Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВИРУСОВ ГРУППЫ ГЕРПЕСА

■ -.: ■■.■ О' «а " - -

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ

ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА ^ЕНИНА АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ИМЕНИ в. и. ЛЕНИНА

■На правах рукописи

БЕЛКИНА Нина Михайловна --

ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ВИРУСОВ ГРУППЫ ГЕРПЕСА (16.00.03 — ветеринарная вирусологи^) ^

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных, наук

V-

Москва — 1974

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ

ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ИМЕНИ В. И. ЛЕНИНА

На правах рукописи

БЕЛКИНА Нина Михайловна

ИЗУЧЕНИЕ НЕКОТОРЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ-ВИРУСОВ ГРУППЫ ГЕРПЕСА (16,00.03 — ветеринарная вирусология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Ч- ..................... .. „„.М1КЛЪ

".:ос(;<>1>с:1 м (, „. ; .л |

М'.-".-:-.:: 1 Тг'ппяэем!

Москва — 1974

Работа выполнена в лаборатории вирусологии Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии.

Директор института — академик ВАСХНИЛ, профессор Я. Р. Коваленко.

Научный руководитель — кандидат ветеринарных наук Н. Н. Крюков.

Официальные оппоненты:

Доктор ветеринарных наук, профессор В. П. Назаров.

Кандидат ветеринарных наук Е. Л. Салажов.

Ведущее учреждение — Украинский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии.

Автореферат разослан » «-"у^-е^ьА^ 1974 года.

Защита диссертации состоится 22 мая 1974 года в 14 часов на заседании Ученого совета Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии (109472, Москва, Кузьминки, ВИЭВ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Ученый секретарь ВИЭВ

кандидат биологических паук В. В. Калугин.

Высокая концентрация животных в крупных животноводческих хозяйствах неизбежно связала с перемещением больших групп окота из различных районов, что повышает возможность возникновения острых инфекционных- болезней.

Значительное место >в инфекционной патологии крупного рогатого скота в промышленных -комплексах занимают респираторные заболевания, вызываемые вирусами, принадлежащими к различным таксономическим группам, которые в виде моно или смешанной инфекции могут протекать атипично, затрудняя диагностику.

Особую роль в инфекционной патологии играют герпес&н-русы, которые широко распространены в природе н поражают различные виды животных, лричиняя значительный экономический ущерб. Эти вирусы неразличимы по морфологии, хотя имеют различия в цикле репродукции в чувствительных культурах клеток, динамике образованижжецифического антигена (S. Н. Madin, С. J. York, D. G. McKercher, 1956; D. G, McKercher et al„ 1957; D. G. McKercher, 1959, 1963, 1964; Л. Бодон, H. H. Крюков и еоавт., 1970; N. N. Krjukov, Z. F. Zudilina, A. N. Litvinov, Bodon Laslo, 1971). У некоторых вирусов этой группы обнаружено родство в реакциях связывания комплемента и диффузионной преципитации в агаровом геле (L. Е. Carmíchael, F. D. Barnes, 1961; G. Plummer, 1964).

В лоследние годы в раде хозяйств страны зарегистрированы случаи респираторных заболеваний крупного рогатого скота, частой причиной которых является вирус инфекционного ринотрахеита (Н. Н. Крюков, 1970, 1971; Ю. В. Фомин, Г. А. Иванова, Б. Д. Бояршинов, В. А. Суднишников, 1970; 3, Ф. Зудилина, Н. Н. Крюков, Г. А. Надточей, 1971; А. Д. Майбо-рода, Н. Н. ^Крюков, 1971|).

Болезнь в нашей стране официально регистрируется с 1969 года и биологические свойства возбудителя¡в сравнительном аспекте с другими вирусами группы герпеса изучены недостаточно, еще.не разработаны средства, специфической профилактики, С момента выделения вируса были дачаты исследования, 'в результате которых предложены методы лаборатор-

мой .диагностики (Н. Н. Крюков, А. Л. Семенихин, 1970; Г. А-Иванова, Ю. В. Фомин, И. В. Сафронская, 1970; А. Л. Семе-нихип, Н. Н. Крюков, Л. Бодон, Н. М. Белкина, 1972).

