Конструирование и иммунобиологические свойства экспериментальных вакцин против гриппа птиц

Борисов, Алексей Васильевич

Диссертации по ветеринарии → Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Конструирование и иммунобиологические свойства экспериментальных вакцин против гриппа птиц

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Борисов, Алексей Васильевич Москва 2009 г.

Ученая степень: кандидата ветеринарных наук

ВАК РФ: 16.00.03

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Конструирование и иммунобиологические свойства экспериментальных вакцин против гриппа птиц

На правах рукописи

БОРИСОВ Алексей Васильевич

КОНСТРУИРОВАНИЕ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ВАКЦИН ПРОТИВ ГРИППА ПТИЦ

16.00.03 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 2009

003469906

Исследования по конструированию и изучению иммунобиологических свойств экспериментальных вакцин против гриппа птиц инактивированных эмульсионных выполнены в течение 2006-2009г, на базе лаборатории качества и стандартизации лекарственных средств против болезней птиц ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» и ОАО «Покровский завод биопрепаратов».

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Смоленский Владимир Иванович

Официальные доктор биологических наук, профессор

оппоненты: Гуненков Виктор Всеволодович;

доктор биологических наук Соловьев Борис Васильевич, ОАО «Институт биотехнологии ветеринарной медицины» г. Москва

„ ГНУ «Всероссиискии научно-исследовательскии

Ведущая организация: „

17 г ветеринарныи институт птицеводства»

Россельхозакадемии

г. Санкт - Петербург

Защита диссертации состоится ¿¿#>м£ 2009 года в ЛГ^ часов на заседании диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 220.011.01 в Федеральном государственном учреждении «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ»),

Адрес: Россия, 123022, г. Москва, д. 22 Звенигородское шоссе, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ВГНКИ».

Автореферат разослан « ¿> » ¿¿¿¿з^ 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, доцент, Заслуженный ветеринарный врач РФ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В условиях современного интенсивного промышленного птицеводства возрастает угроза появления особоопасных инфекционных заболеваний, которые приводят к значительным экономическим потерям в результате гибели поголовья, снижения продуктивности, недополучения молодняка, и затрат на проведение противоэпизоотических мероприятий (П.В. Каргилл, 2004; В.В. Малушко, 1982; Ю.В. Родин, 1998; И.Г. Скутарь, 1980).

Анализ эпизоотической ситуации свидетельствует о реальной угрозе широкого распространения гриппа птиц (ГП) на территориях разных государств. По информации Международного Эпизоотического Бюро (МЭБ) и других организаций данное заболевание регистрируют во многих странах мира, включая Российскую Федерацию. Поэтому предотвращение распространения возбудителя этой опасной болезни на территории нашей страны является одной из приоритетных задач (Т.А. Бектимиров, 2005; A.JI. Беляев, 2004; В.О. Виноходов, 2006; А.Л. Липатов, 2005).

Используются различные меры предотвращения, контроля и ликвидации гриппа птиц, которые варьируют в широких пределах от полной ликвидации всего восприимчивого к гриппу поголовья до организаций мероприятий по специфической профилактике. Каждая страна выбрала свои способы борьбы с гриппом и контроля инфекции. Однако, согласно требованиям Санитарного Кодекса наземных животных МЭБ для выполнения торговых международных соглашений и стандартов меры, используемые для предупреждения, контроля и ликвидации гриппа, должны быть дифференцированы в зависимости от патогенности вируса ГП, особенностей местных и международных рынков, путей распространения инфицированных птиц, экономического статуса государства и др. (Т.А. Бектимиров, 2005; Д.К. Львов и соавторы, 2004; М. Yegani, 2004).

Распространение в течение последних лет во многих странах мира высокопатогенного вируса гриппа птиц (ВПВГП) H5N1 азиатской линии, высокопатогенного вируса гриппа H7N3 (Канада), а также низкопатогенных вирусов подтипов Н5 (США, Португалия) и Н7 (США, Италия, Англия, Пакистан) требует не только укрепления системы раннего обнаружения возбудителя среди домашней и дикой птицы, но и проведение комплексной вакцинопрофилактики поголовья. (Э.Д. Джавадов, 2006; В.И. Смоленский, 2006).

В мире существует множество вакцин против гриппа птиц из аутологичных или гетерологичных штаммов. К примеру, использование вакцины из аутологичного штамма (H5N1) в РФ в период 2006-2007 гг. для предотвращения распространения ВПГП было успешным. Однако не во всех случаях результат применения такой вакцины был положительным. Так, в Пакистане и в Мексике инактивированные аутологичные вакцины не купировали инфекцию.

Данный тип вакцины, как правило, готовят на основе эпизоотических штаммов, выделенных в момент вспышки. При этом сохраняется потенциальная эпизоотическая опасность в случае не полной инактивации вируса. Использование низкопатогенных штаммов вируса ГП может устранить эту проблему. Кроме того, использование гетерологичных штаммов позволяет проводить мониторинг распространения болезни. На использовании гетерологичной вакцины для профилактики ГП основана «DIVA» стратегия (Differentiating Infected from Vaccinated Animals -Дифференциация инфицированных животных от вакцинированных животных), которая была разработана и применялась в Италии.

Вакцины из гетерологичных штаммов по отношению к циркулирующему штамму отличаются тем, что производственный штамм, используемый в вакцине, представляет собой штамм с гемагглютинином (Н) того же типа, что и у полевого вируса, но имеет гетерологичную нейраминидазу (N). Гомологичный подтип Н, входящий в состав вакцины, обеспечивает защиту птиц от циркулирующего вируса, а анализ антител к N в серологическом тесте позволяет различить вакцинированную птицу от инфицированной (Э.Д. Джавадов, 2006; В.Н. Ирза, 2006; В.И. Смоленский, 2006).

Отечественная биопромышленность выпускает вакцину из штамма вируса ГП H5N1, гомологичного циркулирующему на территории РФ. Вакцина широко и успешно используется ветеринарной практикой с целью профилактики ГП. Однако, осуществление дифференциации поствакцинальной и постинфекционной реакции на привитом поголовье практически не возможно.

В связи с этим проблема разработки вакцин из гетерологичных подтипов ВГП, подбор и изучение соответствующих штаммов как производственных в нашей стране чрезвычайно актуальна. Решение этих вопросов позволит выполнить ряд рекомендаций описанных в "Руководстве по диагностическим тестам и вакцинам МЭБ" (Глава 2.1.14).

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является разработка инактивированных эмульсионных вакцин против ГП из ВГП разных подтипов (Н5, Н7 и Н9), обладающих высокой антигенной активностью при низкой реактогенности, а также изучение их иммунобиологических свойств.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

• отработать параметры культивирования различных штаммов вируса гриппа птиц подтипов Н5, Н7 и Н9 в куриных эмбрионах;

• оценить возможность использования различных штаммов подтипов Н5, Н7 и Н9 для наработки вирусного сырья;

• сконструировать экспериментальные инактивированные эмульсионные вакцины против ГП из штаммов подтипов Н5, Н7 и Н9 и изучить их иммунобиологические свойства;

• испытать различные масляные адъюванты для конструирования вакцин против гриппа птиц из гетерологичных штаммов;

• изучить иммуногенную активность и протективную эффективность моно- и полиштаммных инактивированных вакцин против ГП;

• определить продолжительность иммунитета у птиц, привитых экспериментальными вакцинами;

Научная новизна. Научная новизна работы состоит в том, что в результате проведенных исследований:

• получены данные о биологических свойствах штаммов вируса гриппа птиц типа А с антигенной формулой H5N2, H7N2, H7N7, H7N3 и H9N2 - потенциальных продуцентов инактивированных вакцин;

• подобран и обоснован компонентный состав моно- и полиштаммных инактивированных эмульсионных вакцин из изученных штаммов вируса гриппа птиц;

• доказана высокая антигенная активность и протективная эффективность инактивированных эмульсионных вакцин против высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц.

Практическая значимость. Разработана технология производства и предложены для внедрения в ветеринарную практику препараты для специфической профилактики гриппа птиц, вызываемого высокопатогенными вирусами подтипов Н5, Н7 и Н9.

Результаты научных исследований были использованы при составлении проектов нормативной документации (НД), регламентирующей изготовление, контроль и применение вакцин:

• СТО на полиштаммную инактивированную эмульсионную вакцину против ГП из штаммов подтипов Н5, Н7 и Н9 (СТО 70952707-0052-2009);

• Инструкция по применению полиштаммной инактивированной эмульсионной вакцины против ГП из штаммов подтипов Н5, Н7 и Н9;

Разработаны и утверждены Генеральным директором ОАО «Покровский завод биопрепаратов» методические рекомендации по поддержанию и хранению посевных и рабочих расплодок производственных штаммов вируса ГП типа А подтипов Н1-Н16.

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

• биологические свойства исследуемых штаммов вируса гриппа птиц;

• результаты изучения антигенной и иммуногенной активности экспериментальных моно- и полиштаммных инактивированных эмульсионных образцов вакцин против высокопатогенного гриппа птиц;

• зависимость уровня антительного ответа от концентраций антигенов гриппа птиц в вакцине из штаммов «А/утка/Приморский/01» (H5N2), «А/цыпленок/Узбекский/68» (H7N2) и «А/индюк/Висконсин/66» (H9N2).

Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях «Новое в диагностике и профилактике болезней птиц» (Санкт - Петербург, 2008) ВНИВИП, «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (Киров, 2008) 48 Центральный НИИ Минобороны РФ.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них 4 работы из числа включенных в ведущие рецензируемые научные журналы и издания, определенные ВАК РФ.

Личный вклад соискателя. Представленные в диссертации экспериментальные исследования и анализ полученных результатов выполнены автором самостоятельно. В ходе работы практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ФГУ «ВГНКИ» и ОАО «Покровский завод биопрепаратов» кандидаты ветеринарных наук Ю.В. Зуев, Т.В. Руденко, Д.А. Лозовой, Д.С. Сурнев, В.В. Ельников, Г.В. Батченко, за что автор выражает им искреннюю благодарность за оказанную помощь.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 167 страницах компьютерного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, который состоит из 293 источников, в том числе 95 работ на русском языке. Работа иллюстрирована 17 таблицами, 21 рисунками и дополнена приложением документов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Производственные штаммы вируса гриппа птиц:

«А/утка/Приморский/01» (H5N2); «А/цыплёнок/США/1370/83» (H5N2);

«А/утка/Украина/1/63» (H7N7); «А/цыпленок/Узбекский/68» (H7N2);

«A/Eng/Rav/4054/2006» (H7N3); «А/индюк/Висконсин/66» (H9N2); «А/курица/Курган/5/05» (H5N1); «А/цыпленок/Росток/29» (H7N1).

Куриные эмбрионы. В опытах использовали эмбрионы SPF-кур фирмы Lohman (Германия), свободных от антител к вирусу ГП в количестве более 1500 штук.

Подопытные животные. В лабораторных условиях ОАО «Покровский завод биопрепаратов» экспериментальную работу проводили на цыплятах мясного и яичного кроссов. Вся птица была получена из птицефабрик благополучных по вирусу гриппа птиц. Цыплята бройлеры 20 -30-суточного возраста кросса «Ross - 308», массой 150 - 300 грамм, цыплята 30-80 суточного возраста яичного направления продуктивности кросса «Хайсекс Коричневый», «Хайсекс Белый» и «Хай-Лайн W 98». Перед экспериментами все подопытное поголовье исследовали на наличие сывороточных антител против вируса ГП.

Сыворотка крови. В экспериментах было исследовано более 1500 проб сыворотки крови птиц разного возраста, взятых до вакцинации и в различные сроки после вакцинации опытными образцами вакцин.

Культивирование вируса ГП. Культивирование вируса производили на 10-11 суточных эмбрионах SPF-кур и куриных эмбрионах, полученных из яйца племхозяйств, методом заражения в аллантоисную полость. КЭ инкубировали при 37,5±0,5°С в течение 48-72 часов, после чего охлаждали при температуре от 2 до 8°С в течение суток, и отбирали экстраэмбриональную жидкость (ЭЭЖ), содержащую вирус ГП.

Определение инфекционной активности. Инфекционную активность вируса ГП в исследуемом материале определяли методом титрования его на КЭ 10-11 суточного возраста. Гемагглютинирующую активность определяли согласно общепринятой методике постановки РГА. Титр вируса рассчитывали по методу Рида и Менча. Результаты выражали в lg ЭИДзо/см3.

Инактивация вируса. Для инактивации инфекционной активности вирусной суспензии использовали Р-пропиолактон, рабочий раствор которого готовили из расчета 1:4000.

Изготовление экспериментальных образцов вакцин. Для иммунизации птиц готовили экспериментальные образцы вакцин на основе различных масляных адъювантов, образующих эмульсию типа «вода-масло». Стерильные адъюванты помещали в сосуд гомогенизатора, и при скорости вращения ротора 1000 об/мин. вносили антигенный компонент (или его смесь), после чего скорость вращения ротора увеличивали до 7000 об/мин. Весовое соотношение адъювантов к антигенсодержащей жидкости составляло 70:30.

Расчет зависимости уровня антительного ответа от концентраций антигенов вируса гриппа птиц в вакцине. За базовую оценку содержания антигенов вируса ГП в полиштаммной вакцине принимали его инфекционный титр в вируссодержащем материале, установленный до процедуры инактивации. Для удобства вычислительных операций использовали показатели титра вируса, характеризующие теоретическую концентрацию условных единиц инактивированного вируса (IgTv), которая фактически находилась в вакцине соответственно

предшествующей оценке ^То (ЭИД50/СМ3) и заданной величине разведения антигена Э. Необходимые расчеты производили по формуле:

= ^То-0,523-^0 [ 1 ], где: 0,523 - постоянный коэффициент.

При изучении интенсивности гуморальной реакции на различные концентрации исследуемых антигенов использовали общепринятые методы оценки дисперсии, стандартного отклонения и доверительного интервала варьирующих переменных. Определяли существенность различий эмпирических средних оценок и устанавливали количественные показатели связи зависимых переменных в виде коэффициентов корреляции (г) путем построения регрессионных моделей у=у0+кх [2], где: у - прогнозируемое значение зависимого параметра для заданного х.

Также вычисляли коэффициенты детерминации (И2), оценивающие адекватность модели. Эмпирические модели считали адекватными, если

выполнялось неравенство. [Я2/[(1-К2)/(п-2)] > Рр {у1=1;у2=п-2} [3].

Определение иммуногенности вакцин. Для этого были сформированы опытные, контрольные и контактные группы цыплят из птицехозяйств, благополучных по острым инфекционным болезням, в том числе ГП. Цыплятам опытных групп вводили экспериментальные образцы вакцины в прививном объеме 0,5 см3 однократно подкожно внутримышечно в область груди. Через 28 суток после вакцинации контрольной группе птиц внутримышечно вводили высоковирулентный вирус гриппа птиц различных подтипов. За птицей проводили ежедневное наблюдение дважды в сутки, фиксируя отклонения от физиологической нормы. Эффективность вакцинации рассчитывали по формуле Э = [(А-В) /А]х100% [4], где: Э -эффективность вакцинации в %, А - количество голов павшей или заболевшей птицы с признаками ГП в контрольной группе, В - количество голов павшей или заболевшей птицы с признаками ГП в опытной группе (вакцинированной). Вакцину считали иммуногенной при эффективности вакцинации цыплят не менее 80 %.

