Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Серологическая диагностика энцефаломиокардита свиней

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ им. Я. Р. КОВАЛЕНКО

РГ 5 ОД

На правах рукописи

1 о АПР 1ВС5

ЕРМОЛИНА Наталья Александровна

СЕРОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЭНЦЕФАЛОМИОКАРДИТА СВИНЕЙ

16.00.03— ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Авторефер ат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва —

1995

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я- Р. Коваленко.

доктор ветеринарных наук, профессор Б. Г. Орлянкин

доктор биологических наук Н. Л. Соколова (ВИЭВ) кандидат ветеринарных наук М. М. Рахманина (ВГНКИ)

Ведущая организация: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К- И. Скрябина

Защита диссертации состоится 1995 г.

в ^"часов на заседании Специализиротанного совета К 020.28.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. Я- Р. Коваленко по адресу: 109472, Москва, Кузьмин-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

ки, ВИЭВ.

Автореферат разослан

1995 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат ветеринарных наук

Ф. Г. Терешков

I. ОБЩАЯ X АРЖТЕРИЗТ КЧ А Р/БОТЫ

Актуальность теши Б инфекционной патол-тии свиней важную роль играет вирус энцефаломиокардита. У супоросных свиноматок он вызывает гибель и мумификацию плодов, аборты, рождение мёртвых и слабых поросят. Большинство слабых поросят погибает в течение первых 2-3 недель после рождения. У поросят I-4-месячного возраста развивается энцефалит и миокардит, причём летальность достигает 50-80 % ( н. Acland, 1989j Н. Kim, 1989 ).

Впервые заболевание свиней, вызываемое вирусом энцефаломиокардита, было зарегистрировано в 1958 году в Панаме ( т. Mur-папе, i960 ). В настоящее время энцефаломиокардит свиней диагностируют во многих странах мира: США, Канаде, Бразилии, Гватемале, Пуэрто Рико, Австралии, Новой Зеландии, Южной Африке, ¡Италии, Греции, Бельгии,' Голландии, Швейцарии, Великобритании, Чехословакии, Болгарии, Японии и на Кубе.

Заболевание причиняет значительный экономический ущерб. Так, в течение только одной вспышки энцефаломиокардита свиней на двух фермах штата Миннесота, США, ущерб оценивался в 54 тысячи долларов ( !|V. Christianaoni 1990 ).

Вирус энцефаломиокардита широко распространён в свиноводческих хозяйствах ряда стран и в зависимости от патогенности циркулирующего штамма отмечают как вспышки заболевания с различной летальностью, так и субклиническое течение болезни.

Клинические признаки заболевания и патологоанатомические изменения при энцефаломиокардите свиней сходны с таковыми при различных инфекционных ( ящур, болезнь Тешена ) и незаразных ( недостаток витамина Е и селена ) болезнях. В связи с этим окончательный диагноз на наличие заболевания в хозяйстве ставят по результатам лабораторных исследований ( н. Joo, 1988 ).

Диагностика эицефкломаокардита свиней р нашей стране не проводилась, в связи с этим разработка средств к методе;, диагностики данного заболевания является актуальной задачей.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы явилась разработка лабораторных методов диагностики энцефаломиокардита свиней.

В задачи исследований входило:

- получить гипериммунные сыворотки к концентрированным препаратам вируса энцефаломиокардита свиней на подсвинках и морских свинках;

- отработать оптимальные условия постановки реакций гемагглютинации, торможения гемагглютинации и диффузионной преципитации в агаровом геле для диагностики энцефаломиокардита свиней;

- провести сравнительное изучение диагностической ценности реакций нейтрализации, торможения гемагглютинации и диффузионной преципитации для выявления специфических антител;

- провести серологическое обследование свиней на наличие антител к вирусу энцефаломиокардита в ряде свиноводческих хозяйств;

- разработать набор компонентов для выявления антител к вирусу энцефаломиокардита свиней в реакции торможения гемагглютинации.

Научная новизна. Изучены гемагглютинирукщие свойства вируса энцефаломиокардита свиней в зависимости от вида и концентрации эритроцитов, используемого буфера, рН и температурных режимов. Определены условия освобождения сывороток крови свиней от неспецифических ингибиторов гемагглютинации и гетероагглютини-нов. Отработаны методы получения гипериммунных сывороток крови к вирусу энцефаломиокардита на подсвинках и морских свинках.

Определена диагностическая ценность РГГА и РДП в сравнении с РН. Серологическим обследованием свиней установлена циркуляция вируса энцефаломиокардита в ряде свиноводческих хозяйств России. Изучено влияние хранения на активность компонентов набора для выявления антител к вирусу энцефаломиокардита свиней в РГГА.

