Автореферат и диссертация по медицине (14.00.36) на тему:Экспериментально-клиническое обоснование выбора стратегии профилактики гриппозной инфекции в период подготовки к пандемии

На правах рукописи

Миронов Александр Николаевич

Экспериментально-клиническое обоснование выбора стратегии профилактики гриппозной инфекции в период подготовки к пандемии

14.00.36 - Аллергология и иммунология 03.00.06 - Вирусология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

003493564

Работа выполнена на ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ и в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Научные консультанты: академик РАМН,

профессор В.В. Зверев

доктор медицинских наук, профессор H.A. Михайлова

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор медицинских наук, профессор Л.В. Ковальчук

доктор медицинских наук, профессор Б.В. Пинегин

доктор медицинских наук С.Г. Маркушип

НИИ гриппа СЗО РАМН

Защита состоится «25» марта 2010 г. в «12» часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу. 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д.5а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.

Автореферат разослан «15» февраля 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

И.В. Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Грипп - острая вирусная инфекция с воздушно-капельным путем передачи, характеризующаяся острым началом, лихорадкой, общей интоксикацией и поражением респираторного тракта. Эпидемии гриппа происходят ежегодно, поражая до 15 % населения Земного шара, значимо увеличивая смертность в группах повышенного риска, увеличивая затраты на медицинскую помощь и нанося серьезный экономический ущерб. По частоте и количеству случаев грипп и ОРВИ занимают первое место, составляя 95 % всех инфекционных заболеваний. В России ежегодно регистрируют от 27,3 до 41,2 млн. заболевших гриппом и другими ОРВИ [Гендон Ю.З., 2009; Couch R.B., 1999; Sym D., 2009; Gerberding J.L., 2009].

Кроме ежегодных эпидемий вирус гриппа А может вызывать и пандемии. Пандемии всегда являлись событиями мирового значения. Они возникали в результате появления высококонтагиозного вируса гриппа, к которому большая часть населения не имела иммунитета, и, как следствие, практически глобальной восприимчивости людей к инфекции. Характерными особенностями пандемий являлись быстрота распространения гриппа по всем частям света, как правило, менее чем за год, и подверженность заболеванию более четверти всего населения. Помимо высокой смертности пандемии всегда отличались внезапностью возникновения вспышки заболевания, не позволяющей адекватно подготовиться к борьбе с инфекцией. В прошлом столетии отмечено три пандемии гриппа: «испанский грипп» в 1918 г., «азиатский грипп» в 1957 г. и «гонконгский грипп» в 1968 г. «Испанка» унесла от 40 до 50 миллионов человек во всем мире [Mills С.Е, 2004; White L.F, 2008]. Ни сроки, ни последствия следующей пандемии невозможно предсказать определенно.

Из известных 15 подтипов вируса гриппа А подтип H5N1 обладает наиболее высоким пандемическим потенциалом: он быстро мутирует и вступает в рекомбинацию с вирусами, инфицирующими различные виды животных, в том числе млекопитающих [Cleaveland S, 2006; Vahlenkamp

T.W, 2008; Chang S, 2007]. Первый подтвержденный случай заражения людей гриппом птиц произошел в Гонконге в 1997 г., когда H5N1 вызвал тяжелое респираторное заболевание у 18 человек, из которых 6 умерло, причем заболевание было вызвано вирусом, циркулирующим в тот момент в популяции местной домашней птицы [Wong S.S, 2006; Lewis D.B, 2006].

В настоящее время активно дискутируется вопрос о возможности распространения новой пандемии гриппа [García-García J, 2006; Thomas J.K, 2007; Kleinman A.M, 2008]. Опасность представляет не только широкое распространение подтипа H5N1 в популяции птиц, но также высокая летальность для людей при поражении данным вирусом: из 433 случаев заболевания людей гриппом H5N1 262 закончились летальным исходом [WHO, 2009]. В случае с гриппом птиц H5N1 ВОЗ объявила 3 фазу предупреждения пандемии гриппа.

13 апреля 2009 г. в Мексике был подтвержден первый случай заражения новым видом вируса, который получил название «свиной грипп». Позже, когда был идентифицирован штамм возбудителя (California/07/2009), болезнь получила название грипп H INI. Появление и циркуляция данного вируса гриппа H1N1 в популяции людей привели к объявлению 27.04.09 г. 6 фазы предупреждения о пандемии. По данным ВОЗ, на 15.06.2009 в мире случаи заражения вирусом гриппа H INI зафиксированы в 76 странах. Общее число заболевших составило 35928 человек, из них смертью закончились 163 случая [Li G.-X, 2009; Bolotin S, 2009].

Можно предположить, что причина столь быстрого распространения вируса H1N1 в человеческой популяции является отсутствие иммунитета у людей и наличие в геноме данного вируса генов от вируса гриппа птиц и вируса гриппа человека [WER, 2009; Hurt А.С, 2009; MMWR, 2009].