Оценка антигенной активности экспериментальных вакцин. Сущность метода заключается в определении способности вакцины вызывать у привитой птицы выработку специфических антител. Уровни сывороточных антител к вирусу ГП определяли в реакции торможения гемагглютинации (РТГА) согласно действующим методическим указаниям и выражали в логарифмах с основанием 2 (^2).

Оценка физических свойств экспериментальных образцов вакцин. Качество экспериментальных образцов вакцин оценивали по соответствию нижеприведенным параметрам. Стабильность эмульсии - при хранении образцов при температуре 37°С в течение 14 суток, а также их центрифугировании не допускается образование водной фракции на дне пробирки, а отслоение верхней масляной фракции не должно превышать 10% от общего столба эмульсии; в ходе экспресс-теста отслоение водной фракции на дне пробирки не должно превышать 15% от общего столба эмульсии.

Кинематическая вязкость вакцинной эмульсии не должна превышать 200 мм2/с. Дисперсионный состав эмульсии - средний диаметр частиц дисперсионной фазы вакцинной эмульсии не должен превышать 5,0 мкм.

Оценка местных тканевых реакций на введение экспериментальных вакцины. Наблюдение за клиническим состоянием привитых птиц и наружный осмотр места введения опытных образцов вакцин осуществляли ежедневно на протяжении 21 суток после вакцинации, затем проводили послеубойную визуальную оценку состояния тканей в месте инъекции на разрезе. Результаты определения реактогенного действия вакцины оценивали комплексно, учитывая клиническое состояние птиц, результаты наружного осмотра, а также результаты послеубойной оценки степени поражения тканей, которую проводили по критериям Н. Stone (1997).

Статистическая обработка результатов исследований. Для обработки результатов исследований использовались методы, описанные в руководстве по биометрии (Ашмарин И.П., 1962, Weigends S., 1997).

Все вычислительные процедуры выполнены с использованием компьютерной программы «Statistica».

2.2. Результаты исследований

Подбор штаммов вируса ГП для изготовления экспериментальных вакцин против гриппа птиц

Изучение биологических свойств штаммов вируса гриппа птиц типа А подтипов HSN2, H7N2, H7N7, H7N3 и H9N2. Первым этапом наших исследований было определение патогенности штаммов вируса ГП для КЭ. Для этого сформировали двадцать четыре опытные и одну контрольную партию КЭ по 10 штук в каждой. Куриные эмбрионы опытных партий заражали исследуемыми штаммами в дозах: 10000, 1000, 100 и 10 ЭИД50.

Было установлено, что при инокуляции КЭ 10 - 10000 ЭИД50 исследуемые штаммы в течение первых суток не вызывали их гибели. Спустя 48 часов после заражения в дозе от 100 до 10000 ЭИД50 патогенность штаммов «А/цыплёнок/США/13 70/83» (H5N2), «А/утка/Украина/1/63» (H7N7), «А/цыпленок/Узбекский/68» (H7N2), «A/Eng/Rav/4054/2006» (H7N3) была максимальной, гибель эмбрионов достигала 100%, а при минимальной дозе 10 ЭИДл) специфическая гибель КЭ была 80, 90, 50 и 80% соответственно. Минимальная патогенность установлена для штамма «А/утка/Приморский/01» (H5N2), который в течение двух суток инкубации КЭ, зараженных в дозе 10 ЭИД50 не вызывал их гибели, в то время как от штамма «А/индюк/Висконсин/66» (H9N2) в аналогичных условиях погибало 20% КЭ.

При увеличении срока инкубирования до 72 часов гибель 20% КЭ наблюдалась при заражении штаммами «А/утка/Приморский/01» и «А/индюк/Висконсин/66» в дозе 10000 ЭИД^о- Остальные исследуемые штаммы в течение трех суток инкубации проявляли максимальную степень

патогенности, в том числе и при минимальной заражающей дозе.

Проведенные исследования позволили нам определить наиболее перспективные штаммы разных антигенных подтипов вируса ГП как производственные.

Определение эффективной заражающей дозы ВГП. Для этого КЭ заражали исследуемыми штаммами в дозе от 10 до 1000 ЭИД50 и инкубировали в течение 48 часов. Установили, что при заражении куриных эмбрионов ВГП, штаммом «А/уткаУПриморский/01» и штаммом «А/цыплёнок/США/1370/83» в инфицирующей дозе 10 и 100 ЭИД50, получали вирусный материал с максимальным инфекционным титром от 7,75 до 8,45 lg ЭИД50/см3 и от 8,75 до 8,95 lg ЭИД50/см3, соответственно. Так же высокие титры в пределах от 10,2 до 10,7 lg ЭИД50/см3 получали при заражении штаммом «А/цыпленок/Узбекский/68» вируса ГП в дозе 100 ЭИД50. Для других исследуемых штаммов «А/утка/У краина/1/63» и «A/Eng/Rav/4054/2006» заражающая доза 100 ЭИД50 также обеспечивала максимальную инфекционную активность. Использование для заражения более высокой дозы - 1000 ЭИД50 не привело к увеличению инфекционной активности полученного вируссодержащего материала.

Влияние возраста КЭ на «урожай» ВГП, Исследования проводили, используя вышеперечисленные штаммы ВГП в дозе 100 ЭИД50. Заражённые эмбрионы в возрасте 9-12 суток инкубировали в течение 48 часов. Оценивали следующие качественные и количественные показатели, характеризующие вирусный материал: средний объем экстраэмбриональной жидкости от одного КЭ и титр гемагглютинина. Максимальный объем вируссодержащей жидкости (11,6 см3) с гемагглютинирующим титр 7,2 log2 получен при культивировании штамма «А/утка/Приморский/01» на КЭ 11 суточного возраста.

Для наработки штаммов «А/цыпленок/Узбекский/68» и «А/индюк/Висконсин/66» лучшие результаты получены при использовании КЭ 12 суточного возраста.

Исходя из полученных результатов, в дальнейших опытах по конструированию экспериментальных инактивированных эмульсионных вакцин против ГП использовали штаммы «А/утка/Приморский/01», «А/цыпленок/Узбекский/68», «А/индюк/Висконсин/66».

Конструирование экспериментальных инактивированных эмульсионных моновалентных вакцин против ГП из штаммов «А/утка/Приморский/01»(Н5ГО), «А/цыпленок/Узбекский/68»(Н7ГО) «А/индюк/Висконсин/66»(Н9Ш)

Стабильность эмульсии опытных образцов инактивированных вакцин против ГП на основе масляного адъюванта Montanide ISA 70 VG.

Для моделирования и изучения стабильности препарата, в качестве дисперсной среды был выбран адыовант Montanide ISA 70 VG и использовался нами как эталонный, наиболее стандартизированный,

гарантированно обеспечивающий адъювантные функции.

Учитывая известные данные об идентичности физико-химических характеристик вируса гриппа разных подтипов и серовариантов, базовым образцом для исследования стабильности эмульсии считали вакцину из штамма «А/утка/Приморский/01» Н5Ш. Остальные образцы вакцин из штаммов Н7№, ГОШ имели такое же соотношение по весу Моташс1е -антиген (70:30) и готовились по аналогичной методике.

Полученные в ходе испытания результаты стабильности эмульсии представлены в таблице 1.

Основываясь на критериях оценки стабильности эмульсионных вакцин при исследовании в тесте «замораживание - оттаивание», исследуемый образец не отделял водную фазу. В тестах «быстрое старение» и центрифугирование определено высокое качество испытуемой эмульсии на протяжении всего периода наблюдения. Кинематическая вязкость составляла 42,7 мм2/с, что является допустимой нормой, установленной документацией -не более 200 мм2/с.

Таблица 1

Изучение стабильности эмульсии экспериментального образца

вакцины в различных тестах

Вакцина Вязкость мм2/с Фракции вакцины Методы тестирования

Центрифугирование «Замора живание-оттаивание «Быстрое старение» +37°С

14 сут. 60 сут.

Экспериментальная вакцина против ГП из штамма подтип II5N2 42,7 А 2% 3% 3% 35%

В Н/О 4% 4% Н/О

С 98% 93% 93% Н/О

D Н/О Н/О Н/О 65%

Е Н/О Н/О Н/О Н/О

Примечание: А - прозрачное масло, В - жидкая эмульсия, С - нормальная эмульсия, D - плотная эмульсия (коалесцент), Е - водная фаза, I I/O - не обнаружено.

При исследовании в тесте «замораживание - оттаивание», исследуемый образец не отделял водную фазу, что свидетельствовало о высокой стабильности препарата.

При определении типа полученной вакцинной эмульсии «капельным» методом выяснили, что эмульсия на основе адъюванта Montanide ISA 70 VG относится к эмульсиям обратного типа, или «вода-масло».

Дисперсность вакцинной эмульсии изготовленной на основе масляного адъюванта Montanide ISA 70 VG. При изучении результатов тестирования, было обнаружено, что дисперсионная фаза эмульсии, изготовленной на основе адъюванта Montanide ISA 70 VG, представлена в виде мелкозернистой равномерной структуры, частицы в которой имеют диаметр менее 1,0 мкм, с единичными включениями более крупных частиц. Исходя из этого, тестируемый адьювант при смешивании с антигеном и

дальнейшем диспергировании образует эмульсию с отличными дисперсными характеристиками. При этом прослеживается зависимость между размером частиц дисперсной фазы вакцины, и ее стабильностью при хранении.

Антигенная активность и реактогенные свойства экспериментальных моповалентных образцов вакцин. Для получения эмульсионных вакцин против ГП в качестве водной фазы использовали инактивированные антигены штаммов: «А/утка/Приморский/01» (H5N2), «А/цыпленок/Узбекский/68» (H7N2) и «А/индюк/Висконсин/66» (H9N2), в качестве дисперсной среды выступал масляный адъювант Montanide ISA 70 VG. Для постановки опыта использовали цыплят кросса "Хай-Лайн W 98" 3540 суточного возраста, свободных от антител к вирусу гриппа птиц. Вакцинацию проводили однократно внутримышечно в область груди в прививном объёме 0,5 см3.

Антигенную активность вакцин оценивали по динамике накопления антител к вирусу ГП на 14, 21, 28, 42, 60 и 90 сутки после вакцинации у привитых цыплят и цыплят контрольной группы. Полученные сыворотки крови тестировали индивидуально в РТГА с антигеном, гомологичным вакцинному. Реакцию проводили по общепринятой методике. Полученные результаты в виде среднего геометрического титра антител по группе цыплят представлены на рисунке 1.

Рис.1. Динамика титров антител к вирусу ГП у птиц привитых экспериментальными моно вакцинами из подтипов H5N2, H7N2, H9N2.

Из представленных данных следует, что после однократной иммунизации цыплят инактивированными эмульсионными вакцинами из штаммов «А/утка/Приморский/01», «А/цыпленок/Узбекский/68» и «А/индюк/Висконсин/66» во всех опытных группах отмечались равномерные приросты титров антител. Причем максимальные их показатели фиксировали на 60 сутки после вакцинации. Испытуемые образцы вакцин из штаммов «А/цыпленок/Узбекский/68» и «А/индюк/Висконсин/66» индуцировали образование защитных антител на уровне 4,4 и 4,2 log2 уже на 14 сутки, в отличие от штамма «А/утка/Приморский/01», который обеспечивал протективный уровень антител 5,6 log2 лишь на 21 сутки после иммунизации.

Все вакцины на протяжении опыта поддерживали достаточно высокий уровень антител, необходимый для формирования напряженного и длительного иммунитета против ГП. Цыплята контрольной группы оставались серонегативными к вирусу ГП в течение всего периода наблюдения.

Реактогенные свойства вакцин проверяли путём введения цыплятам по 1,0 см3 исследуемого препарата внутримышечно в область груди. По истечению 21 суток проводили оценку безвредности вакцин. Для этого цыплят подвергали эвтаназии, вскрывали место введения и оценивали изменения тканей по критериям предложенным Н. Stone (1997).

Установлено, что вакцины, изготовленные на основе адъюванта Montanide ISA 70 VG, обладали достаточно низкой степенью реактогенности, поскольку в месте введения образовывались незначительные участки инкапсуляции вакцинной эмульсии.

Таким образом, исследуемые образцы вакцин на основе масляного адъюванта Montanide ISA 70 VG обладали как выраженными иммунобиологическими свойствами, так и хорошей стабильностью. Испытанные нами режимы получения вакцинной эмульсии позволяли получить высокоиммуногенный, стабильный и безвредный препарат.

Математическое моделирование зависимости уровня антительного ответа от концентраций антигенов вируса гриппа птиц в вакцине из штаммов «А/утка/Приморский/О I» (Н5^),«А/цыпленок/Узбекский/68» (Н7ГО) и «А/индюк/Висконсин/66» (Н9Ш)

Задачей данного этапа исследований было определение количественных характеристик специфического серологического ответа птиц на препараты, содержащие различные концентрации изучаемых антигенов и построение соответствующих моделей связи, позволяющих прогнозировать интенсивность иммунной реакции птиц на заданные концентрации каждого антигена.

Действие антигенов исследовали раздельно в составе монопрепаратов, где содержание антигенного материала (водной фазы) составляло 30% по весу. При приготовлении препаратов указанную пропорцию водной фазы сохраняли постоянной, но концентрацию антигенов изменяли. Готовили заданные величины разведений (Б) исходных антигенных субстанций (использовали двоичный шаг). В результате, каждый антигенный материал был испытан как в неразбавленном виде (0=1), так и в двукратных разведениях в диапазоне от 1:2 до 1:16 (т.е. от Б=2 до 0=1 б).

Базовой оценкой концентрации антигена считали инфекционный титр вируса, установленный в материале до процедуры инактивации (Т0, ЭИД50). Для удобства последующих вычислений использовали условный показатель, характеризующий теоретическую концентрацию условных единиц инактивированного вируса (Ту), которая фактически находилась в вакцине

соответственно предшествующей оценке Т0 и заданной величине разбавления антигена в препарате. Расчеты проводили по формуле [1].

В экспериментах использовали птиц серонегативных к исследуемым антигенам в возрасте 40-45 суток. Для испытания каждого препарата с заданной концентрацией антигена формировали отдельную группу, численностью не менее 6 птиц. Вакцины вводили внутримышечно в объеме 0,5 см3, в область груди. Через 21 сутки после прививки у вакцинированных птиц исследовали сыворотки крови. В РТГА определяли титры сывороточных антител каждой пробы и вычисляли средние для данной группы птиц величины титров (Т5ег). Полученные значения Т5ег считали оценками гуморального иммунного ответа на заданную концентрацию изучаемого антигена.