Практическая ценность работы. Отработаны реакции торможения гемагглютинации и'диффузионной преципитации в агаровом геле для выявления антител к вирусу энцефаломиокардита свиней.

Разработан лабораторный регламент на изготовление набора для выявления антител к вирусу энцефаломиокардита свиней в реакции торможения гемагглютинации.

Результаты проведённых исследований использованы при составлении временного наставления по применению набора для выявления антител к вирусу энцефаломиокардита свиней в реакции торможения гемагглютинации.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании Учёного совета ВИЗ В (1994 г.), научной конференции (г.Покров, 1994 г.) и межлабораторном совещании сотрудников ВИЭВ (1995 г.).

Публикация результатов исследований. Основные материалы диссертации опубликованы в 3 научных работах.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения и список литературы. Работа иллюстрирована 18 таблицами и I рисунком. Список использованной литературы включает 137 источников, из них II отечественных и 126 зарубежных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ Ж&ЛВДОВЛНИЯ

2.1. Материалы и методы исследований.

Работа выполнена в 1992-1994 гг. в лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики болезней свиней ШЭВ.

Вирус. В опытах использовали культуральный штамм 1029 вируса энцефаломиокардита свиней, полученный из Кубинского национального института ветеринарии. Гемагглютинируюцая активность вигу с Й П

руса составляла 1:128-1:1024, титр инфекционности - 10 •-10 * ТЩо/мл.

Культура клеток и среда. Вирус выращивали в перевиваемой культуре клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ) в стационарных и роллерных условиях. Культуру клеток СПЭВ получали из лаборатории экспериментальной технологии культур клеток, питательных сред и клеточной биотехнологии. В качестве ростовой среды использовали среду 199 на солевом растворе Хенкса с добавлением 710 % стерильной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиков (пенициллин - 100 ЕД/мл, стрептомицин и канамицин - по 100 мкг/мл). Пересев культуры проводили после образования сплошного монослоя с использованием бесцентрифужного метода. Посевная концентрация клеток СПЭВ составляла 50-100 -Ю3 в I мл.

Взращивание вируса энцефаломиокардита свиней в культуре клеток СПЭВ. Вирус энцефаломиокардита вносили в культуральше сосуды после образования монослоя в соотношении 1:10. Инфицированную культуру клеток инкубировали при 37°С в течение 24-36 часов до появления ЦГ1Э. Для освобождения вируса из клеток их разрушали путём двукратного замораживания и оттаивания (температура -20°С и +36-37°С). Культуральный вирус хранили при температуре -20°С.

Буферы. Для постановки РГА и приготовления агарового геля были использованы фосфвтно-буферный (ФБР) (рН 7,2) и физиологический (рН 6,0) растворы, ацетатный (рН 5,0-5,2), веронал-ацетатный (рН 8,5 и 6,5!, боратный № I (рН 8,5 и 6,5), боратный № 2 (рН 8,4-8,6 и 6,5), боратный № 3 (рН 8,0 и 6,5-7,0), КС1 (рН 8,0 и 6,5-7,0), КС1-боратный № 3 (рН 8,0 и 6,5-7,0) буферы.

Реакция гемагглютинации (РГА). РГА ставили микрометодом в лунках полистиролоюх пластин с [/-образным дном в объёме 0,05 мл. В РГА ставили контроль на спонтанную агглютинацию эритроцитов, для чего к 0,05 мл буфера добавляли 0,05 мл суспензии эритроцитов.

Учёт реакции проводили после полного оседания эритроцитов в контроле на дно лунки в виде пуговки или кольца с ровными краями. Реакцию считали положительной, если агглютинированные эритроциты равномерно распределялись в виде тонкой плёнки на внутренней поверхности лунки, образуя своеобразный "зонтик". За гемагглютиниругаций титр вируса принимали наибольшее его разведение, вызывающее полную агглютинацию эритроцитов.

Реакцию макрометодом ставили аналогичным образом, определяя гемагглютиниругаций титр исследуемого материала в объёме 0,25 мл.

Подготовка эритроцитов. Донорами эритроцитов служили человек, свинья, кролик, баран, морская свинка, петух и белые мыши. Кровь у животных брали общепринятыми методами, помещали в раствор Альсевера в соотношении 1:10 и хранили при 4°С в течение 2-3 недель. Перед постановкой реакции эритроциты трижды отмывали ФБР от раствора Альсевера центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут и готовили суспензию эритроцитов соответствующей концентрации.

Реакция торможения гемагглютикации (РГГА). РГГА ставили микрометодом в лунках полистироловых пластин. Перед постановкой реакции сыворотки крови освобождали от термолабильных и термостабильных ингибиторов гемагглютинации и гетероагглютининов. За титр антител принимали предельное разведение сыворотки, полностью подавляющее гемагглютинирущую активность антигена (8 гемагглютинирующих единиц).

