Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Получение моноклональных антител и разработка на их основе средств и методов дифференциальной диагностики трансмассивного гастроэнтерита свинейи респираторной коронавирусной инфекции свиней

УДК Л Ю:Г,К..ОНН.7:57Н.НЛ.1.21-0Н5.37|

Аспирант Орижакопа Ольга Миханлопна

11олучсние моноклонлльнмх анппел и рачраГкпка па их осноне среден» и меюдоп дифференциальной диагноешки фанемиссиниого I астрешперита ешшей и респираторной ^коронапирусной инфекции ениией

16.00.0.1. - |1С1СрШ1Нр|ШЯ М11К]10С»(0Л()1М, нирусолошя, ЭШПООЮ.'КМИИ. ЧНКОЛО! ИЧ И иммуполо! ия

АВТОРЕФЕРАТ

диссср|ацни на соискание ученом пенсии кандидат печеринарпых наук

Покрои - 1996 г

l'aGoia ш.шолпспа но Всероссийском паучпо-исслгдоиан-льском ми-cnuyic нпсрннарной нпруеолопш и микробиолоши И КИСНСКОМ UncíII-

lyic нс1еринарной мс;ищины

НАУЧНЫМ РУКОВОДИTlülll:

Члсн-коррсспоидспг РАСХП, доктр Hricpniiapiif.ix наук, профессор ВИШНЯКОВ И.Ф.

Чаиедующни лабораюрисй "Молекулярной биологии и генешки вирусом" КИВМ, кандидат ветеринарных наук КРАСИОЬАНВ Н.А.

ОФИЦИАЛЫ1Ы1; OI IHOI Ii:iU Ы: док-юр iicicpiiiiapiiuxпаук МИЩЫПСО В.А. (ВПИИШ). кандидат биолошчсских паук ЩНТНИКОВА Л.А. (ВПИИВВиМ).

Ведущее учреждение - Всероссийский ^шучно-исследонатсльский и тсхнологнчсскии Hiicitiiyr биологической промышленное i».

Заиипа cocí от ся 14 июня 1996 г. n 1150 часоп на заседании дисссрса-цнонного совета Д-120.61.01 но Всероссийском иаучпо-исслсдошисльском HHcnuyie испсринарной вирусологии и микробиологии!! по адресу 601120, г. Нокроп Владимирской облает, ВНИИВВиМ.

С диссертацией можно ошакомн п.ся л библион'кс ВНИИВВиМ.

Ашорсфсра! рашелан 12 мая 1996 г.

Учений ccKpeiapi. дисссрктионного concia, кандидат ветеринарных наук

/ФЁДОРОВ Г.II./

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Возбудитель трансмиссивного гастроэнтерита свиней (ТГС) вызывает высоко контагиозное заболевание свиней всех возрастов, однако наиболее восприимчивыми являются поросята до 2-х недельного возраста. Заболевание характеризуется рвотой, изнуряющей диареей и дегидратацией организма. Уровень летальности среди поросят до 10 суточного возраста может достигать 100% (Matishec et al., 1982). Болезнь регистрируют во многих странах мира, в первую очередь в странах с интенсивно развитым свиноводством - США, Канаде, Японии. Болезнь наносит большой экономический ущерб в связи с отсутствием эффективных средств профилактики. Данные статистики показывают, что в США ущерб, причиняемый вирусом ТГС, превосходит убытки от всех, вместе взятых инфекционных болезней свиней. Особую угрозу инфекция представляет для крупных животноводческих комплексов, где на относительно небольших площадях сконцентрировано большое количество восприимчивых животных (Pensaert, 1984).

Вирус ТГС входит в состав рода Coronavirus семейства Coronaviridae. Крс.\:с не. о и этот род входят антигенно родственные вирус эпизоотической диарреи свиней и гемагглютинирующий коронавирус свиней. Биология этих возбудителей изучена достаточно хорошо. В последние годы в свиноводческих хозяйствах некоторых стран Западной Европы обнаружили необычное явление - в отсутствие специфической вакцинопрофилактики и без клинического проявления ТГС резко возросло количество серопози-тивного поголовья (Callebaut, 1988). Двумя независимыми группами исследователей, из респираторного тракта здоровых свиней, был выделен ранее неизвестный коронавирус, с такими характерными свойствами, как пнев-моропность, авирулентность для естественного хозяина и тесное антигенное родство с вирусом ТГС. Выделенный возбудитель получил название респираторный коронавирус свиней (РКС или РКВС). Проникновение указанного вируса в популяцию свиней, по-видимому, способствовало

формированию иммунного фона, достаточной напряженности (Broun et al, 1988; Pensaert et al., 1979). В связи с обнаружением новой нозоединицы возникла необходимость разработки средств н методов лабораторной диагностики, которые позволили бы обнаруживать и дифференцировать указанные коронавирусы.

Для лабораторной диагностики ТГС в настоящее время разработан-ны следующие методы: биопроба на поросятах, выделение вируса на культуре клеток, метод флюоресцирующих антител (МФА), реакция диффузионной преципитации (РДП), реакция нейтрализации и твердофазный им-мунофермеитный анализ на основе поликлональных сывороточных антител для обнаружения антигенов возбудителя; а также реакция нейтрализации на культуре клеток (РН) и непрямой МФА для обнаружения антител к антигенам возбудителя в сыворотке крови иммунных животных. В виду чрезвычайно тесного антигенного родства возбудителей ТГС и РКВС (Correa at al., 1990; Pensaert at al., 1989) ни один из вышеперечисленных методов не позволяет дифференцировать антигены этих двух возбудителей между собой и дифференцировать иммунный ответ при инфицировании животных вирусом ТГС от иммунного ответа при инфицировании РКВС, т.е. ретроспективно дифференцировать ТГС от респираторной коронави-русной инфекции свиней.

