Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Биологические свойства вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней и его влияние на хромосомы клеток животных

ЭСКОМНССШ СОВЕТА МШИСГРОВ СССР ПО {ПРОДОВОЛЬСТВИИ И ЗАШКАМ УКРАИНСКАЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЭЯЙСШЕННАЯ АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

КЯЕСТОВА Зинаида Сергеевна

УДК 619:576.858. 976:316. 17 5. 224 4

ИОШГИЧЕСШЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА СВИНЕЙ И ЕГО ВЛШМЕ НА ХРШОСОШ КЛЕТСК 2ИВ07НШ.

16.00.03 - ветеринарная микробиология, риуусологгя, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степей! кандидата биологических наук

Ккея 1990

Работа выполнена в Украинском научно-исследовательском ветеринарном институте.

Научный руководитель - член-корреспоццент ВАСХНИП, доктор ветеринарных наук, профессор А.И.Собко.

Официальные оппоненты:

1. Доктор биологических наук Спивак Н.Я.

2. Кандидат биологических наук Старчеус А.П.

Ведущее учреждение - Белорусский научно-исследовательский институт экспериментальной ветери.

в аудитории )Г< 412 12 учебного корпуса Украинской ордена Трудовс Красного Знамени сельскохозяйственной академии (ул. полковника Потехика, 16).

Просьба принять участиэ в работе совета или выслать Ваш о: зыв на автореферат в двух экземплярах, заверенных печатью, по адресу: 252041, Киев-41, ул. Героев обороны, 15, УСХА, 3-й учес ный корпус, сектор защити диссертаций.

С диссертацией могло ознакомиться в библиотеке УСХА.

Зашита диссертации состоится /С

в ______ на заседании специализированного совета К 120.7]

Учешй секретарь специализированного совета

К 120.71.05, кандым' биологических наук

■СцА ,В,А.Воргничук

ОБЛЛЯ ХАРАКТЕРЮТША РАБОТЫ

Актуальность теш. В связи с индустриализацией свиноводства, :согда содержание и разведение десятков тнеяч животных осуществляется в замш{утсм цикле, особенно актуально стоят вопросы максимального сохранения поголовья животных. Возникновение в таких хозяйствах трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС) наносит зцугишй экономический ущерб свиноводству.

Бхкное значение в успешной борьбе с гшм заболеванием имеют ■•лубоадо зтния различии биологических свойств вируса ТГС как иконных, тек и эпизоотических ытаиыов, что обязательно при производства вакцин и диагностических препаратоа. ¡имеются некоторые ¡ведения о различной устойчивости вируса ТГС к действию температур окружающей среды (С.Хрнстов и др., 1275; Л.П.Закстильская, 1.В.Шеоолдов, 1977; В.Т.Котоп, Л.Г.Гихов, 19ТО; ¿.Псковски й др., .981; Л.И.Собко, 1981; ¿¿М&о -/¿¿"и^

Качество выпускаемых средств специфической профилактики про-ив 1ГС зависит не только от условий хранения вирусного сырья, :о также от успешного шбора системы кулыивпролгчшя вируса.

При создании вакцин, диагностических ирэпарагоа п получении гтенуиропаншх штаммов необходимо учя®*«ш> остсстйош^уп сарип-ояыюеть вирусов и гетерогенность их популяций з биоцоиоеах.ко-орце иногда саг-киот их ценность (Я.Я.ЦедиистаЙ, 1908; В.ЛЛЬз-пчнов, а.А.Грабачев, Н.С.Гарин, 1977).

В ряде случаев непатогеншо вирусы, а так:::з жэни с

здавлешой БИрулепггостыо снособш пндуг^рогагь лутглг:н (Г.'1Л.'.у--¡опекая, л.л.лукгд, Г.Л.Чаикоасгая, 1970; Ге^тетоп Л.У-Л':: -•:оэск1'я, 197Ь; Н.К.Шытсккх, К.ч.Есчароя, ¡¡.Н.|11:>-.!нек;;х,19г4). эз.чшловенпо аберраций хромосом жг«г:ш нарулыг цсдуггиоссь

генома и его функционирование. В связи с этим большое значение приобретает проблема создания безвредных в генетическом аспекте антивирусных препаратов.

Решение поставленных задач в успешной борьбе с вирусным трансмиссивным гастроэнтеритом свиней возможно только на строго научной основе. ,

Цель исследований. Изучение биологических свойств как вакцинных и эпизоотических штаммов вируса TTC и их изменение в результате воздействия ряда факторов, а танке изучение влияния вируса TTC на генетический аппарат клеток свиней и определение зависимости мутационного процесса в метке ст применяемого штамм-вируса.

Основные задачи исследовг.ний :

- установить воздейстию вируса TTC на генетический аппарат клеток свиней;

- разработать методы по предупреждению и выявлению вирусной контаминации культур клеток';

- изучить процесс репликации вируса TTC в культуре клеток при его адаптации к ней для определения различий между штаммам." и изучить влияние системы культивирования;

- установить изменение инфекционной активности вакционных и эпизоотических штаммов вируса ÎTC при пассировании в культурах меток, а тагско при использовании клеточного шнсслоя разного возраста и смеси разных культур;

- исследовать изменение структуры популяшй вакцинная и »госто отичоских штаммов вируса TTC в зависимости от уровня пассат в культуре клеток, условий хранения, а также установить зависимость уроки; :ш:!екционноГ: активности с составом виру зной популяции;

- определить влияние усяов:й хранения вируса ITC на его гп-'¡жцненод СБО£СГС&;

- дать кариологическую оценку культура клоток с целью определения еа пригодности для проведения исследований по выявлешт мутагенной активности вируса;

- разработать методические рекомендации по анализу и учету аберраций хромосом свиней при вирусных инфекциях (гастроэнтеритах) .

Научная новизна. Впервые описана динамика репродукции вируса 1ГС нескольких штаммов по скорости деструкции клеточного моко-слол в зависимости от уровня пассат в культуре клеток, применительно как к одинаковым, гак и различит.! ее сериям.

Впервые описана закономерность изменений в меточном ыопослов (по характеру деструктивного действия) как у вакцшзгсго штамма "йсв", так и у опизоотического штамма "И 1439/81", что связано со сроком проявления деструктивного действия вируса _1ГС и сменой структуры вирусной популяции.