Для каждого изучаемого антигена исследовали связь между показателями и ^2ТБег, при этом показатели ^2Т5ег считали оценками зависимого параметра в данной системе «доза антигена —* титр антител». Определяли коэффициенты корреляции параметров (г), а также проводили построения соответствующих регрессионных моделей, позволяющих выполнять операции прогнозирования. Полученные результаты в графическом виде представлены на рисунке 2 и демонстрируют, что концентрация антигена во всех препаратах была однонаправлено связана с величиной гуморального иммунного ответа вакцинированных птиц. Увеличение значений контролируемого параметра повсеместно приводило к возрастанию параметра-ответа. Между показателями 1§ТУ и 1о§2Т8ег определяли коэффициенты корреляции, которые у исследуемых антигенов Н5 Н7 и Н9, составили величины: 0,991; 0,988 и 0,989. Все полученные коэффициенты имели высокий уровень достоверности (р<0,001). Далее были построены регрессионные модели, позволяющие прогнозировать величину гуморального иммунного ответа птиц на заданную концентрацию данного антигена. Используя коэффициенты детерминации (Я2), установили, что для всех исследуемых антигенов характеристики адекватности моделей Р=[112/[(1-112)/(п-2)] соответствовали высокой значимости (р<0,001).

Построенная для каждого антигена регрессионная модель являлась уравнением связи показателей 1§ТУ и 1о§2Т5ег. В общем виде данное уравнение имело вид. 1о£2Т5ег=к(^Ту)-А, где: 1о§2Т8ег - прогнозируемое значение титра антител для заданной концентрации антигена (1§ТУ), к - регрессионный коэффициент, А - ордината линии регрессии.

Величина log2Tser, установленная по данному уравнению для монопреиарата, была использована и для прогноза действия антигена в составе полиштаммной вакцины (при условии, что между антигенами, присутствующими в организме в виде смеси, возможность их взаимного ингибирующего или усиливающего эффекта считали маловероятной).

11рйМ;

гт.»* - . л.т-г

к «~ьл ......Шт....................... ...........................

.................................... .........................................

........................1ШЯ» ^ШШШШкшш

Рис.2. Распределения величин титров сывороточных антител, установленных в РТГА (^2Т8СГ)* соответственно концентрации антигена в вакцине и типам исследуемых антигенов (Н5; Н7;Н9).

Регрессии вида: ^2Т5ег=к(^Ту)-А, где: ^гТвег - прогнозируемое значение титра антител для заданной концентрации антигена (1§Ту); к-регрессионный коэффициент; А-ордината линии регрессии. 112 -коэффициент детерминации (характеристика адекватности модели).

*-даны средние логарифмические значения (1оц2), полученные в группах иммунизированных птиц (п>6); стандартные ошибки средних измерений находились в диапазоне 0,2ч0,4.

**-даны средние логарифмические значения (1§), полученные в результате не менее трех измерений (п>3); стандартные ошибки средних измерений находились в диапазоне 0,11ч0,17.

В этом случае, при вычислении показателя концентрации данного антигена

1йТу по формуле [1], значение ^ соответствовало величине их взаимного разбавления в водной фазе препарата (например, если в смеси в равных пропорциях участвовало 2 антигена, то для каждого ^В=1£1=0,301, если 3 антигена, то 1ц0=^3=0,477 и т.д.).

Было принято, что пороговым показателем, характеризующим нижнюю границу интенсивности гуморального иммунного ответа организма на данный антиген, является величина 1о§2Т8ег=4. Считается, что данное значение является наименьшим допустимым титром сывороточных антител, который обеспечивает протективное действие в отношении инфекции вируса гриппа птиц.

Используя соответствующие регрессионные модели (рисунок 2), для исследуемых антигенов определили наименьшие ожидаемые концентрации (1§Ту), которые позволяют достичь значения 1о£2Т5ег=4 и рассчитать статистические характеристики установленных оценок. Порядок расчетов и полученные величины представлены в таблице 2.

Данные таблицы 2 указывают на наиболее вероятные пороговые оценки концентрации изучаемых антигенов (^Ту), которые достаточны для индукции необходимого уровня антител. При этом, ориентируясь на более осторожный прогноз, наиболее надежными показателями, очевидно, следует считать верхние границы установленных доверительных интервалов. А именно, значения 7,76; 9,75 и 8,27 соответственно антигенам подтипа Н5, Н7 и Н9. В биологическом смысле это означает, что в составе вакцинных препаратов содержание исследуемых антигенов должно превышать указанные пороговые величины.

Таблица 2

Наименьшие концентрации (1§Ту) изучаемых антигенов, которые позволяют достичь титра сывороточных антител соответствующего __величине 1оа2Т5ег=4._

Антигены ВГП Значения lgTv полученные по регрессионным уравнениям Границы соответствующих доверительных интервалов (р?0,05)

H5N2 (26,7+4)/4,2525 = 7,22 6,68- -7,76

H7N2 (40,21+4)/4,7429 = 9,32 8,89- -9,75

H9N2 (31,752+4)74,6511 = 7,69 7,11 - -8,27

Комиссионные испытания антигенной и протективной активности опытных образцов моно- и полиштаммных инактивированных эмульсионных вакцин против ГП

Оценка иммуногенности инактивированной эмульсионной вакцины против вируса гриппа птиц типа А подтипа H5N2 в остром опыте. В

наших исследованиях, проведённых раннее, было установлено, что опытный образец инактивированной эмульсионной вакцины, изготовленный из вируса ГП подтипа H5N2, обладает высокой антигенной активностью. Так, на 21

сутки после вакцинации средний геометрический титр превысил протективный уровень (4 и достиг значения 5,6 1о§2. Однако

количественные показатели уровня гуморальных антител не обеспечивают полной характеристики напряженности иммунитета. Поэтому нами решалась задача определить протективную эффективность инактивированной вакцины, изготовленной из вируса ГП подтипа Н5Ш с использованием контрольного заражения вирулентным штаммом вируса ГП подтипа Н5Ш.

В опыте использовали инактивированную эмульсионную вакцину, изготовленную из вируса ГП штамм «А/утка/Приморский/01» (Н5И2). Двадцать цыплят кросса "Хай-Лайн 98" 45-50 суточного возраста, свободных от антител к вирусу гриппа птиц, разделили на опытную и контрольную группы, по 10 голов в каждой. Цыплят обеих групп содержали совместно напольно в одном боксе. Цыплят опытной группы вакцинировали однократно в объёме 0,5 см3. Вакцину вводили внутримышечно в область груди.

Через 28 суток после вакцинации цыплят контрольной группы разделили на две подгруппы, по 5 голов в каждой. Первая подгруппа служила контролем вируса, вторая - контактная птица.

Цыплят первой контрольной подгруппы внутримышечно инфицировали вирусом гриппа птиц типа А Н5Ш (штамм «А/Курган/1/05») с инфекционным титром 8,5 ^ ЛД50/см3 и гемагглютинирующей активностью 5 1о§2) в дозе 100 ЛД5о, который вводили в объёме 1,0 см3.

Все группы подопытных цыплят в тот же день объединяли, и содержали совместно в одном боксе на несменяемой подстилке. За птицей проводили ежедневное наблюдение дважды в сутки, фиксируя отклонения от физиологической нормы. Наблюдение проводили в течение 11 суток.

Протективную эффективность вакцины вычисляли по формуле 4.

Результаты опыта по определению протективной эффективности опытного образца инактивированной эмульсионной вакцины против гриппа птиц, изготовленной на основе вируса с антигенной формулой Н5Ш, представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Клиническое состояние цыплят после проведения контрольного

заражения вирусом гриппа птиц А штамм "А/Курган/1/05" (Н5М)

Группы цыплят Ср. титр в РТГА ■о& Дни наблюдения

1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 11

Вакцинированная 6,7 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0

Контрольная н/о 5/0 5/2 5/3

Контактная н/о 5/0 5/0 5/1 5/2 5/2

Примечание: н/о - не обнаружено; числитель - количество голов в группе; знаменатель - число заболевших или павших голов с видимыми клиническими признаками.

Из данных таблицы 3 следует, что все неиммунные цыплята, зараженные вирулентным штаммом «А/Курган/1/05» заболели и погибли на 2-3 сутки. Контактировавшие с ними (невакцинированные) цыплята также заразились, вероятно, алиментарным путем и погибли на 3-5 сутки с проявлением клинических и патологоанатомических признаков, характерных для ГП.

Все цыплята, иммунизированные инактивированной эмульсионной вакциной из вируса гриппа H5N2, оставались живыми и клинически здоровыми в течение периода наблюдения. Расчетная эффективность вакцинации составила 100%.

Антигенная активность полиштаммных инактивированных вакцин против ГП на основе штаммов «А/утка/Приморский/01», «А/цыпленок/Узбекский/68» и «А/индюк/Висконсин/66». В опыте исследовали полиштаммные инактивированные эмульсионные образцы вакцин, изготовленные из штаммов вируса ГП подтипов H5N2, H7N2 и H9N2, в различных сочетаниях. В качестве дисперсионной среды использовали масляный адъювант Montanide ISA 70 VG, который смешивали в соотношении 30:70 по весу.

Образцы вакцин маркировали в следующем порядке:

№1 - эмульсионная вакцина из штаммов. H5N2 +H7N2+H9N2;

№2 - эмульсионная вакцина из штаммов. H5N2 +H7N2;

№3 - эмульсионная вакцина из штаммов. H5N2+H9N2;

№4 - эмульсионная вакцина из штаммов. H7N2+H9N2.

В опыте использовали 180 цыплят яичных пород 40-50 суточного возраста, свободных от антител к вирусу ГП. Вся птица содержалась напольно в 3 изолированных боксах по 60 голов. Далее цыплят в каждом боксе разделили на 5 групп по 10 голов в каждой и вакцинировали однократно внутримышечно в область груди в объеме 0,5 см3 экспериментальными вакцинами №1, №2, №3 и №4, группа №5 была контактная, группа № 6- контроль вируса (была использована в опыте по определению иммуногенности образцов вакцин).

Антигенную активность вакцин оценивали по накоплению антител к вирусу ГП у привитых и контрольных цыплят на 28 сутки после иммунизации. Сыворотку крови исследовали в РТГА индивидуально с каждым антигеном, гомологичным вакцинному.

Результаты представлены в таблице 4 и выражены в log2 среднего геометрического титра антител по группе.

Данные таблицы 4 свидетельствуют об активной стимуляции иммунного ответа у цыплят всеми антигенными сочетаниями штаммов. Уровни антител при этом были не менее чем в 1,5 раза выше протективных. Цыплята контрольной группы оставались серонегативными к вирусу ГП.

Таблица №4.

Антигенная активность экспериментальных образцов полиштаммных

вакцин

(п=3)

№ гр. Вакцина Колич. голов Средний геометрический титр в РТГА 1оцг на 28 сут после вакцинации

Н5 Н7 Н9

1 Н5+Н7+Н9 10 6,8±0,1 7,0±0,1 6,8±0Д

2 Н5+Н7 10 7,0±0,2 7,2±0,1 н/о

3 Н5+Н9 10 7,0±0,1 н/о 7,0±0,2

4 Н7+Н9 10 н/о 7,2±0,2 7,0±0,1

5 Контактная 10 н/о н/о н/о

6 Контроль вируса 10 н/и н/и н/и

Примечание: н/о - не обнаружено; н/и - в опыте не использовали.

Иммуногеппость полиштаммных ипактивированиых вакцин против ГП. Данные предыдущего опыта показали, что образцы вакцин через 28 суток после введения цыплятам обеспечивали выработку антител в достаточно высоких титрах, которые, по мнению многих авторов, являются основным фактором иммунитета при гриппе птиц. Для подтверждения этого проводили контрольное заражение подопытных цыплят высоковирулентными вирусами - «пробойниками».

Контрольным цыплятам (группа №6) содержащихся в боксе №1, внутримышечно в объеме 1,0 см3 вводили высоковирулентный штамм вируса гриппа «А/Курган/1/05» (Н5Ш) с инфекционным титром 8,5 ^ ЭЛД50/см3 и гемагглютинирующей активностью 5 1оц2. Контрольных цыплят, содержащихся в боксе №2, аналогичным способом заражали штаммом «А/цыпленок/Росток/29» (Н71Ч1) с инфекционным титром активности 7,5 ^ ЭЛД50/см3 и гемагглютинирующей активностью 7 1од2. Контрольная группа цыплят в боксе №3 была заражена штаммом «А/индюк/Висконсин/66» (Н9И2), имеющим инфекционный титр 8,5 ЭЛД50/см3 и

гемагглютинирующей активностью 7 1о§2.

Наблюдение за подопытной птицей вели ежедневно в течение 11 суток и по полученным результатам рассчитывали протективную эффективность вакцин (формуле 4).

Результаты опыта по определению протективной эффективности полиштаммных вакцин против ГП представлены в таблице 5.

Приведенные в таблице 5 данные наглядно демонстрируют, что во всех боксах экспериментально зараженные цыплята заболели и погибли с проявлением клинических и патологоанатомических признаков, характерных для ГП, на 3-5 сутки. Все неиммунные цыплята (гр. № 5) также заражались контактным или алиментарным путем и погибали на 3-6 сутки.

Результаты проведения контрольного заражения штаммами вируса ГП типаД "А/Ку "А/цыпленок/Росток/29" и "АЛшдюк/Внсконсюьбб".

Ко бокса № 1р. Эксгериме шальная эмульсионная вакцина Кяляя- голов Контрольное заражение ЗЪ 28 ш,- после вакцинации Клиническое состояние цыплят на протяз наблюдении

1 2 3 4 5 б 7

1 1 Н5ГО+Н7ГО+Н9 N2 10 Н5ГО. 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0

2 гага+тга 10 10/0 10/0 10/0 ЮЛ) 10/0 ЮЛ) ЮЛ)

3 Н5№+Н9ТО 10 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0

4 Н7№+Н9ГЧ2 10 10/0 10/0 10/0 10/0 10/4 10/4 10/2

5 Контактная птица 10 10/0 10/0 10/0 10/4 10/5 10/1

6 Контроль вируса 10 10/0 10/0 10/3 10/6 юя 1

2 1 Н5т+Н7№+Н9№ 10 Н71Ч1 10/0 10/0 10/0 юл» 10/0 10/0 ЮЛ)

2 Н5ГО+Н7№ 10 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0

3 ШШ+НЭГО 10 10/0 10/0 10/0 10/0 10/3 10/3 10/2

4 10 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 ЮЛ) ЮЛ)

5 Контактная птица 10 10/0 10/0 10/0 10/2 10/4 10/2 10/2

б Контроль вируса 10 10/0 10/0 10/2 10/7 10/1

3 1 Н5ГО+Н7ГО+Н9 N2 10 №N2 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 ЮЛ) 10/0

2 ШГО+тГС 10 10/0 10/0 10/0 10/0 юя 10/2 10/0

3 Н5ГО+Н9т 10 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 ЮЛ) 10/0

4 Шга+ЮГО 10 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0

Контактная птица 10 10/0 10/0 10/0 10/О 10/2 10/2 10/3

6 Контроль вируса 10 10/0 10/0 ЮЯ 10/5 10/2 10/2

Примените: Числитель- количество голов в группе; Знаменатель - число заболевших или павших цыплят.

