Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Технология изготовления инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц

На правах рукописи

Для служебного пользования . . № 58 дсп от 25.10.2000 экз. № ^

УДК 619:616.72 - 002-002.6:615.371

Шкиря Владимир Иванович

ТЕХНОЛОГИЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ РЕОВИРУСНОГО ТЕНОСИНОВИТА ПТИЦ

16.00.03. « Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Владимир - 2000

Работа выполнена в ФГУ Всероссийский научно-исследовательский институт защит! животных (ВНИИЗЖ) Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук,

старший научный сотрудник Старое С.К.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, старший научный

сотрудник Русалеев B.C. (ВНИИЗЖ, г.Владимир

доктор биологических наук,

профессор Сафонов Г.А. (ПЗБ, г.Покров)

Ведущая организация: Всероссийский государственный научно-исследовательский институт контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов (ВГНКИ, г.Москва)

Защита диссертации состоится «¿9у> декабря 2000 года в/С часов н заседании диссертационного совета Д 120.60.01. при Всероссийском научнс исследовательском институте защиты животных Минсельхоза России по адрес; 600900, Владимир, п/о Юрьевец, ВНИИЗЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИЗЖ.

Автореферат разослан «7 У» ноября 2000г.

Ученый секретарь

диссертационного совета - Г.М. Семенова

1.Общая характеристика работы

Актуальность темы. В современных условиях развития промышленного птицеводства выявляется большое количество новых инфекционных заболеваний вирусной этиологии. Одним из таких заболеваний является реовирусная инфекция птиц. Для обеспечения ветеринарного благополучия птицеводческих хозяйств в отношении этого заболевания первое место занимает специфическая профилактика.

Первое выделение реовируса у птиц относится к 1954 г., когда Fahey J.E. и Crawley J.F. изолировали вирус из дыхательных органов цыплят с хронической респираторной болезнью. "

Случаи естественного артрита у цыплят вирусной этиологии были впервые описаны в США (Olson N.O. 1966). Впоследствии было доказано, что агент, вызывающий заболевание, является реовирусом (Walker E.R. 1972).

Со времени первых докладов о заболевании в США оно зарегистрировано во многих странах мира, включая Австрию, Аргентину, Бразилию, Францию, Израиль, Италию, Нидерланды, Великобританию и Россию. На территории Российской Федерации за период 1990 - 1997 г.г., по данным ВНИВИП и ВНИИЗЖ, реовирусная инфекция птиц отмечена во многих птицеводческих хозяйствах.

Экономический ущерб, причиняемый птицеводству реовирусной инфекцией, часто связан с уменьшением яйценоскости на 6 - 20%, низкими привесами, плохой усвояемостью корма, понижением товарности, выбраковкой поражённой птицы и расходами на проведение ветеринарно-санитарных мероприятий. В племенных хозяйствах отмечают снижение половой активности петухов (van der Heide L. 1977, Dobson K.N. 1992).

Реовирусная инфекция птиц может быть ассоциирована с рядом клинических проявлений: теносиновитом, синдромом маладсорбции, авитаминозом, тимусной и бурсальной атрофией.

Повсеместное распространение реовируса птиц, его устойчивость, укрупнение ферм, уменьшение времени между посадками, а также тенденция к увеличению концентрации птичьей популяции говорит о том, что искоренение реовирусной инфекции в хозяйствах может быть трудным. Это также связано с тем, что вирус может передаваться как вертикальным, так и горизонтальным

библиотека [

Для специфической профилактики реовирусного теносиновита кур во многих странах применяют как живые, так и инактивированный вакцины. Схема профилактики предусматривает вакцинацию несушек инактивированными вакцинами с целью создания напряженного иммунитета в родительском стаде, что приводит к получению достаточного уровня пассивного иммунитета у цыплят с 1-го дня жизни. В настоящее время, в ветеринарной практике отсутствуют инактивированные вакцины отечественного производства против реовирусного теносиновита птиц, которые обеспечивали бы достаточно напряженный и продолжительный иммунитет. Очевидно, что в этой ситуации современн£му промышленному птицеводству необходима высокоиммунагенная инактивированная вакцина против реовирусной инфекции птиц.

Успехи, достигнутые в последние годы в области биотехнологии, а также большой опыт, накопленный сотрудниками института в области конструирования вакцин, делают вполне реальной разрешение задачи по созданию промышленной технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц.

Цели и задачи исследований. Целью работы является разработка технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против реовирусной инфекции птиц. Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

• отработать получение биологически активного вирусного сырья;

• изучить вирулицидную активность различных инактивантов в отношении реовируса птиц;

• подобрать компонентный состав инактивированной вакцины против реовирусной инфекции птиц;

• изучить иммуногенную активность инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц с учетом динамики титров антител;

• отработать схему вакцинации в зависимости от кратности и сроков ревакцинации;

• разработать нормативно-техническую документацию на инактивированную вакцину против реовирусного теносиновита птиц;

• провести лабораторные и производственные испытания инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц;

• разработать промышленный регламент по изготовлению и контролю инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц.

Научная новизна. Разработана технология изготовления и контроля инактивированной вакцины против реовирусной инфекции птиц.

Выбрана чувствительная система культивирования реовируса птиц с использованием первично-трипсинизированной культуры клеток фибробластов куриных эмбрионов.

Отработан режим инактивации реовируса птиц аминоэтилэтиленимином в концентрации 0,08% в течение 24 часов при температуре 37°С.