Представляется целесообразным проведение работы по получению МА к консервативным и вариабельным участкам антигенов вируса ТГС для разработки на их основе средств и методов дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной корона-вирусной инфекции свиней.

Цель работы. Получение линий гибридных клеток, стабильно секретирующих МА, обладающие специфичностью к консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС, и совершенствование на их основе средств и методов дифференциальной диагностики

трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней.

Задачи исследования 1. Получить моноклональные антитела к некоторым консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, для чего разработать схему получения таких моноклональных антител, включающую:

- изучение эффективности различных схем иммунизации мышей - доноров иммунных спленоцитов;

- адаптацию некоторых методов лабораторной диагностики для скрининга моноклональных антител нужной специфичности;

- стандартизацию моноклональных иммупореагентов.

2. Экспериментально определить, какие методы лабораторной диагностики позволяют использовать и максимально эффективно реализовать свойства моноклональных антител для обнаружения и дифференцирования антигенов вируса трансмиссивного гастроэнтерита и респираторного ко-ронавируса свиней, а также, для обнаружения и дифференцирования антител, специфичных к указанным возбудителям в сыворотках крови инфицированных животных.

3. Определить пригодность разработанных методов для дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней.

Научная новизна Научная новизна состоит в том, что в результате проведенных исследований:

- получены девятнадцать клонов гибридных клеток, секретирующие МА к консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС и консервативным антигенным детерминантам РКВС;

установлено, что антигенные детерминанты нуклеопротеина (молекулярная масса 47 кД) вируса ТГС, распознаваемые моноклональ-ными антителами клонов ТЮ4.2 и Т404.1, а также антигенные детерминанты пепломерного гликопротеина (молекулярная масса 200 кД) вируса

ТГС, распознаваемые моноклональными антителами клонов ТЗА6.2 и TIC 12.2, присутствуют на соответствующих белках всех изученных референтных и вакцинных штаммов вируса ТГС и его полевых изолятов. Антигенные детерминанты, распознаваемые перечисленными моноклональными антителами, присутствуют также на соответствующих белках респираторного коронавируса свиней. Таким образом, указанные моноклональ-ные антитела пригодны для обнаружения консервативных антигеных детерминант вируса ТГС и РКВС, а также обнаружения антител, специфичных к консервативным антигенным детерминантам вируса ТГС;

- установлено, что антигенные детерминанты, расположенные на пепломерном глпкопротеине S (молекулярная масса 200 кД) вируса ТГС, распознаваемые моноклональными антителами клона Т4В11.1 присутствуют на соответствующем белке у всех изученных референтных и вакцинных штаммов и полевых изолятов вируса ТГС. На пепломерном глпкопротеине респираторного коронавируса свиней антигенные детерминанты, распознаваемые указанными моноклональными антителами, отсутствуют;

- прямой вариант ГХ ИФА, прямой вариант МФА и сэндвич вариант ТФ ИФА, разработанные на основе моноклональных антител клонов T1G4.1 и Т1С12.2 позволяют обнаруживать консервативные антигены вируса ТГС и РКВС;

- прямой вариант ГХ ИФА, прямой вариант МФА и сэндвич вариант ТФ ИФА, разработанные на основе моноклональных антител клона Т4В11.1 позволяют обнаружить вариабельные антигенные детерминанты вируса ТГС и дифференцировать их от антигенов РКВС;

- метод ингибирования ТФ ИФА, разработанный на основе моноклональных антител клонов T1G4.2, Т1С12.2 и T4D4.1, позволяет обнаружить в сыворотке крови свиней антитела к консервативным антигенным детерминантам вируса ТГС и РКВС;

- метод ннгибирования ТФ ИФА, разработанный на основе моноклональных антител клонов Т4В11.1, позволяет обнаружить в сыворотке крови свиней антитела к вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС, которые отсутствуют у РКВС и пригоден для ретроспективной дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней.

Практическая значимость На основании экспериментальных исследований разработаны и рекомендованы для включения в схему дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней чувствительные, специфичные, производительные и экспрессные методы ТФ ИФА, ГХ ИФА и МФА на основе моноклональных антител. Разработанные методы позволяют выявлять консервативные антигенные детерминанты вируса транс-

I

миссивного гастроэнтерита свиней и респираторного коронавируса свиней, а также вариабельные антигенные детерминанты вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней, что позволяет дифференцировать вирус ТГС

от РКВС в ьЬруссодержащих культуральных материалах, пробах органов и

(

содержимого кишечника инфицированных животных. При ретроспек-. тивной дифференциальной диагностике трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней данные методы позволяют обнаружить антитела, специфичные к консервативным антигенным детерминантам вируса ТГС и РКВС, и вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС в сыворотках крови инфицированных животных, что позволяет дифференцировать иммунный ответ при инфицировании животных вирусом ТГС от иммунного ответа при инфицировании животных РКВС. J . .