Все привитые цыплята были защищены от высокопатогенных штаммов вируса ГП гомологичных по гемагглютинину, на протяжении всего срока наблюдения. При осмотре внутренних органов иммунизированных цыплят после контрольного заражения видимых патологоанатомических изменений выявлено не было.

Результаты опыта позволяют заключить, что цыплята, иммунизированные экспериментальными вакцинами, были защищены против заражения вирулентными штаммами вируса ГП с гетерологичной нейраминидазой. При этом эффективность вакцинаций во всех случаях составляла 100%.

Полученные данные свидетельствуют о возможности применения вакцин с отработанным нами компонентным составом для формирования противогриппозного иммунитета у птиц на 24-28 сутки после однократного введения в дозе 0,5 см3 в зависимости от эпизоотической ситуации.

Продолжительность иммунитета у птиц, привитых экспериментальными вакцинами против ГП.

Целью данной серии опытов было сравнение динамики и продолжительности поствакцинального иммунитета, индуцируемого пятью опытно-промышленными вариантами вакцин, а также подтверждение обоснованности расчетной концентрации антигенов в прививной дозе препаратов.

Компоновку вакцин осуществляли согласно установленным нами технологическим критериям. Каждый вариант вакцин вводили цыплятам 25-30 суточного возраста внутримышечно в область груди в объеме 0,5 см3.

Для оценки кинетики антителобразования и определения продолжительности иммунитета у подопытных цыплят отбирали пробы крови и получали сыворотку до вакцинации и через 14, 28, 60, 90, 120, 150, 180, 210 и 240 суток после нее. Уровень специфических антител к вирусу ГП определяли в РТГА с антигенами гомологичным вакцинным.

Результаты опытов представлены на рисунках 3 и 4.

Графики, представленные на рисунках наглядно демонстрируют, что все образцы испытуемых полиштаммных вакцин обладали достаточно высокой антигенной активностью. Специфические антитела в титрах от 2,8 до 4,4 log2 обнаруживались через две недели после введения вакцин. К 28-ым суткам все испытуемые образцы вакцин индуцировали образование антител в титрах от 6,8 до 7,0 log2, что значительно превышало протективный уровень (4,0 log2). Максимальных значений (7,6 - 7,8 log2) уровень антител достигал через 60 суток после вакцинации. На протяжении всего периода наблюдения (240 суток) уровень антител не снижался ниже протективного и сохранялся в пределах 5,4-6,2 log2.

□ подтип Н5 В подтип Н7

□ подтип Н9

60 90 120 150 180 210 240 сроки после вакцинации, сутки

Рис. 3 Динамика антителообразования и продолжительность иммунитета у цыплят, привитых полиштаммной вакциной против ГП из антигенных вариантов вируса Н5Ш, Н7ГО и ГОШ

—подтип Н5

—И— подтип Н7

протективньй тигр

срок после вакцинации, сутки

Рис. 4 Динамика антителообразования и продолжительность иммунитета у цыплят, привитых полиштаммной вакциной против ГП из антигенных вариантов вируса H5N2 и H7N2

Таким образом, все исследованные вакцины, вводимые в объеме 0,5cmj, через 14-28 суток после введения обеспечивали формирование антител в титрах более чем в 1,5 раза превышающих минимальный протективный уровень. Продолжительность индуцируемого ими поствакцинального иммунитета обеспечивала защиту привитого поголовья от высоковирулентных вариантов вируса гриппа птиц в течение срока эксплуатации.

3. ВЫВОДЫ

1. Подобраны штаммы вируса гриппа птиц, предназначенные для изготовления моно- и полиштаммных инактивированных эмульсионных вакцин. Определена их оптимальная заражающая доза для куриных эмбрионов, равная 100 ЭИД5о/о,2см3. Установлены параметры культивирования, обеспечивающие максимальный выход вируссодержащей

жидкости с инфекционной активностью, обеспечивающей изготовление высокоэффективных вакцин: срок инкубации зараженных 11-12-ти суточных эмбрионов кур-48 час. при температуре 37,5±0,5 °С.

2. Определены и обоснованы минимальные значения инфекционных титров штаммов ВГП «А/утка/Приморский/01», «А/цыпленок/Узбекский/68» и «А/индюк/Висконсин/66» при производстве полиштаммных инактивированных вакцин против ГП, которые составляют 7,76 lg ЭИД50/СМ3, 9,75 lg ЭИД50/СМ3 и 8,27 lg ЭИД50/СМ3 соответственно, а также оптимальные гемагглютинирующие титры антигенов, которые должны быть не ниже 6,0 Iogz для подтипа H7N2 и 5,0 log2- для подтипов H5N2 и H9N2.

3. Отработан метод изготовления инактивированных эмульсионных вакцин против ГП из штаммов «А/утка/Приморский/01» (H5N2), «А/цыпленок/Узбекский/68» (H7N2) и «А/индюк/Висконсин/66» (H9N2) на основе масляного адъюванта Montanide ISA 70 VG в соотношении 30:70 с последующим эмульгированием в течение 5 мин при скорости вращения ротора 7000 об/мин. и температуре 10-12°С.

4. При сравнительных испытаниях масляных адьювантов Montanide ISA 70 VG, экспериментального адъюванта с сорбитаноолеатом, Marcol-52 и Адьювант 409 в составе моно вакцин из штамма H5N2 показано, что биопрепарат на основе Montanide ISA 70 VG превосходил другие вакцины по стабильности и безвредности.

5. Экспериментально установлена константа термоденатурации антигена ВГП для верхних пороговых температур хранения эмульсионных вакцин (8°С), позволяющая определить срок годности не менее 18 мес.

6. Экспериментальные моно- и полиштаммные инактивированные эмульсионные вакцины через 14-28 суток после введения индуцировали выработку у птиц антител в титрах, более чем в полтора раза превышающих минимальный защитный уровень и, обеспечивающих напряженный иммунитет, продолжительностью не менее 240 суток.

7. Опытные образцы моно- и полиштаммных инактивированных эмульсионных вакцин обеспечивали 100% защиту привитых цыплят при совместном содержании их с птицами, зараженными вирусами гриппа гомологичных подтипов (штаммы: «А/Курган/1/05»(Н5Ш), «А/цыпленок/Росток/29» (H7N1) и «А/индюк/Висконсин/66» (H9N2)).

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты научных исследований по определению основных технологических параметров при конструировании инактивированных эмульсионных вакцин для профилактики ГП и изучению их иммунобиологических свойств были использованы при составлении следующих документов:

1. Проектов нормативной документации по изготовлению и контролю

опытных образцов ннактивнрованных эмульсионных вакцин против ГП из штаммов подтипов Н5, Н7 и Н9, по которым будут изготовлены и представлены для регистрации препараты в РФ в установленном порядке. (Проект инструкции по применению, проект СТО 70952707-0052-2009);

2. Во Всероссийской государственной коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве при ФГУ «ВГНКИ» депонирован штамм «Приморский подтипа H5N2 №-129 ДЕП» вируса гриппа птиц типа А, который рекомендован в качестве производственного при изготовлении инактивированных вакцин для профилактики ГП;

3. Методических рекомендаций по поддержанию и хранению посевных и рабочих расплодок производственных штаммов вируса ГП типа А подтипов Н1-Н16, утвержденных генеральным директором ОАО «Покровский завод биопрепаратов» в 2009 г.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Производство и полевые испытания инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц (H5N1) / Д.С Сурнев, В.П. Мельников, A.B. Борисов, Д.А. Лозовой // РВЖ. Сельскохозяйственные животные. - 2007. -№2. С. 6-7.

2. Изучение культуральных свойств двух штаммов вируса гриппа птиц типа А подтипа H5N2 / A.B. Борисов, Д.С. Сурнев, В.П. Мельников [и др.] // РВЖ. Сельскохозяйственные животные. - 2008. -№1. С. 37-39.

3. Изучение антигенной активности инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц H5N2 / A.B. Борисов, Д.С. Сурнев, В.П. Мельников [и др.] // РВЖ. Сельскохозяйственные животные. -2008. -№2. С. 46-48.

4. Эффективность инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц (H5N2) / A.B. Борисов, Д.С. Сурнев, В.П. Мельников [и др.] // Ветеринария. - 2008,- №6. - С. 14-17.

5. Разработка и лабораторные испытания инактивированной эмульгированной вакцины против гриппа птиц (H7N1) / A.B. Борисов, Д.С. Сурнев, В.П. Мельников [и др.] // Материалы Всероссийской научной конференции посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология». - Киров, 2008. -С. 50-53.

Отпечатано на полиграфической базе ОАО «Покровский завод биопрепаратов».

Тираж 100 экз., 2009 г.

Оглавление диссертации Борисов, Алексей Васильевич :: 2009 :: Москва

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Распространение гриппа птиц в мире

1.2 Характеристика вируса гриппа птиц

1.2.1 Классификация вируса ГП

1.2.2 Молекулярная структура генома и организация основных белков при репликации вирусов

1.2.3 Химический состав и устойчивость к действию физико-химических факторов

1.3 Источники и пути передачи вируса гриппа птиц

1.4 Клинические признаки и патологоанатомические изменения при гриппе птиц

1.5 Лабораторная диагностика гриппа птиц

1.6 Специфическая профилактика гриппа птиц

1.7 Основные принципы конструирования и контроля эмульсионных противогриппозных вакцин

1.7.1 Культивирование вируса гриппа птиц

1.7.2 Инактивация вируса и принципы действия инактивантов

1.7.3 Очистка и концентрирование вируссодержащего сырья

1.7.4 Применение адъювантов в производстве инактивированных вакцин Механизм действия масляных адъювантов

1.7.5 Подбор адыованта и физические свойства вакцин на основе масляных адъювантов

1.8 Механизм иммунного ответа у птиц и местные тканевые реакции при использовании эмульсионных вакцин

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Борисов, Алексей Васильевич, автореферат

Актуальность темы: В условиях современного интенсивного промышленного птицеводства возрастает угроза появления особоопасных инфекционных заболеваний, которые приводят к значительным экономическим потерям в результате гибели поголовья, снижения продуктивности, недополучения молодняка, и затрат на проведение противоэпизоотических мероприятий [36, 52, 74, 81].

Анализ эпизоотической ситуации свидетельствует о реальной угрозе широкого распространения гриппа птиц (ГП) на территориях разных государств. По информации Международного Эпизоотического Бюро (МЭБ) и других организаций, данное заболевание регистрируют во многих странах мира, включая Российскую Федерацию. Поэтому предотвращение распространения возбудителя этой опасной болезни на территории нашей страны является одной из приоритетных задач [4, 6, 13, 40].

Распространение в течение последних лет во многих странах мира высокопатогенного вируса гриппа птиц (ВПВГП) 115141 азиатской линии, высокопатогенного вируса гриппа НТЫЗ (Канада), а также низкопатогенных вирусов подтипов Н5 (США, Португалия) и Н7 (США, Италия, Англия, Пакистан) требует не только укрепления системы раннего обнаружения возбудителя среди домашней и дикой птицы, но и проведение комплексной вакцинопрофилактики поголовья [24, 82].

В настоящее время единственный способ контроля и предотвращения распространения гриппа птиц на территории РФ — это строгое выполнение ветеринарно-санитарных мероприятий на территории птицеводческих хозяйств закрытого типа, целевая вакцинация домашней птицы в зонах риска и тотальное уничтожение восприимчивого поголовья птицы в местах вспышки.

Данный тип вакцины, как правило, готовят на основе эпизоотических штаммов, выделенных в момент вспышки. При этом сохраняется потенциальная эпизоотическая опасность в случае не полной инактивации вируса. Использование низкопатогенных штаммов вируса ГП может устранить эту проблему. Кроме того, использование гетерологичных штаммов позволяет проводить мониторинг распространения болезни. На использовании гетерологичной вакцины для профилактики ГП основана «DIVA» стратегия (Differentiating Infected from Vaccinated Animals — Дифференциация инфицированных животных от вакцинированных животных), которая была разработана и применялась в Италии.

В настоящее время ряд компаний предпочитают изготавливать вакцины из гетерологичных подтипов возбудителя ГП. Так, фирма «Merial» представляет инактивированную эмульсионную вакцину Gallimune Flu подтипа H5N9. В Китае фирма Weike Biotechnology успешно выпускает инактивированные эмульсионные вакцины различных подтипов Н5 и Н9. Компания «Intervet» представляет широкий спектр моновалентных вакцин подтипов H5N2, H7N7 и H9N2 которые прошли успешную апробацию в Юго-Восточной Азии [24].

В связи с этим проблема разработки вакцин из гетерологичньтх подтипов ВГП, подбор и изучение соответствующих штаммов как производственных в нашей стране чрезвычайно актуальна. Решение этих вопросов позволит выполнить ряд рекомендаций описанных в "Руководстве по диагностическим тестам и вакцинам МЭБ" (Глава 2.1.14).

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

• оценить возможность использования различных штаммов подтипов Н5, Н7 и Н9 для наработки вирусного сырья;

• испытать различные масляные адъюванты для конструирования вакцин против гриппа птиц из гетерологичньтх штаммов;

• определить продолжительность иммунитета у птиц, привитых экспериментальными вакцинами;

Научная новизна. Научная новизна работы состоит в том, что в результате проведенных исследований:

• СТО на полинггаммную инактивированную эмульсионную вакцину против ГП из штаммов подтипов Н5, Н7 и Н9 (СТО 70952707-0052-2009);

• Инструкция по применению полипггаммной инакгивированной эмульсионной вакцины против ГП из штаммов подтипов Н5, Н7 и Н9;

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

• биологические свойства исследуемых штаммов вируса гриппа птиц;

Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях «Новое в диагностике и профилактике болезней птиц» (Санкт — Петербург, 2008) ВНИВИП, «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (Киров, 2008) 48 Центральный НИИ Минобороны РФ.

Личный вклад соискателя. Представленные в диссертации экспериментальные исследования и анализ полученных результатов выполнены автором самостоятельно. В ходе работы практическую и консультативную помощь оказывали сотрудники ФГУ «ВГНКИ» и ОАО «Покровский завод биопрепаратов» кандидаты ветеринарных наукЮ.В. Зуев, Т.В. Руденко, Д.А. Лозовой, Д.С. Сурнев, В.В. Ельников, Г.В. Батченко, за что автор выражает им искреннюю благодарность за оказанную помощь.

Заключение диссертационного исследования на тему "Конструирование и иммунобиологические свойства экспериментальных вакцин против гриппа птиц"

4. ВЫВОДЫ

1. Подобраны штаммы вируса гриппа птиц, предназначенные для изготовления моно- и полипггаммных инактивированных эмульсионных вакцин. Определена их оптимальная заражающая доза для куриных эмбрионов, равная 100 ЭИД5о/о,2см3. Установлены параметры культивирования, обеспечивающие максимальный выход вируссодержащей жидкости с инфекционной активностью, обеспечивающей изготовление высокоэффективных вакцин: срок инкубации зараженных 11-12-ти суточных эмбрионов кур-48 час. при температуре 37,5±0,5 °С.