Подобран компонентный состав инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц.

Изучена иммуногенная и антигенная активность инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц.

Практическая ценность работы. В результате выполненных исследований ветеринарной практике и промышленному птицеводству предложен препарат с высокими иммунобиологическими свойствами для профилактики реовирусного теносиновита птиц.

1. Разработаны и утверждены Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ нормативные документы на получение инактивированной эмульгированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц, в которые входят:

• Технические условия на вакцину против реовирусного теносиновита птиц инактивированную эмульгированную ТУ 9384-017-00495527-99

• Наставление по применению вакцины против реовирусного теносиновита птиц

• Промышленный регламент на производство вакцины против реовирусного теносиновита птиц инактивированной эмульгированной

2. Рекомендуется использование шт.1733 реовируса птиц в качестве контрольного вирулентного штамма для контроля поствакцинального иммунитета.

3. Предложена методика титрования реовируса птиц и определения вируснейтрализующих антител в первичной культуре клеток фибробластов эмбрионов кур.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Инактивация реовируса птиц формальдегидом и аминоэтилэтиленимином

• Подбор оптимального компонентного состава инактивированной вакцины против реовируса птиц

• Изучение иммуногенной активности вакцины против реовирусной инфекции птиц

• Технологический регламент изготовления и контроля инакгивированной вакцины

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» (Щелково, 2000г.), на конференции «Молодых ученых» (ВНИИЗЖ, 2000г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 125 страницах, иллюстрирована 6 рисунками и 14 таблицами. Список использованной литературы включает 211 источников, из них 187 иностранных.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1.1. Штамм реовируса птиц

Культуральный реовирус птиц штамм S1133, выращенный монослойным способом в первичной культуре клеток фибробластов куриных эмбрионов, с титром инфекционности не менее 8,00 Lg ТЦЦ 50/мл.

Культуральный реовирус птиц штамм 1733, выращенный монослойным способом в первичной культуре клеток фибробластов эмбрионов кур, с титром инфекционности не менее 7,50 lg ТЦДбо/мл

2.1.2. Подопытная птица

Цыплята мясных и яичных пород, не иммунные к реовирусу птиц, 30-40-дневного возраста, средней массой 150-300 граммов и молодка 90-120-дневного возраста массой 1,0-1,5 кг.

2.1.3. Культуры клеток и куриные эмбрионы.

В экспериментах использовали: первичную культуру клеток фибробластов куриных эмбрионов, перевиваемую линию клеток почки зеленой мартышки (VERO), а также СПФ-эмбрионы фирмы «Lohman Tiersuch» (Германия).

2.1.4. Культивирование реовируса птиц

Культивирование реовируса птиц шт. S1133 для производства инакгивированной вакцины проводили в первично-трипсинизированной культуре клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК). Предназначенную для

культивирования вируса культуру клеток, готовили из кожно-мышечной ткани 12-дневных СПФ-эмбрионов кур.

В роллерные сосуды с монослоем клеток ФЭК вносили по 10 мл производственной расплодки реовируса птиц из расчета 0,1 ТЦЦ/кл.

Сосуды с инфицированной культурой помещали в роллерный аппарат при температуре 37±1 °С на 1 час для контакта вируса с клетками. После этого в роллерные сосуды заливали поддерживающую среду ПСП рН 7.3-7.4 с 2% инактивированной сыворотки КРС в объеме 300 мл.

2.1.5. Очистка реовируса птиц Культуральный реовирус осветляли низкоскоростным центрифугированием при 2000 об/мин в течение 20 минут.

2.1.6. Инактивация инфекционности реовируса птиц Инактивацию инфекционной активности вируса проводили аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) в концентрации 0,08% в течение 24 часов при температуре 37°С и формальдегидом в концентрации 0,08% в течение 24 часов при температуре 37°С.

2.1.7. Определение полноты инактивации Оценку полноты инактивации реовируса проводили в монослое культуры клеток ФЭК двухсуточного возраста.

3.1.8. Концентрирование суспензии реовируса птиц Концентрирование сорбцией на гель ГОД проводили следующим образом: к инактивированной суспензии реовируса (рН 7,4-7,6) добавляли расчетные количества 3% геля ГОА, смесь перемешивали, а затем отстаивали в течение 24 часов при температуре 4 °С. Надосадочную жидкость сливали до нужной концентрации сорбента.

Для концентрирования инактивированной суспензии реовируса предварительно готовили 50% раствор ПЭГа. Полученный раствор ПЭГа добавляли к антигену реовируса в расчетных количествах, смесь тщательно перемешивали. Также в раствор добавляли NaCI в конечной концентрации 3%. Суспензию выдерживали при температуре 4 °С 18 часов. По истечении указанного срока смесь центрифугировали, а осадок ресуспендировали.

2.1.9. Вакцины

Экспериментальные серии эмульгированной вакцины готовили путем смешивания 3 частей масляного адъюванта (ISA - 70) и 1 части инактивированной

суспензии реовируса. Смесь эмульгировали в гомогенизаторе в течение 5 минут при 3000 об/мин., до получения однородной эмульсии.

Экспериментальные серии сорбированной ГОА вакцины против реовируса птиц, изготавливали из инактивированной суспензии вируса адсорбированного на ГОА с добавлением сапонина.

2.1.10. Контроль вакцины Контроль эмульсионной и сорбированной форм инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц осуществляли путем определения стерильности, безвредности, реактогенности, иммуногенной активности вакцины.