Для предупреждения возникшей угрозы здоровью людей вакцинация будет основным инструментом в борьбе с инфекцией. Следовательно, разработка эффективных вакцин против пандемического гриппа - вопрос первостепенной важности. Лабораторно-экспериментальные исследования, проведенные с субтипом H5N1 показали, что существует реальная проблема

разработки пандемических вакцин, связанная с тем, что отработанные и принятые повсеместно схемы применения (способ введения, кратность, интервал, доза) сезонных гриппозных вакцин не эффективны в случае «птичьего» или «свиного» гриппа [Desheva J.A, 2006; Howard М.К, 2008; MMWR, 2009; WHO, 2009].

Еще одной проблемой, связанной с появлением пандемического вируса гриппа, является недостаток производственных мощностей для обеспечения вакциной всех потребностей населения.

Новые технологии должны сыграть важную роль в разработке безопасной и эффективной вакцины против пандемического гриппа для контингентов, включая беременных, грудных детей и лиц старше 60 лет. Препарат должен содержать небольшое количество антигена вируса и храниться без охлаждения. И наконец, немаловажное значение имеют масштабы производства и стоимость вакцин [ВОЗ, 2005].

Стратегии выпуска иммуногенных вакцин, содержащих меньшее количество антигена, за счет включения в состав адъюванта, могут привести к значительному увеличению производственного потенциала. Для использования их в широкой практике необходимо проведение полномасштабных доклинических и клинических исследований, доказывающих безопасность и иммуногенность сконструированных препаратов.

Имея в виду изложенные аргументы, проведение целенаправленных фундаментальных и прикладных исследований по разработке и изучению свойств «макетных» пандемических вакцин против гриппа является актуальной проблемой.

Цель настоящей работы - экспериментально-клиническое обоснование выбора стратегии профилактики гриппозной инфекции в период подготовки к пандемии.

Задачи исследования:

1. Сконструировать живую и инактивированные потенциальные («макетные») препандемические гриппозные вакцины.

2. Изучить физико-химические и молекулярно-биологические свойства отечественных потенциальных («макетных») препандемических гриппозных вакцин.

3. Провести доклинические и клинические исследования живой гриппозной вакцины «Ультрагривак» и оценить их результаты.

4. Провести сравнительные доклинические и клинические исследования гриппозных инактивированных субъединичных вакцин «ОрниФлю» и «ВГИПС» и выбрать наиболее оптимальный вариант;

5. Провести доклинические и клинические исследования гриппозной инактивированной расщепленной виросомальной адсорбированной вакцины «АвиФлю» и оценить их результаты.

6. Оптимизировать стратегию вакцинации населения в период подготовки к пандемии.

Научная новизна. Впервые изучены свойства живой «Ультрагривак», инактивированных субъединичной сорбированной «ОрниФлю» и расщепленной виросомальной сорбированной «АвиФлю» потенциальных («макетных») препандемических вакцин против гриппа.

В ходе проведенных исследований впервые:

- выбраны наиболее перспективные варианты потенциальных («макетных») препандемических вакцин против гриппа: живая «Ультрагривак», инактивированные адсорбированные - субъединичная «ОрниФлю» и расщепленная виросомальная «АвиФлю»;

экспериментально обоснована необходимость применения двукратной схемы вакцинации с целью профилактики пандемического гриппа;

- в рамках доклинических исследований на лабораторных животных экспериментально доказана безопасность и иммунологическая эффективность живой «Ультрагривак» и инактивированных адсорбированных субъединичной «ОрниФлю» и расщепленной виросомальной «АвиФлю» потенциальных («макетных») препандемических гриппозных вакцин;

- в рамках клинических исследований экспериментально доказана низкая реактогенность, безопасность и иммуногенность живой «Ультрагривак» и инактивированных адсорбированных субъединичной «ОрниФлю» и расщепленной виросомальной «АвиФлю» потенциальных («макетных») препандемических гриппозных вакцин на добровольцах;

- определены критерии реактогенности и иммуногенности живой «Ультрагривак» и инактивированной субъединичной адсорбированной «ОрниФлю» препандемических гриппозных вакцин.

- обоснованы схемы вакцинации населения РФ с целью специфической профилактики гриппа в случае возникновения пандемии: для живой вакцины «Ультрагривак» - интраназально двукратно с интервалом 10 сут в дозе не менее 7,5 ^ ЭИД50; для инактивированной субъединичной адсорбированной вакцины «ОрниФлю» - внутримышечно двукратно с интервалом 28 сут в дозе 15 мкгНА.

Практическая значимость работы. Работа имеет большое народнохозяйственное значение. В результате проведенной работы:

доказана эффективность технологических подходов при конструировании безопасных и эффективных живой и инактивированных вакцин против пандемического гриппа;

- выбраны наиболее оптимальные конструкции вакцин для защиты населения РФ от пандемии гриппа - живая вакцина «Ультрагривак»; инактивированные адсорбированные субъединичная «ОрниФлю» и расщепленная виросомальная «АвиФлю»;

- по результатам исследований оформлены НТД, зарегистрированы и разрешены к применению в РФ живая интраназальная вакцина «Ультрагривак» (ЛСР-002340/09 от 25.03.2009) и инактивированная субъединичная адсорбированная вакцина «ОрниФлю» (ЛСР-001481/09 от 03.03.2009);

- определена стратегия профилактики гриппозной инфекции в период подготовки к пандемии.