Разработана нормативно-техническая документация на "Набор препаратов для дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней гистохимическим иммуноферментным анализом на основе моноклональных антн-

тел" и "Набор препаратов для диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней твердофазным иммуноферментным анализом на основе моно-клональных антител". (Временные инструкции по изготовлению и контролю, Технические условия, Наставления по применению "Наборов..." и Методические указания по постановке ТФ и ГХ ИФА), утвержденные директором ВНИИВВиМ.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научных конференциях ВНИИВВиМ (г. Покров 1993, 1994 гг), научно-практической конференции УНИИКЭВМ (г. Харьков 1995 г) и на заседаниях ученого совета ВНИИВВиМ (г Покров, 1993-1995гг).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ.

Основные положения диссертационной работы.выдвигаемые на защиту:

1. Результаты экспериментов по определению оптимальных условий получения моноклональных антител к консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС.

2. Результаты исследований по разработке на основе полученных моноклональных антител вариантов ТФ ИФА, МФА и ГХ ИФА для дифференциальной диагностики трансмисснвного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней.

3. Результаты апробации методов ТФ ИФА и ГХ ИФА, разработанных на основе полученных моноклональных антител, на практике.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы ( 133 источника, в том числе 19 отечественных). Работа иллюстрирована 16 таблицами, 5 диаграмми, 5 фотографиями и дополнена приложениями.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы.

Вирусы и антигены: В качестве специфических антигенов для ТФ ИФА использовали лизаты клеточных культур, инфицированных штаммом "Д-52", вакцинным штаммом "1лпсШо1т", вакцинным штаммом №462 вируса ТГС; штаммом "ЛУК" респираторного коронавируса свиней. Использовали также препараты, приготовленные из органов и содержимого кишечника поросят 1-5 дневного возраста, зараженных вирусом ТГС.

Для контроля специфичности разработанных методов служили антигены, приготовленные из незаражённых культур клеток, а также антигены гетерслогичных вирусов: классической чумы свиней (КЧС), репродуктив-но-респираторного синдрома свиней (РРСС), ротавируса свиней, болезни Тешена, болезни Ауески. Для контроля специфичности ГХ ИФА и МФА использовали инфекционные материалы вышеперечисленных возбудителен, адаптированных к росту на монослойных перевиваемых культурах клеток почки сибирского горного козерога, линия ПСГК-60, монослойный '•Лрофовариант; почки поросенка (РК-15); тестикулов поросенка (ПТП); почки-эмбриона свиньи (СПЭВ) или макрофагах легких.

I *

Животные. Для клинического воспроизведения трансмиссивного гастроэнтерита свиней и получения вируссодержащего материала в экспериментах были использованы клинически здоровые поросята в возрасте I-

\ г

3 суток. Для получения специфических и нормальных сывороток крови использовали клинически здоровых свиней в возрасте 2-6 месяцев; кроликов в возрасте до 1 года. В качестве доноров иммунных лимфоцитов для получения гибридных клеток и асцитических жидкостей, содержащих моно-

(

клональные антитела, использовали клинически здоровых мышей линии ВАЬВ/с 3-4 недельного возраста массой 10-15 г; и взрослых рожавших самок мышей линии ВАЬВ/с массой 25-30 г, соответственно. Для получения перитонеальных макрофагов использовали мышей белых нелинейных, массой 20-30 г. Животных получали из научно-экспериментальной базы

лабораторных животных, питомников "Светлые горы" и "Столбовая" АМН СССР, а также из хозяйств Владимирской области. До начала эксперимента животных выдерживали под наблюдением в течение 10-14 дней. Кормление осуществляли в соответствии с рационами.

Культуры клеток. Для выделения, культивирования и титрования вируса ТГС использовали двухсуточные культуры клегок: ПТП, СПЭВ, ПСГК, PK-15. Культуры клеток получали в лаборатории "Биологии и культивирования вирусов" и в лаборатории "Культуры клеток с музеем клеточных штаммов" ВНПИВВиМ. В качестве партнера для слияния при получении гибридом использовали дефектную по гнпоксантин-гуапнн-фосфорибозил трансферазе миеломную линию клеток Sp 2/0-Ag 14.1 (Sp 2/0), полученную из Н11ПБТ МЗ СССР.

Получение гибридом, наработка и изучее свойств МА. Для получения гибридом мышей линии BALB/c - доноров спленоцитов иммунизировали препаратами полуочищенного вируса ТГС штамм "Д-52". Введения антигена осуществляли подкожно, внутрибрюшинно, внутривенно и внутриселезёночно в определенные сроки с использованием полногд и неполного адыованта Фреинда и без адыовантов, сочетая сроки и способы, введения по различным схемам. Слияние клеток проводили по методу Kohler & Milstein (1975), используя в качестве партнеров для слияния миеломную линию клеток SP 2/0 Agl4 и B-лимфоциты селезенки мыши, иммунной к вирусу ТГС штамм "Д-52". Гибридизацию проводили при соотношении спленоцитов с миеломными клетками 5:1 в присутствии 40%-ного раствора ПЭГ-4000. Гибридные клетки культивировали в селективной среде ГАТ в течение 21 суток, затем переводили на ростовую среду ДМЕМ с 15% ФС, 2 мМ глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 1 г/л глюкозы, 1 мг/л амфотерицина, 50 мг/л гентамицнна. Исследование культуральных жидкостей гибридных клонов (скрининг) на присутствие антител к вирус-специфическим антигенам проводили через 7-10 дней после начала клоно-образования три раза с трехдневными интервалами. Скрининг проводили

непрямым вариантом ТФ ИФА, вариантом ингибировання ТФ ИФА, экспресс-микровариантом РН. Клонирование гибридных клеток проводили в полужидком агаре (Gooding et al., 1980).