В РГГА ставили контроль эритроцитов на спонтанную агглютинацию и контроль рабочей дозы антигена.

Реакция нейтрализации (РН). РН ставили в перевиваемой культуре клеток СПЭВ, выращенной в пробирках.

Сыворотки перед постановкой реакции инактивировали прогреванием в водяной бане при 56-5Э°С в течение 30 минут.

И! проводили, используя серийные двукратные разведения контрольных (отрицательной и положительной) и испытуемых сывороток, и постоянную дозу вируса (100 ТЩЗзд).

Реакция диффузионной преципитации (РДП). Постановку РДП осуществляли в 0,8 % агаровом геле, приготовленном на различных буферах, в чашках Петри диаметром 9 см. В РДП ставили контроли, используя заведомо положительную и отрицательную сыворотки и контрольный (отрицательный) антиген.

Заполнив лунки соответствующими компонентами, часки Петри помещали во влажную камеру при температуре 20-25°С. Чашки ежедневно просматривали в проходящем луче света под углом <6°. Учёт реакции проводили через 48-72 часа.

Количественную оценку прецилитирующих антител проводили, учитывая последнее разведение сыворотки, дающее преципитат. Это наибольшее разведение, при котором образуется линия преципитации, считали титром сыворотки.

Получение концентрированных препаратов вируса энцефаломио-кардита свиней. Культуральный вирус энцефаломиокардита освобождали от клеточного детрита центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10-15 минут и концентрировали с помощью полиэтилен-гликоля (ПЭГ, молек.масса 6000) в конечной концентрации 8 %.

Получение гипериммунных сывороток. Гипериммунные сыворотки к вирусу энцефаломиокардита получали двукратной иммунизацией подсвинков массой 40-50 кг и морских свинок массой 300-400 г инактивированным препаратом вируса.

В качестве отрицательной использовали нормальную (не содержащую антител к вирусу энцефаломиокардита) сыворотку сеиньи.

Инактивация вируса энцефаломиокардита свиней. Вирус энцефаломиокардита свиней инактивировали димером этиленимина (ДЭИ) в конечной концентрации 5 мМ при температуре 37°С в течение 72 часов. Инактивирующее действие ДЭИ прекращали добавлением к ви-руссодержащей суспензии 20 % раствора тиосульфата натрия в соотношении 1:10.

Определение полноты инактивации вируса. Полноту инактивации вируса оценивали по отсутствию его репродукции в чувствительной клеточной системе (культура клеток СПЭВ) в течение 3 пассажей.

Экспериментальные животные. Нормальную и специфическую сыворотки к вирусу энцефаломиокардита получали на подсвинках массой 40-50 кг и морских свинках массой 300-400 г.

Испытуемые сыворотки. В качестве испытуемых использовали сыворотки крови свиней, полученные из ряда хозяйств России.

Статистическую обработку результатов исследований проводили, используя учебное пособие "Биометрия" Г.Ф. Лакина (1990 г.).

2.2. Результаты исследований.

2.2.1. Отработка условий постановки РГА для обнаружения гемагглютниинов вируса энцефаломиокардита свиней.

Вирус энцефаломиокардита свиней обладает гемагглютинирую-щей активностью. В связи с этим были проведены исследования по отработке оптимальных условий постановки РГА.

Первым этапом исследований было определение чувствительности эритроцитов различных видов животных и птиц к вирусу энцефаломиокардита свиней. В опытах использовали эритроциты человека, барана, свиньи, кролика, морской свинки, белых мышей и петуха в концентрации 0,6 %. Пластины инкубировали при 4°С до полного оседания эритроцитов в контроле.

Было установлено, что вирус энцефаломиокардита агглютинировал эритроциты человека и морской свинки в высоких титрах (1:683*174,6 и 1:213-44 соответственно), эритроциты барана в низких (1:27±5) и совсем не агглютинировал эритроциты свиньи, белых мышей и петуха. Шявить чувствительность эритроцитов кролика к вирусу энцефаломиокардита не удалось, так как в контроле они спонтанно агглютинировали.

На основании проведённых исследований в дальнейших опытах использовали эритроциты морской свинки.

Вторым этапом исследований было изучение гемагглютинирую-щей активности вируса в зависимости от концентрации эритроцитов. В опыте были испытаны эритроциты морской свинки 0,4, 0,5, 0,6, 0,8, 1,0 и 1,5 % концентрации. Для постановки РГА использовали культуральный вирус энцефаломиокардита свиней с инфекционной активностью Ю7,5и Ю8,5 ТЩ^ф/мл. Результаты исследований представлены в таблице I.