В связи с изложенным были 'поставлены следующие задачи:

— изучить-действие ультрафиолетовых лучей на биологические свойства вирусов группы гершеса для установления возможности получения модифицированного вируса инфекционного ринотрахеита и последующего изучения его некоторых биологических свойств;

— усовершенствовать реакцию непрямой гем агглютинации для выяснения вопросов эпизоотологии инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и использования ее при ускоренной диагностике болезни;

— изучить в сравнительном аспекте антигенные свойства вирусов группы герпеса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Для изучения были взяты три -штамма вируса инфекционного ринотрахеита (ИРТ) крупного рогатого скота: ТК, ВВ (выделены в нашей стране!) и Оксфорд (выделен в Англии). При изучении антигенных свойств вирусов группы герпеса использовали также два штамма вируса бычьего герпеса: ЛК и СТ (выделены -сотрудниками лаборатории .вирусологии ВИЭВ); четыре штамма вируса ринопневмонии лошадей: К—69 (выделен лабораторией вирусологии ВИЭВ), Е—6,. 2093/7 и 2094/8 (получены из Венгерского научно -®сс л ед о в а -тельского 'ветеринарного института Академии наук) и штамм РШС вируса болезни Ауески.

Все штаммы вирусов поддерживались в лабораторных условиях путем т1ассирования в чувствительных клеточных культурах по общепринятой методике. В исследованиях использовали следующие первичные культуры клеток н их субкультуры: почки телят, тесггикул бычков, почки эмбрионов коров, почки эмбрионов свиней, а также перевиваемую линию клеток почки эмбриона свиньи.

Для пассирования использовали освобожденную от клеточного детрита (.центрифугирование при 1000 ^ в течение 10—15 минут) вируссодержащую культуральную жидкость предыдущего пассажа из расчета 5—10 тканевых >цитстэтических доз (ТЦД) вируоа на 'клетку.

Адсорбцию вируса проводили в течение 60—90 минут при температуре +37°. После удаления 'неадсорбированяого ¡вируса вносили поддерживающую среду из 0,5% гидролизата лак-тальбумина на растворе -Хенкса (ГЛХ) ¡без сыворотки или с 4

содержанием 2% аминопептида—2 и инкуб и ров-ал и при 37° до наступления цитопэтического действия на 75—90%. В период между пассажами вирусный материал хранили при температуре +4° или —20°.

Вирус титровали в культурах 'клеток, выращенных в пробирках. Тигр вычисляли по методу Рида и Менча и выражали в логарифмах ТЦДи/мл.

При исследовании генетических'признаков вируса применяли методику бляшек, предложенную С. О. Нвшпд, ,1. Ь. Ме1-гиск (1957), О, Г. Анджапаридзе и Л. Г, Степановой (1961).

В процессе изучения действия ультрафиолетовых лучей (УФЛ) на вирусы использовали лампу БУВ—¡15 (длина волны 2540Д ), вмонтированную л камеру, обеспечивающую стерильные условия 'работы. Интенсивность УФЛ в эрг/мм2 измеряли у л ьтр а ф и о л ет м ет р о м, состоящим из приемного блока и высокочувствительного гальванометра М—99. Использовали фотоэлемент с устойчивым к видимому овету магниевым кагодом .чувствительность которого ограничена областью 2300—3500 А.. Интенсивность излучения (И) рассчитывали по формуле (И=Ф Х'К) где Ф — фототок, а К — коэффициент, полученный при градуиро-вке -прибора.

Освобожденную от клеточного детрита внруссодержащую культур альную жидкость с титром 5,0—7,5 ТЦДбо/мл наливали в чашки Петри высотой слоя 2 мм и подвергали облучению при постоянном перемешивании на аппарате для встряхивания. Для контроля остаточной вирулентности облученным вирусом заражали чувствительную культуру клеток. Учет цитопэтического действия проводили на 3 — 6 -сутки. Об инактивации вируса судили по отсутствию щитоп этического действия в культурах клеток после трехкратного пассирования облученного материала.