Изучена в динамике смена состава популяции вируса ТГС по отдельным ита;лмш,1 в зависимости от уровня пассата, сроков и типа, используемо-'' культуры клоток, длительности и условий хранения, г.. также в связи с инфекционной активностью.

доказано вяшлиа многократного замораклвания - оттаивания на инфекшошне свойства вируса И С как вакцинных, так и огшзооти-чоскиг. штаммов.

Оо'нерукен стабильный компонент в популяции вируса, пе изменяющийся щщ различных условиях.

Ьп&ршэ изучено влияние ¡юропавируеа ТГС на гасяодс.:говШ5»К аиь.х.т.т »ах.-гок гдлоко!(шяглеи ьугзгснваЛ •

:переи« сдода>-а попытка увтаьо-дг'.ь связь шзку ызда'едаегмим рел'^лчиянк биолс^пклккг. свойств гируса г его г-уга:^"'^ вхт*-

'гйЩЦ^'й:-. ;оо'отп олрлкле.а "ч;;:, чго мэ.уче^-ш-'

биологические свойства вируса TTC штаммов "Риме", 'i,1-42:', "Цур-дью-115',' "Миллер", "П 14^9/81" и "JI 123/79" применяются для их оценки и использования некоторых из них в качестве вакцииных.Применительно к коронавирусу TTC определен штаммозависимый мутагенный эффект, что позволит стбирсть для производства папуш шташы вируса, не оказывающие поврездеицего воздействия на геном живог -ного.

Методика по продупрездешю и выявлению вирусной кентакшецип культур клеток изложена в '"'етодичеешк рекомендациях по выявле нию и предупреждение) контаминации микоплазмаыи и вирусами кдетсч ■■ пых культур", рассмотренных и утвержденных методической комиссией' Украинского ндучно-иссдедовательского ветеринарного института Е' ноября 1981 года (протокол В п), и изданиых массошм тиражом <tvî • ев, 1904 г.), Методика по обнаружению мутагенного действия вирусов при вирусных гастроэнтеритах у свинои изложена с "Ыэтодк'гес-глх рекомендациях по обнаружению, учету аберраций хромосом клеток свиней при вирусных инфекциях (гастроэнтеритах}*, рассмотренных и одобренных методкошссией Украинского научно~ис"ледовнтель ского вэтерипарного института '¿1 ноября 1939 года (протокол fc 6), рекомепзоьанных для Союзного утверждения и отправленных ь Ошве-;1 (г. Москву) 29.05,1^90 года.

Эконоу^чрский кт. Полученные результаты по биологически..' свойстгам вируса ТГС используются при подоотовке сгамиов в кнчо • огне иорцалшх и нршеяяешх в широком производственно«! ойы»-«. Используемая вакцина из оташа "П 1439/81'' позволяет умеиышлч» паде;г. :: потери ь привесах у низоачьгх. При этом экономический ,'окт составлпа-" F О ООО руб. в год на 1 хозы'.стоо с ZJ ООО »w

ДПЛ-^йИЩ JtV'iiliii- Ссновше положим диссер-гицш! дши^леь- ■

- конференциях молодмх ученых и специалистов УкрНЛВИ, г.Ки-1В (1983-1985 гг.);

- республиканской научно-практической конференции, г. Киеп, жтябрь 1983 г.;

- республиканской тучно-производственной конференции, •• Киев, декабрь 1907 г.;

- республиканской научной конференции молодых ученых, поденной 70-летию ШДСМ, г. Харьков, УШ1ИЭВ, ноябрь 1988 г.;

- второй Всесоюзной конференции по цитогенетике сельскохо-шйслвснных животных, г. Ленинград-Душкин, май 1988 г.;

- научно-теоретической конференции молодых ученых к аспиран-'ов 1Саменец-Лодольского с/х института, г. Кпменец-Подольский, гай 19139 г.;

- республиканской нздчно-пронпводственноЯ конференции, г.Ви-'ебск, сентябрь 1990 г.;

- расширенном меялаборцтортм заседании сотрудников УкрИИВН т 29 октября 1990 г.

Публикация. Ш теме диссертации опубликовано II работ.

■Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на стра-ицах мошиношхного текста, иллюстрировала 31 таблицами, 12 ри~ уккаки. Объем текстовой части работ»! составляет 141 страниц, остоит из введения, обзора литературы, собстпешлх иссяодсоа-ий, обсуждения результатов исследований, впводов и практических родложениП. Список использованной литературы включает 277 ис~ очника, в том число 142 - отечественных и 1.3:3 - г<арубо;:;:щ>с аз~ эроп.

сошетиш пявдозш*

Ьотгерирдч и наголо. Иаетодгс! раг.о;а яилкегсл шлю-

зе оадаипП - С! 05 К (рчппорт-ошт СП УССР от ЙГ-.С2.3? г. Г61 р)

"Разработать ассоциированную вакцину против корона - и энтеро-вирусного гастроэнтерита свиней, определить схецу ее применения» - "Создать и освоить производство набора вакцин против трансмиссивного гастроэнтгрига и ротавирусной болезни свиней" № госрегистрации 01870076236; - "Изучить эпизоотические особенности, разработать и внедрить эффективные методы диагностики, профилактики инфекционных болезней свиней (болезнь Ауески, ротавирусные и эн-те^ровирусше заболевания, клостридиоз и др.), выдать Минсельхо-з,у СССР соответствующие рекомендации", № госрегисграции 0I820I24IÎ