Максимальные титры гемагглотининов отмечали при испольэо-

Таблица I

Гемагглютинируяцая активность вируса энцефа-ломиокардита в зависимости от концентрации эритроцитов морской свинки

( Х±ш, П=3 )

Инфекционная ! активность ви!-руса, ТД^ о/мл! Титр гемагглютинииов (обратные ве. ___при_кон^ент£ауии эритроцитов 0,5 ! 0,6 ! 0,8 дичины) ! 1,0

Ю7'5 427187 25б±0 107122 531Ц

171±44 Ю7±22 43111 2715

341187 171144 85122 431II

Ю8'5 8531175 683±175 256±0 85122

3413±699 1707±347 68311% 341187

17071347 13651347 6831175 171144

вании 0,5 % суспензии эритроцитов морской свинки. Различия в титрах гемагглютинииов при использовании 0,5 и 1,0 % концентраций были статистически достоверны (р<0,05). Повышение концентрации эритроцитов до 0',8-1,0 % снижало тигр гемагглютинииов в 3,5-18 раз. При использовании в реакции 0,4 и 1,5 % суспензии эритроцитов были получены нечёткие и трудно учитываемые результаты.

В дальнейших исследованиях при постановке РГА и РТГА использовалась суспензия эритроцитов морской свинки в концентрации 0,5 %.

Для определения оптимальной температуры постановки РГА реакционные смеси инкубировали при 4, 20 и 37°С в течение 2 часов. Результаты исследований показали, что вирус знцефаломиоквр-дита агглютинирует эритроциты морской свинки только при 4 и 20° С. Различия титров гемагглютинииов при этих температурах были статистически недостоверны <р>0,05), однако наблюдаемая в РГА

картина при 20°С была менее чёткой, чем при 4°С. В связи с этим температура 4°С была выбрана как оптимальная для постановки РГА.

Поскольку вирусы способны агглютинировать эритроциты животных в определённом диапазоне рН среды, была изучена гемагглзоти-нирующая активность вируса энцефаломиокардита свиней в зависимости от используемого буфера и значения его рН. Двукратные разведения вируса и 0,5 % суспензию эритроцитов морской свинки готовили на каждом испытуемом буфере для каждого значения рН. Пластины инкубировали при 4°С в течение 1,5-2 часов. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Гемогглютинирующая активность вируса энцефаломиокардита свиней проявлялась при использовании ряда буферов с.рН от 6,5 до 8,6. Максимальные титры гемагглютининов выявляли при постановке реакции'с использованием веронал-ацетатного (рН 6,5) и КС1-боратлого № 3'(рН 6,5-7,0) буферов. Титры гемагглютининов, определяемые в РГА при использовании тех же буферов с рН 8,5 и 8,0 снижались в 8 и 4 раза соответственно. При постановке РГА с боратным № 2, КС1 буферами, СБ? и физиологическим раствором гемагглютиннрунцая активность вируса снижалась в 50, 21, 25 и 32 раза соответственно. При использовании ацетатного буфера наблюдали гемолиз эритроцитов. Веронал-ацетатный буфер не имеет широкого применения в 'лабораторной практике, поэтому из всех испытуемых буферных растворов был выбран КС1-боратный № 3 буфер с рН 6,5-7,0.

Таким образом, на основании проведённых исследований оптимальными условиями постановки РГА микрометодом были выбраны: в качестве буферной системы - ХС1-боратный № 3 буфер (рН 6,57,0), эритроциты морской свинки в концентрации 0,5 %, темпера-

Таблица 2

Гемагглютинирующая активность вируса энцефаломиокардита свиней в зависимости от используемого буфера и его рН

_(X ±т. , 3)

_ Буфе£ный_раствор_и_его_рН

Номер Ацетатный ¡Физиологи-! ФБР !Боратный №1!Боратный № 2 ! Боратный № 3

пробы ! ческий ! I ! !

