Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Биологические свойства эпизоотических вирусов трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиней, используемых для конструирования вакцин

Министерство сельского хозяйства и продовольствия Ой Республики Беларусь

Академия аграрных наук Республики Беларусь Белорусский научно- исследователь сгшй институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского

УДК 619:578.834.1.097.3

Бычковский Анатолий Михайлович

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭПИЗООТИЧЕСКИХ ВИРУСОВ ТРАНСМИССИВНОГО ГАСТРОЭНТЕРИТА И РОТАВИРУСНОЙ БОЛЕЗНИ СВИНЕЙ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ВАКЦИН

16.00.03. - ветеринарная микробиология,вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кзндидата ветеринарках наук

Минск - 1996

Работа выполнена в Белорусском каучно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского

Научный консультант - доктор ветеринарных наук, профессор,

акздемгос ААН Республики Беларусь Ковалев H.A.

'Научный руководитель - кандидат ветеринарных наук,

старший научный сотрудник Ястребов A.c.

Официальные оппоненты; доктор ветеринарных наук, профессор

Туэова Р.В.

кандидат ветеринарных наук, доцент Иаудеиков В. И.

(йшояирувцзя организация - Гродненский сельскохозяйственный цистит;.

Баздаа состоится Ч&Т" ¿¿WH¡Ягазе г. в часов на азееданш совета по .эеякте диссертаций Д 05.16.01. ЕелИИИЗВ им. (LH.EiöoaeccKoro 223020, Минский район, Кунцевщина, ул Вышелесс-isro 2

С диссертацией «гожно оэкакошться в библиотеке Белорусского föffi вксцеряывитальной ветеринария т. С.Н.Вызелесского

Автореферат разослан 'V&7" 1ЭЭ6 г.

Ученый секретарь совета со esssте диссертаций, доктор ве^ершшрных

ваух, профэсоор Б.Я.Лшних

ОВДДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. О важности проблемы борьбы о трансмиссивным гастроэнтеритом (TTC) и ротавирусной бсшегныо свиней (РВБС) свидетельствуют материалы Международных конгрессов по болезням свиней, проходивши в Дании (1980, 1985), Бельгии (1987), где указывалось на широкое распространение этих болезней во всех странах с развитым свиноводством. Сообщалось, что основная роль в борьбе с ними принадлежит разработке средств специфической профилактики.

Для создания средств специфической профилактики необходимо четко знзть иммунобиологические свойства возбудителей, способы их культивирования, инактивации, способы и схемы применения животным.

В республике отсутствовали лабораторные штаммы вирусов трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиней, которые обладали оы выраженными иммуногешшми свойствами. Поэтому возникла острая необходимость в подборе эпизоотических штаммов, пригодных для изготовления вакцин против заболеваний, вызываемых указанными вирусами.

В литературе имеются сообщения о культивировании вирусов TTC и РВБС. Однако эти исследования, в основном, выполнены о использованием дефицитных у нас в республике культур клеток и импортных питательных сред. Поэтому изыскание способов культивирования указанных вирусов на доступных культурах клеток с использованием доступных и относительно девевых питательных сред и от-работкз режимов их культивирования о целью приготовления вакцин является актуальной задачей ветеринарной науки.

Связь с научными программами. Работа выполненз в рамках подпрограммы "Ветеринария", регистрационный номер 1993135, задание 04 *• Нз основе биотехнологических методов разработать и усовершенствовать средства диагностики и профилактики наиболее распространенных инфекционных болезней животных, позволяющие обеспечить стойкое благополучие хозяйств". '

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в выделении, подборе и разработке способов вырадивания вирусов TTC и РВБС, используемых для конструирования вакцины.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить

- г -

следующие задачи:

1. Выделить и подобрать эпизоотические штаммы корона- и ро-тавирусов свиней, обладавшие хорошо выраженными антигенным» свойствами.

2. Изыскать наиболее продуктивные клеточные системы, питательные среды, отработать регламент выравдвания выделенных.вирусов TTC и РВБС, подобрать ииактиванты и адиованты.

3. Изучить антигенную и иммуногенную активность выделенных штаммов вирусов при раздельном и одновременном введении животным.

Научная новиэна. В ходе исследований впервые в Республике Беларусь выделены и отобраны штаммы вирусов трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиной, обладаявде выраженной антигенной активностью, получены данное о продуктивных клеточных системах, пригодных для накопления вирусов TTC и РВБС, отработаны технологические приемы культивирования их, изучены способы инактивации и адсорбции, а также кммуногепкость при введении «ивотным.

Практическая значимость. Результаты исследований, изложенные в диссертации, включены в следующие разработки:

1. "Технические условия на ассоциированную вакцину против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни поросят". . Утверждении Гдгавотупром Минсельхоепрода Республик Беларусь 6 карта 1996 г. ;

г. "Временная инструкция по изготовлению и контролю ассоциированной вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной кнфекщш поросят". Утвераденна директором БелНИИЭВ 7 1ЮНЙ 1995 г.;

3. "Временное наставление по применению ассоциированной вакцдаы против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции поросят". Утвераденна Гдавветупром Минсельхозпрода Республики Беларусь 6 марта 1996 г. ;

4. "Технические условия на инактивированную вакцину против трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной болезни и колибак-териога поросят". Утверждении Гдавветупром Минсельхозпрода Республики Беларусь 16 декабря 1996.г.!