2.1.11.1. Определение стерильности Испытание на стерильность вакцины проводили по ГОСТ 28085-89 (ст. СЭВ 6280-88), "Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности".

2.1.11.2. Проверка на безвредность и реактогенность вакцины Контроль на безвредность проводили на 10 цыплятах 90-120 суточного возраста, полученных из хозяйств, благополучных по острым инфекционным болезням птиц.

Проведение испытания проводили следующим образом: 3-х кратную дозу вакцины (1,0мл) вводили 10 цыплятам в мышцу груди, а 5 цыплят оставляли интактными. Вакцина считается безвредной, если 10 цыплят в течение указанного срока остаются живыми, без клинических признаков переболевания.

2.1.11.3. Проверка антигенной активности вакцины Антигенную активность определяли на опытной и контрольной группах цыплят 90-120 дневного возраста, по 10 голов в каждой. Цыплятам опытной группы вакцину вводили в мышцу груди в объеме 0,3 мл.

Через 21 сутки от птицы контрольной и опытной групп отбирали пробы крови из подкрыльцовой вены. Пробы сыворотки крови исследовали в РН или ИФА.

Вакцина считается антигенноактивной, если титр антител в сыворотке крови у 80% вакцинированных птиц через 21 день после иммунизации не ниже 1:800 или прирост антител составляет не менее двух разведений по сравнению с исходным.

2.1.12. Статистическая обработка результатов исследований Для обработки результатов исследований использовали статистические методы в биологии (И.П. Ашмарин, А.А. Воробьев, 1962 г.).

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.2.1. Изучение антигенной активности вакцин из вируса, полученного в различных системах культивирования

Для успешной разработки технологии изготовления и контроля

инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц на первом этапе исследований необходимо было выбрать систему культивирования реовируса птиц шт. S1133, обеспечивающую урожай вируса с высокими иммунобиологическими свойствами.

В качестве тестируемых систем для культивирования реовируса нами были выбраны: 10-дневные СПФ-эмбрионы (КЭ-вирус), первичная культура клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК-вирус) и культура клеток Vero (Vero-вирус). Цыплят прививали в дозе 0,3 мл. Отбор крови для исследований проводился на 14 и 21 день после вакцинации. В результате исследований установлено, что вакцинация птиц препаратами из вирусов, полученных в различных системах культивирования, индуцирует на 14 день после введения вакцины образование антител против реовирусного теносиновита с повышением к 21 дню до уровня 1:3455±329, 1:4745±267, 1:4172±211, соответственно (р<0,05). Причем отмечена высокая иммуногенная активность вакцины на основе ФЭК- и Vero-вируса.

В результате проведенных исследований нами в качестве системы культивирования была выбрана первично-трипсинизированная культура клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК-вирус),

2.2.2. Разработка метода очистки реовируса птиц

Методику очистки реовируса отрабатывали с использованием низкоскоростного центрифугирования и хлороформа. В суспензию вируса вносили хлороформ в конечных концентрациях 1%, 2,5%, 4% и 6%. Контролем служили образцы вирусной суспензии без добавления хлороформа.

Очищенный вирус инактивировали аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ). Экспериментальные образцы вакцины вводили цыплятам в дозе 0.3 мл. Сыворотку крови у вакцинированной птицы отбирали на 21 сутки после иммунизации. Результаты проведенных исследований показывают, что очистка суспензии вируса хлороформом снижает титр инфекционности вируса с 8,25±0,25 lg ТЦД5о/мл до 7,50±0,25 lg ТЦД50/мл и 6,75±0,34 lg ТЦД50/мл при концентрации хлороформа 1% и 6%, соответственно. Тогда как при одном низкоскоростном центрифугировании титр инфекционное™ вируса практически не снижался и составлял 8,00±0,12 Lg ТЦД50/мл.

Проверка иммуногенности препаратов при различных способах очистки показала, что титр антител в ИФА у цыплят иммунизированных препаратами из не очищенного вируса составлял 1:3363±348, не отличаясь от очищенного только низкоскоростным центрифугированием (1:3325±549), в то время как применение хлороформа при очистке, снижало антигенную активность вакцин, составляя: 1:2758±386 и 1:2363±772 при концентрации хлороформа 1% и 6% соответственно.

При испытании реактогенности экспериментальных образцов эмульсионных вакцин, изготовленных на основе исходного (не очищенного вируса) и вируса, очищенного различными способами, достоверных различий не установлено. Таким образом, проведенные исследования показали, что изготовление вакцины может проводиться как с очисткой, так и без очистки суспензии реовируса птиц. Однако нами для дальнейшей работы применялась очистка с использованием низкоскоростного центрифугирования. Этот метод очистки позволяет очистить суспензию вируса от клеточного детрита с сохранением его основных биологических свойств.

2.2.3. Инактивация реовируса птиц

В опытах использовали суспензию реовируса птиц штамм БИЗЗ, выращенный роллерным способом в первичной культуре клеток фибробластов эмбрионов кур (ФЭК). Исходный титр вируса до инактивации составлял 8,0 1_д ТЦД50/мл.

В качестве инактивантов использовали аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) и формалин. Для изучения инактивирующей активности АЭЭИ и формалина на реовирус птиц в суспензию вируса вносили различное количество инактивантов: в конечных концентрациях 0,04; 0,08 и 0,16%. Инактивацию проводили при температуре 30,0±0,5°С и 37,0±0,5°С, в течение 48 часов. Результаты исследований представлены в таблице 1 и рисунках 1 и 2.