Облучив культур ал ьный вирус ИРТ дозой УФЛ, близкой к пороговой, выделялл 1—2 клона, которые после двух—четырех 1культуральных пассажей подвергали очередному облучению. Таким способом поэтапно селекционировали клоны, которые яо ряду бнолотических признаков отличались от исходного полевого вируса.

Свойства модифицированных -клонов вируса сравнивали с исходным вирулентным вирусом ИРТ (бл я прообразующая способность, терморезистентность, устойчивость к УФЛ. плавучая плотность, антнгенность на морских свинках, патскген-ность и им мутагенность для телят!).

Для изучения антигенных свойств испытуемых вирусов получали специфические сыворотки путем геперимму низания мороких свинок и кроликов культуральной внруссодержащей

жидкостью, освобожденной от клеточного детрита ,в равном соотношении с 10% поливиниловым спиртом. При получении контрольных сывороток животных иммунизировали культу-ральной жидкостью -незаряженных культур клеток, применяемых для выращивания вирусов, аналогичным способом.*'

От -подопытных и естественнобольных животных стерильным ватно-марлевым тампоном брали носовую и влагалищную слизь. Выделение .вируса из проб слизи проводили в чувствительных культурах клеток. Изолированный вирус исследовали в реакциях нейтрализации {РН) н непрямой гемагглютинащш (РНГА) с использованием положительных к вирусу ИРТ сывороток.

Реакцию нейтрализации проводили методом разведения сыворотки с (постоянной дозой вируса и методом разведения вируса с 'постоянной дозой сыворотки.

Реакцию непрямой гечагглютинации ставили по методу J. Е. Whitman, F. М. Heirick (1966), усовершенствованному Н. Н. Крюковым, А. Л. Семеннхины1 м (1970), А. Л. Семенихн-ным, Н. Н. Крюковым, Л. Бодон, Н. М. Белкиной (1972).

Диагностические сыворотки, вирусы и «клеточные» антигены с различными наполнителями ¡консервировали путем лио-фильного высушивания в -ампулах в сублимационном аппарате «Edwards» тип 30Р2/809. Запайку ампул проводили в коллекторе под вакуумом.

Результаты некоторых опытов 'Подвергали статистической обработке. Оценку достоверности сродней величины выборочной совокупности и разницу между средними величинами двух совокупностей 'проводили по таблице t—критериев Стьюдекта. Достоверными считались результаты при Р<0,05, то есть в том случае, когда вероятность больше 95%.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние ультрафиолетовых лучей на антигенные свойства вируса болезни Ауески

Известно, что антигенные свойства вирусов определяются их бельковой оболочкой, а инфекционные — нуклеиновой кис-лртой. При получении авирулентных д и а гн ос тш умов и иммунизирующих препаратов необходимо использовать факторы, и »активирующие вирус за счет преимущественного поражения нуклеинового компонента.

Литературные данные (Н. П. Мазуренко, 1950; С. С. Мзк-сумов, 1964; Е. Е, Никитин, В. Н- Сюпин, 1964; Р. С. Дрейзин, Э, Е. Золотарская, .1966; П. П, Кузнецов, Е. Е. Никитин, А. В. Еснопов н др., 1968; В. С. Иванов, 1970) указывают па воз-

■С " 1

можность инактивации ряда вирусов под воздействием ультрафиолетовых лучей.

Для изучения влияния ультрафиолетовых лучей на 'биологические свойства вирусов группы герпеса нами были проведены опыты по получению антнсыворотки пропив вирусу болезни Ауески на кроликах. Специфическим антигеном служила вируссодержащая 'Культуральная, жидкость вирулентного штамма РШС, инактиенрованного УФЛ; контрольным антигенов — нормальная культуральная жидкость, обработанная аналогичным способом.

В наших опытах пороговая доза полной инактивации вируса болезни Ауески составляла 7,2}<105 эрг/мм2. Доза УФЛ 9,2х 105 эрг/мм2, превышающая пороговую, надежно обеспечивала получение инактивированного препарата с сохранением антигенных свойств. Инактивированный УФЛ вирус не восстанавливал инфекш! они ость при хранении в замороженном состоянии в течение 12 месяцев (срок наблюдения).