Получение препаративных количеств МА в виде асцитических препаратов проводили по стандартной методике. Коныогирование монокло-нальных антител с пероксидазой хрена проводили по методу пернодат-ного окисления (Tjissen, 1985). Изотип секретируемых гибридомными клопами мопоклональпых антител определяли методом ТФ ИФА с использованием набора "Calbiochem Hybridoma Sub-Isotyping Kit Mouse" в соответствии с рекомендациями поставщика.

Полипептидную специфичность МА определяли методом иммуноблот-тиига. Иммуноэлектроосмофорез проводили как описано Miyake et all (1980).

Результаты исследований

Получение гибридом При иммунизации мышей-доноров лимфоцитов для получения моноклональных антител к вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС, расположенным на гликопротеине Е2 (S), было необходимо вызвать максимальный антительный иммунный ответ на этот белок. При изучении в реакции нейтрализации иммунного ответа мышей-доноров лимфоцитов на гликопротеин вируса ТГС оказалось, что важную роль играет способ введения антигена. В ходе отработки различных схем иммунизации наивысшие титры вируснейтрализующих антител выявляли в сыворотках крови мышей после четырехкратного введения антигена. Мы обнаружили, что если после введения бустер-дозы антигена внутривенно титр антител в реакции нейтрализации увеличивается вдвое, как и в непрямом ТФ ИФА и МФА, то введение бустер-дозы антигена внутрь селезенки вызывало увеличение титра нейтрализующих антител в 10 раз при увеличении титра антител в непрямом ТФ ИФА и МФА только вдвое. Учитывая то, что основные антигенные детерминанты, обусловливающие нейтрализацию вируса ТГС, расположены на поверхностном по-

липептиде Б, можно сделать вывод, что последняя схема иммунизации является оптимальной при необходимости получения максимального иммунного ответа на антигенные детерминанты наружного пепломерного глпкопротеина Е2 (Б) вируса ТГС. Этот факт имеет важное значение при получении МА на такие эпитопы вируса ТГС, которые отсутствуют на Б протеине респираторного коронавируса свиней.

Результаты скрининга МА. Для скрининга гибридом, секрети-рующих МА нужной специфичности, адаптировали некоторые методы лабораторной диагностики. Эти методы позволили, во-первых, обнаружить в малых обьемах (100-200 мкл) культуральпой жидкости минимальные количества МА. обладающие специфичностью к антигенным детерминантам вируса ТГС. имеющим дифференциально-диагностическое значение, и во-вторых, при первичном скрининге отобрать клопы гибридом, секретп-рующие МА пригодные для применения в диагностике заболевания теми методами, которые в перспективе должны быть разработанны на основе полученных антител.

Непрямым методом ТФ ИФА выявили 19 клонов гибридных клеток, которые секретировали МА, реагпрующие-с,антигенами штамма Д-52 вируса ТГС и не реагировали с антигеном незараженной культуры клеток, используемой для наработки вируса. Процент специфического клонооб-разования, в данном случае, составил 62%. Вторичная проверка этих девятнадцати клонов, обладающих вирусспецифической секрецией, показала, что восемнадцать из них секретировали МА, реагирующие в непрямом ТФ ИФА с антигенами штамма Д-52 вируса ТГС, вакцинного штамма "ЫпёЬо1т" вируса ТГС, штамма "ЛУК" респираторного коронавируса свиней, т.е. обладающие специфичностью к консервативным антигенным детерминантам вируса ТГС. Гибридомы одного клона продуцировали МА, которые реагировали с антигенами всех вышеперечисленных штаммов вируса ТГС и не реагировали с антигенами респираторного корона-

вируса свиней штамм "ЛУК", т.е. обладали специфичностью к вариабельной антигенной детерминанте вируса ТГС.

При скрининге вируснейтрализующнх МА микроварпантом экспресс-метода РН обнаружили восемь клонов гибридом, секретирующих МА, способные нейтрализовать инфекционную активность вируса ТГС штамма Д-52 для культуры клеток ПТП. Скрининг МА непрямым вариантом МФА обнаружил четырнадцать клонов гибридом, секретирующих МА, проявляющие активность в данном методе. Непрямым методом инги-бирования ТФ ИФА обнаружили восемь клонов гибридом, которые сек-ретировалн МА, способные конкурировать со специфическими к антигенам вируса ТГС антителами сыворотки крови свиней за связывание с антигенами вируса ТГС.

Клетки гибридом, секретирующие МА нужной специфичности, клонировали в полужидком агаре. Результаты клонирования считали удовлетворительными, если после клонирования 90-100% клопов сохраняли специфическую секрецию МА, которые давали положительную реакцию в соответствующем методе скрининга. В большинстве случаев было достаточно двух клонирований. Клонированные клетки гибридом наращивали до концентрации 100 тыс клеток в мл для закладки на хранение и для введения мышам с целью получения асцитических жидкостей.