Исследованиями по определению инактивирующей способности АЭЭИ и формалина было установлено, что инактиванты обладают выраженным инактивирующим действием в отношении реовируса птиц. Падение инфекционности реовируса птиц зависит от концентрации инактивантов, продолжительности процесса и температуры реакционной смеси.

Экспериментальными исследованиями установлено, что оптимальная концентрация формалина для инактивации реовируса составляет 0,08%; экспозиция 18 часов при температуре процесса 37,0±0,5°С.

Для инактивации реовируса птиц АЭЭИ предложен следующий режим: концентрация АЭЭИ - 0,08%, время экспозиции -16 часов и температура процесса - 37,0±0,5°С.

Таблица 1.

Динамика инактивации реовируса птиц аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ)

____п=5

№ Время инактивации, час Температура инактивации

30иС 37иС

Концентрация АЭЭИ, %

0,04 0,08 0,16 0,04 0,08 0,16

Инфекционный титр вируса, 1д ТЦД5о/мл (М±т)

1 0 8,00± 0,25 8,00± 0,25 8,00± 0,25 8,00± 0,25 8,00± 0,25 8,00± 0,25

2 4 7,25± 0,20 5,25± 0,14 5,75± 0,23 7,00± 0,55 6,00+ 0,12 4,00± 0,23

3 8 6,00± 0,23 4,50± 0,23 3,50+ 0,23 5,50± 0,31 4,25± 0,23 0

4 12 5,00± 0.14 2,00± 0,23 1,25± 0,20 4,25± 0,37 2,00± 0,23 0

5 16 4,00± 0,12 0,75± 0,20 0 2,75± 0,20 0 0

6 20 3,25± 0,12 0 0 0,75± 0,12 0 0

7 24 2,00± 0,23 0 0 0 0 0

8 28 1,25± 0,12 0 0 0 0 0

9 30 0 0 0 0 0 0

10 34 0 0 0 0 0 0

11 38 0 0 0 0 0 0

12 42 0 0 0 0 0 0

13 48 0 0 0 0 0 0

Примечание: р<0,05

Кроме условий инактивации реовируса (концентрация инактиванта, температура и продолжительность обработки) перед нами была поставлена задача изучения режима инактивации, при котором наиболее полно сохранялась антигенная активность вируса в составе эмульгированных вакцин. Результаты исследований показали, что титр антител у птиц, привитых вакциной с антигеном инактивированным АЭЭИ, составлял 1:14989+615, в то время как у птицы,

привитой антигеном инактивированным формалином, составлял 1:13797±309, при этом концентрация инактивантов была одинаковой и соответствовала 0,08%.

5 о

<

о. 2: ш

о. н

'0,04 формалина -4-0,08% формалина -Ф-0,16% формалина

Рисунок 1. Динамика инактивации реовируса птиц с использованием формалина при температуре 30°С

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

ЧАСЫ

*0,04 формалина ->-0,08 формалин -¿г-0,16 формалина

Рисунок 2. Динамика инактивации реовируса птиц с использованием формалина при температуре 37°С.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что для изготовления инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц возможно применение, как формальдегида, так и АЭЭИ. Однако, учитывая более высокую антигенную активность вакцин на основе АЭЭИ, для дальнейшей работы нами использовался АЭЭИ.

2.2.4. Изучение концентрирования реовируса птиц

Для изучения условий концентрирования реовируса птиц использовали: гидроокись алюминия и полиэтиленгликоль (ПЭГ м.м. 6000). Исходным материалом служил реовирус птиц с инфекционной активностью 8,00±0,25 Ig ТЦДбо/мл. После концентрирования отбирали пробы для определения титра инфекционности надосадочной жидкости на культуре клеток ФЭК. Результаты исследований свидетельствуют о том, что повышение концентрации ПЭГа и ГОА в суспензии реовируса птиц снижают потери вируса при концентрировании. При этом в надосадочной части суспензии реовируса птиц при титровании на культуре ФЭК, инфекционная активность вируса составляла 2,50±0,12 Ig ТЦЦ50/мл и 3,00±0,25 Ig ТЦД50/мл, соответственно. Наиболее оптимальной является конечная концентрация ПЭГа 8% с добавлением 3% NaCI, а концентрация ГОА - 0,8%.

2.2.5. Выбор компонентного состава инактивированной вакцины против реовирусной инфекции птиц

Напряженность и длительность иммунитета у птиц зависит от количества и качества антигена, а также использования неспецифических стимуляторов иммуногенеза, т.е. адъювантов.

Перед нами стояла задача определения количества антигена и выбора адъюванта, обеспечивающего получение иммуногенных вакцин. Были проведены сравнительные испытания эмульсионной вакцины с использованием адъюванта ISA-70 и сорбированной ГОА-вакцины с добавлением сапонина в сравнении с исходным инактивированным вирусом. Для изучения влияния концентрирования на атигенные свойства реовируса птиц проводили концентрирование антигена в 5 и 25 раз, при помощи ГОА и ПЭГа.