Установив, что однократное введение инактивкроваиного УФЛ—'антигена не защищает кроликов от заражения вирулентным вирусом болезни Ауески, провели иммунизацию кроликов по схеме; двукратная инокуляция с .недельным интервалом в толщу мякишей лапок или внутривенно 6 мл смеси УФЛ-антигена с 10% поливиниловым спиртом в соотношении 2:1 1Н через 17 дней последующее внутривенное или иптраплан-тарное введение 100 ТЦДбо вирулентного вируса. Сыворотки « разведении 1:10, полученные на 15 день после введения вирулентного вируса, нейтрализовали 104—Ю5 тканевых 'пптопа-тических доз вируса.

Кролики, иммунизированные указанным способом, были устойчивы к заражению 1000 ТЦД50 .вирулентного вируса. Тем не менее при введении 10000 и более ТЦД50 вирулентного вируса некоторые животные погибали при наличии в сыворотке крови высокого уровня нейтрализующих антител. Несоответствие между достаточно высоким титром вггруснейтрализую-щих антител и напряженностью иммунитета, то-в иди мо-м у, объясняется диспропорцией содержания антител в сыворотке крови и экстрацеллюлярной жидкости, омывающей чувствительные к вирусу клетки организма.

Таким образом, с помощью УФЛ-антигена по предлагаемой схеме иммунизации можно получить высокоактивную сыворотку для проведения диагностических исследований болезни Ауески у сельскохозяйственных животных.

Кроме того, положительные результаты защиты кроликов инактивированным УФЛ-антнгеном от вирулентного вируса, по нашему мнению, создают (предпосылку для проведения ие-

следований по приготовлению инактивированной УФЛ — вакцины -против -болезни Ауески животных.

Получение модифицированного вируса инфекционного ринотрахеита с помощью ультрафиолетовых лучей и изучение его биологических свойств

При облучении исходного вируса ИРТ штамма ТК дозой УФЛ, близкой к пороговой, нами выделены клоны, которые после пассирования в культуре клеток вновь подвергали облучению. Полученный таким способом модифицированный вирус ТК—А 28 раз подвергали облучению УФЛ и пассировали 89 раз в культурах клеток. В промежутках между облучениями изучали биологические свойства вируса.

В качестве контроля служил исходный вирус ТК, который не облучали, но, аналогично модифицированному, пассировали в культурах клеток.

Изучение бляшкообразующей способности. Б культурах клеток тючки теленка и тючки эмбриона коровы как исходный штамм ТК, так и его модифицированный вариант обладали способностью образовывать морфологически однотипные бляшки в отсутствии от при добавлении в агаровую среду гпротам-инсульфата.

Макроскопически видимые бляшки диаметром 0,11— 0,20 мм появлялись через 39—56 часов инкубирования, число и размер негативных колоний постепенно возрастали до 5—7 суток, диаметр их к этому сроку достигал 2.99—4,22 мм.

При одинаковых дозах заражения модифицированный вирус по сравнению -с исходным образовывал бляшки на 15 часов позже, то есть'через 50 часов, что свидетельствует о более продолжительном цикле репродукции. Указанное свойство модифицированного вируса передавалось потомству до 28 обработки УФЛ и на 'Протяжении 12 пассажей в культуре клеток без облучения (срок наблюдения).

Изучение терморезистентности. При сравнительном изучении терморезистентности оказалось, что устойчивость к прогреванию испытуемых вирусов разлЕгчна. В отличие от исходного вируса, который инактивировался в процессе нагревания при 56° за 9—¡11 минут, модифицированный -вирус утрачивал инфекционную активность за 4—6 минут. Приобретенное свойство термолабильности стабильно характеризовало модифицированный аирус до 28 ступени воздействия УФЛ н на протяжении 12 пассажей в культуре клеток без облучения (срок наблюдения!).