Препаративные количества МА получали из асцитических жидкостей мышей. Для этого взрослым рожавшим самкам мышей линии ВАЬВ/с вводили внутрнбрюшинно по 0,5 мл НАФ, и через 3-7 суток вводили внутри-брюшинно по 1-2 млн гибридных клеток в 2 мл бессывороточной среды ДМЭМ. Максимальное количество накопления асцитической жидкости наблюдали на 7-14 сутки. Асциты отбирали в количестве 3-10 мл от одного животного. МА из асцитов выделяли стандартным методом. Определяли концентрацию белка и активность выделенных ^ в РДП, РН, непрямом варианте ТФ ИФА, непрямом МФА.

Результаты изучения свойств МА. Для определения МА, конкурирующих за связывание с одной и тон же антигенной детерминантой вируса ТГС, использовали метод ингибнрования ТФ ИФА. Каждый вид МА проверили на способность конкурировать с остальными восемнадцатью видами МА за связывание с определенными эпитопами вируса ТГС штамм Д-52.

Все МА объединили в восемь групп по способности конкурировать за связывание с антигенными детерминантами вируса ТГС. В дальнейшей работе использовали восемь видов МА - по одному из каждой группы (в таб. 1 шифры этих МА выделены курсивом).

Таблица 1

Полппептпдная специфичность МА, конкурирующих за связывание с антигенными детерминантами вируса ТГС штамм Д-52.

и=3

Группа клонов гибридом Полипептндная специфичность МА

Т4Е12.1; Т2Х2)1.\. Е2 (Б)

Т4В11.1: Т2В10.1; Т4А9.1. Е2 (Б)

ТЗА6.1: ТЗН11.1; Т1С8.3. Е2 (Б)

ТЮ4.2\ Т5Н9.1; Т5С11.1. N

77 С/2.2; Т1П2.1. Е2 (Б)

Т4П4.1;ТЮ8.2\ ТЗВ9.1. N

ТЗСН.1. не установлена

ТЗЕ5.1: ТЮ9.1. не установлена

Выбор МА определялся максимальной их удельной активностью в непрямом варианте ТФ ИФА и изотипом антител. Предпочтение было отдано антителам с изотипом в связи с относительной простотой очистки таких МА и большей их пригодностью для конъюгирования с пе-роксидазой хрена. I

Полипептидную специфичность МА определяли в иммуноблоттинге. Электрофорез в ДСН-ПААГ в восстанавливающей системе проводили в вертикальных пластинах (120x95x1 мм) в 10% ПААГ, по методу ЬаетшП. Использовали по одному виду МА из каждой группы (в таб. 1

шифры этих MA выделены курсивом)- Определили, чго два вида МА связывались с антигенными детерминантами, расположенными на пуклеопро-тсине N вируса ТГС штамма Д-52. Четыре вида МА связывались с антигенными детерминантами, расположенными на пепломерном глнкопро-теине Е2 вируса ТГС штамма Д-52. МА двух клонов не реагировали с антигенами вируса ТГС в нммуноблотинге. Предположили, что эти МА специфичны к конформационно-зависимым антигенным детерминантам, которые разрушаются в процессе подготовки антигенов для электрофоретн-ческого фракционирования (антигены подвергали кипячению и воздействию додецилсульфата натрия.

Для определения преципитирующей активности МА в пммуноэлек-троосмофорсзе (ИЭОФ) и реакции диффузионной преципитации (РДП) использовали кульгуральный антиген вируса ТГС штамм Д-52. ИЭОФ проводили, как описано Mivake et all. РДП проводили как описано Pearson et. al. Обнаружили, что МА клона T1G4.2 реагируют с антигенами вируса ТГС и РКВС в титрах: в ИЭОФ 1:40 и в-РДП 1:20. Сопоставив полученные результаты с данными по определению полипептидной специфичности МА, установили, что антигенные детерминанты вируса ТГС, проявляющие активность в реакции диффузионной преципитации (РДП) и пммуноэлектроосмофорезе (ИЭОФ), расположены на нуклеопротеине вируса ТГС. По-видимому, именно эти антигенные участки определяют перекрестное реагирование вируса ТГС и РКВС в РДП.

При изучении нейтрализующих свойств полученных МА установили, что такими свойствами обладают МА, специфичные к антигенным детерминантам, расположенным на пепломерном гликопротеине Е2 вируса ТГС и РКВС. Интересно, что МА клона Т4В11.1, специфичные к антигенным детерминантам белка Е2 вируса ТГС, которые отсутствуют на соответствующем белке РКВС, не обладают вируснейтрализующей активностью. Эти данные подтверждают вывод Callebaut и соавт. о невозможности дифференцирования вируса ТГС и РКВС в реакции нейтрализации.

Разработка методов лабораторной дифференциальной диагностики ТГС и респираторной коронавирусной инфекции свиней. Отбор МА, пригодных для использования в диагностике ТГС и его дифференцировании от респираторной коронавирусной инфекции свиней проводили одновременно с разработкой соответствующих методов лабораторной диагностики. Работу проводили в двух направлениях:

- поиск МА, пригодных для использования в диагностических реакциях, по обнаружению консервативных и вариабельных антигенных детерминант коронавнрусов;

- поиск МА, пригодных для использования в диагностических реакциях, с целью обнаружения антител к консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС в сыворотках крови инфицированных животных.