Б. "Инструкция по изготовлению и контролю кнактивированной вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной бо-

лезни и колибэктериоэа поросят". Утверждений директором БелНИ-ИЭВ ? имя 1995 г. ;

6. " Временное наставление по применении инактивированной вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной болезни и колибактериоза поросят". Утвержденно Главветупром Минсельхозпрода Республики Беларусь 6 марта 1996 г.;

Экономическая. значимость подучещмх результатов. Результаты проведениях исследований послужили основой для конструирования двух препаратов: ассоциированной вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной Болезни свиней и инактивированной вакцины против трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной болезни и колибактериоза поросят. Указанные вакцины являются ко-, мерческим продуктом.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Физиш-химические, культуральные и антигенные свойства эпизоотических вирусов трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной инфекции свиней, поэволгазвне подобрать штаммы вирусов ТГС и РВБС, с выраженной антигенной активностью.

2. Способ культивирования вирусов TTC и РВБС, использованный для подобра наиболее продуктивных культур меток и' питательных сред.

3. Способ инактивации и адсорбции вирусов TTC и РВБС, использованный дан Выбора эффективных инактивапта и адыовапта.

4. Антигенная и иммуногенная активность инактивированных и адсорбированных вирусов ТГС и PBSC при раздельном и одновременном введении их животным, что дало возможность использовать эти вирусы для конструирования препаратов с высокой иммунологической эффективностью.

Личный вклад соискателя. .Соискателем выполнены все работы по выделению, титрации вирусов, серологические исследования, изучена антигенная активность вирусов ТГС и РВБС при раздельном, и совместном их использовании, а также самостоятельно проведена статистическая обработка полученных результатов". В соавторстве со старшими научными сотрудниками Ястребовым A.C. и Савельевой т.д. изучена иммуногенная активность препаратов вирусов ТГС и РВБС. Совместно со старшим Научным сотрудником Белянко Л.В. проведены электронно микроскопические исследования.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены:

1. На Ш-й республиканской научно-практической конференции

"Современные проблемы профилактики зоонозшх болезней и пути их решения" (г. Гродно, 20-21 мая 1987 г.).

2. На научной конференции "Интенсификация производства в отраслях агропромышленного комплекса на основе методов биотехнологии" (г. Минск, 21-25 февраля 1989 г.)

3. На научно-практической конференции "Технология получения и выращивания здорового молодняка сельскохозяйственных животных и рыбопосадочиого материала" (Витебск, 1993 г.)

4. На Ученых. Советах БелЛИИЭЗ юл. С.Н.Вьжзлесского в 1935 -1995 г.г.

5. На заседаниях Ветблэ£арикптзсии (Минск, 1995-1996 гг.)

Опубллкоззш!ост;> результатов. По материалам диссертации

опубликовало 12 работ.

Стругстура а объем диссертации. Диссертация изложена на 108 страницах ыашшитслого текста и состоит из введения, обзора литература, собственник исследовашй, аагиззчшшя, выводов, лрак-ттетхъ: продлояоаш'з, спнска литературы и прило.т^няя. Список литературы вкеочззт 210 истсчшиш, в tc;j число 65 отечественных и 153 юзострзишх. Текстовая часть диссертации шшзci радована 26 таЗлкцаш и 5 рзтсуякашь

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ К&териаш и мэтода

Вирусы. Вирусы трансмиссивного гастроэнтерита штаммы БГ, Т0зй5Лю2 и Пурдьв, ротавируо обезьян штамм SA-11 и свиней штамм К, пзяучешпд? кз ВЙЭВ км Я.Р.Коваленко.

Культуры клеток Использованы первично трипсиниеированная культура клеток почка эмбриона свиньи (ПЭС) и перевиваемые линии клеток:" свиной почки эмбриональной версениэированной (СПЭВ), клетки щитовидной железы свиней (КЩС) и почки зеленой мартьики (МА-104).

Первичные культуры клеток выращивали на среде 0,5% гидроли-эата лактшабумзша (ГЛА) с добавлением 10Z сыворотки крови крупного рогатого скота.

Перевиваемые культуры клеток СПЭВ, КЩС и МА-104 выращивали

в 1,5 литровых матрасах и пробирках. В качестве ростовой среды для СПЭВ использовали среду 199 или 5Х-ный геыогидролизат для культур клеток с добавлением 10% сыворотки крови крупного рогатого скота; для Ma-104 и КЩС - среду 199 и среду Игла (по 4521) и сыворотку крови крупного рогатого скота (10Ï).

В качестве поддерживавшей среды использовали те же среды, что и ростовые только, без добавления сыворотки крови крупного рогатого скота.