Изучение плавучей плотности. Опыты, (Проведенные совместно с Г. А. Надточим, показало, что четких различий моди-3

■фицированый и исходный вирусы не ишеют. При равновесном центрифугировании в хлористом цезии популяции вирио-нов исходного и модифицированного вирусов длли три лика по плотности 0,308; 1,288; 1,278 г/мл) и один пик ин-фекционлости,-совпадающий с плотностью 1,288 т/мл. Эти данные не являются достаточными для дифференциации полевого и модифицированного вирусов.

Изучение антигенных свойств. Для изучения антигенных свойств (Предварительно были получены аитнсыворотки к исходному к модифицированному вирусам на морских свинках. В -перекрестных реакциях нейтрализации « непрямой гемаг-, .глютинации 'было установлено, что модифицированный -вируй вызывает образование специфических антител в сыворотке крови морских свинок. Сыворотки в разведении 1:128 нейтрализовали 100 ТЦДьо/мл модифицированного и исходного вирусов, в РНГА сыворотки были активны в разведении 1:512.

Изучение резистентности к ультрафиолетовым лучам. В литературе имеются сведения о получении с помощью УФЛ резистентных и чувствительных мутантов микроорганизмов (а. йгеепЬег^, Р. \Vodi—Каггег, 1963; И. А. Захаров, Т. Н. Кожина, 1967; В. 3. ВагпИаг!, Б. Н. Сох, 1968).

В наших опытах мы стремились выяснить, может ли изменяться чувствительность вируса ИРТ к действию УФЛ. Для этого чувствительность модифицированного вируса к УФЛ сравнивали с исходным вирусом. В результате многократных опытов установили, что с нарастанием количества облучений устойчивость к УФЛ существенно увеличивается (Р<0,025), однако заметно резистентнее становится также исходный вирус, подвергнутый параллельному пассированию а культуре 'клеток с облучаемым (Р<0,01).

При сравнении устойчивости к УФЛ между вирусами облучаемым и паснруемым разница наблюдалась: доза облучения Д0Х105 зрг/мм^ полностью инактнвировала инфекционные свойства исходного вируса, модифицированный вирус сохранял способность вызывать цнтопэтическое действие при дозе, близкой к 5,5х105 эрг/мм2.

Изучение биологических свойств модифицированного вируса ИРТ на естествен невосприимчивых животных. Вирус ИРТ, подвергнутый воздействию ультрафиолетовых лучей, на уровнях 7, 13, 18, 27, 28 обработок УФЛ был проверен на ■патогелность, реактогенность и иммуногенность для телят, ■ свободных от специфических -антител и с наличием в крави пассивных антител.

Для оценки .патогенных и реактогеиных свойств применяли 120-балльную шкалу:

5 баллов—температурная реакция: до 40°—1 балл; 40,5° —

9

-2 балла; 41,0° — 3 балла; свыше 41,0° — 4 балла; продолжительность реакции свыше 4 дней — дополнительно 1 балл;

3 балл-а — саливация;

4 .балла — кашель: продолжительность кашля до 5 дней— 3 'балла; -свыше 5 дней — дополнительно 1 балл;

5 баллов — поражения слизистых оболочек носовой полости: серозный ринит — 3 балла; серозночгнойный ринит — 4 балла; образование'везикул, язв в лредверни носа — 5 баллов;

3 балла — -поражения слизистых оболочек глаз: серозное «стечение из <глаз — ] балл; конъюнктивит — 2 балла; гнойный конъюнктивит —■ 3 балла.

Вся шкала'включает 20 баллов. Реакцию животных оценивали та-к;

— отсутствие реакции — 0 баллов О

— слабая реакция — 1—5 баллов +

—: умеренная реакция — 6—10 баллов -4- +

— сильная реакция —-11—15 баллов + + +

— тяжелая реакция — 16—20 баллов -+-+ + +

Результаты исследований, полученные на 37 телятах, свидетельствуют, что по мере увеличения количества облучений снижались патогенные свойства вируса и сохранялись антигенные.

После тринадцати УФ—облучений модифицированный вирус вызывал у привитых животных умеренную или слабую поствакцинальную реакцию, выражающуюся в кратковременном незначительном повышении температуры тела и слабом рините или конъюнктивите у отдельных животных без других выраженных признаков отклонений от нормального клинического состояния.