I

Для выполнения первой задачи разработали прямой вариант гистохимического ИФА и МФА, прямой и сэндвич-варианты ТФ ИФА; для вы-

I

полнения второй - вариант ингибировапия ТФ ИФА. Для использования в ТФ ИФ>А^ некоторые МА нужной специфичности конъюгировали с пе-роксидазой хреиа по модифицированному методу периодатного окисления (Tijssen, 1985). J \

При разработке прямого варианта ТФ ИФА и сэндвич-варианта ТФ

j

ИФА для обнаружения антигенов вируса ТГС в культуральных вируссо-держащих материалах и содержимом тонкого отдела кишечника инфицированных животных, изучали:

I

- пригодность МА клонов TIC 12.2. и TIG4.2 для выявления консервативных детерминант коронавнрусов;

- пригодность МА клона Т4В11.1 для выявления вариабельных антигенных детерминант вируса ТГС, отсутствующих у респираторного коро-навируса свиней. <

Установили, что при обнаружении антигенов вируса ТГС в содержимом кишечника прямым вариантом ТФ ИФА имеют место высокие фоно-

1Г>

вые показатели для нормальных и гстерологнчных ашнгенов (1:2-1:8). Это делает реакцию менее наглядной, кроме того, затрудняет обнаружение минимальных количеств вирусспецифпческих антигенов в низких разведениях впруссодержащих препаратов (1:2-1:8) при необходимости исследования материалов с небольшим уровнем накопления антигенов возбудителя.

При разработке сэндвич варианта ТФ ИФА для обнаружения консервативных и вариабельных антигенов вируса ТГС в вируссодержашнх материалах определили оптимальные сочетания МА для сенсибилизации твердой фазы и для выявления связавшегося антигена.

В дальнейшей работе по изучению специфичности сэндвич варианта ТФ ИФА использовали пары МА клопов Т4В11.1 и Т1С12.2, как специфичные к двум различным детерминантам пепломерного гликопротенна Е2 (5) вируса ТГС, а так же МА клонов ТЮ4.2 и Т404.1, как специфичные к двум различным детерминантам нуклеопротеина вируса ТГС.

В результате проверки чувствительности и специфичности разработанного сэндвич варианта ТФ ИФА установили, что при сенсибилизации твердой фазы моноклональными антителами клона Т404.1 и использовании для выявления связавшегося антигена пероксидазного конъюгата МА клона ТЮ4.2 метод позволяет обнаружить консервативные антигенные детерминанты всех исследованных штаммов вируса ТГС в 10%-ной суспензии содержимого тонкого отдела кишечника зараженных поросят и в куль-туральных антигенах п титре до 1:160, а также обнаружить консервативные антигенные детерминанты РКВС штамм "ЛУК" в культуральных антигенах в титре до 1:160. При этом метод позволяет дифференцировать данные антигены от антигенов других возбудителей болезней свиней. При сенсибилизации твердой фазы моноклональными антителами клона Т1С12.2 и использовании для выявления связавшегося антигена пероксидазного конъюгата МА клона Т4В 11.1 метод позволяет обнаружить вариабельные антигенные детерминанты всех исследованных штаммов вируса ТГС в 10%-ной суспензии содержимого тонкого отдела кишечника зараженных

поросят и в культуральных антигенах в титре до 1:320. При этом метод позволяет дифференцировать данные антигены от антигенов респираторного коронавпруса свиней, а также от антигенов других возбудителей болезней свиней.

Для обнаружения антител к консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС в сыворотках крови инфицированных животных разрабатывали вариант ингибировапия ТФ ИФА. Изучилили пригодность МА клонов Т1С12.2 и ТЮ4.2 для выявления антител к консервативным антигенным детерминантам вируса ТГС; а так же пригодность МА клонов Т4В11.1 для выявления антител к вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС.

Установили, что в методе ингибировапия ТФ ИФА, способностью ингибировать взаимодействие специфического антигена, сорбированного

I

на ТФ, с пероксидазным коныогатом МА клона ТЮ4.2, обладают сыворотки крови свиней, иммунных к всем изученным штаммам вируса ТГС и

!

РКВС в титре до 1:2430. Нормальные и гетерологичные сыворотки дают отрицательный результат, начиная с разведения 1:10. Способностью ингибировать взаимодействие специфического антигена вируса ТГС штамм Д-52, сорбированного на ТФ,! с пероксидазным коныогатом МА клона Т4В11.1, обладают сыворотки крови свиней, иммунных ко всем исследованным нами штаммам вируса ТГС в титре до 1:810. Специфичные к РКВС

\ I

штамм 'ЛУК", нормальные и гетерологичные сыворотки крови свиней дают отрицательный результат начиная с разведения 1:10. На основании этих данных можно сделать заключение, что метод ингибировапия ТФ ИФА с применением МА обладает необходимой специфичностью и чувствительностью для ретроспективной дифференциальной диагностики ТГС и респираторной коронавирусной инфекции свиней.