Животные: Кролики породы Шинснла весом 2,5 - 3,0 кг, полученные из вивзрия БелНИИЭВ;

Свиноматки крупной белой породы и безмолоэивные поросята, полученные из хозяйств, благополучных по трансмиссивному гастроэнтериту и ротавирусной болезни свиней

Выделение вирусов TTC и РВБС проводили на первичной культуре клеток ПЭС. Для этого от вынуждено убитых поросят с признаками гастроэнтерита отбирали тонкий отдел кишечника и замораживали в жидком азоте.

В лаборзтории из патматериала готовили 20-30%-ную суспензии на растворе Хенкса и обрабатывали антибиотиками.

Подготовленную стерильную суспензию вносили на культуру клеток ПЭС. Наблюдение веди в течение 5-6 двей ежедневно просматривая культуру под микроскопом с целью выявления цитопатоген-ного действия (ЦПД). При отсутствии ЦГЩ в первом пассаже проводили 3-7 слепых пасса*ей.

Изучение выделенных изолятов проводили в реакции диффузионной преципитации в агаровом геле (РДП) и реакции нейтрализации (РН).

РДП ставили по общепринятой методике

Реакцию нейтрализации ставили на первичной культуре клеток ПЭС и перевиваемой культуре клеток СПШ с постоянной дозой вируса 100 ТЦД 50 и различными разведениями сыворотки.

Титраци» вирусов на культурах клеток ПЭС и СПЗВ проводили по общепринятой методике.

У выделенных штаммов корона- и ротавирусов изучали чувстви- • тельность к эфиру, хлороформу, температуре и определяли тип нуклеиновой кислоты. .

Для ивактивзцки вирусов использовали формалин в концентра-

ции 0,05, 0,1, 0,2 и 0,ЭХ и димер-этиленимина (ДЭИ) в концентрации 0,01, .0,02 и 0,037.. Одновременно испытывали различные сроки их воздействия на вирусы при различных температурах.

Для изготовления инактивированных и адсорбированных препаратов вирусов TTC и РВБС использовали алшокалиевые квасцы в конечной концентрации 0,25; 0,5 и 0,757. или аэросил в концентрат«! 1,0; 2,0 И 3,0%,

Антигенную активность инактивированных и адсорбированных препаратов вирусов TTC и РЕБС изучали на кроликах и свиноматках. Оценку результатов проводили по уровню антител в сыворотке крови привитых животных к вирусу TTC в РИГА и РН, к вирусу РВБС - в РТГА и РН.

Статистическую обработку полученных данных проводили согласно "М&тодичесюаа указаниям к методу вычисления среднеквадра-тической оиибки и доверителышх интервалов средних арифметических величин с помощью таблицы Стрелкова Р.Б." Витебск, 1988 г.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Выделение корона- и ротавирусов на культуре клеток ПЭС . и их идентификация

При исследовании паттатериала от больных диареей вынужденно убитых поросят из хозяйств республики на культуре клеток ПЭС нами было выделено 5 цитопатогенных агентов, которые условно были пронуыеровззш 1; 2; 3; 4 и 5,

На первичной культуре клеток ПЭС три цитопатогенные агента ' (1,2 и 4) вызывали ЦЦД через 96-100 часов, а цитопатогенные агенты 3 И 5 проявляли свое действие через 48-72 часа после заражения культуры клеток. При т и грации на культуре клеток ПЭС установлено, что наивысшие титры были у цитопатогенных агентов N 2 (колхоз Бродовка Борисовского района Минской области, 3,25 le ТЦЦ50) И N 3 (совхоз - комбинат Борисовский Борисовского района Минской области, 3,75 lg ТЦД50). .

Идентификацию выделенных цитопатогенных агентов проводили в РДП.и РН-

При постановке РДП с выделенными цитопатогенными агентами

установлено, что 1-й, 2-й и 4-й агенты образовывали линии преципитации с гипериммунной сывороткой к вирусу TTC штамм TO36SD102. с 3 и 5 агентами линии преципитации не образовывались. В свою очередь 3 и Б цитопатогенные агенты образовывали линию преципитации с гипериммунной сывороткой к вирусу РНБС птамм К.

Все пять цитопатогенных агентов не образовывали линии преципитации с гипериммунной поливалентной сьшороткой к энтеровиру-сам.

Идентификация выделенных вирусных агентов проводили также в РН на культуре клеток ГГЭС. Полученные данные показывают, что цитопатогенные агенты 1; 2 и 4 нейтрализовались гипериммунной сывороткой к вирусу TTC итамм TO36SD1Q2 и не нейтрализовались ги-лериммунной сывороткой к вирусу РВВС гатамы К. Напротив, выделенные цитопатогенные агенты 3 и 5 нейтрализовались гипериммунной сывороткой к вирусу РББС штамм К и не нейтрализовались гипериммунными сывороткам! к вирусу TTC. Все выделенные цитопатогенные агенты без добавления гиперишунных сывороток оказывали цитопа-тогенное действие на культуру клеток (контроль).