В работе использованы: а) 2 референтных штамма вируса ITC: "Г1урдыо-115", полученный из Всесоюзного ордена Грудового Красного знамени Государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов и передан из лаборатории технологии культивироьа-нил вирусов УкрНИВИ с исходным титром инфекционности БОЕ/см3 на уровне 31 пассажа; "Миллер" - вирулентный штамм.культивированный 6 пассажей на однодневных поросятах с титром 4,5 ЛДзд; б) вакцинные штаммы: штамм вируса TTC реизолирован в культуре клеток СПЭВ (из коммерческой лиофилизированной вакцины производства ГДР серии 160 01 81), обозначен как "Риме"; "М-42п -получен из научно-исследовательского института (референтного центра) г. Брно, ЧССР, передан на уровне 1, 3, 7 и 8 пассажей е культуре клеток СПЭВ из лаборатории вирусологии с исходным тигром инфекционности 4,75*0,24 Б0Е/сма (на уровне I пассажа); в) эпизоотические штаммы вируса TTC: - "П I439/ÜI" - выделен 01. 07.81 года в культуре первичных глоток почоз: поросят (СП) с проявление« ЦЦД вируса в 3 пассаже из тот;ого отдела кишечника больного поросенка, принадлежавшего совхозу-коь:б>:иату "Поволжский" Куйбышевской области, PCiCP. Адаптирован к культуре клеток тЪ с титром 4,1 ty 'ЛЩдо/cî.',0 на уровне 6 пассат, передан д,::л .••ccaöio&aaü ».с дабораторш; идеологи»; _ "Я 122/70" - аддояс»

19.04.79 в первичной культуре клеток свиных тестккулов ССТ) с прояачением ЦЦД, вируса в 3 пассаже из тонкого отдела кишечника больного двухнедельного поросенка принадлежащего спецхозу им. Калинина Еусского район^ Львовской области. Адаптирован к культуре клеток СГШ, с титром инф-экционности 5,5 ТЦД^о/см3 та уровне 6 пассажа. Для исследований получен из лаборатории вирусологии УкрИИВИ.

В работе использованы как моноварианты перевиваем.« культур клеток: почек свиней - СГШ, СГОВ-М, ПСП, тестикулов поросят (ПТП), так и их смеси СПЭВ + ПТП, СПОВ + ПСП. Монослойше культура клеток получали в виде клеточной суспензии из лаборатории культур тканей УкрИИВИ и выращивали в матрасах, пробирках и 50 см3 флаконах, содержащем ЙТ.ЗЭЗ^бЗЮй клеток. Использовали соответствующие поддерживающие средн. Монослойные культуры клеток заражали культуральным вирусом из расчета 100 ТЦД^о/см^Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча (1930), выражали в тканевых цитопатических дозах в 1,0 см2 (ТЦЦ^о/см3). Негативные колонии вируса изучали используя мэтод Ши/игу. алсС Ме-ЕтисЬ (1955) с применением агарового покрытия по прописи этих авторов (1957). Титры, полученные при этом-выражали в БОП/см3, рассчитывали по методике, приведенной у Ллрски 3. (1980).

Мзтафазше пластинки хромосом свиной получал., по методам МяпЯеасС1960), Иакгрогор Г., Варли Дж. (1906), Методическим рекомоцоациям ВШИТОЕ (Под ред. Л.3.Яковлева) (1976). Дифферен-цютьцую окраску хромосом свиньи проводили по Методическим рекомендациям ВПКЛЕП! (Под ред. А.5.Яколлепа) (19:31). Повреждения

ХРОМОСОМ У'-ШТЬШПЛИ В СоОТПеТСТВИП С ГОТСДамп, Чрирц1е!ЙЕ.ЛК

г.оГ. Л.С. (1970) Зягароост А. 5. в ;ц>. ПШР.).

¡¿■лучен'ш аре парадов и&тафэдиос хромосом с их сьнхуои'Пй.шь/! и ."-г.'-моиь-ал": 'Г'вдтонь:'; кендеьсац:;:: прочадила с п :л.;льгокип;е:.' 5?

раствора ледяной уксусной кислоты (ЛУК), раствора этидиум бромида. Для этого, посла гипотонической обработки и осаждения клеток, отобрав надосадочную лшдкость, оставив ее 0,5 см3, осторожно ресуспецдироггли осадок. Добавляли по 3 см3 3 % раствора ЛУК в дистиллированной воде, пилетируя. При применении этого раствора комнатной температуры, выдержка составляла 5 мин, - подогретого до (37*0,5) °С - 2 мин. После экспозиции с ЛУК клеточную взвесь осаждали центрифугированием с частотой вращения 1000 об/ мин ь течение 5 мин. Дальнейшую обработку проводили, как описано в методах приготовления метафазных пластинок хромосом (см. виши) При использовании раствора этидиум бромида, его вводили г культуру лейкоцитов периферической крови за 2-4 часа до конца культивирования. Этот раствор готовили в дистиллированной воде г применяли в конечной концентрации 3-5 У /см3.

При статистической обработке результатов использовали общепринятые методы (вычисление средней арифметической, среднего квадратического отклонения, 'средней квадратической ошибки разула тата, коэффициента корреляции вероятности), а также формулы, изложенные в "^ководстве по ветеринарной вирусологии" (П., 1966). Различия между числом негативных колоний в раз1ых флаконах одного разведения, не превышающе границы случайных отклонений вычисляли по коэффициенту Д, предложенного ç/llwtti/i' M■ и др. (1975).

При определении степени достоверности результатов по повреждению хромосом вирусом использованы формулы, предложенные Лакл-нш Г.¡5. (II., 1930).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕН!ШХ ПССЛЕДОВЛШЙ I• Изучена процесса адаптации, вируса TTC i: культурам utот-n 1гхсдчого ш;руу-(ого as:.*.: wr.ri np

данных и диагностических препаратов, вирусы сдаптирувт, по воз-гажности, к различии культурам клеток и культивируют в них серийным пассированием.

Важным этапом в проведении исследований было определение различий мелдау вакцинными и эпизоотическими штамлв.!® вируса ТГС ю изменению: скорости деструкции инфицированного клеточного мо-¡ослоя, инфекционной активности, в зависимости от серии пассажей i культуре клеток. Необходимо било обследовать эти изменения з чродолжительном интервале пассажей, поэтог£у нами исследовано по-зедение вакцинных штампов с 1-30 пасса"';', а эпизоотических по 40) пассажи в культуре клеток СПЭВ. В культуре клеток ПСП ис.ледо-зали эпизоотический штамм "Я 1439/81" до 65 пассажа включительно.