Вирус был изолирован из носовых секретов нитраназально привитых телят, у одного привитого внутримышечно и не изолирован при подкожной илъекции. Вирус, выделяемый во внешнюю среду, не представлял опасности для телят, находившихся на -контакте: он не вызвал у них заболевание, хотя и был изолирован от них.

На 10—12 день после введения вируса в сыворотке крови ■привитых телят обнаруживали специфические антитела, титр которых нарастал и составлял у отдельных животных при исследовании через 15 — 21 день от 1,0 до 4,0 по индексу нейтрализации, а в РНГА 1:16 — 1:256. У контактных телят антител не обнаружили.

Титр антател был более высоким у интраназалыю привитых животных по сравнению с привитыми подкожмо или внутримышечно. 10

Телята, не имеющие специфических антител ¡1 привитые однократно модифицированным вирусом на уровне 27—28 обработок УФЛ, ¡приобретали прочный иммунитет, что подтверждалось обнаружением у них специфических антител и устойчивостью 'к контрольному заражению вирулентным вирусом. Контрольные и контактные животные тяжело болели с характерной клинической картиной ИРТ.

•На 9—10-е сутки после контрольного заражения устанавливали повышение уровня анпител (3,0—5,75 lg но индексу нейтрализации и 1:256 — 1:512 по разведению сыворотки в РНГА)..В период между 20 н 48 днями 'после контрольного заражения титр антител практически оставался таким же.

Модифицированный вирус, привитый телятам, имеющим пассивные антитела, напряженный иммунитет не гшдуоиро-вал.

Пониженная реактогенность и выраженные нммуиогелные свойства модифицированного вируса сохранялись на протяжении 12 пассажей в культуре клеток без облучения.

Совершенствование реакции непрямой гемаггл юти нации для ретроспективной диагностики инфекционного рннотрахеита крупного рогатого скота и идентификации

вируса

Основным методом диагностики ИРТ является реакция нейтрализации. Кроме того J. Е. Whitman, F. M. Hetrkk (1965), Н. Н. Крюков, А. Л. Семенихнн (1970) для ретроспективной диагностики предложили РНГА, доказали ее специфичность и высокую чувствительность, используя для сенсибилизации эритроцитов .полевой вирус.

Наши 'предварительные исслодоваиия показали, что моди-фидярованяый вирус ТК—А инфекционного рннотрахеита то сенсибилизирующей активности в РНГА не отличается от исходного полевого вируса. Поэтому в дальнейших исследованиях по изучению условий приготовления специфического антигена для РНГА использовали только модицифнцировапнын вирус.

«Клеточные» сконцентрированные в 10 раз антигены, одновременно полученные из одного и того же оируссодсржашего клеточного детрита .после обработки ультразвуком и двукратной заморозки—разморозки, обладали более высокими сенсибилизирующими свойствами чем вируссодержащая культу-ральиая жидкость. Эритроциты, сенсибилизированные ими, агглютинировались положительны ми к вирусу ИРТ сыворотками в разведении 1:512 — 1:2048. Титр этих сывороток по индексу нейтрализации составлял 4,5—6,0 !g. С полностью

п

-инактивированным УФЛ—антигеном стабильных результатов не получено.

В следующей серии экспериментов изучали влияние лио-фи.шзацин на активность и сохраняемость диагностических антигенов и сьгвороток. Лиоф ил из и ров а иные «клеточные» антигены модифицированного Т:К—А .вируса ИРТ в течение 7 месяцев (срок наблюдения) сохраняли сенсибилизирующие свойства в РНГА без снижения титра при .использовании в качестве наполнителя 10% лошадиной сыворотки без гетероге-мапглюгининов.

Гилериммунные сыворотки после лиофилдаации не снижали титр специфических антител в течение 2 лет храпения при температуре +4° (срок наблюдение).

В РНГА с использованием модифицированного вируса ИРТ проведено исследование 434 проб сыворотки крови крупного рогатого скота, переболевшего с клиническими призна-ми острого респираторного заболевания в различных географических зонах страны. Из исследованных проб 181 (44,9%) реагировали положительно. Полученные результаты свидетельствуют, что в отдельных хозяйствах имеет место циркуляция вируса инфекционного ринотрахеита.