Исходя из вышеизложенного, выделенные изоляты 1; 2 и 4 идентифицированы как коронавирусы, а 3 и 5 - как ротавирусы.

Для отбора вирусов, пригодных в качестве ввкцштых, были изучены на кроликах их антигенные свойства. Для этого каздыы вирусом иммунизировано по 3 кролика. Вирус вводили двадды с интервалом 14 дней в дозе 4,0 1ЕТЦД50- Кровь для исследования брали через 14 дней после последней иммунизации. В качестве адьюванта использовали полный адыовант Фрейнда. Сыворотку крови исследовали в РН на культуре клеток СПЭВ с использованием вируса TTC штамм TOjgSDipí и вируса РВБС ита).о,) К.

Исследованиями установлено, что наибольший титр антител к коронаиирусу был у кроликов, иммунизированных 2-м цитопатогенным агентом (3,0 ¿ 0.65 lofs), а цитопатогенные агенты i-ый и 4-ый индуцировали выработку антител в более низких титрах (2,1 i 0,8 и 1.9 ± 0,7 1огг).Цитопатогенные агенты Э-ий и 6-ий не индуцировали образование антител к коронавирусу.

Титры антител сыворотки крови к ротавирусу у кроликов, иммунизированных 3-им и 5-ым цитопатогенными агентами, достигали 3,2* 0,94 и 1,9 * 0,63 loga- Цитопатогенные агенты 1; 2 и 4 нэ

индуцировали выработку антител к ротавирусу.

Исходя из "результатов исследований, для дальнейшей работы были отобраны вирусный измят 2 коронавируса и изолят 3 ротави-руса, которые имели наивысшие титры на культуре клеток и индуцировали выработку антител у кроликов в более высоких титрах.

Выделенному коронавирусу 2 нами было присвоено условное название Ер, а ротавирусу 3 - название Бс.

Культурадьные свойства выделенных вирусов TTC и РВБС.

Адаптации гуделеняых вирусов ТГС штамм Бр и РВБС втамм Бс проводили к перевиваемым культурам клеток СПЗВ, КЩС и Ма-104.

На основаиий проведенных исследований установлено, что наивысший титр вируса TTC штамм Бр в культуре клеток СПЭВ (6, 5± 0,25 le ТЦДэа/сыЭ) определялся на уровне 20 пассажа, в культура клеток КЩС (6,Б± 0,04 1g ТЦЦдо/смз) ~ па уровне 15 пассата. В культуре каеток (¿з-10-i -вирус ие размножался.

• Ери определенна ояосоОвссти накэпления вируса ТГС на культуре клзюк СП53 И ШД с испольсованием различных питательных срод усташзлвко, что Eîîpyc на культуре клеток СПЭВ хорошо на-î^niimarca с аобыш! аэтательзадш средснл. Культура клеток КЩС с питательной средой 1533 и гемогвдролизатом росла и развивалась плохо, что сэотвэтстьонко cîKSKaso и накопление вируса.

Вирус РВН; втамм Ее капитального титра 7,25- 7,33 lg ТЦД50/сыЗ во всэх используемых культурах достигал на уровне 15 пассажа .

Вирус хорошо накапливался при использовании культуры клеток СПЭВ со средой 199, БХ-ным гемогадролиэатом и смесью среды 199 со средой Игла В равных количествах. В культурах клеток КЩС и Ma-104 вирус накапливался в наибольшем количестве только при использовании смеси среды 199 со средой Игла.

Учитывая полученные данные, для дальнейших исследований обоих вирусов выбрали культуру клеток СПЭВ, так как она хорошо размножается на многих питательных средах и является наиболее продуктивной клеточной системой.

Изучение параметров инактивации вирусов TTC и РВБС и их антигенной активности.

Инактивацию вирусов TTC и РВБС проводили формалином и диме-ром зтиденимина (ДЗИ).

При этом установлено, что при температуре 37°С формалин в концентрации 0,1% и ДЭИ в концентрации 0,0ZK инактивируют вирус TTC за 12 часов. Вирус РНВС ютктивкровался формалином в 0,зж-ной, а ДЗИ в 0,03Х-ной концентращш за 24 часа.

При проведении последующих исследований по изучении антигенной и иммуногеюгай активности препаратов вирусов TTC и РВБС были использованы Еирусы, ин&чтивироватше формалином, Tat как Д31 менее доступен (не производится в Республике Беларусь) и более токсичен для животных.