Образцы вакцины испытывали на цыплятах 30-дневного возраста, которым вводили экспериментальные вакцины в дозе 0,3 мл внутримышечно. Цыплят в количестве 90 голов разделили на 6 групп. Первую группу цыплят иммунизировали исходным вирусом, 2-ю - эмульгированной вакциной (без концентрирования), 3-ю - эмульгированной (концентрированной в 5 раз), 4-ю -эмульгированной (концентрированной в 25 раз), 5-ю - сорбированной

(концентрированной в 5 раз), 6-ю - сорбированной вакциной (концентрированной в 25 раз). Антигенную активность препаратов оценивали в ИФА по наличию в сыворотках крови антител. Кровь отбирали через 21 сутки после иммунизации. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2

Сравнительное изучение антигенной а>стивности ГОА и эмульсионных

вакцин

п=3

№ Вакцины Доза вакцины мл Титр антител в ИФА (М±т) Титрогруппа в ИФА

1" Нативный вирус (исходный инак-тивированный антиген) 0,3 1:3407±562 4

2 Эмульгированная без конц. 0,3 1:6412±754 7

3 Эмульгированная конц. в 5 раз ПЭГом 0,3 1:6583±927 7

4 Эмульгированная конц. в 25 раз ПЭГом 0,3 1:8358±996 9

5 Сорбированная конц, в 5 раз 0,3 1:5694±773 6

6 Сорбированная конц. в 25 раз 0,3 1:7394±973 8

7 Контроль __ 1:715±245 2

Примечание: р<0,05

Результаты опытов показали, что введение антигена с адъювантом, независимо от природы последнего, оказывает более эффективное воздействие на иммуногенез, чем введение нативного вируса. При этом эмульгированные вакцины индуцировали выработку более высокого уровня специфических антител против реовируса птиц, чем сорбированные формы вакцин. Так, введение эмульгированной вакцины без концентрирования обеспечивало выработку антител, соответствующих 1:6412±754, а применение сорбированной вакцины, концентрированной в 5 раз приводило к образованию антител соответствующих 1:5694±773.

Из представленных данных также видно, что напряженность иммунного ответа зависит от количества вводимого в вакцину антигена. Однако, независимо от выбора адъюванта, антигенная активность вакцин возрастала неадекватно кратности концентрирования вируса. Концентрирование антигена в эмульгированной форме вакцины в 5 раз увеличивает выработку антител всего на

0,11 титрогруппы, по сравнению с неконцентрированным препаратом. Следовательно, использование данного способа концентрирования при производстве моновалентной вакцины против реовирусного теносиновита птиц, нецелесообразно.

Таким образом, нами выбран адъювант ISA-70, обеспечивающий выработку наиболее выраженного иммунного ответа.

Хорошо известно, что антигенная активность эмульгированных вакцин существенно зависит от соотношения в вакцине антиген/масло.

В процессе использования адъюванта ISA-70 для получения инакгивированной эмульгированной вакцины против реовируса птиц были изготовлены и испытаны образцы вакцины с различным соотношением антигена и адъюванта.

Испытание полученных образцов вакцинных препаратов проводили на цыплятах, которым вводили препарат в дозе 0,3 мл, внутримышечно. В опыте использовали 80 цыплят, которых разделили на 4 группы. Первой группе цыплят вводили вакцину с соотношением адъюванта и антигена 50:50, второй группе -вакцину с соотношением 60:40, третьей группе - вакцину с соотношением 70:30. Четвертая группа была контрольной. На 21 сутки отбирали сыворотки крови от иммунизированной и контрольной птицы для исследований в ИФА. Результаты исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3

Сравнительное изучение антигенной активности вакцин при различном

ингредиентном составе

п=3

№ Соотношение в вакцине адъювант/антиген (%) Титр антител в ИФА(М±т) Титрогруппа в ИФА

1 50:50 1:4437±382 5

2 60:40 1:4392±619 5

3 70:30 1:4221 ±874 5

4 Контроль 1:398±192 2

Примечание: р<0,05

Наиболее выраженный иммунный ответ получен у цыплят, которым вводили вакцину с соотношением адъюванта и антигена 50:50, титр антител в ИФА составил 1:4437±382 (5 титрогруппа). Однако необходимо отметить, что

образцы вакцин, в которых соотношение адъюванта и антигена было 50:50 и 60:40 обладали повышенной вязкостью и были нестойки при хранении. Поэтому, нами была выбрана вакцина, в которой соотношение адъюванта и антигена было 70:30, как наиболее полно отвечающее требованиям по вязкости и стойкости эмульсии, а также по иммуногенности и безвредности на цыплятах.

2.2.6. Определение оптимальной иммунизирующей дозы Для определения оптимальной иммунизирующей дозы вакцины, обеспечивающей выработку напряженного иммунитета, был проведен опыт на 150 цыплятах 60-суточного возраста. Каждую дозу вакцины - 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5 мл, вводили группе по 20 цыплят. Кровь для исследований в ИФА отбирали на 21 сутки после вакцинации. В дополнение к данному эксперименту образцы инактивированной эмульсионной вакцины против реовируса птиц были исследованы на безвредность. Для этого одной группе вводили вакцину в дозе 1,0 мл, а другой группе - в дозе 1,5 мл. Результаты исследований представлены на рисунке 3.

5000-1

g 4000 ^ 3000

X

? 2000

1000 о

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 доза вакцины (мл)

Рисунок 3. Динамика тира антител против реовирусного теносиновита птиц в зависимости от дозы вакцины

Установлено, что введение вакцины в различных дозах индуцирует образование антител в крови птиц всех экспериментальных групп. Максимальный титр антител отмечен в группе, вакцинированной в дозе 0,5 мл и был равен 1:4667±412 (р<0,05). Однако необходимо отметить, что нарастание титра антител идет до определенного предела, затем при постепенном увеличении дозы вакцины кривая становится менее крутой и выходит на плато.