Проанализировано изменение свойств вируса 7ГС кавдого штамма отдельно, так и в срашенш всех штаммов мезкду собсй. В результате проведенных опытов (несмотря на равные условия) установлено, 1то по скорости деструкции инфицированного меточного монослоя 1по средним показателя!.! на I пассаж) вакциншо итакмы оперетлм »пизоотические: штамм "М-42" вызывал дегвиэрацпю культура клотон ta 27,82 часа, штамм "Риме" - за 41,6 паса, штамм "П 1439/81" -ia 50,33 часа, эгакм "Д 123/79" - за 53,65 tiaca. Из всех ипучгп-IIIX штампов только у "М-42" развитие 1ЩЦ в некоторых пассажах доходило быстрее прочих (за 10 час) с поражением клеточного ко-юслоя до 100 %, у остальных - оно длилось 24-28 часов, рег.е 72 taca, юходя из ьтих пределов только в некоторых пассс&жс У ¡етпм-:а "л 123/79" (7!S часов) и у "11 1439/81" (96 пасок). Яегависшо >т того, относится лп штамм к быстро рс:!л::циру''':Щ!1!,',ся, у ьчят. име-:j'r.b кокенти, когда он замедлил с ron иктпшость. Им один штамма. :i'pyca 1ГС не обладая постоянном нреыеиоч роплг.г-ччии. -У штамма 'К М29/Ы" в одаишпдцатк случаев (из 23) скоро;:, гь импликации .'..■•:.''í-.íí-;tü;u.¿:0 : ояы:.;, чем у обоих .-¡акцш-змг k'í'íhwce, однако, 3

И-ы пассаже она превышала вакцинные штаммы, в 10, 17, 23, 25, 26, 27, 28 - на одном уровне с одним из вакцинных штаммов, а в 18, 22 и 24 пассажах занимала промежуточное положение. У штамма "Л 123/79" только в трех случаях (в 27, 28, 29 пассажах) развитие его ЦГЩ в культуре клеток дольше вакцинных, в остальных случаях оно наравне с одним из вакцинных штаммов, или занимало промежуточное положение. При сравнении обоих эпизоотических штаммов скорость репликации была одинакова только в трех случаях (26, 29, 36 пассажах), в'семи случаях (24, 25, 30, 31, 34, 35, 40 пассажи) она у "П 1439/81" медленнее, а также в семи случаях (27, 28, 32 , 33 , 37, 38 , 39) одинакова со штаммом "Л 1.23/79". Применив даже одинаковые серии культуры клеток,наблюдалось различие по течению инфекционного процесса в клеточном монослое. Отмечено разное время проявления вирусного ЦВД от пассажа к пассажу, однако, в некоторых интервалах (с 12-16 и 22-24) пассажей штшлш вируса имели одинаковую репродуктивную способность, где она была постоянной. Наше предположение о'том, что ото явленио могло быть связано с постоянством структуры популяции вируса не подтвердилось: у всех штаммов имелось качественное и количественное варьирование бляшкообразующих единиц по £ -признаку. Однако, более длительному развитию ЦГЩ, соответствовало большее разнообразие структуры вирусной популяции у штамма "И 1439/81". Сравнение в одном интервале (с 12-16 пассажи) инфекционной активности этих штаммов также не выявило какой-либо тенденции. Одщко в другом таком интервале (22-24 пассажи) медленная скорость репликации соответствовала самым низким значениям инфекционной активности, а также большей гетерогенности популяции : пруса у штамма "П 1439/81' по сравнению с "М-42". Как уже отмечалось, сравнили скорость деструкции клеточного ыонослоя с уровнями инфекционной активности •дташов по пассатам на всем протяжении адаптации. У яташов

"Rfl.ic' и "M-42" более низким значениям титров инфекционности вируса соответствовало замедленное развитие инфекционного процесса в монослое клеток, более высоким - его ускорение (с одним исключением). Однако, такой зависимости нет у эпизоотических штаммов! Между вакцинными штаммами вируса ITC по скорости репродукции их в культуре клеток СПЭВ обнаружили среднюю корреляцию. Очень слабой она била между ва'сциншми штаммами и "Л 1439/81". Прямая и сильная корреляция наблюдалась только между эпизоотическими штаммами. А эпизоотический штамм "JI 123/79" с обоими вакцинными - шал обратную коррелятивную связь. Таким образом, межштаммовые различия имели место. Helm и не отмечено уменьшение сроков деструкции инфицированного клеточного монослоя в зависимости от уровш пассата. В процессе адаптации наблюдали периодичность характера изменений в монослое меток у штаммов "Ршс" и "II 1439/81". Они отличались там, что в одних случаях наблюдали набухание некоторых клеток, округление их по краям зоны Ц1Щ, в последующем клетки становились зернистыми, отделялись друг от друга и от стекла,что приводило к частичной их дегенерации. В других случаях - клеточный монослой {азрыхлялся, но наблюдали зернистых клеток, они шс-сово отторгались в поддертлвающую среду, внешний вид резко отличался от клеток в контроле. Всо вируссодержание жидкости проверяли на стерильность, обрабатывали 25 раствором хлороформа и осуществляли контроль с помощью электронного микроскопа. При развитии деструктивного действия вируса, описанного во втором сяучао наблюдали замедление репликации вируса штамма "Rimc" на 12,2 часа, у штамма ":I 1439/81" ни 4,4сЗ часа, чем в первом случае, Палю предлол^кенио о том, что это могло быть связало с изменениями в структуре популяции вируса подтвердилось. У штамма "Рдос" в одном токок интзрвало наблюдали появление двух но ei к ендов Э!'[:усн;.а инфшгл'оншос одкющ (по i -признаку), в другом ин-

терюало, наоборот, происходила утрата всех вируош:;. одстщ, креме образующих мелкие бляшки. У штамма "II 1439/01" смену характера деструктивных изменений в монослое клеток вызывало уменьшение ла 3 вцна блашкообразуюцих единиц. Новое рекультивирование вируса штамма "Риме", проведенное через 0 лет хранения из той же серии лиофилизированнойщкцпш обнаружило ту не периодичность в смо не характера деструктивного Дсйстеия в клеточном монослое, что вы зпвалось уменьшением бляшкообразугацих единиц вируса в популяции. При олектрониомикроскопическом обследовании не выявлено морфологически дефектных частиц. В ранних исследованиях при чередовании деструктивных изменений в неточном монослое, так же как и при новом культивировании через 3 лет у штамма "Риме", на наблюдали достоверных изменений инфекционной активности. Однако, скорость развития ЩИ на всем протяжении адаптации при рекультивировании ого через 8 лет хранения проходила на 20,5 часа медленнее (по средним показателям), чем ранее. .