Антигенную активность адаптированных к клеткам СПЭВ вирусов TTC штамм Бр и РВБС птзмм Бс изучали на кроликах, которым подкожно дважды с интервалом 14 дней вводили нативный и 1Шактивированный вирусы TTC с инфекционной активностыз 6,5 Is ТЦД so « РВБС с инфекционной активностыз 7,1 ТВД 50, первый раэ по 1,0 мл и второй раз 1,5 мл. У всех животных до введешш вирусов и через 21 день после последней иммунизации брали кровь и исследовали на наличие антител в РИГА (TTC), РТГА (РВБС) и РН (TTC и РВБС). Установлено, что наиболее выссиам титр антител был у кроликов на введение неинактивированного вируса TTC (4,25± 1,1 log-2 в РН, 4,95± 1,9 1осг2 в РИГА). Титры антител при использовании инактивированного формалином вируса TTC maint Бр были соответственно 4,0± 0,86 log-2 и 4,84 0.94 log2 •

Титры антител в сыворотке крови кроликов на введение неинактивированного и инактивированного вируса РВБС штамм Бс существенно не отличались. Они в обеих групп кроликов составлял в РТГА 5,12± 1,32 - 5.14t 1.65 logs, при исследовании'в РН - 5.89± 1.28 - 5.9± 1.43 lo?2-

Таким образом, при сравнении уровня антител в сыворотке крови кроликов, иммунизированных неинактивированными и инактиви-рованными формалином вирусами TTC втамм Бр и РВБС пташ Бс, существенных различий не установлено.

Подбор оптимальных концентраций сорбентов для приготовления сорбированных препаратов вирусов TTC и РВБС и изучение их антигенной активности.

Сорбцию инактивированных вирусов TTC и РВБС проводили алю-мокалиевыми квасцами и взрос илом.

При атом установлено, что адшокалиевые квасцы в 0,5Х-ной концентрации и азросил в 2%-ной концентрации наиболее полно сср-бировали антигены вирусов TTC и РВБС.

Антигенную активность инактивированных формалином, неад-сорбированных И адсорбированных алшокалиевыыи квасцами вирусов TTC и РВЗС при их раздельном и совместном введении изучали на кроликах и свиноматках.

Кроликов иммунизировали внутримышечно двукратно с интервалом в 2 недели первый раз в дозе 2,0 мл, второй раз - 2,5 мл.

Свшшааякам вакцину вводшш внутримышечно, двукратно с интервалом в 2 недели в дозе 1 раз - 6 мл, второй раз - 7 мл.

Кровь для исследования у всех животных брали через 21 день после последней ваизшации и исследовали в РИГА (ТГС), РТГА (РВБС) и РН (TTC и РВБС).

В опыте яа 20 кроликах и 20 свиноматках было установлено, что чэрев 21 день после второй иммунизации титры вируснейтрали-вущих антител у кроликов и свиноматок при применении коронави-русного npensparra о едьюваитоы достигали уровня 4,53± 0,09 1оег и 4,7Э± 0,18 соответственно. При исследовании в РИГА антитела в сыворотке крови кроликов в свиноматок обнаруживались в титрах б,1± 0,46 и 6,35t 0,31 log2 соответственно.

При применении ротавирусного препарата с адиовантом вирус-нейтралиэуюаде антитела в сыворотке крови на 21-й день после последней иммунизации кроликов и свиноматок обнаруживались в титрах'5,8± 0,14 lo¡í2 и 5,911 0,11 loge соответственно, при исследовании в РТГА - в титрах 6,5* а, 14 и б,75± 0,09 1овг- На ин активированные вирусы без адгюванта антитела вырабатывались в титрах в среднем на 0,56 logz ниже.

■ В опытах яа io кроликах и 10 свиноматках было установлено, что одновременное введение инактивированных вирусов с адиовантом 'вызывает выработку антител к вирусу ТГЭ в сыворотке кроликов в

титрах 4,95± 0.15 loK при исследовании в FU и в титрах 6,2± 0.15 logra при исследовании в РИГА, У свинонаток - в титрах соответственно 5,2± 0.09 1о£2 в FH и 6,44 0.1 1о?2 в РИГА. К вирусу РВБС в сыворотке крови кроликов вяруонейтралиэумдао антитела накапливались в титрах 5,75± 0.1 logg, а при исследовании в РТГА -в титрах 6,4¿ 0.15 los2- У свиноматок титры были соответственно 6,1± 0.1 log2 в PH и б,7± 0.09 lozz в РТГА. Антигенная активность вирусов без адъюванта была несколько нияе (0,1 - 1,1 1огг).

Полученные данные показывай!, что совместное введение инак-тивированных вирусов TTC и РНБС индуцирует выработку антител в более высоких титрах, чем раздельное их введение. Наиболее высокие титры антител отмечены при введении вирусов о едыовантом. Оба вируса при совместном их введении и использовании не обладали антагонистической активностью.

Изучение иммуногенной активности вирусов TTC и FBBC.

Изучение иммуногенной активности сорбированных препаратов вирусов TTC штамм Бр и РВБС штамм Бс при их раздельном введении проводили на супоросных свиноматках в условиях вивария Вел533133. Для этой цели в хозяйстве, благополучном по трансмиссивному гастроэнтериту и ротавирусной болезни, было подобрано 12 свиноматок. из которых сформировали 3 группы по 4 животных. Свиноматкам 1 группы вводили инактивированныи и адсорбированный вирус трансмиссивного гастроэнтерита штамм Бр, Свиноматкам второй группы вводили инактивированныи и адсорбированный вирус ротавирусной болезни свиней. Свиноматок третьей группы не вакцинировали (контроль).