Результаты и выводы диссертации могут быть использованы при разработке средств профилактики и лечения инфекционных заболеваний, имеющих пандемический потенциал.

Внедрение результатов работы. По теме работы разработана НТД (ФСП, инструкция по применению, регламент производства) на живую гриппозную вакцину «Ультрагривак», гриппозные инактивированные адсорбированные субъединичную «ОрниФлю» и расщепленную виросомальную «АвиФлю». Технологические решения, оформленные в регламентах производства на живую гриппозную вакцину «Ультрагривак» и инактивированные адсорбированные субъединичную «ОрниФлю» и расщепленную виросомальную «АвиФлю», внедрены на филиалах ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ: в г. Иркутске «Иркутское предприятие по производству бактерийных препаратов» и г. Уфе «Иммунопрепарат».

В марте 2009 г. в РФ зарегистрированы и разрешены к применению две «макетные» пандемические гриппозные вакцины:

- инактивированная субъединичная адсорбированная «ОрниФлю» (ЛСР-001481/09 от 03.03.2009);

- живая «Ультрагривак» (ЛСР-002340/09 от 25.03.2009).

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы

доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 21-22 ноября 2006 г.), Международном семинаре-тренинге «Актуальные вопросы защиты населения от биологических угроз» (Москва, 17-19 октября

2007 г.), Шестой международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 12 октября 2007 г.), Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 17-18 апреля

2008 г.), Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к

пандемии гриппа» (Новосибирская обл., Кольцово, 9-10 октября 2008 г.), IV научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (Краснодарский край (пос. Джемете), 9-12 сентября 2008 г.), Проблемной комиссии РАМН «Грипп и гриппоподобные инфекции, включая особо опасные. Фундаментальные и прикладные аспекты изучения. (Санкт-Петербург, 19 февраля 2009 г.), VII съезде аллергологов и иммунологов СНГ. II Всемирный форум по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 26-28 апреля 2009 г.), Международной конференции «Актуальные проблемы в области развития и внедрения противогриппозных вакцин и вакцин против гриппа птиц» (г. Иркутск, 14-15 мая 2009 г.), X международном конгрессе, посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», г. Казань, 20-23 мая 2009 г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 56 печатных работ, в том числе в 15 журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 484 страницах текста и включает введение, три главы обзора литературы, пять глав собственных исследований, заключение, выводы, 129 таблиц и 34 рисунка. Список литературы содержит 317 источников, из них 24 отечественных и 293 иностранных.

Личный вклад автора. Тема и план диссертации, ее основные идеи и содержание сформулированы на основании проведенных исследований. Проекты конструирования, планирование и проведение доклинических и клинических исследований препандемических гриппозных вакцин проведены при непосредственном участии автора. Автор принимал личное участие в заседаниях ВОЗ, Проблемной Комиссии и Комиссии по гриппозным вакцинным и диагностическим штаммам по вопросам, связанными с подготовкой к пандемии гриппа. Во всех совместных исследованиях по теме диссертации, наряду с личным участием в их проведении, автору принадлежит участие в анализе полученных данных. Все

материалы, использованные в диссертационной работе, проанализированы и обобщены лично автором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы:

Вакцинные штаммы

При конструировании «макетных» пандемических вакцин использованы два вакцинных штамма, рекомендованные ВОЗ и полученные методом обратной генетики, и один штамм, на основе апатогенного утиного штамма Н5, полученный в РФ методом классической рекомбинации (реассортации).

Штамм NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), клайд 1, предоставлен Национальным институтом биологических стандартов и контроля (NIBSC), Великобритания. Штамм A/Indonesia/5/2005, клайд 2.1., получен из Института по контролю за заболеваниями (CDC), США.

Реассортанты NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5Nl) и

A/Indones¡a/5/2005 (H5N1) разработаны на основе штамма A/PR/8/34(HlNl) и содержали модифицированные методами обратной генетики НА и NA. Соотношение генов в штаммах 6:2, история пассирования - клеточная культура VERO - 1 пассаж, развивающиеся куриные эмбрионы (РКЭ) - 2 пассажа.

Методом классической рекомбинации, в ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН, подготовлен вакцинный штамм А/17/утка'Потсдам/86/92(Н5Ы2)[17/Н5], на основе апатогенного утиного штамма вируса А/утка/Потсдам/1402-6/86(Н5Ш) и холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(Н2К2). Соотношение генов в вакцинном штамме А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Н2)[17/Н5] - 7:1, с историей пассирования - 7 пассажей в РКЭ в процессе реассортации.

Субстрат накопления

В качестве субстрата накопления вакцинных штаммов использованы 10 - суточные РКЭ.

и

Культуры клеток

Для определения биологической активности штаммов вирусов гриппа птиц в исследованиях использованы перевиваемые культуры клеток почек зеленых мартышек - Vero В, почек собаки - MDCK. В качестве ростовой среды и среды поддержания использовали полусинтетическую среду (ПС-4) на базе раствора Хенкса (раствор Эрла для культуры клеток Vero В), содержащую 7,5 и 2 % сыворотки крупного рогатого скота, соответственно.