2. Определены и обоснованы минимальные значения инфекционных титров штаммов ВГП «А/утка/Приморский/01», «А/цыпленок/Узбекский/68» и «А/индюк/Висконсин/66» при производстве полиштаммных инактивированных вакцин против ГП, которые составляют 7,76 Ig ЭИДзо/см3, 9,75 Ig ЭИДзо/см3 и 8,27 о lg ЭИД50/см соответственно, а также оптимальные гемагглютинирующие титры антигенов, которые должны быть не ниже 6,0 log2 для подтипа H7N2 и 5,0 log2 - для подтипов H5N2 и H9N2.

4. При сравнительных испытаниях масляных адъювантов Montanide ISA 70 VG, экспериментального адъюванта с сорбитаноолеатом, Mareol-52 и Адыовант 409 в составе моно вакцин из штамма H5N2 показано, что биопрепарат на основе Montanide ISA 70 VG превосходил другие вакцины по стабильности и безвредности.

А/цыпленок/Росток/29» (H7N1) и «А/индюк/Висконсин/66» (H9N2)).

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Проектов нормативной документации по изготовлению и контролю опытных образцов инактивированных эмульсионных вакцин против ГП из штаммов подтипов Н5, Н7 и Н9, по которым будут изготовлены и представлены для регистрации препараты в РФ в установленном порядке. (Проект инструкции по применению, проект СТО 70952707-0052-2009);

3. Методических рекомендаций по поддержанию и хранению посевных и рабочих расплодок производственных штаммов вируса ГП типа А подтипов HIHI 6, утвержденных генеральным директором ОАО «Покровский завод биопрепаратов» в 2009 г.

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2009 года, Борисов, Алексей Васильевич

1. Абрамзон, A.A. Поверхностно активные вещества: - Свойства и применение / A.A. Абрамзон. -Л.: Химия, 1981. - 304 с.

2. Адъювант: / С.А. Дудников, А.Ф. Бондаренко, А.И. Дудников, В.П. Онуфриев а.с.961186 СССР: МПК7 А61К39/00.

3. Ашмарин, И.П. Статистические методы в микробиологических исследованиях / И.П. Ашмарин, А.А.Воробьев. -Л.: Медицина, 1962. 179 с.

4. Бектимиров, Т.А. Птичий грипп и возможная пандемия / Т.А. Бектимиров // Биопрепараты. 2005. - №17. -С. 14- 16.

5. Белезин, С.П. Эмульсии и пены / С.П. Белезин, Г.С Парфёнов // Основы физической и коллоидной химии. М., 1959. - С. 67.

6. Беляев, АЛ. Грипп птиц — глобальная проблема / A.JI. Беляев, А.Н. Слепушкин // РЭТ-инфо. 2004. - № 3 (51). - С. 39 - 43.

7. Берулава, С.И. Очистка вируса ящура при помощи аскангеля / С.И. Берулава // Вопр. вет. вирусологии.-М., 1964.-Т. 1. С. 203-208.

8. Биотехнология клеток животных: В 2-х т.: пер. с англ. / ред. Г.А. Сафонов,-М.: Агропромиздат, 1989.

9. Болезни домашних и сельскохозяйственных птиц: пер. с англ. / под ред. Б. У. Кэлнека, X. Д. Барнса. М.: Аквариум Бук, 2003. - С. 672 — 693.

10. Болотников, И.А. Практическая иммунология сельскохозяйственной птицы / И.А. Болотников, Ю.В. Конопатов. СПб.: Наука, 1993. - 204 с.

11. Борисов, В.В. Особенности применения инактивированных вакцин в птицеводстве / В.В. Борисов, A.B. Борисов, С.К. Старов // БИО. 2007. - №2. - С. 37-41.

12. Вебстер, Р. Антигенные вариации / Р. Вебстер, В. Лейвер, Г. Эйр // Генетика вирусов гриппа. М., 1986. - С.123-160.

13. Виноходов, В.О. Грипп птиц. Его потенциальная опасность. Возможность профилактики и ликвидации болезни / В.О. Виноходов // Ветеринария.- 2006. №2. -С. 4-16.

14. Вирусные болезни животных / В. Н. Сюрин, А. Я. Самуйленко, Б. В. Соловьёв, Н. В. Фомина. М.: ВНИИТиБП, 1998. - С. 324-336.

15. Вирусология: В 3-х т.: пер. с англ. / под ред. Б. Филдса, Д. Найпа.-М.: Мир,1989. -Т. 1.-С.96.

16. Влияние концентрации балластных белков в водной фазе инактивированной вакцины на стабильность эмульсии / Д.Л. Долгов, Д.А. Лозовой, В.В. Борисов // Тр. Федерального центра охраны здоровья животных. Владимир, 2005. - Т. 3. - С. 303308.

17. Воробьев, A.A. Адьюванты / A.A. Воробьев, H.H. Васильев М.: Агропромиздат, 1969. —206 с.

18. Воробьёв, A.A. Проблема адъювантов в вакцинно сывороточном деле / A.A. Воробьёв // Тез. докл. - М., 1975.-С.19-22.

19. Воробьева, М.М. Получение очищенного лапинизированного вируса ящура / М.М. Воробьева, Н.М. Блинова //Тр. ВГНКИ.- 1964. -Т. 12.-С. 336-340.

20. Высокопатогенный вирус гриппа птиц, вызывающий гриппозную пневмонию у человека / В.В. Макаров, A.A. Воробьев, В.М. Бондаренко, Б.В. Боев // Микробиология. 2005. - № 3. - С. 105- 109.

21. Гендон, Ю.З. Молекулярные основы изменчивости эпидемических штаммов вируса гриппа человека / Ю.З. Гендон // Молекул, генетика, микробиология, и вирусология. — 1985.- №8. С.3-12.

22. Дерягин, Б.В .Поверхностные силы / Б.В. Дерягин, Н.В. Чураев, В.Н. Мулл ер. -М.: Наука, 1985.-С. 34.

23. Дудников, А.И. Перспективы использования адьювантов в противоящурных вакцинах / А.И. Дудников // Материалы семинара, спец. стран-членов СЭВ "Разработка и использование новых адьювантов для биотехнологических целей". -Владимир, 1990. С. 3-6.

24. Закс, JI. Статистическое оценивание / JI. Закс // Статистика. -М., 1976. С. 598.

25. Захарченко, В.Н. Коллоидная химия / В.Н. Захарченко. -М.: Высшая школа, 1989.-238 с.

26. Изменения в антигенной композиции гемагглюгинина вирусов гриппа А (H1N1) в 1977-1982гг, выявленные с помощью моноклональных антител / ЯЛ. Закстельская, В.А. Исаченко, Т.А. Оскерко, С.Ф. Шендерович //Вопр. вирусологии.- 1934.-Т.29, №.1.- С. 62-66.

27. Изменчивость вирусов гриппа А и ее значение в эпидемическом процессе / Л.Я. Закстельская, М.А. Яхно, В.А. Исаченко, И.В. Антонов // Актуал. Вопр. общей и медицинской вирусологии.- М., 1986.- С. 104 -115.

28. Изучение дисперсных свойств вакцины с обратным типом эмульсии разными методами / Д.А. Лозовой, В.В. Борисов, Д.Л. Долгов, A.A. Егоров // Актуал. пробл. и перспект. разв. агропром. комплекса: Матер, конф. Иваново, 2005. - Т.2. - С.121-122.

29. Ирза, В.Н. Эпизоотическая ситуация в мире и РФ по гриппу птиц H5N1 и меры борьбы с ним / В.Н. Ирза // Грипп птиц: проблемы и пути их решения: материалы науч. сессии СЗНМЦ Россельхозакадемии и ВНИВИП 29-30 мая 2006, С-Пб, 2006. С.18.-22.

30. Исаева, Е.С. Гликопротеиды ортомиксовирусов / Е.С. Исаева, З.К. Чувакова, В.Э. Березин. Алма-Ата: Наука, 1988.- 168 с.

31. Каверин, Н. В. Межвидовая трансмиссия вирусов гриппа А и проблема пандемий / Н. В. Каверин, Ю. А. Смирнов // Вопр. вирусологии. 2003. -ЖЗ.-С.4

32. Каргилл, П.В. Проблема организации программ вакцинации в промышленном птицеводстве / П.В. Каргилл // БИО. 2004. - № 1. - С. 6-8.

33. Контроль физических свойств инактивированных эмульсионных вакцин против вирусных болезней птиц / Д.А. Лозовой, В.В. Борисов, Д.Л. Долгов и др. // Сб. науч. тр. ВГНКИ. М., 2005. - Т. 66. - С. 99- 106.

34. Косяков, П.Н. Антигены гемагглютинина вирусов гриппа, выделенных от человека и птиц / П.Н. Косяков, B.C. Панкратов, З.И. Ровнова // Вопр. вирусологии.- 1979.- №3.- С.242-246.

35. Критерии оценки качества масляных адьювантов и подбор их компонентов /В. Ю. Савельев, Н. С. Мамков, В. Г. Беденко и др. //Актуал. вопр. вет. вирусологии.: тез. докл. науч.-теорет. конф. молодых учёных, ноябрь 1990 г. -Владимир, 1990. С. 80-81.

36. Липатов, A.C. Эволюция вирусов гриппа птиц H5N1 с 1997 по 2004 г. в Южной и Юго-Восточной Азии / A.C. Липатов, Ю.А. Смирнов, Н.В. Каверин, Р.Г. Вебстер // Вопр. вирусологии. 2005. - Т. 50, № 4. - С. 11 - 17.

37. Лихолетов, С.М. Современные аспекты разработки вакцин, адьювантов и иммуномодуляторов / С.М. Лихолетов // Успехи современной биологии. 1988. - Т. 105, вып. 1. - С. 83-99.

38. Лозовой, Д. А. Усовершенствование технологи изготовления инакгивированной эмульгированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76: автореф. дис. канд. вет. наук / Лозовой Дмитрий Анатольевич. -Владимир, 2001. 26 с.

39. Малахов, А.Г. Некоторые физико-химические методы очистки и концентрирования вируса ящура / А.Г. Малахов // Материалы Всесоюз. конф. по биохимии с.-х. животных. М., 1961. - Вып.1. - С. 65-66.

40. Мамков, Н.С Масляные адъюванты дня противоящурных вакцин: дис. д-ра.вет. наук. Владимир, 1999.-225с.

41. Мамков, Н.С Оценка реактогенноети компонентов эмульсионных вакцин на белых мышах / Н.С Мамков, В.Ю. Савельев, А.И. Дудников // Актуал. пробл. вет. вирусологии.: тез. докл. науч. конф., посвящен. 30- летшо ВНИЯИ. Владимир, 1988.-Ч. 2.-С. 31-33.

42. Межпопуляционные взаимодействия в системе вирусы гриппа А животные — человек / Д.К. Львов, С.С. Ямникова, А.Д. Забережный, Т.В. Гребенникова // Вопр. вирусологии. - 2005. - Т. 50, № 4. - С. 4 - 11.

43. Методика изготовления вакцины из лапинизированного вируса ящура типа О / Г.А. Козловский, И.И. Носов, М.Ф. Шанин, А.И. Ибрагимов // Тез. докл. науч. -произв. конф. ГНКИ. М., 1972. - С. 54-55.

44. Микроэмульсии. Структура и динамика. М.: Мир, 1990. - 320 с.

45. Мисюк, Н.С. Корреляционно-регрессионный анализ / Н.С. Мисюк, A.C. Мастыкин, Г.П. Кузнецов. — М.: Медицина, 1975. С. 192.

46. Михалишина, ЗЛ. Иммуногенность и реактогенность эмульсионной вакцины против ящура типа Ol в зависимости от используемых масел для её изготовления / ЗЛ. Михалишина, А.И. Дудников // Актуал. пробл. вет. вирусологии. Владимир, 1986. - С. 79-80.

47. Млушко, В.В. Борьба с инфекционными болезнями в промышленном птицеводстве / В.В. Млушко // Ветеринария. -1982. N 5. - С. 36-37.

48. Некоторые вопросы очистки вируса в производстве лапинизированной противоящурной вакцины / Ю.В. Поляков, Е.В. Васько, Ю.В Демин и др. // Микробиол. пром-сть.: реф. сб. - 1972. - Вып. 9(93). - С. 45-46.

49. Новые методы очистки вируссодержащей суспензии при изготовлении противоящурной вакцины / Е.Е. Никитин, В.А. Сергеев, Е.В. Сорвачев и др. // Тр. ГНКИ. 1968. - Т. 15. - С. 57-60.

50. Оптимизация параметров культивирования штамма "Новосибирский" вируса гриппа птиц / C.B. Фролов, Т.Б. Манин, A.B. Борисов и др. // Тр. Федеральногоцентра охраны здоровья животных. Владимир, 2007. — Т. 5. — С. 131-137.

51. Основные параметры отечественных масляных адъювантов / В.Ю. Савельев, Н.С. Мамков, А.И. Дудников и др. // Материалы семинара спец. стран-членов СЭВ "Разработка и использование новых адъювантов для биотехнологических целей". Владимир, 1990. - С. 9-10.

52. Основы инфекционной иммунологии / В.В. Макаров, A.A. Гусев, Е.В. Гусева, О.И Сухарев. Владимир -Москва: Фолиант, 2000. С. 115-139.

53. Очистка вируса ящура глюконатом кальция с добавлением хлороформа / З.Ф. Сорокина, А.И. Дудников, Ю.Б. Морев и др. // Актуал. пробл. вет. вирусологии. -Владимир, 1977. С. 94-96.

54. Очистка инактивированного вируса синдрома снижения яйценоскости-76 от балластных белков / Д.А. Лозовой, В.В. Борисов, О.В. Воробьёва и др. // Достижения молодых учёных в вет. практику: материалы конф. молодых учёных. - Владимир, 2000. - С. 19-23.

55. Павлов, В.Г. Особенности строения олеогранулём у свиней при испытании противоящурнои эмульсионной вакцины с разными маслами / В.Г. Павлов, А.М. Рахманов, В.И. Смирнов // Актуал. пробл. вет. вирусологии,- Владимир, 1978.-С. 65-67

56. Пасынский, А.Г. Коллоидная химия / А.Г. Пасынский. М.: Высшая школа,1968. 232 с.

57. Плохинский, H.A. Биометрия / H.A. Плохинский. -М.: Изд-во МГУ, 1970. — 367 с.

58. Подбор эмульгаторов для изготовления масляных противоящурных вакцин / Н.С. Мамков, А.И. Дудников, О.Н. Цветков и др. // К новой стратегии борьбы с ящуром:. Междунар. конф. Владимир, 1991. - С. 54-55.

59. Поллард, Дж. Справочник по вычислительным методам статистики / Дж. Поллард. М.: Финансы и статистика, 1982. — С. 344.

60. Разработване на инактивиране минерално-маслено-аджувантни ваксини срещу псевдочума (нюкясълска болеет) по птиците / Г. Хаджиев, Н. Джамбазова, П. Цветков и др. // Птицевъдство. 1997. - № 6. — С. 23-27.