В исследуемом интервале пассажей наибольшей инфекционная активность была у штамма "М-42" - средний показатель 7,14 БОЕ/ см3, у остальных - ниже: 5,9 Е0£Усм3, 5,54 Б0Е/см°, 4,99| БОНУсм3 соответственно у штаммов "П 1439/81", "Риме", "Л 123/79", Саше низкие показатели по скорости репликации и по инфекционной активности (по средним показателям) были у штамма "Л 123/79". Менее адаптированные штаммы медленнее проявляли вирусное ЦЦД, но при сравнении инфекционной активности столь четкой зависимости н; было, т. к. эпизоотический штамм "П 1439/01" и "Риме" имели практически одинаковые ее значения, у двух других - эта зависимость сохранилась. Все штаммы проявляли инфекционные свойства по-разнону в исследуемом интервале пассалей. ¡¿сада "Риме" тлел два пика сиикешл пн-зкциснлсК активности (с 13-15 и с 20-24 иассати). Ро смотря на то. ч;о нэ обигруг.илп достоверной роз нищ с «н'^яуто!!-

ней активности вируса при смене деструктивного действия в клеточном монослое, с 20-24 пассажи такая негативная связь тлелась, после чего инфекционная активность повышалась. В этом интервале исследований популяция вируса была более гетерогенной по сравнению с первым интервалом смены характера ЦГЩ (8-12 пассажи) и наиболее гетерогенной из всех исследуемых пассажей (в 23). Таким образом, смена инфекционной активности вируса в этом интервале пассажей зависела от состава его популяции. При рекультивировании штамма вируса "Риме" через 8 лет хранения наблюдали погашение инфекционной активности 1а -(6,32 ^ БОЕ/сал3) по сравнению с началом культивирования (5,54^ БОЕУш3), что свидетельствовало о том, что вирус не утратил своих инфекционных свойств. У штамма "1.1-42" на всем протяжении исследований наблюдали постоянное повышение инфляционной активности. Не обнаружили существенной разницы у обоих вакцинных штаммоэ по инфекционной активности до 13 пассажей, а она наблюдалась с 13-26 пассажи включительно. Структура популяций вируса в среднем различалась по количеству вирусных инфекционных единиц, образующих бляшки ^ 2,0 т 9,46 % (у штамма "Рдао" их большз (- 6 2,5-4,0 мм на 9,59 %) у штамма "М-42" их оолызе), ¿4,1-5,5 юл на 0,13 % (у штамма "Риме" их больше) по £ - признаку. Таким образом, большая инфекционная активность -вируса "М-42" в этом интервале вызвана наличием большего числа вирусных единиц, образующих негативные колонии диаметром 6 2,£-4,0 мм, а также образующих их 5,5 мм, т. е. последних не било у штамма "Риме". В интервале 1-9 пассажей, где не было различий по инфекционной активности у вакцинных штшмов из установил« :уществен-ной разницы по колтоеству бляшкообразующих единиц (0,74-0,75 %). Таким образом, существовала прелая связь можду наличием опредслон-юи микроного'лгаз'Л вируса, численностью их членов и инфекционной активность«) вируса. Это бьяо подтверждено и исследованием 13 глс-

сажей отих штаммов, с которых началось существенное различно по структура популяций. Высшему уровню инфокциошой активности у штамма "1.1-42" соответствовала более гетерогенная популяция вируса по сравнению со штаммом "?имс" и у него в этом случае численность вирусних частиц, образующих точечные бляшки на 65,69 % выше, чем у "Риме". В интервале пассажей вакцинных штаммов, где не обнаружили существенной разницы в численном составе поцуляций вируса (1-13 пассажи) установлено, что и но скорости разрушения клеточного монослоя они практически одинаковы (с разницей в 0,23 часа). Е пассахах с разным составом популяций, инфекционной активностью (с 13-30) обнаружили также и значительную разницу по скорости репликации на 18 часо^з в пользу штамма "Ы-42". Оба штамма имели сильную прямую корреляцию по инфекционной активности б пассажах 1-9 и очень слабую ( V = 0,024) и интервале 13-26 пассажи. Таким образом, оба вакцинных штакма иыели сходный процесс адаптации к культуре клеток СПЗВ до 13 пассажа. 11нф опционная активность вируса штамма "П 1439/81" изменялась в процессе адаптации как к культуре клеток СШВ, так и к ПСИ (средний показатель в нервом случае 5,9^Е0ЕУсма, во втором случае - Б0Е/смэ)

Самой низкой инфекционной активностью вирус обладал в 10 пассажах обеих культур клеток, после чего она повшалась до 35 пассачса включительно, а с 35-40 пассата достоверно снижалась в обоих случаях. В интервале с 10-40 пассажи инфекционная активность этого штамма в среднем выше в культуре клеток СИ;В (5,33 (к Б05/см3) ,че;.' в ПСИ (5,56 ЕС"/см3). Оба варианта вируса "П 1439/81" в этом материале пассажей имели нряодю, сильную корреляцию инфокционш" активности ( "С- = 0»СЗ %). В обеих культур-« клеток выявлено кзмс-ношт состава пбцуляции вируса. Однако, в конечной точке иссле-доэагкй но сб1.-?.р;-:--хк п^ыаення ее, газчфэг^аюс.'и. В культуре клеток 0122 в -\0 щбладалн '.по гразлеию; с асм! а с-г-. ■

ее количество вирусных инфекционных единиц, вызывающих мелкие Зляшки I мм (на 40,98 %)\ в культуре клеток 11СП - это вирусные частицы, вызывающие негативные колонии 3,5 мм (на 21,42 %). У второго эпизоотического штамма изменение инфекционной активности проходило скачкообразно, отличаясь от штамма "П 1439/81" несмотря на применение одинаковых серий культуры клеток (прямой корреляции не выявили). С двумя вакцинными штаммами у штамма "Л 123/79" обнаружена обратная корреляция. Сравнение состава его популяции, инфекционной активности по пассажам, зависимости от количественных характеристик не выявило. Сильную корреляцию по инфекционной активности наблюдали только между штаммами "М-42" я "П 1439/81". У штаммов "Риме", "М-42" и "Л 123/79" обнаружили зависимость между повышением инфекционной активности и большей гетерогенностью вирусных популяций. В двух случаях (у штамма "Риме" начального культивирования и у штамма "П 1439/81" повышение инфекционной активности не связано с повышением гетерогенности популяции. Обнаружена стабильная часть вирусной популяции (у лтамма "М-42" вирусные гястицы, образующие бляшки "¿-I мм, у штампа "П 1439/81" в обоих культурах клеток мм, у штамма "Л 123/