Адъюванты

В качестве адъювантов использованы: алюминия гидроксид («Brenntag Biosector», Дания), Полиоксидоний® - сополимер N-окиси 1,4 этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазшшй бромида («Группа Компаний Петровакс», г. Москва), Глутоксим® - Бис-(гамма-Ь-глутамил)-Ь-цистеинил-бис-глицин динатриевая соль (ЗАО «ФАРМА ВАМ», г. Москва).

Исследуемые вакцины против гриппа птиц

На основе вакцинных штаммов приготовлены три типа инактивированных (цельновирионная, сплит (расщепленная) и субъединичная) и живая атгенуированная вакцины против гриппа птиц.

Инактивированная цельновирионная вакцина против гриппа птиц, на основе штамма NIBRG-14 (A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), изготовлена по технологии получения Вакцины гриппозной инактивированной элюатно-центрифужной жидкой, зарегистрированной и разрешенной к применению в РФ.

Инактивированная субъединичная вакцина против гриппа птиц, на основе штамма NIBRG-14 (A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), получена по технологии производства сезонной вакцины «Гриппол» (Вакцина гриппозная тривалентная полимер-субъединичная жидкая), зарегистрированной и используемой в РФ в рамках календаря профилактических прививок. В зависимости от входящих в состав препарата адъювантов сконструированы 2 вида субъединичных вакцин — «ОрниФлю» - вакцина сорбированная на алюминии гидроксиде и «ВГИПС» - вакцина в смеси с Полиоксидонием.

В основе технологии приготовления инактивированной сплит (расщепленной) вакцины против гриппа птиц «АвиФлю» использованы подходы, отработанные на новой сезонной инактивированной расщепленной вакцине «Грифор», зарегистрированной в 2008 г. в РФ. Инактивированная расщепленная вакцина против гриппа птиц, поэтапно, произведена на основе штаммов NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5N1), A/Indonesia/5/2005(H5Nl), А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ш)[17/Н5]. Принципиальное отличие конструкции данной вакцины заключалось в использовании адъюванта алюминия гидроксида и в пространственной структуре препарата в форме виросом.

«Ультрагривак» - живая атгенуированная вакцина против гриппа птиц, приготовлена на основе вакцинного штамма

А/17/утка/Потсдам/8б/92(Н5К2)[17/Н5], произведена по технологии сезонной гриппозной вакцины «Ультравак», успешно применяемой в РФ для предотвращения и снижения заболеваемости гриппом различных возрастных групп на протяжении более 30 лет.

Экспериментально-производственные серии живой и инактивированных вакцин против гриппа птиц произведены на филиалах ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ: в г. Иркутске «Иркутское предприятие по производству бактерийных препаратов» и г. Уфе «Иммунопрепарат».

Вирулентный штамм вируса гриппа птиц А/H5N1

Для оценки протективных свойств полученных вакцин против гриппа птиц использован дикий вирулентный штамм вируса гриппа птиц А/курица/Курган/Россия/2/05 (H5N1).

Штаммы вируса гриппа птии. используемые при оиенке кросс-реактивности вакцин против гриппа птиц

При изучении кросс-реактивности вакцины живой атгенуированной «Ультрагривак» использован штамм вируса гриппа птиц A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005 (H5N1), выделенный в Новосибирской области в 2005 г. Кроме того, при исследовании сывороток крови привитых

вакциной «Ультрагривак» использованы гетерологичные вакцинные штаммы: NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(HSN1), AAndonesi а/5/2005 (H5N1).

При оценке кросс-реактивности вакцины инактивированной расщепленной «АвиФлю» применены гетерологичные вакцинные штаммы: NIBRG- 14(A/Vietnam/1194/2004(H5Nl), A/Indonesia/5/2005 (H5N1) и А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ы2)[17/Н5].

Лабораторные животные Лабораторно-экспериментальные (доклинические) исследования проведены на белых беспородных половозрелых мышах обоего пола, массой 18-20 г; морских свинках обоего пола, массой 200-250 г; кроликах породы «Шиншилла» обоего пола, массой 2,5- 3 кг; курах породы белый Леггорн в возрасте 4-х недель; хорьках обоего пола в возрасте 4-х месяцев; обезьянах: яванских макаках, массой от 2,5 до 3,0 кг, павианах гамадрилах, массой от 2,3 до 2,7 кг, зеленых мартышках, массой 2,0 кг, макаках резусах, массой 2,4 кг.

Биоматериалы

Кровь и сыворотки крови, полученные от иммунизированных животных, изучали в рамках доклинических исследований.

Кровь и сыворотки крови, мочу и носоглоточные смывы привитых добровольцев изучали в рамках клинических исследований. Получение и обработку клинических материалов проводили согласно «Методическим указаниям по проведению контроля противогриппозных препаратов» от 16.11.84 или МУК 4.2.2136-06. Методы:

Электронная микроскопия Вакцины против гриппа птиц на различных технологических стадиях приготовления исследовали в электронном микроскопе JEM 100-СХ (JEOL, Япония) при инструментальном увеличении 58000х, напряжении 80 кВольт и апертурной диафрагме 50 мкм. Фотографирование производили на фотопленку (Agfa Alliance Camera СЕ, Германия). Морфологический анализ изучаемых образцов проводили методом негативного контрастирования.