61. Рамон, Г. Сорок лет исследовательской работы / Г. Рамон. М.: Медгиз, 1962.- 459с.

62. Реакгогенность и адъювантные свойства масляных препаратов / P.A. Алексанян, A.A. Гусев, В. И. Шипилов и др. // Актуал. пробл. вет. вирусологии.: тез. докл. науч. конф. ВНИЯИ. Владимир, 1987. - Ч. 1. - С. 19-20.

63. Родин, Ю.В. Оценка эпизоотологической ситуации и особенности специфической профилактики при ньюкаслской болезни / Ю.В. Родин, Т.В. Руденко, В.И. Смоленский // Вестн. ветеринарии. 1998. - №2. - С.66-75.

64. Рождественский, И.К. Вакцинопрофилактика вирусных болезней / И.К. Рождественский, А.Б. Терюханов, О.Ф. Хохлачёв // Птицеводство. 1998. - № 4. -С. 34.

65. Савельев, В.Ю. Адыовантные свойства липосом / В.Ю. Савельев, Н.С. Мамков, В.И. Шоршнев // Актуал. пробл. вет. вирусологии.: тез. докл. науч. конф., посвящен. 30-летию ВНИЯИ. Владимир, 1988. - Ч. 2. - С. 25-26.

66. Сергеев, В.А. Вирусные вакцины / В.А. Сергеев. Киев: Урожай, -1993. - С. 159-183.

67. Сергеев, В.Д. Диагностика инфекционного бронхита птиц / В.Д. Сергеев // Архив вет. наук. СПб., 1999. - Т. 2 (49), ч. 1. - С. 261-285.

68. Скутарь, И.Г. Борьба с инфекциями в промышленном птицеводстве / И.Г. Скутарь. Кишинев: Штиинца, 1980. - 209 с.

69. Смоленский, В.И. Вакцинация как метод профилактики гриппа птиц / В.И. Смоленский, О.И. Хохлачев, H.A. Власов // Аграрный эксперт. — 2006. - №3. — С. 13.

70. Смоленский, В.И. Современные методы контроля противовирусных вакцин для птиц / В.И. Смоленский //100 лет Курской биофабрике и агробиологической промышленности России: тез.науч.-произв.конф. Курск, 1996. - С. 289-293.

71. Сорокина, З.Ф. Очистка вируса ящура солями кальция / З.Ф. Сорокина, В.В. Михалишин // Актуал. пробл. вет. вирусологии. Владимир, 1978. - С. 28-29.

72. Сюрин, В. Н. Диагностика вирусных болезней животных: справочник / В. Н. Сюрин, Р. В. Белоусова, Н. В. Фомина. М.: Агропромиздат, 1991. - С. 182 - 196.

73. Троицкая, И.В. Эиизоотологический надзор при синдроме снижения яйценоскости кур в промышленном птицеводстве: дис. канд. вет. наук. — Н.Новгород, 2000. 150 с.

74. Узюмов, B.JI. Ультраструктура и свойства вируса ящура / B.JI. Узюмов. -Фрунзе: Кыргызстан, 1970. - 246 с.

75. Характеристика миграций водоплавающих птиц Саратовской области на основе анализа данных кольцевания и визуальных наблюдений / Е.В. Завьялов, В.Г. Табачишин, Г.В. Шляхтин, Н.Н. Якушев // Украинский орнитол. журн. 2002. — Т. 11, вып. 2.-С. 215-250.

76. Хохлачев, О.Ф. Конструирование вакцин и разработка технологии получения и методики вакцинации против синдрома снижения яйценоскости кур: дис. . канд. вет. наук. СПб., 1993. - 192 с.

77. Шажко, Л.Ф. Сравнительная оценка иммуногенности противоящурных формолвакцин, приготовленных с гидратом окиси алюминия и фосфатом кальция / Л.Ф. Шажко, М.Г. Удалых // Ящур: матер, науч. конф. - Владимир, 1970. - С. 5657.

78. Шерман, Ф. Эмульсии / Ф. Шерман. Л.: Химия, 1972. - С. 448.

79. Экология и эволюция вирусов гриппа в России (1979-2002) / Д.К. Львов, С.С. Ямников, И.Т. Федяков и др. // Вопр. вирусологии. 2004. - №3. - С. 17-24.

80. Экспресс-тест определения стабильности масляных вакцин с эмульсией обратного типа // Д.А. Лозовой, В.В. Борисов, Д.Л. Долгов и др. // Сб. науч. тр. ВГНКИ. М, 2005. - Т.65. - С. 119-128.

81. Activation of influenza A viruses by trypsin treatment / H. Klenk, R. Rott, M. Orlich, J. Blodorn // Virology. 1975. - Vol. 68. - P. 426-439.

82. Adjuvant activity of a novel metabolisable lipid emulsion with inactivated viral vaccines / J.A. Reynolds, D.G. Harrington, C.L. Crabbs et al. // Infection and Immunity. 1980. - Vol. 28, N 3. - P. 937-943.

83. Adjuvant activity of emulsan, a secreted lipopolysaccharide from acinetobacter calcoaceticus / B. Panilaitis, A .Johri, W Blank et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. -2002. Vol. 9, N 6. - P. - 1240-1247.

84. Adjuvant activity of purified peptidoglycan of Listeria monocytogenes in mice and guinea pigs H. Saiki, K. Kamisango, Y. Tanio et al. // Infection and Immunity. 1982. -Vol. 38, N1,-P. 58-65.

85. Adjuvant effects of saponins on animal immune responses / Z.I. Rajput, S.H. Hu, C.W. Xiao, A.G. Arijo // J. Zhejiang Univ. Sci. B. 2007. - Vol. 8, N 3. - P. 153-161.

86. Alexander, D. Ecology of avian influenza in domestic birds / D. Alexander // Proc. Int. Symp. on Emergence and Control of Zoonotic Ortho- and Paramyxovirus Diseases: Merieux Foundation 2001. -P. 25-34.

87. Alexander, D.J. Orthomyxovirus infections / D. J. Alexander // Virus Infections of Birds. Amsterdam etc., 1993. - P. 287-316.

88. An outbreak of highly pathogenic avian influenza in turkeys in Great Britain in 1991 / D, J. Alexander, S. A. Lister, M. J. Johnson et al. // Vet. Rec. 1993.-Vol. 132.-P. 535-536.

89. Aprile, M.A. Aluminium compounds as adjuvants for vaccines and toxoids in man. A review / M.A. Aprile, A.C. Wardlaw // Can. J. Public Health. 1966. - V.57. - P. 343 -360.

90. Avian Influenza //OIE. Terrestrial Animal Health Code. 15th ed. -Paris, 2006.-P. 302-309.

91. Bahnemann, H.G. Inactivation of viruses in serum with binary ethylenimine / H.G. Bahnemann // J. Clin. Microbiol. 1976. - Vol.3. - P. 209-210.

92. Bahnemann, H.G. Large scale application of oil adjuvant foot and mouth disease vaccine/ H.G. Bahnemann // Europ. Commiss. Control FMD. Rio de Janeiro, Brazil, 15

93. Oct. 1985. Rome, 1986. - P. 132-135.

94. Bahnemann, H.G. Oil adjuvants vaccine against foot and mouth disease / H.G. Bahnemann, J.A. Mesquite // Bol. CPFA. 1987. - Vol. 53. - P. 25-30.

95. Bankowski, R. A. Introduction and objectives of the symposium / R. A. Bankowski // Proc. 1st Int. Symp. on Avian Influenza Animal Health Assoc. Richmond, Virginia, 2224 April. Beltsville, Maryland, 1981. - P. 7-14.

96. Barber, T.L. Inactivation of bluetongue virus with binary ethylenimine / T.L. Barber, M.M. Jochim // Ann. Med. Am. Soc.Microbiol. 1978. -Vol.3. - P. 339.

97. Beard, C.W. Influence of environmental temperatures on the serologic responses of broiler chickens to inactivated and viable Newcastle disease vaccines / C.W. Beard, B.W. Mitchell // Avian Dis. 1987. - Vol. 31, N 2. - P. 321-326.

98. Berlin, B.S. Chemical and biological properties of Arlacel A / B.S. Berlin // Ann. Allg. -1963. Vol. 21. - P. 82-90.

99. Bouloy, M. Globin mRNAs are primers for the transcription of influenza viral RNA in vitro / M. Bouloy, S.J. Plotch, R.M. Krug // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1978. №75. - P. 4886-4890.

100. Brancq, B. Nouveaux adjuvants pour vaccins huileux / B. Brancq, P. de Lafaire // Nouveaux adjuvants pour vaccins huileux. Paris: SEPPIC, 1986. - P. 7.

101. Brennan, S. O. Cleavage of proalbumin peptides by furin reveals unexpected restrictions at the P2 and Pi sites / S. O. Brennan, K. Nakayama // FEBS Lett. 1994. -Vol. 347. - P. 80-84.

102. Brugh, M. Comparison of inactivated Newcastle disease viral vaccines containing different emulsion adjuvants / M. Brugh, H.D. Stone, H.W. Lupton // Am. J. Vet. Res. -1983.-Vol. 44.-P. 72-75.

103. Brugh, M. Immunization of chickens and turkeys against avian influenza with monovalent and polyvalent oil emulsion vaccines / M. Brugh, C.W. Beard, H.D. Stone // Am. J. Vet. Res. 1979. - Vol. 40. - P. 165-169.

104. Capua, I. Avian influenza: recent developmente / I. Capua, D. Alexander // Avian

105. Pathol. 2004. Vol.33. - P. 393 -404.

106. Capua, I. Vaccination for avian influenza in Asia. / I. Capua, S. Marangon // Vaccine. -2004. Vol. 22. P. 4137 -4138.

107. Changing epidemiology and ecology of highly pathogenic avian H5N1 influenza viruses / R. G. Webster, D. J. Hulse-Post, K. M. Sturm-Ramires et al. // Avian Dis. -2007.-Vol. 51.-P. 269-272.

108. Characterization of a novel influenza hemagglutinin, HI5: criteria for determination of influenza A subtypes / C Rohm, N. A. Zhou, J. C Suss et al. // Virology. 1996. -Vol. 217.-P. 508-516.

109. Colman, P.M. The three-dimensional structure of a complex of influenza virus neuraminidase and an antibody / P. M. Colman, W. G. Laver, J. N. Varghese // Nature (London). 1987. - Vol. 326. - P. 358-363.

110. Cook, J.K.A. Egg drop syndrome 1986 (EDS-76) virus infection in inadequately vaccinated chickens / J.K.A Cook // Avian Pathol. 1983. - Vol. 12. - P. 9- 16.

111. Cook, M.E. Enhanced incidence of leg abnormalities in reovinis WVU 2937 infected chickens fed various dietary levels of selected vitamins / M.E. Cook, W.T. Springer, J .A. Herbert // Avian Dis. 1984. - Vol. 28. - P.548-561.

112. CpG oligodeoxynucleotide and montanide ISA 51 adjuvant combination enhanced the protective efficacy of a subunit malaria vaccine / S. Kumar, T. R. Jones, M. S. Oakley et al. // Infection and Immunity. 2004. - Vol. 72, N 2. - P. 949-957.

113. Culter, J.C. Use of poliomyelitis virus vaccine in light mineral oil adjuvant in a community immunization program and report of reactions encountered. / J.C. Culter, L. Lesesne, I. Vaughn // J. Allergy. 1962. - Vol. 33. - P. 193-209.

114. Dalessi, S. The 2005/2006 avian influenza monitoring of wild birds and commercial poultry in Switzerland / S. Dalessi, R. Hoop, M. Engels // Avian Dis. 2007. -Vol. 51.-P. 355-358.

115. Desmettre, P. Tolerance locale et innocuité des vaccins aviaires en adjuvant huileux /P. Desmettre, A. Chevrier // Develop. Biol. Stand. 1981. - Vol. 51. - P. 45-53.

116. Detection of influenza A viruses from different species by PCR amplification of conserved sequences in the matrix gene / R. Fouchier, T. M. Bestebroer, S. Herst et al. // J. Clinical. Microbiol. 2000. - Vol. 38. - P. 4096-4101.

117. Development of a real-time reverse transcriptase PCR assay for type A influenza virus and the avian H5 and H7 hemagglutinin subtypes / E. Spackman, D. A. Senne, T. J. Myer et al. // J. Clinical Microbiol. -2002. Vol.40, №9.-P. 3256-3260.

118. Different hemagglutinin cleavage site variants of H7N7 in an influenza outbreak in chickens in Leipzig, Germany / C. Rohm, J. Suss, V. Pohle, R. G. Webster // Virology. -1996.-Vol. 218.-P. 253-257.

119. Discovery of novel immunostimulants by dendritic-cell-based functional screening / N. Mizumoto, J. Gao, H. Matsushima et al. // Blood. 2005. - Vol. 106, N 9. - P. 3082-3089.

120. Doel, T.R. Inactivation of viruses produced in animal / T.R. Doel // Animal Cell Biotechnology. London, 1985. -Vol. 2. - P. 124-149.

121. Dresser, D.V. The effect of localized injection to adjuvant material on the draining lymphoide. 2. Circulating lymphocytes / D.V. Dresser, R.N. Taub, A.R. Krantz // Immunology. 1970. - Vol. 18. - P. 663-670.

122. Duffy, J.I. Vaccine preparation techniques / J.I. Duffy // New Jersey Park Ridge, 1980. — P.44-46.

123. Dukor, P. Immunostimulants / P. Dukor, L. Tarcsay, G. Baschang // Ann. Rep. Med. Chem. 1979. - Vol. 14. - P. 146-167.

124. Dumitrius, S. Polymeric biomaterials as enzyme anc drug carriers.5: Polymeric matrices as drug delivery systems / S. Dumitrius, M. Popa, M.L. Dumitrius // J. Bioact. Comp. Polymers. 1990. - Vol. 5. - P. 89-127.

125. Easterday, B. C Influenza / B. C Easterday, V. S. Hinshaw, D. A. Halvorson // Diseases of Poultry. Ames, Iowa 1984, - P. 583-605.

126. Eckroade, R. J. Avian influenza in Pennsylvania: the beginning / R. J. Eckroade L. A. S. Bachin // Proc. 2nd Int. Symp. on Avian Influenza. 1987.-P. 22-32.

127. Edelman, R. Summary of an International Symposium on Potentiation of the Immune Response to Vaccines / R. Edelman, M. Hardegree, C.L Carolyn // J. Infect. Dis. -I980.-Vol. 141.-P. 103-112.

128. Edelman, R. Vaccine adjuvants / R. Edelman // Rev. Infect. Dis. 1980. - Vol. 2. -P. 370-383.

129. Effect of avian reoviruses on lymphoid organ weights and antibody response in chickens / R.D. Montgomery, P. Villegas, D.L. Dawe, J. Brown // Avian Dis. 1985. — V. 29.-P. 552-560.

130. Emulsificante montanide 888 para la preparación de vacuna antiaflosa con adjuvante oleoso / D. Abaracon, LA. Mesquita, S. Sallua, R. Perez Rama // Bol. C P F A. 1982.-N45-46.-P. 51-53.