5,0-5,2 ! 6,0 ! 7,2-7,4 ! 6,5 ! 8,5 ! 6,5 8,4-8,6 6,5-7,0 ! 8,0

I Гемолиз 53±И 43±И <2 <2 21±5 И±3 683^75 171±44

2 эритроци- 43±П 27±5 <2 <2 27±5 13±3 1365±348 341±87

3 тов во 21±5 21±5 <2 <2 13±3 7±1 683^175 171±44

4 всех про- П±3 13±3 <2 <2 И-З 7+1 427±87 Ю7±22

5 бах 85±22 Ю7±22 <2 <2 52±И 37±5 2731-699 6831175

Номер _ Буфе£ный_раствор_и_его_рН ______

пробы КС1 1 КС1-боратный № 3 1:1 ! Веронал-ацетатный

6,5-7,0 ! 8,0 ! 6,5-7,0 ! 8,0 ! 6,5 ! 8,5

I 53±Н 27±5 853±1% 128^0 853±175 213-44

2 43±Н 21±5 1365±348 341187 1365±348 171-44

3 32±0 21±5 853±195 171±44 683±175 Ю7±22

4 21±5 И±3 427±87 85±22 512^0 85122

5 128^0 53±П 2731-699 663^175 3413^699 427^87

турный режим - 4°С, время инкубации реакционной смеси 2-3 часа,

С учётом полученных данных сравнивали микро- и макрометоды постановки РГА. Разница титров гемагглютшиноэ, выявляемых в обоих методах статистически недостоверна (р>0,05).

2.2.2. Отработка оптимальных условий постановки PITA для выявления антител к вирусу энцефаломиокардита свиней.

Сыворотки крови освобождали от гетероагглютининов адсорбцией эритроцитами морской свинки. К 0,2 мл каждой сыворотки добавляли осадок отмытых в ФБР эритроцитов в объёме 0,05, 0,10, 0,15 и 0,20 мл. В качестве контроля использовали необработанные сыворотки. Смесь сыворотка-эритроциты выдерживали I час при комнатной температуре, периодически встряхивая, после чего эритроциты осаждали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 10 минут. Сыворотку отбирали и исследовали в РГА микрометодом.

Результаты исследований показали, что 24 (96 %) испытуемых необработанных сывороток содержали гетероагглютинины в титрах от 1:4 до 1:256. При добавлении к сывороткам 0,05 мл осадка эритроцитов морской свинки, гетероагглютинины были удалены в 68 % проб. Обработка 0,15 и 0,20 мл осадка эритроцитов полностью освобождала испытуемые сыворотки от гетероагглютининов, а добавление 0,10 мл осадка эритроцитов исключало наличие гетероагглютининов в 84 % случаев, причём титры неудалённых гетероагглютининов не превышали 1:8.

Для освобождения от термолабильных ингибиторов гемагглюти-нации сыворотки крови прогревали в водяной бане при 5б-58°С в течение 30 минут. Для освобождения сывороток крови от термостабильных ингибиторов гемагглютинации были испытаны методы обработки каолином и перйосагом калия. Для определения оптимальной

концентрации каолина, полностью адсорбирующей ингибиторы, к 0,2 мл инактивированной сыворотки добавляли 0,4, 0,6, 0,8, 1,0 и 1,2 мл 25 % суспензии каолина, обработанного ЬяНС!. Смесь сыворотка-каолин выдерживали 20-30 минут при комнатной температуре и центрифугировали 10 минут при 1500 об/мин. Сыворотки отбирали и обрабатывали 0,15 мл осадка эритроцитов морской свинки. Затем сыворотки исследовали в РГГА на наличие антител к вирусу энцефаломиокардита свиней. Учёт реакции проводили через 2-3 часа, выдерживая пластины при 4°С.

В необработанных каолином сыворотках отмечали нечёткую картину реакции. При обработке сывороток крови суспензией каолина в различных объёмах, наблюдали тенденцию снижения титров анти-гемагглютининов: они минимальны при использовании 1,2 мл каолина. Достоверные различия титров антигемагглютининов (р< 0,05) отмечали между сыворотками, обработанными суспензией каолина в объёме 0,8 мл и необработанными.

Оптимальный объём суспензии каолина, необходимый для обработки сывороток крови, определяли по полноте удаления ингибиторов гемагглютинации.

Было установлено, что при обработке сывороток крови свиней 0,6 мл 25 % суспензией каолина, в 45 % случаев ингибиторы не были обнаружены; в остальных - их титр колебался от 1:8 до I: 64. При использовании 1,0 и 1,2 мл каолина ингибиторы гемагглютинации были удалены в'16 (80 %) съшоротках, причём их титры не превышали 1:10 и 1:20 соответственно. В связи с этим в дальнейшей работе обработку сывороток крови проводили 1,0 мл 25 % суспензии каолина.

Различия титров антител в сыворотках крови, обработанных отмытым и неотмытым в соляной кислоте каолином, статистически

недостоверны (р>0,05).

Для освобождения сывороток крови от термостабильных ингибиторов гемагглютинации испытывали раствор перйодата калия. При сравнении титров антигемагглютининов в сыворотках крови свиней, обработанных 1,0 мл 25 % суспензии каолина и перйодатом калия, были получены практически одинаковые результаты. Все исследуемые сыворотки давали чёткую реакцию.

Хранение инактивированных сывороток, обработанных каолином и эритроцитами морской свинки, в течение ночи при 4°С практически не влияло на результаты РГГА.