Метод электрофореза Определение чистоты, гомогенности и молекулярной массы антигенов, входящих в состав инактивированных вакцин, проводили методом электрофореза в 12 % полиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия (808) в нередуцирующих условиях с последующей окраской геля Кумасси ярко-голубым 11-250. В испытаниях использовали полуфабрикаты вакцин перед добавлением стабилизаторов, консервантов и других компонентов, входящих в состав лекарственной формы.

Доклинические исследования Доклинические исследования проводили в соответствии с Федеральным законом о лекарственных средствах от 22 июня 1998 г. № 86-ФЗ, приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 № 267 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» и рекомендаций руководств.

На лабораторных животных проводили оценку безопасности вакцин против гриппа птиц по следующим критериям: острая токсичность, хроническая токсичность, влияние на гематологические показатели, местное и местно-раздражающее действие, гиперчувствительность немедленного типа, гиперчувствительность замедленного типа, генетическая стабильность.

Эффективность вакцин против гриппа птиц на лабораторных животных включала оценку иммуногенных свойств в ИФА, РТГА, РН и протективных свойств - после инфицирования вирулентным штаммом вируса гриппа птиц.

Клинические исследования Клинические исследования проводили в соответствии с Федеральным законом о лекарственных средствах от 22 июня 1998 г. № 86-ФЗ, приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 № 266 «Правила клинической практики в Российской Федерации», национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р52379-2005 «Надлежащая клиническая практика», согласно Европейским Предписаниям по йСР и Хельсинской Декларации и утвержденным протоколам, на основании решений Федерального комитета по этике и разрешений Росздравнадзора.

Критерии переносимости, реактогенности и безопасности включали оценку витальных показателей (АД, ЧСС, t° тела), нежелательных явлений (местные и системные реакции), согласно МУ 3.3.2.1758-03 «Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа» и лабораторных показателей (IgA, lgM, IgG, lgE, OAK, OAM, б/х крови).

Иммуногенные свойства вакцин против гриппа птиц изучали в РТГА, РМН, ИФА, определяя уровень сероконверсии, уровень серопротекции, фактор сероконверсии, величину среднегеометрического титра антител. После вакцинации живой аттенуированной вакциной против гриппа птиц также проводили оценку секреторного IgA и специфического IgG.

Анализ гена гемагглютинина Н5 вируса гриппа методом ПЦР

Анализ гена гемагглютинина серотипа Н5 в вируссодержащем материале проводили с использованием коммерческих наборов «АмплиСенс Influenza virus Н5» - для выявления РНК вируса гриппа А и идентификации субтипа H5N1 методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флюоресцентной детекцией по «конечной точке».

Анализ нуклеотидных последовательностей генов PEI, РВ2. РА. М. и

NS

Вирусную РНК выделяли из вируссодержащей культуральной жидкости набором RNeasy Mini kit «Qiagen» (Valencia, CA). Реакцию обратной транскрипции проводили с праймером Uni-12, комплементарным 3'-концевой последовательности всех сегментов генома вируса гриппа с помощью ревертазы M-MulV «СибЭнзим» (Россия). Методом ПЦР с использованием специфичных праймеров на гены РВ1, РВ2, PA, NP, М, и NS вируса гриппа получены фрагменты ДНК генов. Постановку полимеразной реакции осуществляли на амплифнкаторе Dyad «BioRad».

Определение концентрации секреторного IgA в назальных смывах методом ИФА

Для исследования использовали набор реагентов для иммуноферментного определения концентрации секреторного иммуноглобулина класса А в биологических жидкостях («Вектор-Бест», Россия). Концентрацию slgA в образцах определяли по калибровочному графику. Чувствительность анализа составляла 0,35 мг/л.

Определение активности цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), сенсибилизированных к вирусу гриппа Идентификацию (предсказание) ЦТЛ-эпитопов в последовательностях белков вируса гриппа А (ВГА) для оценки ВГА-специфического ответа CD8+ Т-лимфоцитов (TCD8+) в реакции ELISPOT ИФН-гамма проводили с помощью программы ProPredl и оригинального программного обеспечения QMpredict. Шесть пептидов для ELISPOT ИФН-гамма анализа: GILGFVFTLTV, RMVLASTTAK, ELRSRYWAI, SRYWAIRTR, CTELKLSDY, KMNTQFEAV, были синтезированы стандартным твердофазным методом на тритильном полимере с использованием Nsc-аминокислот. Очистку пептидов обращено-фазовой ВЭЖХ проводили на колонке 15x250 мм с полимером PLRP (Polymer Laboratories Reverse Phase) 300A 15-20 мкм в градиенте ацетонитрила с 0,1% трифторуксусной кислотой (ТФУ). Для постановки ELISPOT ИФН-гамма использовали наборы Human IFN-gamma ELISPOT Set, Pierce Product # ELS002 и 96-луночные планшеты Millipore MultiScreenHTS-IP Filter Plates for ELISPOT, Millipore Product # MSIPS4W10.