На 3-й день после опороса 14 поросят от двух свиноматок первой группы заражали вирусом ТГС, 15 поросят от двух свиноматок 2-й группы - вирусом РВБС.

9 поросят, полученных от контрольных свиноматок, заразили вирусом TTC и 7 - вирусом РВБС

Вирусы вводили интраназально и орально в дозе по 100 ТЦД 50/0.5см3 соответственно.

В день спороса, а затем на 3, 7 и 21 день от всех свинома-

ток брали пробы крови и молозива для определения титров антител к коронавирусу в РНРА и ротавирусу в РТГА. От поросят с этой целью брали кровь сразу после опороса, до сосания молозива и на 3, 7 и 21 день после опороса.

Иммунологическую эффективность вирусов рассчитывали по формуле

Е » ш-100/ А - в*100/В где: Е - йлгуиологшеская эффективность;

а - количество вшжваих подопытных живоТ1шх; А - количество подопытных животных; в - количество вьйишши контрольных животных; В - количество контрольных животных В результате было установлено, что иммунологическая эффективность инакхивировашюго и адсорбированного вируса TTC штамм Бр составила 74%, а вируса РВБС штамм Бс - 56,67..

При исследовании сыворотки крови и калозивз у свиноматок наивысшие титры антител как к ротавирусу, так и к коронавирусу обнаруживались в молозиве, вептш в день опроса. Они составляли ОТ 7,0 ДО 9,0 log2*

В сыворотке крови поросят уг.е на з" день после опороса антитела к коронавирусу достигали 5,С lo¿2, к 7 дню после опороса они накапливались s максимальных титрах (6,0 1огг), а гатеы к 21 дня несколько снижались (5,0 1огг) .

• Та же тенденция наблюдалась у поросят, полученных от свиноматок, вакцинированных ротавирускш компонентом. На 3 день после опороса титры антител в сыворотке крови достигали 4.8 log-г и снижались к 21 дню ДО 4,6 logo-

Для изучения ймыуногенной активности инактивированных и адсорбированных вирусов TTC И РВБС при одновременном введении в благополучном по названным заболеваниям хозяйстве было подобрано 10 свиноматок, которых иммунизировали приготовленным бивалентным препаратом первый раз в дозе 6,0 мл и второй рзз за 3 недели в дозе 7,0 мл.

На 3-й день после опороса 19 поросят от 2 вакцинированных свиноматок и 17 поросят от 2-х контрольных заразили смесью вирусов TTC и РВБС в равных соотношениях по 100 ТЦД so каждого вируса. Вирусы вводили назооральпо.

Серологические исследования свиноматок и поросят проводили по такой же схеме, как и в первом бпыте

Иммунологическую эффективность рассчитала по ранее приведенной формуле. Она была равной 78,17..

При исследования молозива у евино;,штач иаивыссие титры антител как к корона-, так и к ротазкрусу обнаруживались в молозиве, взятом в день опороса (7,0 - 8.Q loz2 и 3,0 - 10,0 1огг соответственно). В контрольной группе свиноматок антител к корена-и ротавирусу в молозиве не обнаруживалось.

В сыворотке креви свиноматок опытной группы на 3 день после опороса титры антител к корона- и ротавирусу были 6,0 loffa 8,0 1с£2 соответственно. К 21 дот после заражения титры антител несколько снижались, по оставались па достаточно высоком уровне (к корснавирусу 5,0 loge . к ротавирусу 7,0 I032). В контрольной . группе свиноматок антитела отсутствовали.

В сыворотке крови поросят на 3 лень после опороса титры антител к коронавирусу были 5,6 lcj2, к ротавирусу - 6,3 1огг< К 21 дню после опороса они снижались соответственно до 4,0 и 5,9 loge-

Исходя иэ полученных данных, можно сделать зеклпченне, что смесь инактивированиык и адсорбированных вирусов TTC и F8EC обладает выраженными иммуногешшми свойствами и при введении свиноматкам создает достаточно напряженный колостралышй иммунитет у поросят. Применение бивалентного препарата позволяет sasscçe* от заболевания трансмиссивным гастроэнтеритом и ротавирусной болезнью 78,IX поросят.

вывода

1. Выделенные от больных диареей поросят 5 цитопатогеши . агентов идентифицирования как вирусы трансмиссивного гастроэнтерита (3 иэолята) и ротавирусной болезни свиней (2 изолята).

2. При адаптировании наделенных вирусов TTC и FBBC к перевивает гым линиям клеток СЯЭВ и ЩС наиболее высокие титры получены при культивировании на культуре клеток СПЭВ о использеванием питательной среды 199 или гемогвдролиэата.

3. Наибольшее накопление вирусов TTC я F03D происходило пря

множественности заражения культуры клеток СПЭВ вирусами в дозе 0,3 ПЩ so/кд.

4. При серийном пассировании вирусов TTC и РВБС на культуре клеток СПЭВ снижения инфекционного титра на протяжении 15 пассажей не происходило.