Изучали влияние температуры и длительности инкубации смеси вирус-сыворотка на титр обнаруживаемых антител. Смесь вирус-сыворотка выдерживали при 4, 20 и 37°С в течение 18, I и 2, I и 2 часов соответственно. Было установлено, что результаты РТГА остаются неизменными при всех температурных режимах и времени инкубации смеси вирус-сыворотка.

Таким образом, перед постановкой РГГА испытуемые сыворотки крови освобождают от термолабильных ингибиторов прогреванием в водяной бане при 56-58°С в течение 30 минут; от термостабильных ингибиторов - обработкой 1,0 мл 25 % суспензии каолина; от гетероагглютининов - адсорбцией осадком эритроцитов морской свинки в количестве 0,15 мл. Допускается хранение обработанных сывороток в течение ночи при 4°С. При постановке РГГА смесь вирус-сыворотка инкубируют I час при 20°С, а затем добавляют 0,5 % суспензию эритроцитов морской свинки. Пластины инкубируют при 4°С в течение 2-3 часов.

Сравнение титров антигемагглютининов,.определяемых микро-и макрометодами постановки РГГА, показало хорошее совпадение результатов.

2.2.3. Отработка реакции диффузионной преципитации в агаровом геле для выявления антител к вирусу энцефа-ломиокардита свиней.

Нами были отработаны условия постановки РДП в агаровом геле для выявления и титрования антител к вирусу энцефаломиокар-дита свиней в сыворотках крови. Гипериммунные сыворотки, необходимые для отработки РДП, получали на подсветках и морских свинках к инактивированным препаратам вируса энцефаломиокарди-та. Уровень антител в гипериммунных сыворотках подсвинков составлял 1:192, а в сыворотках крови морских свинок - от Ii128 до 1:1024.

На первом этапе в качестве антигена для РДП использовали культуральную вируссодержащую жидкость с активностью вируса эн-цефаломиокардита в РГА 1:128. При постановке реакции с культу-ральным неконцентрированным вирусом, видимых линий между ним и гипериммунными сыворотками не образовывалось. В связи с этим вирус концентрировали ПЭГ. Гемагглютинирующая активность концентрированного вируса энцефаломиокардита составляла 1:1024. В качестве контроля использовали неинфицированные клетки СПЭВ, прошедшие такую же обработку.

Вирус энцефаломиокардита, концентрированный ПЭГ, титрова-. ли с гипериммунными сыворотками крови свиньи и морской свинки.

При использовании цельного и разведённого вируса энцефаломиокардита отмечали, что разведение вируса в 2 раза приводило к образованию либо слабых полос преципитации, либо к снижению титра выявляемых в РДП антител. При разведении вируса в 4 раза видимых линий преципитации не получали. Линии преципитации между контрольным антигеном и гипериммунными сыворотками не образовывались. Гипериммунная сыворотка подсвинков была активна не-

разведённой, а гипериммуные сыворотки морских свинок № 1-3 - в разведении 1:16, 1:32 и 1:4 соответственно.

В дальнейших исследованиях использовали нераэведённый вирус знцефаломиокардита свиней, концентрированный ПЭГ, и гипериммунные преципитирующие сыворотки в рабочем разведении.

На чувствительность РДП также влияют состав буфера, на котором готовят агар, и значение его рН. Было установлено, что полосы преципитации между вирусом и сыворотками образовывались только при использовании агарового геля, приготовленного на бо-ратном № 3, КС1-боратном № 3 (1:1) и веронал-ацетатном буферах.

Таким образом, РДД в агаровом геле ставят с использованием КС1-боратного № 3 буфера (рН 6,5-7,0), концентрированного вируса знцефаломиокардита-и преципитирующих гипериммунных сывороток в рабочем разведении.

2.2.4. Сравнение диагностической ценности РГГА, РДП и

Ш для выявления антител к вирусу знцефаломиокардита свиней.

Для определения чувствительности РГГА, результаты, полученные с её помощью, сравнивали с таковыми, полученными в РН и РДП. В опытах использовали 25 сывороток крови свиней, полученных из различных хозяйств, и 25 гипериммунных сывороток крови морских свинок. Постановку РГГА и РДП осуществляли согласно методикам, описанным выше. РН ставили макрометодом в культуре клеток СПЭВ, выращенной в пробирках. Корреляция результатов составила 91 и 95 % при определении наличия тормозящих гемагглю-тинацию и нейтрализующих вирус антител в сыворотках крови свиней и морских свинок соответственно. Уровень антигемагглютини-нов статистически достоверно отличался от уровня нейтрализующих антител в сыворотках крови свиней - в 4 %, в сыворотках

крови морских свинок - в 16 % случаев.