Статистическая обработка данных При анализе полученных результатов определяли средние величины и стандартное отклонение (М±ст). Оценку статистической достоверности различий проводили при помощи компьютерной программы Statistica (версия 6,0) с использованием теста t-распределения Стьюдента для выборок с нормальным распределением, или непараметрических критериев Уилкоксона-Манна-Уитни.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Конструирование и изучение физико-химических и молекулярно-биологических свойств «макетных» пандемических вакцин против

гриппа

Позиция ВОЗ по вопросу использования вакцин с целью профилактики гриппозной инфекции сводится к тому, что наиболее надежными средствами защиты от вирусных инфекций являются вакцинные препараты, формирующие при иммунизации напряженный и длительный иммунитет.

Необходимость разработки новых подходов в конструировании и изучении свойств препандемических гриппозных вакцин связана с невозможностью применения классических подходов получения вакцинных штаммов, неэффективностью использования традиционных схем (кратность, интервал введения, дозы), используемых в настоящее время для специфической профилактики сезонного гриппа, а также необходимостью включения в состав инактивированных препаратов адъювантов, с целью повышения иммуногенных свойств вакцин и уменьшения дозы антигена, без потери эффективности.

Использование в технологии приготовления вакцин концентрирования и очистки вируса методами высокоскоростного центрифугирования, а также добавление детергента тетрадецилтриметиламмония бромида (ТДТАБ) позволило получить высокоочищенные субъединичные препараты с низкой реактогенностью и достаточной иммуногенностью. Используя отработанные технологические подходы на основе штамма МВ1Ш-14 (АЛ^еЬгатЛ194/2004), были сконструированы прототипы пандемической инактивированной субъединичной вакцины против гриппа птиц Н51Ч1 («ОрниФлю», «ВГИПС»). Методом электронной микроскопии выявлено, что основными морфологическими структурами полуфабриката вакцин были специфические объединения гемагглютининов (розетки), а также минивиросомы размером от 22 до 50 нм (рис. 1). При проведении электрофореза в ПААГ показано, что очищенные вирионы вируса гриппа

птиц Н5?\П содержали в составе как внутренние, так и наружные антигены.

Проведение технологических операций приготовления субъединичной

вакцины позволило получить высокоочищенный препарат, состоящий из

поверхностного белка НАо и следовых количества ^ (рис. 2).

Рисунок 1 - Полуфабрикат вакцины «ОрниФлю», субтип Н5М, штамм КШГШ -14( А/УтеШат/! 194/2004)

Рисунок 2 - Анализ полипептидного состава вакцины «ОрниФлю»

1. Препарат очищенных вирионов вируса гриппа птиц, штамм NIBRG-14 (A/Vietnam/1194/2004);

2. Полуфабрикат вакцины «ОрниФлю», штамм NIBRG-14 (A/Vietnam/1194/2004).

В отличие от технологии приготовления инактивированных субъединичных вакцин «ОрниФлю» и «ВГИПС», при конструировании расщепленной виросомальной вакцины «АвиФлю» использовали более щадящий метод инактивации вирусов гриппа-ультрафиолетовое облучение, позволяющее сохранять в нативном состоянии структуру вирионов, новый детергент - бета октилгликозид, обеспечивающий возможность самосборки структур в форме виросом, моделирующих пространственную структуру вирионов вируса гриппа, а также современные методы концентрирования и очистки с использованием хромотографических установок.

При морфологическом исследовании полуфабриката расщепленной виросомальной вакцины выявлено наличие в материале большого количества виросом диаметром 100-180 нм, на поверхности которых неравномерно располагались гемагглютинины. В отличие от вирионов виросомы

НАо

NP

представляли собой слабо структурированные «пустые» частицы, состоявшие из оболочки и упомянутых выше гемагглютининов (рис. 3, 4). При изучении полипептидного состава инактивированной расщепленной виросомальной вакцины «АвиФлю», приготовленной на основе штаммов АЛп<1опеиа/5/2005 (Н5Ш) и А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ы2)[17/Н5] установлено, что препараты содержали поверхностный антиген вируса НАо и внутренние белки М1 и К'Р. Молекулярная масса полипептидов НАо отличалась в зависимости от штаммов, так для штамма А/1п(1опе51 а/5/2005 (Н5Ш) она составляла 75 кДА, а для штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ы2)[17/Н5] - 72 кДа (рис. 5).

Рисунок 3 - Полуфабрикат вакцины «АвиФлю», субтип Н5К1, штамм А/Ыопе$1а/5/2005 (Н5Ш)

Рисунок 4 - Полуфабрикат вакцины «АвиФлю», субтип Н5Ы2, штамм А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ш)[ 17/Н5]

Рис. 5 - Анализ полипептидного состава вакцины «АвиФлю»

1. Полуфабрикат вакцины «АвиФлю», штамм А/Ыопе81а/5/2005 (Н5Ы1).

2. Полуфабрикат вакцины «АвиФлю», штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5Ы2)[17/Н5].

