

Сохранность птиц в опытной группе цыплят, где выпаивали вакцину из штамма "СТ" на 3,4% выше по сравнению с контролем и на 2,5% - по сравнению с группой цыплят, иммунизированных вакциной производства ГДР.

Живая масса одного бройлера в первой группе была на Бо г выше по сравнению с массой одной гол в контроле и на 55 г - по сравнению с группой цыплят, привитой коммерческой вакциной. Среднесуточный привес у цыплят-бройлеров в первой группе на 2,9 выше по сравнению с показателями в контроле и 2,1 г - по отношению к данным во второй группе. Таким образом, производственные испытания опытных серий вирусвакцины протип инфекционной бурсаль-ной болезни из штамма "СТ" показали ее безвредность и экономическую эффективность по сравнению с коммерческой вакциной.

ВЫВОДЫ

1. Вакцинный штамм "СТ" вируса ИББ культивируется на СПФ-эмбрионах кур, вызывая 100% гибель в течении 6-ти суток после заражения. Максимальное накопление вируса отмечается к 72 ч после заражения и составляет 6,0 ЭИД^/мл.

2. Вирус штамма "СТ" безвреден для СПФ-цыплят при окулярном, интраназальном и пероральном введении.

3. Штамм "СТ" вируса ИББ репродуцируется в культуре клеток куриных эмбрионов, вызывает выраженный цитопатический эффект и накапливает в титре 6,0 ^ ТЦДзд в I мл в течении 48 ч. Гетеро-логичные культуры клеток оказались слабо чувствительными к штамму "СТ".

4. Определены оптимальные условия культивирования вакцинного штамма "СТ" вируса ИББ в первичной культуре ФЭК, включающие заражение 24 ч монослоя вирусом в дозе 0,01 ТЦДзд на клетку, использование поддерживающей среды без сыворотки КРС и сбор биомассы через 48 ч культивирования при 37°С. Приэтих условиях выращивания вирус накапливается в титре Ю6-Ю6'5 ТЦД^/мл.

5. Вакцинный штамм "СТ" индуцирует в культуре клеток куриных эмбрионов под агаровым покрытием образование двух типов бляшек, характеризующихся как з+ и .

. 6. Ыелкобляшечный вариант ( э" ) вакцинного штамма "СТ" ре-лродуцируетов культуре клеток куриных эмбрионов в высоких титрах, безвреден для СПФ-цыплят разного возраста и обладает высо-

кими иммуногенными свойствами. Установлена корреляция между биологической и иммуногенной активностью вакцинного штамма.

7. Пассивный иммунитет оказывает отрицательное влияние на формирование поствакцинального иммунитета при инфекционной бур-сальной болезни.

8. Вирусвакцина.изготовленная из штамма "СТ", создает напряженный иммунитет у цыплят, привитых в 14-21-28-дневном возрасте при различных методах ее применения. Оптимальной иммунизирующей дозой^является 10^"® ТЦДзд в объеме 10 мл воды при эн-теральном »"¡2 капель воды при интраназальном и окулярном введении.

9. Разработана технологическая инструкция (регламент) по изготовлению и контролю ьакцины против инфекционной бурсальной болезни из штамма "СТ" и временксе наставление по применению.

10. Применение вакцины из штамма "СТ" в неблагополучном по ИББ хозяйстве наряду с другими ветеринарно-санитарными мерами обеспечивает профилактику заболевания, повышает сохранность поголовья и экономическую эффективность выращивания бройлеров.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработан лабораторный регламент получения вирусного материала для изготовления лиофилизированного препарата вируса ИББ.

Результаты диссертационной работы нашли отражение в норма-, тивно-технической документации на опытно-промышленное производство "Вакцины против инфекционной бурсальной болезни" утвержденной директором ВНИЕИП.

СПИСОК

научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Годизов П.Х. Оценка напряженности иммунитета у цыплят, вакцинированных против болезни Гамборо //Всесоюзная конференция молодых ученых и аспирантов по птицеводству: Тезисы доклада /ВДОТИП. - М., 1989. - С.90.

2. Алиев А.С., Кудрявцев О.С., Годизов П.Х. Оценка эффективности вирусвакцины претив болезни Гамборо в лабораторных условиях //Комплексная система ветеринарных мероприятий в птицеводстве - резерв повышения эффективности производства: Сб.науч. тр./ВНИЁИП. - Л., 1989. - С.40-42.

3. Годизов П.Х., Алиев А.С. Иммунобиологические свойства вакцинного штамма "СТ" вируса инфекционной бурсальной болезни, в печати. ■ • /;Ь.л,/ г