При разработке гистохимического иммунофермеитного анализа для обнаружения антигенов вируса ТГС и РКВС в клетках, инокулированных вируссодержащим материалом изучили пригодность пероксидазных

коныогатов Л1А клонов ТЗА6.1, ТЮ4.2, Т4В11.1 н Т1С12.2 для выявления консервативных и вариабельных антигенных детерминант указанных возбудителен в клетках, зараженных вирусом ТГС или РКВС. В результате проверки чувствительности и специфичности разработанного варианта ГХ 11ФА определили, что при использовании для выявления вирусспенифиче-ских антигенов пероксидазных коныогатов МА клонов ТЮ4.2, ТЗА6.1 и ТIС12.2 метод позволяет обнаружить внутри зараженных клеток консервативные аншгенпые детерминанты всех исследованных штаммов вируса ТГС и респираторного коронавируса свиней при разведении материалов до 1:!0\ соответственно. При этом метод позволяет дифференцировать данные антигены от антигенов вирусов других семейств. При использовании для выявления вирусспецифнческих антигенов пероксидазного конъ-югата МА клопа Т4В11.1 метод позволяет обнаружить внутри зараженных клеток вариабельные антигенные детерминанты всех исследованных штаммов вируса ТГС при разведении вируссодержащего материала до 1:103 и дифференцировать их от антигенов респираторного коронавируса свиней, а также от антигенов вирусов других семейств.

Разработали МФА для обнаружения антигенов вируса ТГС и РКВС в клетках, ннокулированных вируссодержащим материалом. При разработке указанного варианта ИФА изучили пригодность ФИТЦ-коныогатов МА клонов ТЮ4.2 и Т4В11.1 для выявления, соответственно, консервативных и вариабельных антигенных детерминант указанных возбудителей в клетках, зараженных вирусом ТГС или РКВС. В результате проверки чувствительности и специфичности прямого варианта МФА определили, что при использовании для выявления вирусспецифнческих антигенов ФИТЦ-конъюгата МА клона ТЮ4.2 метод позволяет обнаружить внутри зараженных клеток консервативные антигенные детерминанты всех исследованных штаммов вируса ТГС и респираторного коронавируса свиней при разведении материалов до 1:106, соответственно. При этом метод позволяет дифференцировать данные антигены от антигенов вирусов других

семейств. При использовании для выявления вирусспецифических антигенов ФИТЦ-конъюгата МА клона Т4В11.1 метод позволяет обнаружить внутри зараженных клеток вариабельные антигенные детерминанты всех исследованных штаммов вируса ТГС при разведении вируссодержащего материала до 1:106 и дифференцировать их от антигенов респираторного коронавируса свиней, а также от антигенов вирусов других семейств.

Применение разработанных методов лабораторной диагностики для экспертизных исследований В течение 1994 п 1995 годов во ВНИИВВиМ для экспертизных исследований поступал патологический материал от больных свиней, подозреваемых на заражение вирусом ТГС. Предварительный диагноз основывался на результах клинического и эпи-зоотологического обследования и результатах патологоанатомического вскрытия.

Разработанные нами методы применили для идентификации возбудителя заболевания, а также для обнаружения вирусспецифических антител в сыворотках крови свиней.

Для проведения экспертизных исследований поступали следующие материалы: пробы органов, от погибших поросят или полученные при убое больных поросят (селезенка, л/узлы, печень, кишечник с содержимым, легкие и почки); сыворотки крови взрослых свиней из хозяйств, в которых возникло подозрение на ТГС. Все материалы доставляли в институт в замороженном или охлажденном виде. Из проб органов и содержимого кишечника готовили 10%-ные суспензии на ФБР с добавлением 100 ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина и 25 ед/мл амфотеррицина В. Сыворотки крови инактивировали прогреванием при 56 °С в течение 30 минут.

Прямое обнаружение антигена вируса в пробах органов и содержимого кишечника проводили сэндвич вариантом ТФ ИФА на основе МА клона Т4В11.1, специфичных к антигенным детерминантам, расположенным на пепломерном гликопротеине Е2 (Б) вируса ТГС. Вариабельные антигенные детерминанты вируса ТГС обнаруживали в пробах содержи-

мого тонкого отдела кишечника зараженных поросят в титре до 1:128. Для подтверждения результатов, полученных при исследовании проб органов и содержимого тонкого отдела кишечника сэндвич вариантом ТФ 11ФА, дальнейшую работу проводили по выделению вируса ТГС и его идентификации. Выделение вируса проводили путем инокуляции 2-3-х суточной культуры клеток ПТП 10%-ной суспензией слизистой и содержимого тонкого отдела кишечника. Инокулированную культуру клеток культивировали в течение 3-4-х суток (длительность одного пассажа). Цитопатические изменения культуры клеток наблюдали, начиная с 3-5 пассажа. Параллельно с ттим определяли накопление антигенов вируса ТГС внутри зараженных клеток прямым ГХ ИФА, разработанным на основе МА клона ТЮ4.2, специфичным к консервативным эпитопам нуклеопротеина вируса ТГС и МА клона Т4В11.1, специфичным к вариабельным эпитопам пепло-мерного гликопротеина Е2 (5) вируса ТГС. Данные по результатам экспер-тизного исследования патологического материала от погибших поросят (с-з "Губкннский") представлены в таблице 2.

Таблица 2

Результаты выделения и обнаружения вируса ТГС в культуре клеток ПТП

п=3

Количество пассажей Наличие ЦПД Титр вируса в прямом ГХ ИФА на основе МА: ТЮ4.2 | Т4В11.1

1 пасс. - 1 1.е 012

2 пасс. — 2 1.2 1,51.2

3 пасс. — 31.2 2,5 1.2

4 пасс. + 4,5 1й 3,51г

5 пасс. + 51* 51.2

6 пасс. + 61.2 61.2

(--) - отсутствие цитопатическнх изменений; (+) - наличие цитопатогенных изменений.