Для усиления иммуногенных свойств в конструкции «макетных» инактивированных субъединичной и расщепленной виросомальной вакцин использованы адъюванты - алюминия гидроксид (вакцины «ОрниФлю», «АвиФлю») и Полиоксидоний (вакцина «ВГИПС»),

На первом этапе исследований, согласно регулирующим стандартам по проведению доклинических испытаний новых МИБП и в соответствии с согласованным с ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича «Протоколом исследования», оценена переносимость и безопасность сконструированных препаратов на двух видах лабораторных животных (белые беспородные мыши и морские свинки).

В результате проведенных исследований показано, что инактивированные цельновирионные (несорбированная и сорбированная на алюминии гидроксиде) препандемические вакцины, полученные на основе штамма Ы1В11С-14 (А/\,1е1лаш/1194/2004 (Н5Ы1), обладали токсическими свойствами, плохо переносились и вызывали у лабораторных животных изменения в поведении, снижение двигательной активности и аппетита, изменение шерстяного покрова. Кроме того, у животных, иммунизированных этими препаратами, при патоморфологическом и гистологическом изучении наблюдали образования лимфогистиоцитарных инфильтратов в печени и незначительную гиперплазию единичных лимфоидных фолликулов в ткани селезенки, что могло быть одним из проявлений реакции на вводимые препараты. При изучении местного действия инактивированной цельновирионной вакцины сорбированной на алюминии гидроксиде отмечали выраженные местные воспалительные реакции в виде покраснения и отека. У лабораторных животных после введения инактивированной субъединичной вакцины в смеси с Полиоксидонием местные реакции оказались менее выраженными.

Экспериментальные образцы сконструированных препандемических вакцин против гриппа птиц (инактивированные субъединичные и расщепленная) в остром опыте при однократном внутрибрюшинном введение в дозах 0,65 мкг/кг и 2250 мкг/кг - для белых мышей и 0,65 мкг/кг и 181,7 мкг/кг - для морских свинок, не вызывало клинических симптомов интоксикации (гибели животных, снижение массы тела, образование воспалительных экссудатов, выпотов, некробиотических изменений). Ежедневное в течение 14 сут подкожное введение этих препаратов в

суммарной дозе 181,7 мкг/кг - для морских свинок и 2250 мкг/кг - для белых мышей, не вызывало гибели животных, не приводило к снижению массы тела, изменению поведения и самочувствия иммунизированных лабораторных животных, что явилось доказательством хорошей переносимости и безопасности разработанных вариантов вакцин.

После отработки ряда технологических деталей и результатов, полученных в рамках экспериментальных исследований, определены перспективные для дальнейших исследований четыре прототипа вакцин против гриппа птиц Н5: «ОрниФлю» - инактивированная субъединичная сорбированная на алюминии гидроксиде; «ВГИПС» - инактивированная субъединичная в смеси с Полиоксидонием; «АвиФлю» - инактивированная расщепленная виросомальная сорбированная на алюминии гидроксиде; «Ультрагривак» - живая интраназальная.

С целью оптимизации схемы иммунизации (кратности введения препарата), выбора инфицирующей дозы вируса гриппа птиц (штамм А/курица/Курган/Россия/2/2005 (Н5Ш)), для оценки иммуногенных (РТГА, РН, ИФА) и протективных свойств экспериментальных образцов живой и инактивированных вакцин против гриппа птиц использовали белых мышей.

В результате экспериментальных исследований «макетных» вакцин против гриппа птиц было показано, что для формирования иммунного ответа у лабораторных животных необходимо проводить не менее двух иммунизаций с интервалом 21-28 сут (для инактивированных) и 10 сут (для живой). Обязательным условием повышения иммуногенноста сконструированных инактивированных вакцин явилось включение в их состав адъювантов, наиболее перспективными из которых, явились алюминия гидроксид и Полиоксидоний.

При сравнительном изучении иммуногенных и протективных свойств разработанных экспериментальных образцов вакцин установлена зависимость эффективности вакцин от схемы иммунизации животных. Увеличение дозы и кратности введения существенно повышали иммуногенные и защитные свойства как живой, так и для инактивированных

вакцин. Для инактивированных вакцин («ОрниФлго», «ВГИПС», «АвиФлю») наиболее оптимальной схемой иммунизации оказалось двукратное (с интервалом 21-28 суток) введение препаратов в дозе 15 мкг НА. Такая тактика вакцинации приводила к индукции ИФ-АТ в титрах от 1:80 до 1:320, АГА - от 1:10 до 1:40 и ВНА - 1:20 и защищала от заражения вирулентным штаммом (27 ЛД5о) от 50 до 80 % белых мышей. Наиболее эффективными являлись инактивированные субъединичная и расщепленная виросомальная вакцины, сорбированные на гидроокиси алюминия, обеспечивающие 71 и 80 % выживаемости животных. Субъединичная вакцина в смеси с Полиоксидонием оказывала менее выраженный защитный эффект - в пределах 50 %.