Для применения в практических условиях нами рекомендуется использовать дозу вакцины 0,3 мл. При соблюдении всех требований, указанных в

промышленном регламенте по изготовлению и контролю вакцины, эта доза вакцины обеспечивает образование напряженного иммунитета на 21 сутки после однократной иммунизации и по иммуногенности практически аналогична дозе вакцины 0,5 мл.

Контроль клинического состояния подопытной птицы в ходе эксперимента не выявил патологических признаков общего и местного характера в группах вакцинированной птицы. При вскрытии птицы отмечено, что на месте введения при дозе вакцины в дозе от 1,0 до 1,5 мл отмечались следы эмульсии на 21 сутки после иммунизации.

2.2.7. Изучение динамики антител после вакцинации против реовирусного теносиновита птиц в зависимости от кратности и сроков ревакцинации

В дальнейших опытах перед нами была поставлена задача разработки схемы вакцинации с применением инактивированной эмульгированной вакцины, а также изучение напряженности и длительности поствакцинального иммунитета.

В опытах использовали цыплят 30-дневного возраста. На первом этапе опыта нами было использовано 200 голов птицы, из них 150 голов было вакцинировано инактивированной эмульгированной вакциной против реовирусного теносиновита птиц в дозе 0,3 мл, а 50 голов оставляли интактными. Ревакцинацию проводили через 30 и 60 дней, по 50 голов для каждой ревакцинации. Данные исследований представлены на рисунке 4.

7000т

^ 6000

ш 5000-

| 4000-

< 3000

£ 2000

Н 1000

14 21 30 50 60 90 120 150 180

Дни после вакцинации

Ш Контроль В Однократная вакцинация

□ Ревакцинация на 30 сутки □ Ревакцинация на 60 сутки

Рисунок 4. Динамика титров антител у цыплят в зависимости от сроков и кратности вакцинации инактивированной эмульгированной вакциной.

Проведенными исследованиями установлено, что введение инактивированна эмульгированной вакцины индуцирует активное формирование иммунитета привитых цыплят. Так, спустя 21 день после однократной вакцинации птиц тит| антител достигал значения 1:1487 (2 титрогруппа), постепенно повышаясь к 30 дт до 1:4626 (5 титрогруппа). После этого к 180 дню наблюдалось постепенно снижение титра антител до 1:3289, что соответствует 4 титрогруппе.

Ревакцинация птицы спустя 30 дней после первого введения вакцин! сопровождалась повышением уровня антител. Максимальный титр, которы отмечался через 60 дней, составляя 1:6001 (7 титрогруппа). К 180 дню опыта тит антител в этой группе снижался до значения 1:3856 (4 титрогруппа).

Также нами была проведена ревакцинация птицы через 60 дней после перво вакцинации. Максимальный подъем титров антител наблюдался через 30 дне! после ревакцинации, достигая значения 1:6007 (7 титрогруппа). К окончанию опыт отмечалось снижение уровня антител в этой опытной группе до 1:4789 ( титрогруппа).

Исследованиями установлено, что двукратная иммунизация птиц эмульгированной вакциной с 60-дневным интервалом между инъекциями боле эффективна, чем однократная и с ревакцинацией на 30 день. Однако и однократна вакцинация обеспечивает напряженный и продолжительный иммунитет проти реовируса птиц в течение 6 мес. (срок наблюдения). Необходимость ревакцинаци обусловлена тем, что она обеспечивает более высокий и однородный уровеь антител и защиты птицы от заражения.

Проведенные исследования показывают, что однократная вакцинация позволяет защитить птицу от заражения реовирусной инфекцией, так как по сообщению Тийс ван Дийка (фирма Интервет), титры антител в пределах 3-4 титрогруппы предохраняют птицу от заболевания. Ревакцинация через 60 дней может быть предложена для ремонтного молодняка с целью формирования более напряженного иммунитета у цыплят в первые дни жизни.

2.2.8. Изучение антигенной активности вакцины против реовирусного теносиновита кур после различных сроков хранения

Успех профилактики вирусных болезней у птиц зависит от иммуногеннос-применяемой вакцины. Большое значение при этом имеют условия и сроки хранен! вакцины. В наших исследованиях эмульгированную вакцину хранили в течение ' месяцев при температуре 4 - 6 °С. Иммуногенность вакцины определяли сра после изготовления, а также через 6 и 12 месяцев хранения.

При хранении вакцины в течение 12 месяцев при температуре 4 - 6 °С не отмечено существенного снижения иммуногенной активности вакцины. Так, титры антител через 21 сутки после вакцинации составляли: свежеприготовленной вакцины - 1:4626 ± 505 (5 титрогруппа) и через 6 и 12 месяцев хранения -1:4528 ± 423 и 1:4565 ± 401 (5 и 5 титрогруппы), соответственно.

Установлено, что вакцина против реовирусного теносиновита птиц инактивированная эмульгированная через 12 месяцев хранения сохраняла свою исходную иммуногенную активность.

2.2.9. Изучение возрастной резистентности цыплят к реовирусному

теносиновиту птиц

С целью проверки факта возрастной резистентности цыплят к заражению реовирусом птиц использовался имеющийся в коллекции ВНИИЗЖ шт. 1733.