79" -^1,5 мм;. По мере культивирования вируса ITC вакцинных

ась

атаммов, повшшГ гетерогенность популяции за счет вирусных частиц, образующих крупные бляшки; у эпизоотических - структура популя-дий в изучаемом интервале пассажей колебалась. Штаммы вируса "Риме" и "М-42" имели вирусные частицы способные и :еспособные к образованию бляшек с осветленной зоной в клеточном монослое.

Применив для репликации вируса различные культуры клеток, збнарууили, что изменение инфекциогшой активности у штамма "П [439/81" не связано с системой культивирования (СП5В и ОСП). Все изученные втгшмы не имели обцей тенденции к изменении инфекционных свойстг а зпгиеимости от вида культуру K-ier-'ic, У ,.>того спи-

ма имелась вариабельна часть вирусной популяции, чувствительная к смене культуры клеток, что однако не сказалось на инфекциошых свойствах вируса при использовании клеток Г1СП, С1ТЭВ и СПЭВ 4- ПСП. Но выявили зависимости между инфекционной активностью и количеством вирусных частиц.

С целью выяснения вопроса влияния возраста системы культивирования на инфекционные свойства вируса TTC провели исследования, применив 2-9 суточный монэслой культуры клеток СПЭВ. Обнаружена разная чувствительность к вирусу TTC системы культивирования в зависимости от ее физиологического состояния. Оптимальный варишт клеточного монослоя для штамма "Pïimc" был на всем протяжении (2-9) исследований, для штамма "Цурдью-115" _ 2_8 суточный, для штамма "П 1439/81" - 2 суточный. Это зависело от состава вирусной популяции, однако, изменение ее не повлияло на показатели инфекционной активности у вируса штамма "Риме". У штамма "Цурдью-115" меньшая инфекционная активность вызывалась значительным преобладанием вирусных частиц, образующих бляшки диаметром 1,5-2,5 мм и меньшей гетерогенностью популяции в 9 суточном монослое клеток (по сравнению с 3 и 5 суточным, где инфекционная активность достоверно вше). У штамма "П 1439/91" также большей гетерогенности вирусной популяции соответствовала высшая инфекционная активность. Обнапуасна избирательность репликации млкропоцуляций вируса TTC в монослое клеток разного возраста, однако не наблюдали общую зависимость у всех штаммов в одинаковом по возрасту монослоа клеток.

Таким образом, вакцинные и опизостические штаммы вируса TTC различались по скорости развитая деструктивного действия в культурах ¡слеток, шйокциотой активности к по составу популяции вируса в процессе едагсодда к. культура клеток.

Изучение устойчивости вируса TTC к воздействию условий хранения и взаимосвязь этого явления со структурой его популяции

Нами проводена серия опытов по выяснению способности сохранения инфекционных свойств вируса при воздействии на него разных температур и длительности хранения. Исследовали штаммы "Риме", "11 1439/81",-'"Цурдью-115", "1.1-42" и "Л 123/79". Определено, что при 213 °С на протяжении 72 часов но инактивировался ни один из штаммов: "Rimc", "Цурдью-IIb" и "II 1439/81", однако, существенно снижая свои инфекционные свойства. Чувствительность вируса к действию температур (4*0,5) °С и минус (13*0,5) °С различна в зависимости от сроков хранения: штамм "Риме" не реагирует на температуру 4 °С в течение 2 месяцев, после чего сникал титры инфекционно-сти, выживая, однако до I года и 3 мес (срок исследования) в лно-филизированном состоянии сохранялся в течение 8 лет с уменьшением его шфзкциошой активности, ь. ттаым "Л 123/79" до 5 лот. У птамма "М-42" температура хранения (4-0,5) °С, та1.: жо, как и у штаммов "Риме", "фрдыо-Пй", "Л 1439/01" и "Л 123/79" минус (13* 0,5) °С вызывала различную 'чувствительность раз та уровней пассажей к дяпталыюцу хранению. Все итаммг вируса при (4*0,5) уменьшали гетерогенность популяций. При температуре минус (13*0,5) °С изменение структур популяций зависело от применяемого што-мма: "Л 1439/01", адаптированный к культурам клеток СПЭВ и ) ¡СП и штамм "Дурдью-Пб" - увеличивали их гетерогенность, a. штаммы "Л 123/79" и "Гиыс" - уменьшали. При отом имелись стабильные и лабильна компоненты поцуляцгй: у "ГЪ:с" вирусные частиц.!, акпиюпдно бляшки диаметром 41-1,5 i/j.i; у "Пурды:,-115п - 1-5,0 ш; у "II 1439/ 61- é 1,С мм н 3,0 мм; у "Л 123/79" - é 1,0 к 2,0 хл.

Таким обрезом, усханоачена ухгличшт чуэст-гэлькоат!. вирус. ■■ •••■:■•.■■vmos '<■ /дигвльк-зстн <

(25*0,Ь), (4*0,5) и ыицус (13±0,5) °С.

В результате изучения вопроса изменения инфекционных свойств вируса ITC при многократном (13 разовом) замораживании -оттаивании вмруссодержащей жидкости от (18*0,5) °С до минус 13 °С обнаруживали, что штаммы вируса "Риме" и "П 1439/81" на реагируют на такие условия хранения, а штамм "Цурдыо-115" снижает при этом достовер1 о инфекционную активность после ?.-го раза замораживания - оттаивания.

Таким образом, полученше результаты свидетельствуют о различной чувствительности вируса TTC к условиям хранения в зависимости от штамма вируса.