131. Evolution and ecology of influenza A viruses / R. G. Webster, W. J. Bean, O. T. Gorman et al. // Microbiol. Rev. 1992. - Vol. 56. - P. 152-179.

132. Evolution of influenza A virus nucleoprotein genes: implications for the origins of H1N1 human and classical swine viruses / O. T. Gorman, W. J. Bean, Y. Kawaoka et al. //J. Virol. 1991. - Vol. 65. - P. 3704-3714.

133. Expression and analysis of the NS2 protein of influenza A virus / A. C. Ward, L. A. Castelli, A. C. Lucantoni et al. // Arch. Virol. 1995. - Vol. 140.-P. 2067-2073.

134. Feare, C J. The role of wild birds in the spread of HPAI H5N1 / C J. Feare // Avian Dis. 2007. - Vol. 51. - P. 440-447.

135. Fellowes, O.N. Comparison of the inactivation and antigenicity of foot and mouth disease virus by combined effect of ultraviolet light and B-propiolactone / O.N. Fellowes //J. Immunol. 1965.-Vol. 95, №6.-P. 1100-1106.

136. First introduction of highly pathogenic H5N1 avian influenza A viruses in wild and domestic birds in Denmark, Northern Europe / K. Bragstad, P. H. Jorgensen, K. Handberg et al. // J. Virol. 2007. - Vol. 81. - P. 43-52.

137. Fraenkel-Conrat, H. Chemical modification of viruses / H. Fraenkel-Conrat // Comprehensive Virology. N.Y; London, 1981. -Vol. 17. - P. 245-283.

138. Freeman, M.J. Heterogenecity of the antibody response of rabbits immunized with acrylic particle bovine serum albumin complexes / M.J. Freeman // J. Immunol. - 1968.-Vol.15.-P. 481-49.

139. Freund, J. The mode of action of immunologic adjuvants / J. Freund // Adv. Tuberc. Res. 1956.-Vol. 7.-P. 130-148.

140. Frost, P. The relation of lymphocyte trapping to the mode of action of adjuvants / P. Frost, E.M. Lance // Ciba Found. Symp. 1973. - Vol. 18. - P. 24-45.

141. Gard, S. Inactivation of poliovirus by formaldehyde. Analysis of inactivation curves / S. Gard, E. Lucke // Arch. ges. Virusforsch. 1957. -Vol. 7. - P. 471-493.

142. Gard, S. Theoretical consideration in the inactivation of viruses by chemical means / S. Gard // Ann. N.Y. Acad. Sei. 1960. -V. 83. -P. 513 - 760.

143. Genome analysis linking recent european and african influenza (H5N1) viruses / S. L. Salzberg, C Kingsford, G. Cattoli et al. //Emerging Infect. Dis. 2007. - Vol. 13. - P. 713-718.

144. Glisson, J.R. Alternative injection sites for Pasteurella multocida bacterin / J.R. Glisson // Avian Dis. —1990. Vol. 34, N 1. - P. 214-217.

145. Glisson, J.R. Proper use of inactivated poultry vaccines / J.R. Glisson // Vineland Zabs Publ., 1998.

146. Global patterns of Influenza A virus in wild birds / B. Olsen, V. J. Munster, A. Vallensten et al. // Science. 2006. - Vol. 312. - P. 384-388.

147. Glutaraldehyde inactivated pertussis vaccine: a safe vaccine in the innocuity test / R.K. Gupta, B. Sharma, S. Ahuja et. al. // Vaccine. 1987. - Vol. 5. - P. 102-104.

148. Graves, G.H. Acetylethylenimine in the preparation of inactivated foot and mouth disease vaccines / G.H. Graves, R.B. Arlinghaus // Proc. Ann. Meet. U.S. Livest. Sanit. Assoc. 1967. - Vol. 71. - P. 396-403.

149. Graves, G.H. Formaldehyde inactivation of foot and mouth disease virus as applied to vaccine preparation / G.H Graves //Am. J. Vet. Res. 1963. -Vol. 24. -P. 1131 - 1135.

150. Growth, immune response and behavior of broiler and leghorn cockerels fed different methionine levels / R. Maatman, W.B. Gross, E.A. Dunnington et.al. // Arch. Gefluegelkd. 1993. - Vol. 57. - P. 249-256.

151. Hardegree, M.C. Influence of antigens on release of free fatty acids from Arlasel A (mannide monooleate) / M.C. Hardegree, M. Pittman // Proc. Sec. Exp. Biol. Med. -1967.-Vol. 123.-P. 179-182.

152. Heat inactivated HBs Ag as a vaccine against hepatitis B / H.W. Reesink, E.E.

153. Reering-Brongers, H.G. Brummelhuis et. ah. // Antiviral Res. 1981. - Vol. l.-P. 13-25.

154. Heller, E.D. Serological evidence for major histocompasibility complex (B complex) antigens in broilers selected for humoral immune response / E.D. Heller, Z. Uni // Poultry Sci. 1991. - Vol. 70. - P. 726-732.

155. Herbert, WJ. Ultiple emulsions: a new form of mineral oil antigen adjuvant / WJ. Herbert//Lancet. 1965. - Vol. 11. - P. 771.

156. Heterogeneity in the haemagglutinin gene and emergence of the highly pathogenic phenotype among recent H5N2 avian influenza viruses from Mexico / M. Garcia, J. M. Crawford, J. W. Latimer E. et al. // J. Gen. Virol. 1996. - Vol. 77. - P. 1493-1504.

157. Highly pathogenic avian influenza // O.I.E. Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines. Paris, 2004. - Vol. l.-P. 258-269.

158. Highly pathogenic avian influenza virus subtype H5N1 in Mute swans in the Czech Republic / A. Nagy, J. Machova, J. Hornickova et al. // Vet. Microbiol. 2007. - Vol. 120.-P. 9-16. -5.

159. Hinshaw, V. S. The perpetuation of orthomyxoviruses and paramyxoviruses in Canadian waterfowl / V. S. Hinshaw, R. G. Webster, B. Turner // Can. J. Microbiol. -1980. Vol. 26. - P. 622-629.

160. Hirst, G. K. Agglutination of red cells by allantoic fluid of chick embryos infected with influenza virus / G. K. Hirst // Science. 1941. - Vol. 94. - P. 22-23.

161. Human influenza A H5N1 virus related to a highly pathogenic avian influenza virus / E. J. Claas, A. E. Osterhaus, R. Van Beek J. et al. // Lancet. 1998. - Vol. 351. - P. 472-477.

162. Hunter, R. L. Overview of vaccine adjuvants: present and future / R. L. Hunter // -Vaccine. -2002. Vol.20, suppl. 3. P. 57-512.

163. Identification and subtyping of avian influenza viruses by reverse transcription-PCR / M. Lee, P. Chang, J. Shien et al. // J. Virol. Methods. -2001.-Vol. 97.-P. 13-22.

164. Impaired response to killed Newcastle disease vaccine in chicken possessing circulating antibody to chicken anaemia agent / P.G. Box, H.C. Holmes, A.C. Bushell,

165. P.M. Finney // Avian Pathol. 1988. - Vol. 17. - P. 713-723.

166. Inactivation of foot and mouth disease virus vaccine strains by activation of virus-associated endonuclease / E.A. Scodeller, M.A. Lebendiker, M.S. Dubra et. al. // J. Gen. Virol. 1984. -Vol. 65. - P. 1567-1573.

167. Inactivation of O, FMD viris by binary ethylenimin (BEI) / H.C. Girard, O. Bayramoglu, N. Erol et. al. // Bull.Off Int. Epizoot. 1977. - Vol. 87. - P. 201-207.

168. Inactivation of polymyelitis virus by formaldehyde / T. Wessler, E. Lucke, S. Gard, G. Olin // Ach. ges. Virusforsch. 1957. - Bd. 7. - S. 125-135.

169. Incidence of adamantane resistance among influenza A(H3N2) viruses isolated worldwide from 1994 to 2005 / R. Brigth, M. Medina, X. Xu et al. // Lancet. 2005. -Vol.366.-P. 1175-1181.

170. Influence of epitope polarity and adjuvants on the immunogenicity and efficacy of a synthetic peptide vaccine against Semliki Forest virus / I.M. Fernandez, A. Snijders, B J. Benaissa-Trouw et al. // J. Virol. 1993. - Vol. 67, N 10.-P. 5843-5848.

171. Influenza (H5N1) viruses in poultry, Russian Federation, 2005-2006 / A. S. Lipatov, V. A. Evseenko, H.-L. Yen et al. // Emerging Infect. Dis. 2007.-Vol. 13.-P. 539-546.

172. Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems / A. Garcia-Sastre, A. Egorov, D. Matassov et al. // Virology. 1995.-Vol. 252. -P. 324330.

173. Information sur montanide adjuvants pour vaccins et injectables huileux. Paris: SEPPIC, 1986.

174. Intestinal influenza: replication and characterization of influenza viruses in ducks / R. G. Webster, M. Yakhno, V, S. Hinshaw et al. // Virology. 1978.-Vol. 84.-P. 268278.

175. Investigation of problems associated with intramuscular breast injection of oil-adjuvant killed vaccines in chickens / R. Droual, A.A. Bickford, B.R. Charlton, D.R. Kuney // Avian Dis. 1990. - Vol. 34, N 2. - P. 473-478.

176. Isolation and properties of a macromolecular, water soluble, immunoadjuvant fraction from the cell wall of Mycobacterium smegmatis / A. Adam, R. Ciorbaru, J.F. Petit et al. // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1972. - Vol.39. - P. 851-854.

177. Jarc, V.H. Histologische and chemische Untersuchungen über Ruckstande in Huhnern nach Applikation einer Oil-Emulsion vaccine Newcastle disease / V.H. Jarc, S. Kolbl // Berl. Munch, tierarztl. Wschr. 1984. - Bd. 97. - S. 325-329.

178. Jolles, P. Chemical and biological basis of adjuvants / P. Jolles, A. Paraf. London: Chapman and Hall, 1973.

179. Jones, R. C. Reovirus-induced tenosynovitis: persistence of homologous challenge virus in broiler chicks after vaccination of parents / R. C. Jones, B.N.C. Nwajei // Res. Vet. Sei. 1985. - Vol. 39. - P. 39-41.

180. Joo, I. Mineral carriers as adjuvants/1. Joo // Symp. Ser. ImmunobioL Stand. -1974.-Vol.22.-P. 123-130.

181. Kaeberle, M.L. Function of carriers and adjuvants in induction of immune responses / M.L. Kaeberle // Advance in Carriers and Adjuvants for Veterinary Biologies. Iowa: Univ. Press, 1986. - P. 11-23.

182. Kaplan, M. WHO coordinated research on the role of animals in influenza epidemiology: introduction /M. Kaplan, W. I. Beveridge // Bull. W.H.O. 1972.-Vol. 47.-P. 439-448.

183. Kawaoka, Y. Interplay between carbohydrate in the stalk and the length of the connecting peptide determines the cleavability of influenza virus hemagglutinin / Y. Kawaoka, R. G. Webster // J. Virol. 1989. - Vol. 63. - P. 3296-3300.

184. Klasing, K.C. Influence of acute feed deprivation or excess feed intake on immunocompetence of broiler chicks / K.C. Klasing // Poultry Sei. 1988. - Vol. 67. — P. 626-634.

185. Klasing, K.C. Nutritional modulation of resistance to infectious diseases / K.C. Klasing // Poultry Sei. 1998. - Vol. 77. - P. 1119-1125.

186. Klenk, H. Host cell proteases controlling virus pathogenicity / H. Klenk, W. Garten

187. Trends Microbiol. 1994. - Vol. 2. - P. 39-43.

188. Krug, R. M. Are the 5' ends of influenza viral mRNAs synthesized in vivo donated by host mRNA / R. M. Krug, B. A. Broni, M. Bouloy // Cell. 1979.-Vol. 18.-P. 329334.

189. Lamb, R. A. Orthomyxoviridae: the viruses and their replication /R. A.Lamb, R. M. Krug // ed. FieldsVirology / B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley. 3rd ed. Lippincott-Raven, Philadelphia, Pa, 1996. - P. 1353-1395.

190. Lancaster, J.E. Newcastle disease. A review 1926-1964 / J.E. Lancaster // Can. Agric. 1966. - Vol.3. - P.208.

191. Larghi, O.P. Rabies virus inactiation by binary ethylenimine: new method for inactivated vaccine production / O.P. Larghi, A.E. Nebel // J. Clin. Microbiol. 1980. -Vol. 11.-P. 120-122.

192. Laver, W.G. Antigenic variation and the structure of influenza virus glycoproteins / W.G. Laver // Microbiological Sci.-1984.- Vol.1, N2.- P.37- 43.

193. Laver, W.G. Preparation and immunogenicity of an influenza virus hemagglutinin and neuraminidase subunit vaccine / W.G. Laver, R.G. Webster // Virology. — 1976. -Vol. 69.-P. 511-515.

194. Lee, C. Effect of vaccine use in the evolution of Mexican linage H5N2 avian influenza virus / C. Lee, D. Senne, D. Suarez // Virolojy.- 2004. Vol. 78.- P. 8372-8381.

195. Lee, C. Generation of reassortant influenza vaccine by revers genetics that allow utilization of a DIVA strategy for the control of avian influenza / C. Lee, D. Senne, D. Suarez//Vaccine.-2004. Vol. 22. - P. 3175 - 3181.

196. Liu, J.J. Current approaches to vaccine preparation / J.J. Liu, A. Cepica // Can. Vet. J. 1990.-Vol. 31.-P. 181-189.

197. Local and systemic specific antibody response of different chicken lines after ocular vaccination against infectious bronchitis / H. Toro, E. Reyes, T. Redmann, E.F. Kaleta // J. Vet. Med. B. 1996. - Vol. 43. - P. 449-454.

198. Local pathological reactions and immune response of chickens to ISA-70 and other adjuvants containing Newcastle disease virus antigen / M. Yamanaka, T. Okade, M. Nakai, N. Goto // Avian Dis. 1993. - Vol. 37. - P. 459-466.

199. Low-pathogenicity avian influenza in Italy (2000-01) / S. Marangon, L. Bortolotti, I. Capua, et al. //Avian Dis. 2003. Special issue. - P. 1006 - 1009.

200. Lucio, B. Oil-emulsified vaccine-related lesions / B. Lucio // Cornell. 1993. -Vol. 43, N4.-P. 3.

201. Martinsen, J.S. Inactivation of foot and mouth disease virus by glicidaldehyde / J.S. Martinsen // Am. J. Vet. Res. 1964. - Vol. 25. - P. 1417-1432.

202. Mayo, M.A. Virus taxonomy 1997 / M.A. Mayo, C.R. Pringle // J. Gen. Virol. 1998, Vol. 79.-P. 649-657.

203. McKercher, P.D. Adjuvants immunizing activity/ P.D. McKercher // 17th Conf.O.I.E. FMD Comission. - Paris, 1986.-P. 389-399.

204. McKercher, P.D. Oil adjuvants: their use in veterinary biologies / P.D. McKercher // Advance in Carriers and Adjuvants for Veterinary Biologies. Iowa: Univ. Press, 1986. -P. 115-119.