В опытах использовали 120 голов СПФ-цыплят, в возрасте 1 и 14 суток (по 60 цыплят в каждой возрастной группе). Цыплята в каждой возрастной группе далее были разделены на 4 группы, по 15 голов в каждой. Первую группу цыплят заражали орально, вторую в мякиш лапы реовирусом птиц шт. 1733. Вирус цыплятам вводили в дозе 6,5 lg ТЦЦго/о.гМЛ. Третьей и четвертой группе цыплят вводили физиологический раствор орально и в мякиш лапы, соответственно. Цыплята во время опыта находились в 2-х изолированных боксах. В первом боксе содержали цыплят, зараженных в возрасте одних суток, а во втором -цыплят зараженных в возрасте 14 суток. Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таблица 4

Заболеваемость цыплят после заражения в возрасте 1 дня и 2-х недель

п=3

Возраст цыплят, сутки Группа Способ заражения Заболело/ всего % заболевших

1 Инфицирова иные Орально 14/15 93,3

Мякиш лапы 15/15 100

Контроль Орально 0/15 0

Мякиш лапы 0/15 0

14 Инфицирова нные Орально 0/15 0

Мякиш лапы 0/15 0

Контроль Орально 0/15 0

Мякиш лапы 0/15 0

На основании проведенных исследований можно сделать вывод, что штамм 1733 может использоваться для контрольного заражения цыплят только однодневного возраста, с увеличением возраста, независимо от наличия антител, воспроизведение острого течения реовирусного теносиновита становиться невозможным.

2.2.10. Сравнительная оценка пассивного иммунитета против реовируса птиц у цыплят, полученных от невакцинированных и вакцинированных кур

В дальнейших исследованиях пред нами была поставлена задача провести сравнительную оценку пассивного иммунитета у цыплят, полученных от неиммунизированных и иммунизированных птиц родительского стада вакциной против реовирусного теносиновита.

Исследования по изучению пассивного иммунитета проводили на птицефабриках России. У цыплят, полученных от иммунизированных инактивированной вакциной и неиммунизированных родителей в возрасте 1, 3, 6, 9, 12, 15 и 21 суток, отбирали пробы сыворотки крови для оценки антител против реовируса птиц. Результаты исследований представлены на рисунке 5.

_СУТКИ_

Вакцинированные —в— Невакцинорованные

Рисунок 5. Динамика антител у цыплят полученных от вакцинированных и невакцинированных родителей

Изучение динамики уровня пассивных антител в зависимости от возраста показало, что у цыплят, полученных от иммунизированных родителей, средний титр антител был выше, составляя 1:2558, чем у цыплят, полученных от неиммунизированных родителей 1:1081. При этом титры антител у вакцинированных родителей находились на уровне 1:5116. С увеличением

возраста цыплят, независимо от вакцинации родителей, происходит снижение титров антител. Однако антитела у цыплят полученных от иммунизированных родителей, выявляются вплоть до 21 суток. Тогда как к 15 суткам у цыплят, полученных от неиммунизированных родителей, антитела не обнаруживаются.

Одновременно велись исследования по оценке пассивного иммунитета у цыплят с использованием контрольного заражения вирулентным штаммом 1733 реовируса птиц. Для заражения было взято по 15 цыплят от вакцинированных и невакцинированных кур. Заражение цыплят производили орально в дозе 6,5 1д ТЦД5оЛ),2мл. Данные представлены в таблице 5.

— Таблица 5

Качественная оценка пассивного иммунитета однодневных цыплят

Группа Родители 1 дневные цыплята Заболело/ всего % защиты

Титр антител (М±т) Титро-группа Титр антител (М±т) Титро-группа

Первая 1:5116± 901 6 1:2558± 506 3 0/15 100

Вторая н.и. н.и. 1:1081± 589 2 11/15 26,7

Примечание — н.и. — не исследовались

Результаты контрольного заражения показали, что цыплята, полученные от родителей, вакцинированных инактивированной реовирусной вакциной, имели достаточно высокий уровень пассивного иммунитета, обеспечивающий защиту против контрольного заражения. При заражении цыплят первой группы, процент защищенных против реовирусной инфекции составлял 100%, а во второй группе этот показатель составил 26,7%.

Таким образом, испытание инактивированной эмульгированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц в производственных условиях, показало возможность создания надежной защиты цыплят от инфицирования реовирусной инфекцией в раннем возрасте путем вакцинации материнского стада.

2.2.11. Разработка технологического регламента изготовления инактивированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц

При разработке лабораторного регламента изготовления инактивированной вакцины осуществлялась следующая схема технологического процесса:

1. Получение и контроль матричной расплодки реовируса птиц.

2. Получение и контроль производственной расплодки реовируса птиц.

3. Получение и контроль производственной партии реовируса птиц.

4. Инактивация и контроль инактивации вирусной суспензии.

5. Очистка антигена.

6. Приготовление эмульгированной вакцины.

7. Фасовка и укупорка вакцины.

8. Упаковка и маркировка вакцины.

9. Контроль вакцины.

На основании разработанного регламента было произведено 19 серий (22342000 доз) инактивированной эмульгированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц. Выпущенные серии подвергались контролю качества, в результате которого установлено, что все образцы вышеназванного препарата отвечали требованиям действующего ТУ.

Выводы

1. Разработана технология изготовления и контроля инактивированной эмульгированной вакцины против реовирусного теносиновита птиц на основе культурального вируса (шт. ЭНЗЗ), инактивированного аминоэтилэтиленимина (АЭЭИ) с использованием адъюванта 1БА-70, в соотношении адъюванта и антигена 70:30.