При сравнении результатов, полученных в РГГА и РДП корреляция между ними обнаружена только в 20 % сывороток крови свиней к в 77 % сывороток крови морских свинок. Линии преципитации между вирусом и сыворотками образовывались только в том случае, когда уровень антигемагглютининов в них составлял более 1:16.

Таким образом, РТГА и Ш являются высокоспецифичными и могут использоваться для выявления антител к вирусу энцефаломио-кардита в сыворотках крови свиней. . .

2.2.5. Разработка набора для выявления антител к вирусу энцефаломиокардита свиней в реакции'торможения гемагглютинации.

Для обнаружения антител к вирусу энцефаломиокардита в сыворотках крови свиней был разработан диагностический набор.

2.2.5.1. Приготовление компонентов диагностического набора.

В качестве специфического антигена использовали культура-льный вирус с гемагглютинирующей активностью 1:128-1:1024, инак-тивированный ДЭИ в конечной концентрации 5 мМ.

Гипериммунные сыворотки получали путём двукратной иммунизации подсвинков и морских свинок. Животным вводили концентрированный с помощью ПЭГ' вирус, смешашгый с масляным адъювантом в соотношении 1:1. Титры антигемагглютининов составляли 1:192 в сыворотках крови подсвинков и от 1:128 до 1:1024 у морских свинок. В качестве нормальных (отрицательных) использовали сыворотки крови свиней и морских свинок, не содержащие антител к вирусу энцефаломиокардита.

Стерильность компонентов диагностического набора определяли путём посева на питательные среды: Ш1А, МТБ, М11Ш и Сабуро. Роста бактериальной микрофлоры и грибов не отмечали.

Все компоненты диагностического набора хранили до употребления в стерильных флаконах при -20°С.

2.2.5.2. Влияние хранения компонентов диагностического

набора на их активность При длительном хранении возможно изменение первоначальных свойств компонентов диагностического набора. В связи с этим активность хранившихся в течение 12 месяцев при -20°С вируса и сывороток определяли в РГА и РГГА через каждые 3 месяца (таблица 3).

Таблица 3

Активность компонентов диагностического набора в процессе хранения

_( х*т, п=з )_'

Продолжи- !________£!_____'___

хранения' 1 Вирус ¡Положительная сыворотка Тотрицательная мес. ! ! свиньи ¡морской свинки!сывоРотка

0 ' 341 87 171 + 44 1024 + 0 ¿8

3' ■ 341 + 87 128 + 0 853 + 175 <8

б 256 + 0 171 + 44 1024 + 0 <8

9 256 + 0 128 + 0 1024 + 0 ¿8

12 171 + 44 128 + 0 853 + 176 <в

Примечание: в таблице представлены данные, обратные среднегеометрическому титру антител и антигена.

Активность компонентов (жидкого инактивированного вируса энцефаломиокардита свиней, жидких гипериммунной и нормальной (отрицательной) сывороток) оставалась практически неизменной (р > 0,05).

2.2.6. Серологическое обследование свиней на наличие антител к вирусу энцефаломиокардита с помощью РГГА и РН.

Используя отработанную методику постановки РГГА и компоне-. нты набора, было проведено серологическое обследование свиней из ряда хозяйств на наличие антител к вирусу энцефаломиокардита. В 1992-1994 гг. была исследована 261 проба сывороток крови свиней различных возрастов из 20 хозяйств России. Сыворотки крови были получены из свиноводческих хозяйств, имевших случаи нарушений репродуктивной функции свиноматок и гибели поросят (таблица 4). 62 (24 %) сыворотки крови свиней из 14 (70 %) хозяйств содержали специфические антитела в титрах от 1:8 до 1:64.

Для подтверждения результатов, полученных в РГГА, все положительные сыворотки исследовали в РН. Установили, что 60 (97 %) сывороток, содержавших тормозящие агглютинацию антитела, нейтрализовали вирус в титрах от 1:4 до 1:128. Полученные данные свидетельствуют о циркуляции вируса энцефалоглокардита свиней в ряде хозяйств России.

ВЫВОДЫ

1. Получены гипериммунные сыворотки к вирусу энцефаломиокардита свиней на подсвинках и морских свинках (уровень анти- . гемагглютининов 1:128-1:256 и 1:128-1:1024 соответственно).

2. Определены оптимальные условия постановки РГА для выявления и количественной оценки вируса энцефаломиокардита свиней. Реакцию ставят на КС1-€оратном № 3 буфере (рН 6,5-7,0) с эритроцитами морской свинки в концентрации 0,5 % при температуре 4°С. Учёт реакции проводят через 2-3 часа.