205. Miller, J.M. Evaluation of an inactivated bovine leikemia virus preparation as an immunogen in cattle / J.M. Miller, M.J. Van der Maaten // Ann. Rech. Vet. 1978. - Vol. 9.-P. 871-877.

206. Miller, L.L. Inheritance of antibody response to sheep red blood cells for fifty-six-day body weight / L.L. Miller, P.B. Siegel, E.A. Dunnington // Poultry Sei. 1992. -Vol. 71.-P. 47-52.

207. Molecular analysis of highly pathogenic avian influenza virus of subtype H5N1 isolated from wild birds and mammals in northern Germany / S. Weber, T. Harder, E. Starick et al. // J. Gen. Virol. 2007. - Vol. 88. - P. 554-558.

208. Molecular analysis of the hemagglutinin genes of H5 influenza viruses: origin of a virulent turkey strain / Y. Kawaoka, A. Nestorowicz, D. J. Alexander, R. G. Webster//Virology. 1987. -Vol. 158. -P. 218-227.

209. Molecular mechanisms of variation in influenza viruses / R.G. Webster, W.G. Laver, G.M. Air, G.G. Schild //Nature.-1982.- Vol.296. P.l 15-121.

210. Morgan, D.O. Vaccination against foot and mouth disease: New developments with human and veterinary vaccines / D.O. Morgan, D.M. Moore, P.D. McKercher // Progress Clinical and Biol. Res. N.Y., 1980. - Vol. 47. - P. 169-178.

211. Mukaigawa, J. Two signals mediate nuclear localization of influenza virus (A/WSN/33) polymerase basic protein 2 / J. Mukaigawa, D. P. Nayak // J. Virol. 1991. -Vol. 65. - P. 245-253.

212. Murphy, B. R. Orthomyxoviruses / B. R. Murphy, R. G. Webster // Fields Virology / ed B. N. Fields, D. M. Knipe, P. M. Howley. 3rd ed. Lippincott-Raven, Philadelphia, Pa, 1996. P. - 1397-1445.

213. Mutalib, A. Influence of cite of inoculation of inactivated vaccine on the immune response in chicken / A. Mutalib, C.R Boyl // Avian Dis. 1994. - Vol. 38, N 4. - P. 857-860.

214. Nath, S. T. Function of two discrete regions is required for nuclear localization of polymerase basic protein 1 of A/WSN/33 influenza virus (HIN1) / S. T. Nath, D. P. Nayak//Mol. Cell. Biol. 1990. - Vol. 10. - P. 4139-4145.

215. Neta, R. Adjuvants in the induction of supressor cells / R. Neta, S.B. Salvin // Infection and Immunity. 1979. -Vol. 23, N. 2.-P. 360-365.

216. Observations on the relationship in chickens between the virulence of some avian influenza viruses and their pathogenicity for various organs / P. T. Hooper, G. W. Russell, P. W. Selleck, W. L. Stanislawek // Avian Dis. 1995.-Vol. 39.-P. 458-464.

217. O'Neill, R. E. The influenza virus NEP (NS2 protein) mediates the nuclearexport of viral ribonucleoproteins / R. E. O'Neill, J. Talon, P. Palese // EMBO J. 1998. - Vol. 17. -P. 288-296.

218. Origin and molecular changes associated with emergence of a highly pathogenic H5N2 influenza virus in Mexico / T. Horimoto, E. Rivera, J. Pearson et al. // Virology. -1995. Vol. 213. - P. 223-230.

219. Parker, J. Inactivation of African horse sickness virus by betapropiolactone and by pH / J. Parker // Arch . Virol. 1975. - Vol. 47. - P. 357-365.

220. Pathogenicity of H5 influenza virus for ducks / N. Koshoda, Y. Sakoda, N. Isoda et al. // Virolojy. -2005. Vol. 150. - P. 1383 - 1393.

221. Paulson, J. C. Interactions of animal viruses with cell surface receptors / J. C. Paulson // ed. M. Connor. The Receptors. Orlando, 1985. - P. 131-219.

222. Perdue, M. L. Virulence-associated sequence duplication at the hemagglutinin cleavage site of avian influenza viruses / M. L. Perdue, M. Garcia, D. Senne // Virus Res. 1997.-Vol. 49.-P. 173-186.

223. Perpetuation of influenza A viruses in Alaskan waterfowl reservoirs / T. Ito, K. Okazaki, Y. Kawaoka et al. // Arch. Virol. 1995. - Vol. 140. - P. 1163-1172.

224. Perrin, G.G. Observations de granulomes inflammatoires d'origine medicamenteuse chez les poules pondeuses / G.G. Perrin, G.J. Perrin // Rev. Med. Vet. — 1978.-P. 281-284.

225. Plotch, S. J. A unique cap (m7GpppXm)-dependent influenza virion endonuclease cleaves capped RNAs to generate the primers that initiate viral RNA transcription / S. J. Plotch, M. Bouloy, I. Ulmanen, R. M. Krug // Cell. -1981.-Vol. 23.-P. 847-858.

226. Poss, P. E. The nature of avian influenza in turkeys in Minnesota / P. E. Poss, D. A. Halvorson // Proc. 2nd Int. Symp. on Avian Influenza, 1987. P. 112-117.

227. Povey, R.C. Technical basis of vaccination / R.C. Povey, S. Carman // Vet. Vaccinology. / ed. P.-P.Pastoret et.al. Amsterdam, Netherlands, 1997. - P. 519-524.

228. Preliminary vaccine potency trial of a Newcastle disease virus inactivated with binary ethylenimine/ C. Buonavoglia, A. Fioretti, M. Toliis et. al. // Vet. Res. Comm. -1988. -Vol. 12.-P. 195-197.

229. Preparation of a standardized efficacie of agricultural H5N3 vaccine by revers genetics / M. Liu, J. Wood, T. Ellis et al. // Virology. 2003. - Vol. 314. - P. 584 - 590.

230. Preparation of inactivated oil-emulsion vaccines with avian viral or mycoplasma antigens / H.D. Stone, M. Brugh, S.R. Hopkins, et.al. // Avian Dis. 1978. - Vol. 22. -P. 666-674.

231. Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in Western China / H. Chen, Y. Li, J. Shi et al. // J. Virol. -2006. Vol. 80, № 12. - P. 5976-5983.

232. Protection of mice against lethal infection with highly pathogenic H7N7 influenza A virus by using a recombinant low-pathogenicity vaccine strain / E.Wit, T. Munster, W. Spronken et al. //Virology. 2005. Vol. 79. P. 12401 - 12047.

233. Raettig, H. Inaktivierung vor Bakteriophagen durch Athyleniminderivate / H. Raettig, W. Uecher // Naturwissenschalten. 1955. - Bd. 42. - S. 490.

234. Receptor specificity in human, avian, and equine H2 and H3 influenza virus isolates / R. J. Connor, Y. Kawaoka, R. G. Webster, J. C. Paulson // Virology. 1994. -Vol. 205.-P. 17-23.

235. Reemerging H5N1 influenza virus in Hong Kong 2000 are highly pathogenic toducks / K. Stirm-Ramirez, T. Ellis, B. Bonsfield et al. // Virology. 2004. Vol. 78. P. 4892-4896.

236. Responsiveness to a pandemic alert: use of revers genetics for rapid development of influenza vaccines / R. Webby, D. Perez, J. Coleman et al. // Lancet. 2000. - Vol. 363. -P. 1099 -1103.

237. Rogers, G. N. Receptor binding properties of human and animal HI influenza virus isolates / G. N. Rogers, B. L. D'Souza // Virology. 1989. - Vol. 173.-P. 317-322.

238. Sander, J. Vaccination reactions / J. Sander // Poultry Int. 1997. - Vol. 36, N 7. -P. 66-73.

239. Schafer, W. Sero-immunologic studies on incomplete forms of the virus of classical fowl plague (German) / W. Schafer // Arch. Exp. Vet. Med. 1955. -Vol. 9.-P. 218-230.

240. Scholler, G.M. Kinetics of inactivation of African swine fever antigen with binary ethylenimine / G.M. Scholler // Proc. U.S. Anim. Health. Assoc. 1982. - Vol. 86. - P. 253- 260.

241. Seo, S. Cross-reactive, cell-mediated immunity and protection of chickens from lethal H5N1 influenza virus infection in Hong Kong poultry markets / S. Seo, R. Webster // Virology. 2001. - Vol. 75. - P. 2516 - 2525.

242. Shafer, A.L. Development and validation of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay for detection of type A influenza antibodies in avian sera / A.L. Shafer, J.B. Katz, K.A. Eernisse // Avian Dis. 1998. Vol. - 42. - P. 28 - 34.

243. Starick, E. Type- and subtype-specific RT-PCR assays for avian influenza A viruses (AIV) / E. Starick, A. Romer-Oberdorfer, O. Werner // J. Vet. Med. B. -2000. -Vol.47 P. 295-301.

244. Statt, E.J. Preliminary observations on Quil A' as an adjuvant for an inactivated respiratory syncytial virus vaccine / E.J. Statt, G. Taylor, L.H. Thomas // Symp. on Vaccine Adjuvants. London, - 1981. - P. 19-24.

245. Stone, H.D. Efficacy of experimental animal and vegetable oil-emulsion vaccinesfor Newcastle disease and avian influenza / H.D. Stone // Avian Dis. — 1993. Vol. 37. — P. 399-405.

246. Stone, H.D. Efficacy of experimental Newcastle disease water-in-oil-emulsion vaccines formulated from squalare and squalene / H.D. Stone, X. Zuixun // Avian Dis. — 1990. Vol. 34. - P. 979-983.

247. Stone, H.D. Evaluation of inactivated Newcastle disease oil-emulsion vaccines / H.D. Stone, M. Brugh, C.W. Beard // Avian Dis. 1980. - Vol. 24. - P. 99-111.

248. Stone, H.D. Influence of formulation on the efficacy of experimental oil-emulsion Newcastle disease vaccines / H.D. Stone, M. Brugh, C.W. Beard // Avian Dis. — 1983. — Vol. 27.-P. 688-697.

249. Stone, H.D. Newcastle disease oil emulsion vaccines prepared with animal, vegetable, and synthetic oils / H.D. Stone // Avian Dis. 1997. - Vol. 41. - P. 591-597.

250. Stones, P.D. The potency testing of oil adjuvant avian vaccines with particular reference to infectious bronchitis / P.D. Stones, B. Roberts, A.V. Beresford // Develop. Biol. Stand. 1981. - Vol. 51. - P. 59-94.

251. Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion / P. A. Bullough, F. M. Hughson, J. J. Skehel, D. C. Wiley // Nature (London). 1994.-Vol. 371.-P. 37-43.

252. Sundquist, B. Influenza virus ISCOMS antibody response in animals / B. Sundquist, K. Lovgren, B. Morein // Vaccine. 1988. - Vol. 6. - P. 49-53.

253. Suzuki, Y. Gangliosides as influenza virus receptors. Variation of influenza viruses and their recognition of the receptor sialo-sugar chains / Y. Suzuki // Prog. Lipid Res. -1994. Vol. 33. - P. 429-457.

254. Swayne, D.E. Avian influenza vaccine strategies / D. E. Swayne // Proc. 32nd National Meeting on Poultry Health and Processing / ed. S. Klopp, 14-16 Oct. 1997. -Ocean City, Maryland, 1997.-P. 115-121.

255. Swayne, D.E. Pathobiology of H5N2 Mexican avian influenza viruses for chickens / D. E. Swayne // Vet. Pathol. 1997. - Vol. 34. - P. 557-567.

256. The effect of Marek's disease vaccination of day-old chicks against Newcastle disease, using B1 and oil emulsion vaccine / P.G. Box, I.G.S. Furminger, W.W. Robertson, D. Warden // Avian Pathol. 1976. - Vol. 5. - P. 299-305.

257. The influence of a water-in-oil emulsion on humoral immunity / B.A. Bokhout, A.T.I. Bianchi, Ph. I. van der Heijden et al. // Comp. Immunol., Microbiol, and Infect. Dis. 1986. - Vol. 9, N 2-3. - P. 161-168.

258. Tse, H.Y. Immunogenecity and antigen presentation in the induction of an immune response / H.Y. Tse, A.S. Rosenthal // Advances in Carriers and Adjuvantes for Veterinary Biologies. Iowa, 1986. - P. 3-9.

259. Type-A influenza viruses isolated from wild free-flying ducks in California / R. D. Slemons, D. C. Johnson, J. S. Osborn, F. Hayes // Avian Dis. 1974. - Vol. 18.-P. 119125.

260. Update of human infections with highly patogenic avian influenza virus A/ H7N7 during an outbreak in poultry in the Netherlands / M. Koopmans, R. Fouchier, B. Wilbrink et al. // Eurosurveillance Weekly. 2003. - P. 1-5.

261. Vawaoka, Y. Is virulence of H5N2 influenza virus in chikens assciated with loss of carbohydrate from hemagglutinin / Y. Vawaoka, C. Noeve, R. Webster // Virology. -1984.-Vol. 139-P. 303 -316.

262. Villegas, P. Antibody response against Newcastle disease in commercial broilers fed different dietary protein levels / P. Villegas, G.M. Pesti, D. Pesti // Poultry Sci. -1983. Vol. 62. - P. 277-281.

263. Wang, P. The NPI-l/NPI-3 (Karyopherin a) binding site on the influenza A virus nucleoprotein NP is a nonconventional nuclear localization signal / P. Wang, P. Palese, R. E. O'Neill // J. Virol. 1990. - Vol. 71. - P. 1850-1856.

264. Warrer, H. Sh. Future prospects for vaccine adjuvants / H.Sh. Warrer, L.A. Chedid // CRC Critical Reviews on Immunology. 1988. - P. 83-101.

265. Warsmann, B.H. Adjuvants and immune regulation by lymphoid cells / B.H. Warsmann // Springer Semin. Immunopathol. — 1970. Vol. 2. - P. 5-33.

266. Webster, R. G. Protection against lethal influenza with neuraminidase / R. G. Webster, P. A. Reay, W. G. Laver // Virology. 1988. - Vol. 164, - P. 230-237.

267. White, R. G. Correlation of adjuvant activity and chemical structure of wax D fractions of mycobacteria / R.G. White, P. Jolies, D. Samour, E. Lederer // Immunology. 1964. - Vol. 7, N 2. - P. 158-171.

268. Wilson, I. A. Structure of the haemagglutinin membrane glycoprotein of influenza virus at 3A resolution /1. A. Wilson, J. J. Skehel, D. C. Wiley // Nature (London). 1981. -Vol.289.-P. 366-373.

269. Yegani, M. Avian influenza causing a poultry industry crisis./ M. Yegani // World Poultry. 2004. Vol. 20. P. 20 -22.

270. Zebedee, S. L, Influenza A virus M2 protein: monoclonal antibody restriction of virus growth and detection of M2 in virions / S. L. Zebedee, R. A. Lamb // J. Virology. -1988. Vol. 62. - P. 2762-2772.