Диагностическая ценность РНГА проверена параллельными исследованиями проб сыворотки в РН, при этом установлены совпадающие результаты, однако показатели титра антител в РНГА были выше чем в РН.

Кроме того РНГА мы применяли для -ускоренной диагностики ИРТ и идентификации выделенного вируса, С этой целью использовали 4 палевых штамма вируса, выделенные« нашим участием при остро протекающем респираторном заболевании крупного рогатого скота в 'Промышленных комплексах «Подгорненский», «Миткирейский», «Вертуновский» Пензенской области и «ВВ», выделенный от больной коровы в Калининской области.

Для идентификации штаммов использовали вируссодер-жащие материалы первого, второго или третьего пассажей при наличии .цитопатического действия. Из них готовили специфические «клеточные» антигены, которыми сенсибилизировали эритроциты барана. Реакцию ставили с заведомо положительной гипериммунной антисывороткой к вирусу ИРТ.

Эритроциты, сенсибилизированные антигенами этих штаммов вируса, агглютинировались специфической сывороткой в разведениях 1:128 — 1:512 при отрицательных результатах в контроле. Полученные данные были подтверждены в реакциях нейтрализации.

Использование РНГА для идентификации вновь выделенного вируса и, следовательно, для диагностики ИРТ значитель-12

но сокращает время, затрачиваемое па проведение исследований. Если для ндентфшащги выделенного вируса с помощью реакции нейтрализации требуется 5—8 суток, то такие же результаты можно получить в течении 1—2 суток при использовании РИГА,

Изучение антигенных свойств вирусов группы герпеса

Изучение антигенного родства между вирусами группы герпеса представляет интерес для диагностики н идентификации вирусов, а также установления возможности использования гетерогенных антигенов 'в качестве специфических препаратов. По литературным данным в реакциях связывания ком'гыемепта и диффузионной преципитации в агаровом геле установлены антигенные связи между: вирусами инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и лошадиным герпес вирусом тип 1 (L. Е. Carmichal, F. D. Barnes, 1961; G. Plummer, 1964); вирусами герпеса лошадей тип 1, псевдобешенства л простого герпеса; простого герпеса п вируса В (А. Sabin, 1534; L. Е. Carmichacl, F. D. Barnes, 1961; К. E. Schneweis, 1962; G. Plummer, 1964; A. Mayr, H. Böhm, S. Woy-ciechowska, 1965). Исследование антигенных связей между вирусами инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и ринопневмонии лошадей (герпес-вирус тип 1) проводили D. G. McKercher, J. К. Saito, R. М. Matis, 1969) в опытах на пони с целью возможной профилактики ринопневмошш с помощью вируса инфекционного ринотрахеита.

Эти сведения послужили основанием для изучения антигенных взаимоотношений между вирусами группы герпеса в реакции нейтрализации, для чего нами были получены штам-мошецифичеокие сыворотки па кроликах. Близкородственная антигенная связь установлена между штаммами ТК и ТК—А, ТК. и Окофорд вируса ИРТ. Штаммы К—69 и Е—6 вируса ринопневмонии лошадей являются близкородственными, но значительно отличаются от двух других штаммов (2093/7 и 2094/8) этого же вируса. Связь обнаружена также у штаммов ЛК и CT вируса бычьего герпеса. Однако между различными вирусами группы герпеса (инфекционного ринотрахеита, ринопневмошш лошадей, бычьего герпеса и болезни Ауескп) антигенного родства нами не установлено.

ВЫВОДЫ

1. Пороговая доза ультрафиолетовых лучей для полной инактивации вируса болезни Ауеоки с титром 7,0—7,5 lg ТЦДзо/мл составляет 7,2х105 эрг/мм2, модифицированного ви-

руса инфекционного ринотрахеита с титром 6,0 — 7,0 lg■ ТЦДзд/мл 5,5Х Ю5 эрг/мм2 Увеличение пороговой дозы в 1,5-раза для вируса болезни-Ауески сохраняет антигенные свойства и: обеспечивает получение 'активного иммунизирующего-препарата.