3. Отработаны оптимальные условия постановки РГГА для обнаружения антител к вирусу энцефаломиокардита в сыворотках крови

Таблица 4

Серологическое обследование СЕИней на наличие антител к вирусу энцефаломиокардита в РГГА

! » п/п 1 Название хозяйства, область 1 Количество иссле-'дованных !сывороток ! Число и процент положительных сы-!вороток

I "Кузнецовский", Московская 28 7(25 %)

2 "Россия", Курская 5 -

3 "Владимирский", Владимирская 20 6(30 %)

4 "Боровое", Ивановская 15 4(27 %)

5 "Илышогорский", Нижегородская 10 3(30 %)

6 "Курба", Ярославская 13 4(31 %)

7 "Лазаревский", Тульская 18 8(44 %)

8 "им. Тельмана", Курская 4 -

9 "Прогресс", Курская 10 8(80 %)

10 "Золотоношский", Курская 10 2(20 %)

II "Рыльский", Курская 6 -

12 "Дзержинский", Нижегородская 4 -

13 "Поволжский", Самарская ■ 5 1(20 %) ■

14 "им.50-летия СССР", Нижегородская 8 3(37 %)

15 "Гибридный", Самарская 4 -

16 "Красногорский", Челябинская 20 -

17 "Лузинский", Омская 29 4(14 %)

18 "Восточный", Удмуртия 26 6(23 56)

19 "Ленинское знамя", Сахалинская 20 5(25 %)

20 Северная Осетия 6 1(17 %)

Всего исследовано:

261 62(24 %)

свиней. Исслецуемые пробы освобождают от термолабильных (при 5б-58°С 30 минут) и термостабильных (обработкой 25 % суспензией каолина) ингибиторов гемагглютинации и гетероагглютининов (адсорбцией эритроцитами морской свинки).

4. Определены оптимальные условия постановки РДЛ в агаро- ' всм геле для обнаружения антител к вирусу энцефаломиокардита в сыворотках крови свиней. Реакцию ставят с использованием 0,8 % агара, приготовленного на НС1-боратном №3 буфере (рН 6,5-7,0), концентрированного вируса с гемагглютинирукхцей активностью не менее 1:1024 и преципитируицих гипериммунных сывороток крови подсвинков или морских свинок в рабочем разведении. Преципитирую-щие антитела в испытуемых сыворотках крови обнаруживаются только в том случае, когда уровень антигемагглютининов в них более 1:16.

5. Проведено сравнительное изучение диагностической ценности РГГА и РДП для выявления специфических антител в сравнении с РН. Установлена высокая чувствительность РГГА для выявления антител к вирусу энцефаломиокардита в сыворотках крови свиней. Отмечен высокий процент совпадений результатов в РГГА и РН при исследовании сывороток крови свиней и морских свинок (91 и 95 % соответственно); совпадение результатов РДП и РН отмечено в 20 и 90 % случаев соответственно. •

6. Установлена циркуляция вируса энцефаломиокардита в ряде свиноводческих хозяйств России. При исследовании сывороток крови свиней из 20 хозяйств специфические тормозящие гемагглютина-цию антитела в диагностических титрах (1:8-1:64) обнаружены в 62 (24 %) пробах из 14 (70 %) хозяйств. 60 (97 %) положительных в РГГА сывороток крови свиней содержали вдруснейтралиэующие антитела в титрах от 1:4 до 1:128.

7. Разработан набор компонентов для выявления антител к .

вирусу энцефаломиокардита свиней в РГГА. Активность компонентов практически не изменяется в процессе хранения их при температуре -20°С в течение 12 месяцев (срок наблюдения).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработан "Лабораторный регламент на изготовление набора для выявления антител к вирусу энцефаломиокардита свиней в реакции торможения гемагглютинации" (утверждён директором ® 28 ноября 1994 года).

2. Результаты проведённых исследований использованы при составлении "Временного наставления по применению набора для выявления антител к вирусу энцефаломиокардита свиней в реакции торможения гемагглютинации" (утверждено директором ВШВ 28 ноября 1994 года).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Ермолина H.A. Обнаружение антител к вирусу энцефаломиокардита свиней в реакциях торможения гемагглютинации и нейтрализации // Материалы научной конференции "Актуальные проблемы • ветеринарии, животноводства и подготовки кадров на Южном Урале". - Челябинск. - 1993. - С. 14-16.

2. Ермолина H.A., Орлянкин Б.Г. Лабораторная диагностика энцефаломиокардита свиней Ц С-х биология. - 1993. - № 4.- С. 138-140.

3. Ермолина H.A., Орлянкин Б.Г., Фёдорова Е.С. Серологическая диагностика энцефаломиокардита свиней /I Материалы научной конференции "Классическая чума свиней" - Покров. - 1994. (в печати) .