2. Инактивированная вакцина против реовирусного теносиновита птиц из шт.БИЗЗ является высокоиммуногенным и безвредным препаратом для цыплят любого возраста.

3. Установлено, что культивирование реовируса птиц на культуре клеток ФЭК, позволяет получать урожай вируса в титре 8,0 1д ТЦЦ5о/мл, из которого возможно получать вакцины с высокими антигенными и иммуногенными свойствами.

4. Показано, что при инактивации реовируса птиц аминоэтилэтиленимином в концентрации 0,08% в течение 16 часов при температуре 37,0°С происходит полная инактивация инфекционности вируса при сохранении антигенных и иммуногенных свойств вируса.

5. Установлено, что при использовании формалина в концентрации 0,08% в течение 18 часов при температуре 37°С происходит инактивация инфекционности с сохранением антигенности препаратов.

6. При сравнительном испытании сорбированных и эмульгированных вакцин против реовирусного теносиновита птиц показано, что эмульгированные вакцины на основе масляного адъюванта ISA-70 по антигенной активности значительно превосходят сорбированные вакцины с сапонином.

7. Показано, что 1-дневные цыплята чувствительны к заражению шт. 1733 реовируса птиц и при этом у них ярко проявляются клинические признаки в виде угнетения, опухания мякиша лап, развития артритов, синдрома маладсорбции и «вертолетной болезни». Показана возрастная резистентность цыплят к заражению реовирусом шт.1733.

8. Изуче"на динамика формирования и продолжительность иммунитета у цыплят, привитых инактивированной вакциной против реовирусного теносиновита птиц. Установлено, что после однократной иммунизации цыплят продолжительность иммунитета составляет 150 дней. Ревакцинация по иммунному фону через 60 дней индуцирует напряженный и продолжительный иммунитет в течение всего срока эксплуатации птицы.

9. Инактивированная эмульгированная вакцина против реовирусного теносиновита птиц сохраняет высокую иммуногенную активность в течение срока годности (12 месяцев), при температуре 4-6 сС.

10. По результатам сероконверсии и контрольного заражения установлено, что инактивированная эмульгированная вакцина против реовирусного теносиновита кур при вакцинации маточного поголовья обеспечивает получение однородного пассивного иммунитета у однодневных цыплят, создающего защиту против инфицирования в первые недели жизни.

Практические предложения

1. Рекомендуются для использования в ветеринарной практике разработанные и утвержденные Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ НТД на вакцину против реовирусного теносиновита птиц инактивированную эмульгированную: Технические условия на вакцину 9384-017-00495527-99; наставление по применению вакцины против реовирусного теносиновита птиц; промышленный регламент на производство вакцины против реовирусного теносиновита птиц инактивированной эмульгированной.

Вакцина по разработанному регламенту производится во ВНИИЗЖ и используется в птицеводческих хозяйствах Российской Федерации.

2. Учитывая высокую чувствительность однодневных цыплят к реовирус\ шт.1733, целесообразно использовать их в качестве лабораторной модели дл; контроля поствакцинального иммунитета.

3. Вирулентный шт.1733 реовируса птиц рекомендуется в качестве контрольногс вирулентного штамма при проверке иммуногенности вакцины.

4. Разработана, одобрена ученым советом и утверждена директором институте «Методика титрования реовируса птиц и определения вируснейтрализующиэ антител в первичной культуре клеток фибробластов эмбрионов кур».

~ Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Шкиря В.И., Старов С.К., Герасимова Н.И., Куприянов А.И., Сарбасов А.Б., Ельников В.В. Сравнительное изучение иммуногенной активности вакцины против реовирусного теносиновита птиц из антигена, полученного в различных системах культивирования // Диагност, проф. и меры борьбы с особо опасными, экзотическ. и зооантропоноз. бол. ж-ных: Сб, статей Междунар. науч.-прак. Конф. 15-16 августа 2000 г., Покров с. 104-106.

2. Бурдейная Л.В., Старов С.К., Герасимова Н.И., Шкиря В.И., Куляшбекова Ш.К., Герасимов В.И., Черняева Т.Ю., Ельников В.В. Выращивание вакцинного штамма 1133 реовируса птиц в различных клеточных системах II Научн. основы производства вет. биол. преп.: Тез. докл. - Щелково, 2000. -с.93-94.

3. Бурдейная Л.В., Старов С.К., Герасимова Н.И., Шкиря В.И., Ельников В.В.

Изучение условий хранения вируса теносиновита кур // Научн. основы производства вет. биол. преп.: Тез. докл. - Щелково, 2000. - с.92-93.

4. Бурдейная Л.В., Старов С.К., Герасимова Н.И., Шкиря В.И., Черняева Т.Ю., Сарбасов А.Б. Условия выращивания вакцинного штамма 1133 реовируса птиц // Научн. основы производства вет. биол. преп.: Тез. докл. - Щелково, 2000.-с.95.

5. Куприянов А.И., Шкиря В.И., Мудрак Н.С., Старов С.К., Дрыгин В.В.

Разработка диагностической тест-системы на основе непрямого варианта иммуноферментного анализа и ее применение для эпизоотологического мониторинга реовирусной инфекции птиц // Роль ветеринарной науки в развитии животноводства: Мат. меж. научн.-произ. конф., пос. 75-летию Казахского НИВИ. - С.124-125. 1