Ьлпяние коронапяруса трансмиссивного гастроэнтерита свиней на хромосом..' клеток животшх

Для выяснения мутагенного аффекта вируса TTC нами были тестированы имеющиеся культуры клеток СЮВ-М и ПСП (составлены ¡с &> рислогические характеристики). Они явились хорошей моделью по а» явленна мутагенных во-действий' , так как первая из них: содержал,'. 5,14 % ыотафаалых пластинок с поврдауюнияыи хромосом, а вторая » 6,14 îj, Обо клоточше культуры имели модальный класс 38 хромосом соответствующий нормальному диплоидному набору хромосом вида. ГТ* раллельнэ с контролем интактных клеток, изучали характеристику клеток,инфицированных внесением клеточной суспензии троекратно :.ш.ороженной-оттаяной. Такая обработка не выявила достоверного ношиония Уровня повратдогая хромосом. При исследовании влияли;: зташов "¿1-42" и "Миллер" на хромосош лейкоцитов свиней не обт рушено достоьерного пооетения аберраций хромосом (титр ин-екцисн иости Di руса атаыма "11-42" был 4,88 - 5,5 х Ю-3. БОЕ/см3, "Миллер", как описало э разделе "Материала и методы"). Crmcr вирус:. ТС '¡¿Rin-ÏK* и "П 14Э9/ЯГ * культуре -лето- СЛИЛ !

лтрами инфокционности 0,09-0,63 х Ю-6 BOF/см0 и 0,03-4,0x10-7 ■ОвУсма соответственно) повышали содержание меток с поврезгде-ияии хромосом достоверно (Р<£ 0,001). Штамм "Пу ргоыо-I15"-почти I 8 раз по сравнения с контролем (39,50 % по сравнению с 5,14 %), . лтамм "Л 1439/81" повышал количество клеток с повреждениями .ромоесм до 36,09 % (из них 14,23 % - готороплоиды, 9,52 % чцоитрики, 14,2В % приходилось на другие повреждения - слияние роматид, одиночные разрывы] При уменьшении вносимого объема ви-усного материала с 1,0 до 0,1 да3 число мотафазных пластинок ромосом а аберрациями составило 52,94 %, из них - 35,29 % были етерогаоидц; % - дицентрики, у 5,08 % наблюдалась пульворп-ация хромосом и у 5,08 % - одиночные фрагменты. Разница ме;кду омтролыдои клетками и опытными достоверна - Р<-'~ 0,001. '¡¡Ььмм ;1урдш-ПЬ" в культуро клеток СГШ вызывал у 22 % клеток двой-ие и оди.чеч-ше разрывы с образованием фрагментов, 10 % - при-лось isi неравномерную кондонсац^то хроматина (утолщения одного ли своих гомологических плеч хромосом), -1 7> созтагили дицентри-v;, а столько ;:;о - полигиоидн (из всех обслодовашаж). IOiotok, сдер^дянх хромосомы меньпо норш било 70 1,33 клеток имело исло хромосом больше 3d. Отот штаг/л.-, в гудьтуро лдеток CR3E -М в ,2 '¡-, сяулиоз вызвал фрагментацию хромосом.

При использовании культури клеток ПОЛ штамм "iiyprj.-s-IIS4 пс-количество ¡леток с аберрациями петой j 3 раза ( до 22,22 ,'j) - из них - 11,11 % состиоила тхуллао?..;пш.,ля .) сголысо о ..олиаоцдия). Однако, повре^дагцое дейстэ'.'е вируса щ хре-оссш ¡леток свиньи,с использованием критерия :;крсе1К1,ока£йДсс:» есуцествешилл (Р >• 0,1).

Я;.« обследовании перв^врячэской крови (лейкозов) бопит ТТС квогю.к кз совхоза им. Ленина Брестской сблас?:« де-

то i ррнуа р,_5!п;цу (Р*£Г 0,01) по срапноюоо о хкюткл-

-гоми. В контроле метафазных пластинок хромосом со структурными аберрациями хромосом содержалось 10,52 % и все повреждения -разрывы, 21,04 % - анеушюидныэ клетки. Инфицированные животные содержали 35,93 % метафазныг пластинок хромосом со структурными повреждениями (из них 9,35 % - разрывы, 17,18 % - были фрагмен-тированы - пульверизация, 6,23 % - имели слияние хроматид, 1,5 % - К-мито: (колхяциновый).

При сравнении различий между мутагенным эффектом штаммов "Дурдью-П5" и "Л 1439/81" (при инфицировании 0,1 см3 вирусной суспензией) достоверных отличий не выявили - Р>0,1.

Иаким образом, в результате исследований установлено, что вирус ITC разных штаммов имел различное воздействие на генетический аппарат клеток свиней: в одних случаях обладая мутагенным эффектом, в других - нет.

ВЫВОДЫ

I. Установлено различие в биологических свойствах эпизоотических и вакцинных штаммов вируса TTC в процессе адаптации к культурам клеток, хранении (по скорости развития и характеру деструктивных изменений клеточного монослоя, инфякционности, структуре вирусной поп. ляции), а также по влиянию на наследственный аппарат клеток свиней).

?.. Обнаружено различное воздействие вируса 1ГС на хромосомы клеток свиней: штаммы "Л J439/8I" и "Пурдыо-115" вызывали их аберрации в клетках СГОВ; штамм "Дурдью-И5" в клетках ГСП, штамм "М-42" и "Миллер" в клетках лейкоцитов - на вызывали.

3. Подобраны наиболее чувствительные биологические системы культивирования для изученных штаммов: для штамма "Риме" - культуры клеток СПЭЬ и ЛТП, для штаммов-vj] 1439/81" и "JI 123/79" -

культуры клеток СПЭВ и ПСП.

4. Установлена возрастная чувствительность культур меток к вирусу TTC. Наиболее оптимальным для штамма "Риме" оказался 2-9 дневный, для штамма "Л 1439/81" - 2 дневный, для штамма "Цурдьм-115" - 2-8 дневный монослсй культуры клеток СГШ.

5. Штаммы TTC "Риме" и "II 1439/81" оказались устойчивыми к тринадцатик^атному замораживанию-размораживанию в интервале температур от минус 13 °С до 10 °С, а штамм "Пурп.ью-115" - чувствительным к атому воздействию. Температура +25 °С, +4 °С, muye

13 °С снижала инфекционную активность штамма "Риме", "Дурдью-115'. "П I439/8I", "JI 123/79" с течение s времени в разной степени.