2. Разработана схема иммунизации кроликов инактивирован ньгм: УФЛ. антигеном, для получения диагностической сыворотки против вируса болезни Ауески.

3. Облучение, внеклеточного вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота дозами УФЛ, близкими к' пороговым, позволяет- получить вирус с измененными биологическими признаками. По мере увеличения количества УФ--облучений снижаются патогенные свойства и сохраняются' иммулогенные.

4. Телята, не имеющие до вакцинации специфических антител, лосле однократной иммунизации модифицированным вирусом, становятся устойчивым 'к заражению вирулентным вирусом. Прививка модифицированным вирусом телят, имеющим пассивные антитела, не ¡приводит к образованию прочного иммунитета. Модифицированный вирус не вызывает у здоровых телят, находящихся в контакте с привитыми, заболевание ринотрахеитом, хотя вирус от них реизолируется.

5. Приобретенное свойство ослабленной вирулентности стабильно при выращивании модифицированного вируса в культуре клеток на протяжении 12-'пассажей.

6. Ослабление вирулентности н сохранение антигенных свойств у модифицированного вируса позволяют рекомендовать его в качестве диагностикума для реакции непрямой ге-магглютинации : при ретроспективной диагностике инфекционного ринотрахеита.

7. Лиофильно высушенный модифицированный вирус сохраняет антигенные -свойства в РИГА в течение 7 месяцев хранения при температуре +4" (срок наблюдения).

8. Реакцию непрямой гемагглютинацин можно рекомендовать в качестве экспресс-метода для идентификации выделенного вируса инфекционного ринотрахеита.

9. Вирусы инфекциоиного ринотрахеита крупного рогатого скота, ринопневмонии лошадей, -бычьего герпеса и болезни Ауески не обладают антигенным родством в реакции нейтрализации.

Полученные результаты исследований позволяют внести следующие практические предложения:

II) методика получения диагностической кроличьей сыворотки против -вируса-болезни Ауеокн;

2) метод идентификации вируса инфекционного ринотрахеита реакцией' непрямой гемагглютинации; И

3) модифицированный вирус ТК—А рекомендован в качестве диагностнкума для РНГА при диагностике инфекционного ринотрахеита.

Результаты наших исследований по разработке методики РНГА вошли во «Временное наставление по лабораторной диагностике инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота», утвержденное Главным управлением ветеринарии Ми-.нистерства сельского хозяйства СССР 18 мая 1973 года.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Получение гипериммунной сыворотки против вируса болезни Ауески на кроликах. Тезисы докладов научно-производственной конференции но профилактике и ликвидации инфекционных болезней сельскохозяйственных животных 23 — 25 ноября 1971 г., Минск, 170—171 (в соавторстве с Н. Н. Крюковым, Б. И. Суриным).

2. Получение модифицированного вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота и -испытание его нм-муногеиных свойств. Бюллетень ВИЭВ, 1972, выпуск 14, 5—8 (в соавторстве с Н. Н. Крюковым, А. Л. Семенихиным)-

3. Повышение чувствительности реакции непрямой гемаг-глютинацнп -при инфекционном ринотрахеите крупного рогатого скота. Бюллетень ВИЭВ, 1972, выпуск 14, 16—18 (в соавторстве с А. Л. Семенихиным, Н. Н. Крюковым, Л. Бодон).

4. Сравнительное изучение морфологических изменений в культурах клеток под действием вирусов группы герпеса. Бюллетень ВИЭВ, 1972, выпуск 14, 25—27.

Материалы диссертации доложены:

На Второй Всесоюзной конференции молодых ученых по ветеринарии, Москва, ВАСХНИЛ, декабрь, 1971 г.

На научно-производственной конференции по профилактике и ликвидации инфекционных болезней сельскохозяйственных животных, Минск, ноябрь, 1971 г.

На заседании Ученого совета ВИЭВ, январь, 1973 г.

Ответственный за выпуск автореферата Н. Н. Крюков.

Заказ 557 Тираж 150

Типография Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии имени К- И. Скрябина