5. Формалин и димер этиленимина при температуре 37°С полностью инактивируют вирус TTC в концентрациях 0,12 и 0,02Х соответственно в течение 12 часов, а вирус РВБС - в концентрациях 0,31 и 0,035 в течение 24 часов.

6. Наиболее полно антигены вирусов ТГС и РВБС осаждаются олямокалиевыми квасцами в конечной концентрации 0,57. или сорбируется на аэросиле 2£-ной концентрации. Вирусы, инактивированные формалином и осажденные алюмокалиеьыми квасцзми, сохраняют антигенную активность, что дает основание рекомендовать указанные инактиванты и адгжвант для производства вакцины.

7. Инактивнровааные и адсорбированные вирусы TTC и РВБС при одновременном введении не обладают антагонистическим действием и при одновременном введении свиноматкам и кроликам вызывают у них выраженную иммунологическую реакцию.

Полученные от иммунизированных свиноматок поросята при заражении их в 3- суточном возрасте патогенными эпизоотическими вирусами TTC и РВБС не заболевали в 78Z случаев

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты исследований, изложенные в диссертации использованы для разработки нормативно - технической документации (технических условий, инструкции по изготовлению и контролю и наставления по применению) на ассоциированную вакцину против трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиней и на инактивированную вакцину против трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусной болезни и колибактериоза поросят, которые утверждены {5 марта 1996 г. и 15 декабря 1995 г. Главным управлением ветеринарии Минсельхозпрода Республики Беларусь.

СПИСОК

- опубликованных работ по теме диссертации

1. Ястребов A.C., Бычковский A.M. Иммуноглобулин и тканевая инактивированная вакцина против трансмиссивного гастроэнтерита свиней //Современные проблемы профилактики зооногкьк болезней й пути их решения. Тез. докл. конф.- Синен,1997

2. Ястребов А.С., Мирская Т.А., Болянко Л.В. Бычковский A.M.Изучение эпизоотической ситуации по вирусным гастроэнтеритам свиней в хозяйствах республики //Ветеринарная наука - производству. - Шнек,1989. - Вып.27.-С. З-б.

3. Ястребов A.C., Бучукури Д.В., Бычковский A.M. Концентрирование вируса трансмиссивного гастроэнтерита свиней с помощью мембран //Ветеринарная наука - производству.-Минск, 1930. - Вып. 28. С.23-24.

4. Ястребов A.C., Бычковский A.M., Сазедъева Т.А. Роль рота- и коронавирусов в этиологии острых гастроэнтеритов новорожденных поросят //Профилактика и меры борьбы с болезнями молодняка сельскохозяйственных животных. Тез. докл. конф.-Минск, 19S0.

5. Ястребов A.C., Гутковский A.A., Бычковский A.M., Андро-сик Л. Д. Результаты исследования в лабораторных условиях защитных и антигенных свойств поливалентной вакцины против корона-, рота- и эверихиозной инфекции поросят //Профилактка и меры борьбы с болезнями молодняка сельскохозяйственных ливотных. Тез. докл. конф.-Минск, 1990.

6. Ястребов A.C., Бычковский A.M., Мирская Т.А. К вопросу разработки инактивироваяной бивакцины против ротавируснои болезни и вирусного (трансмиссивного) гастроэнтерита свиней //Интенсификация производства в отраслях агропромышленного комплекса на основе использования методов биотехнологии. Тев. докл. конф. -Минск,19S9.

7. Ястребов A.C., Бычковский A.M., Савельева Т.А., Гутково-кий A.A. Антигенная активность иначтивированной вакцшш против трансмиссивного гастроэнтерита, ротавирусяой болезни и колибак-териога свиней //Ветеринарная наука производству. - Минск,1992-Вып.ЗО -С.6-10.

3. Ястребов A.C., Бычковский A.M., Ковалев H.A., Гутковский A.A. Ассоциированная вакцине, промяв тргнсшосивного гастроэнте-

рита, ротавирусной инфекции и колибактериоза поросят // Технология получения и выращивания здорового молодняка сельскохозяйственных животных и рыболосадочного материала. Тез. докл. конф. -Витебск, 1993.

0. Ястребов A.C., Бычковский A.M., Савельева Т.А. Конструирование масляной ивактивярованной вакцины против FBBC и TTC И Технология получения и выращивания здорового молодняка сельскохозяйственных животных и рыбопосадочного материала. Тез. докл. конф. -Витебск, 1993.

10. Ястребов A.C., Белянко Л.В., Бычковский A.M. Вирусный (трансмиссивный) гастроэнтерит в свиноводческих хозяйствах Белоруссии. //Вотеркнаряаз наука- производству - Минск, 1991-Вып.29. С.З-Б.

11. Ястребов A.C., Гутковский A.A., Бычковский A.M., Андро-сик Л. Д. Защитные и антигенные свойства поливалентной взкцины против »аэрона-, ротавирусиой и зогрихиозной инфекции поросят // Вотвп>шарнаа наука- производству - Минск, 1991-Вып.29.