0. Установлена вариабельность состава популяции вируса TTC во время адаптации к культурам клеток, длительности хранения, возраста клеточного монослоя, выражающаяся в изменении соотношений мелко- и крупнобляшечних фракций вируса. Отмечено постоянной и временное присутствие в популяции вируса некоторых из этих фракций.

7. Вакцинные штаммы "Риме" и "М-42" способны вызывать образование негативных колоний с разной морфологией: с осветленной зоной вокруг них и без нее.

íiPAKTIHECiülE ¡¡ЩДДОЖШИЯ И РЫЮМЕЦПДЦИИ

1. Разработаны "Методическио рекомендации по выявлению и предупреждению контаминации микоплазмами и вирусами клеточных ¡(ультур". (Рассмотрены и одобрены методкомиссией Укр!'Ш1 27 чолбря X9dl года (протокол 7) и издашшх массовом ти;«.тем (Ккс-ч, KÓ4).

'1. На основании .-.лтериглов исследований рглр;/лгг;г)'!,: ••

?.сг«кэ речоигнеедте по сби&уаяш, уъу.у mîôpîaw*» xpwoc-.«

клеток свиней. при вирусных инфекциях и^етроонхо^яи--..), рига • ренних и утвержденных ыетодкомисспей УкрНШИ 21 ноябре 19В? г (протокол и 5).

3. Выявленные различия в биологических свойствах вируса ис пользуются при производстве вакцин (опытного производства Н11ВЯ).

СПИСОК ОЛУЕ1ПКОМНШХ РАБОТ ПО ШИШАМ ДЛССИРГАЦШ

I. Краснобаев Е.А., Кучорявенко A.A., Дерябина Е-Г., !/!акарен-) ¿¿.С. Ьллшкообразугащая способность вируса трансмиссивного гастро-и^ерпта свиной // Актуальные вопроси ветеринарной вирусологии:

дом. &-Я Всесоюзи. вет. виру см. коиф., 13-15 пая 1980 г. -юань, 19С0. - С. 84.

Ü. Кяесх-ъва З.С., Кучерявонко A.A., Хомрнко З.Г., Кучерявен-з A.A. Сравнительное. изучение блгаиообраяуюгтей способности гигаы-

"Риме" и "L--12" вируса трансмиссивного гсстроэкгерпта свиной 1 Ветеринарные проблемы промышленного свиноводства: Тез. докл. )Нф., 16-20 октября 1933 г. - Киев, 1933. - С. 33-34,

3. Клестсва З.С., Кучорявенко A.A., Кучерлвелкс A.A. Влияние ¡лтеяыюго ;;ра.:(сния на ;.шзкеслособность пап;ппи.:.х "таммог вируса 'С "PtiKc" к "11-12" // Еоторпнарше прсбл^.;к ароныл~сппг,?е хулот-;вод1-;а5'. Тез. докл. ресцубл. нау^ю-лрлптич. кглф., 17—19 октя-•<к IÖS5 г. - г. Euiaii Церксвь, I9B5. - Ч-;<>;•»• I. -■ С. .14.

1. Кучер^ьглтуо A.A., Кучср<шен':о А,Л.; Усг.'еп'.-ч 2.Г. , I.'i-грс-б-1к О.П., ¡¿..карего З.С., Гукопск'и'. bS.t •■ппч '..И., Г.'.а,:оро-i Г.К. Ьстсртсгод» рй'/лЧкзкдму.и по шг.шеагл и пре^кре^д'лга» <»гг.л.авгкп гш;огаат.»1.:;: и вируса-.:« кчет.'-цач гу-а--« р. -■■-1. - Zi с.

о. Кзостоза З.С., Еабищсвич О.С. Изучение ./янякообрлгуг^й

гссобиссги :-н!гоотичоского ."тошла вируса ?ршсм1'--,с* пчпгп г:лтро-a'0f>va свиней "Ii 1439" // Пошлоияе эф'лгегчт^с-гк »огор:«*; ноге 'оспечоння прошляошюго свиноводства: до.'.т. •дстаадщрй респубд. ксн*:., декабрь 193? г. - К..;;,, ;'_-?.?. - С. 556. Каестсаа З.С., Вабицеьич O.G. Хо,ракгьр.чет^/а ¡»и ¡",;озг::т;;:^га any cipycy ти!исм1бквк".го гастроенгорсту лрк цепах*:! «о~

:!■;:,кслсУМ г. кчпьтур1 ч.Цтг.н // Тод. ,г<;ггг?¿^ тукисо-'з-ео-

ри'.'Ично1 конф., шлодих вчених I асп1рат?1в. - м. Кам"яньць-По-Пльсышй, 1909. - С. 51-52.

7. Клестова 3,С. Частота ¡крушений хромосомного аппарата перевиваемой культуры ¡теток свиней, инфицчрогашгой вирусом. - В кн.: Цптогеиетика и биотехнология, Л.., 1939. - С. 64-68.

8. Клсстова З.С. Воздействие вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней на генетический аппарат перевиваемой культур« глоток свиней // УП съезд Украинского микробиологического общества: Тез. докл., сентябрь 1989 г. - Киев-Чер:;эвцы, 1989. -

С. 205.

9. Клестова З.С. Инфекционная активность и бляшкообразут^ая способность эпизоотического штамма вируса трансмиссивного ге.стро-энтерита свиней //Там же. Киев-Черновцп, 1989. - С, 205.

10. Клестова З.С. Влияние температуры на изменение инфекционной активности и состава популяции вируса TTC // Профилактика и меры борьбы с болозняпи молодняка сельскохозяйственных нивотшх: Тез. дога, ресцубл. научко-производств. конф., 12-13 сентября 1990 г. - г. Минск, 1990. - С. 28-29.

11. Клестова З.С. Изменение инфекционной активности вируса ТГ1' в зависимости от уровш пассана в культуре клеток СЩВ // Там жз. - г. Минск. - С. 29-30,

/

l пг.ч. Г. ООГ. «Л-МЛ'1 '.0 .ч 8-1 10 Е:У l'l'MA ЧИП ) пкч.ою.

______ _ _________ - ..1 - ''j \ -: -. CL1 -.. * . ___________ ..