Сыворотки крови свиней, отобранных в хозяйствах различных регионов РФ, исследовали в реакции нейтрализации, а также вариантом ин-гибирования ТФ ИФА на основе МА клонов ТЮ4.2 и Т4В11.1, обла-

дающих специфичностью, соответственно, к консервативным и вариабельным антигенным детерминантам вируса ТГС. Результаты исследований представлены в таблице 3. При сравнении результатов, полученных при исследовании сывороток вариантом ингибирования ТФ ИФА и в реакции нейтрализации, установили совпадение результатов двух реакций в 89 % случаев.

Таблица 3

Результаты исследования сывороток крови свиней в РН и методе ингибирования ТФ ИФА на основе МА

Исследуемый материал Иссле- Положительные в ТФ ИФА Положит.

довано на основе МА клонов в РН

ТЮ4.2 Т4В11.1

Совхоз "Лазаревский" 20 14 14 9

Совхоз "Губкинский" 12 11 11 11

Оп. хоз. ТНИСХИ 10 0 0 0

Таким образом, методы ТФ ИФА, разработанные нами на основе полученных МА, позволяют в короткий срок обнаружить антигены вируса ТГС в пробах содержимого тонкого отдела кишечника и антитела к таким антигенам в пробах сывороток крови животных. Одновременно данные методы позволяют дифференцировать трансмиссивный гастроэнтерит свиней от респираторной коронавирусной инфекции свиней.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны схемы получения МА к вариабельным и консервативным антигенным детерминантам вируса ТГС. Получено 19 линий гибридных клеток мышиного происхождения, стабильно продуцирующие МА к антигенным детерминантам, расположенным на гликопротеине Е2 (Б) и на нуклеопротеине вируса ТГС.

2. Установлено, что антигенные детерминанты пепломерного глико-протеина Е2 (Б) вируса ТГС (молекулярная масса 200 кД), выявляемые МА клонов ТЗА6.1 и Т1С12.2, а также антигенные детерминанты нуклеопро-теина N вируса ТГС (молекулярная масса 47 кД), выявляемые МА клонов

ТЮ4.2 и Т404.1 являются высококонсервативны.ми и присутствуют у всех изученных референтных, вакцинных и полевых штаммов вируса ТГС и у респираторного коронавируса свиней, что позволяет использовать специфические к этим детерминантам МА в диагностике ТГС и респираторной коронавирусной инфекции свиней.

3. Установлено, что антигенные детерминанты пепломерного глико-протенна Е2 (Б) вируса ТГС (молекулярная масса 200 кД), выявляемые МА клона Т4В11.1, присутствуют у всех изученных референтных вакцинных и полевых штаммов вируса ТГС. Такие антигенные детерминанты отсутствуют на соответствующем гликопротеине РКВС, что позволяет использовать специфические к этим детерминантам МА для дифференциальной диагностики ТГС и РКВ-инфекции свиней.

4. Разработаны сэндвич вариант ТФ ИФА, прямой вариант ГХ ИФА и прямой вариант МФА на основе МА клонов ТЮ4.2, Т1С12.2 и Т4В11.1 для обнаружения антигенов вирусов ТГС и РКВС и их дифференциации. Метод позволяет выявлять специфические антигены вирусов ТГС и РКВС в суспензиях проб органов и содержимого тонкого отдела кишечника зараженных поросят (ТФ ИФА)^в титре до 1:360, а так же в зараженных клетках (ГХ ИФА и МФА), инокулированных вируссодержашими культу -ральными материалами в титре до 1:10е.

5. Разработан метод ингибирования ТФ ИФА на основе МА клонов ТЮ4.2, Т1С12.2 т Т4В11.1 для обнаружения антител к консервативным и вариабельным антигенным вариантам вируса ТГС. Метод позволяет обнаружить такие антитела в сыворотках крови животных в титре до 1:1280 и дифференцировать иммунный ответ на инфицирование свиней вирусом ТГС или РКВС.

6. Варианты ИФ ИФА и ГХ ИФА, разработанные на основе полученных МА, апробированы на практике и показали свою пригодность для применения в лабораторной диагностике ТГС и респираторной коронавирусной инфекции свиней.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В результате проведения экспериментальных исследований получены данные, позволяющие рекомендовать для применения в лабораторной диагностике ТГС и дифференциальной диагностике ТГС и РКВ-инфекцни свиней чувствительные, специфичные, высокопроизводительные и экспрессные методы ГХ ИФА и ТФ ИФА на основе МА.

2. Разработаны и предложены для применения в практике ветеринарных лабораторных исследований "Набор препаратов для дифференциальной диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней и респираторной коронавирусной инфекции свиней гистохимическим иммунофермент-ным анализом на основе моноклональных антител" н "Набор препаратов для диагностики трансмиссивного гастроэнтерита свиней твердофазным нммуноферментным анализом на основе моноклональных антител". Разработана соответствующая нормативно-техническая документация (Временные инструкции по изготовлению и контролю "Наборов...", Технические условия, Наставления по применению "Наборов..." и Методические указания по постановке гистохимического и твердофазного иммуно-ферментного анализа на основе МА), утвержденная директором института.