12. Ястребов A.C., Бычковский A.M., Гутковский A.M. Об им-ыупогешюй активности ^активированной вачцины против вирусных гастроэнтеритов и киадбактеркоза поросят //Ветеринарная наука -производству .- S&',hck,1SS3- Ban.31. С.22-23.

РЭЗШЕ

Бычкоуск1 Анатоль М1хайлав1ч Б1ялаг1чния уласц1васщ эп!заатычных вiруса? трансм!с1унага гзстраэнтэрыту i ротав1руснай хваробы св1ней, вкклрыстоуЕпемнх

для канструявання вакцкй. Клвчавыя словы: si русы, трачсм!с1уяы гастроэнтерит (TTC), рота-в!русная хвзробз (РЕХС), трусы, CBiwii, культуры клетак, И'-аэти-валты, зд'юванты.

Аб'ект дасдедзвашш: оп1еат,К!!ыя в!русы тралсм1с1унага гастраэнтэрыта i ротавхруснай хвзробы, культуры глетах, палыунзе асяроддзе, анактыванты 1 адсзрбенты, а штай - выдзяление, пад-бор i распрацоука спосэба г-ырсичЕзнкя Bipycay TTC i Р8ХС, выка-рыстсуЕаемых для ватворчасц! вакцын. Кэрыстаччыся в1русалаг1ч-ным1, сералаПчньвЛ, шуналагйчныт ыетадаи! даследавашя на культурах клетак, трусах i св1наматках, уперпьпао у Рзспублацы Беларусь вылучаны i выбраны шта^ы в i руса трзнс:яс1унзга гастраэнтэрыта i ротав!руснай хвзробы свиней, вагодажчыл вачуленай антигенам актыунасцо, атрыманы дадэеные аб прадукцыйных клетзчпых састэмах, пригодных для накаплення Bipycay TTC i РЗХС. Адлраца-ваны тэхналаг1чныя приемы кульщв1равання ix, вывучаны спосабы 1нагсшвацц1 i адсорбцт, вывучана амунагеннасць пры умдгенн! nj-велам. На аснове выШкаУ даследванняу распрацавана нарматыуна -тэх1пчная дакументацыя на асацы1раваную ва)щыну супраць трачсм!-ciynara гастраэнтэрыта i ротав1руснай хваробы св1ней 1 на iii2K-тывграваную вакцыну супраць трзнешсцунага гастраэнтэрыта, рота-В1руснай хваробы i кол^бактэрыозу парасят.

.РЕЗЮМЕ Бычковский Анатолий Михаилович Биологические свойства эпизоотических вирусов трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиней, используемых для конструирования вакцин.

Ключевые слова: вирусы, трансмиссивный гастроэнтерит, рота-вирусная болезнь, кролики, свиньи, культуры клеток, инактиванты, адъюванты.

Объект исследования: эпизоотические вирусы трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиней, культуры клеток, питательные среды, инактиванты и аддтюванты. а целью - выделение, подбор и раэрзбот(са способа выращивания вирусов TTC и РВБС, используемых для производства вакцин. Используя вирусологические, серологические, иммунологические методы исследований нз культурах клеток, кроликах и свиноматках, впервые в Республике Беларусь выделены и отобраны штаммы вирусов трансмиссивного гастроэнтерита и ротавирусной болезни свиней, обладающие выраненной антигенной активностью, получены данные о продуктивны/, клеточных системах, пригодны:', для накопления вирусов ТГС и РВБС1, отработаны технологические приемы культивирования, изучены способы инактивации и адсорбщии, изучена иммуногенность при введении животным. На основании результатов исследований разработана нормативно- техническая докум'-нт.чция ил гчссоциированную кжцину против трансмиссивного гагтргс»нттитп и ротавирусной болезни свиней и на инактивированную ьткцину против тргшсмиссньного гас-троэнт^ри-та, ротавирусной Сслег-ни и w''ЛгЛ'акториада поросят

SUMMARY

Anatoly Mikhaylovich Bychkovsky Biological properties of swine epizootic transmissible gastroenteritis and rotavirus disease viruses used for construction of

vaccines.

Key words: viruses, transmissible gastroenteritis (TGE), rotavirus disease (RD), rabbits, swino, cell cultures, inactivants, adjuvants.

Research subect: epizootic transmissible gastroenteritis and rotavirus disease viruses of svrine, cell cultures, nutrient media, inactivants, adjuvants.

desesrch purpose: isolation, selection and development of methods of cultivation of swine TGE and ED viruses used for vaccine production.

Using virological, immunological research methods on cell cultures,rabbits and sows in the Republic of Belarus for the first time swine TGE and RD virus strains with expressed antigenic activity were isolated and selected; data about productive cell systems, that are suitable for multiplication of TGEV and RDV, were received; technological methods of cultivttion were worked out; methods of inactivation and adsorption as well as immunogenesity after administration to animals were studies.

On the basis of research results normative - technical documentation on an associated vaccine against TGE and RD of swine and fin inactivated vaccine against TGE aid RD and colibacillosis in piflets is elaborated.