При двукратном интраназальном введении с интервалом в 10 суток в дозе 106'4 ЭИД5о живая вакцина «Ультрагривак» вызывала индукцию ИФ-АТ в титре 1:1280, АГА- 1:180, ВНА - 1:40, и обеспечивала защиту 87 % белых мышей от интраназального заражения вирулентным вирусом гриппа птиц в дозе 27 ЛД50, что соответствовало требованиям к медицинским средствам защиты (OTT 8.1.112-98). Однократная иммунизация в аналогичных условиях обеспечивала защиту только 57 % животных. В контрольных группах, зараженных той же дозой вирулентного возбудителя, погибли 100 % особей, что подтвердило обоснованность выбора инфицирующей дозы вирулентного штамма (табл. 1)

Таблица 1 - Оценка иммуногенных и протективных свойств вакцин против гриппа птиц на белых мышах

№ Вакцина Иммуни- Средняя величина титров Доля выживших

п/п зация антител после иммунизации в животных после

серологических реакциях инфицирования,

ИФА РН РТГА %

1. «АвиФлю» 1 1:40 <1:10 <1:10 33

2 1:160 1:33 1:40 71

2. «ОрниФлю» 1 1:80 1:10 <1:10 40

2 1:320 1:20 1:10 80

3. «ВГИПС» 1 <1:40 <1:10 <1:10 20

2 1:80 1:20 1:20 50

4. «Ультрагривак» 1 1:320 1:14 1:40 57

2 1:1280 1:40 1:180 87

5. Контроль 1,2 <1:10 <1:10 <1:10 0

В рамках лабораторно-экспериментальных исследований изучены физико-химические и иммунобиологические свойства и выбраны наиболее перспективные вакцинные кандидаты: живая интраназальная («Ультрагривак») и инактивированные субъединичные («ОрниФлю», «В ГИПС»), расщепленная виросомальная («АвиФлю»),

Доклиническое и клиническое изучение живой гриппозной вакцины «Ультрагривак»

Экспериментальные серии «макетной» вакцины «Ультрагривак» наработаны на Иркутском предприятии ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ с использованием штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ы2)[17/Н5].

В рамках доклинических исследований показано, что реассортантный штамм А/17/утка/Потсдам/8б/92(Н5К2) сохранял молекулярную структуру НА и оказался антигенно-идентичным родительскому птичьему вирусу; он не был патогенен для кур; проявлял аттенуирующий фенотип при интраназальном введении мышам, активно репродуцируясь в ВДП при сниженной репродукции вируса в легких; вызывал образование системных и локальных антител не только к гомологичному вирусу, но и к высокопатогенным вирусам подтипа Н5М1; при однократном введении создавал высокий уровень резистентности к инфекции высокопатогенным вирусом подтипа А(Н5М1). Вакцина гриппозная живая «Ультрагривак» оказалась иммунологически эффективным препаратом, вызывая выработку: 1) ИФ-АТ в титре 1:320 при однократном и 1:1280 при двукратном (с интервалом 10 сут) введении в дозе 106'4 ЭИД50 белым мышам массой 14-16 г, 2) вируснейтрализующих антител в титре 1:40 при двукратном введении и 3) гемагглютинирующих антител при однократном введении в титре 1:40, при двукратном - 1:80 и 4) обеспечивала 100 % защиту от заражения 8 ЛД50 и 87 % защиту от 27 ЛД50 вирулентного штамма вируса гриппа птиц А/курица/Курган/Россия/2/2005 (Н5Ы1) (табл. 2).

Таблица 2 - Результаты оценки антигенных и протективных свойств вакцины «Ультрагривак» на белых мышах

Схема введе ния вакцины Титр в ИФА Титр в РН Титр в РТГА Зара жаю шая доза, ЛД50 Количество погибших животных после заражения на ... сутки Продол житель ность жизни живот ных (х±5), сут. Доля выжив ших, про цент

ДО инфи циро в алия после инфи циро вания крат ность превы шения, раз до инфиц ирова ния после инфиц ирова ния до ин фи циро ва ния после инфи циро вания крат ность превыше ния, раз

5 6 7 s 9 10 п 12 13 14

Одно кратное 1:320 1:2560 8 <1:10 1:160 1:40 1:320 8 8 0 0 1 3 2 0 0 0 0 0 8Д±0,8 60 (9/15)

1:2560 8 1:160 1:160 4 27 1 1 * 2 3 0 0 0 0 0 0 73=1,2 57 (8/14)

Дву кратное 1:1280 1:1280 1 1:40 1:80 1:80 1:160 2 8 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 - 100 (15/15)

1:1280 1 1:80 1:160 2 27 0 0 1 1 0 0 0 0 0 0 7,5±0,7 87 (13/15)

Контроль (неиммунизиро ванные) 8 0 0 1 1 8 8,7±0,7 0

27 0 0 1 6 3 8,2±0,6 0

Примечание 1.- 1*-у погибшего животного вирус гриппа Н5Ш из легких не выделили, при вскрытии отсутствовал характерный признак поражения легких - «красное опеченение». 2.4-кратное и более превышение титра в ИФА после заражения свидетельствует о перенесенной инфекции животных.

Оценивая влияние иммунизации живой вакциной против гриппа птиц на лунный статус обезьян, необходимо отметить, что вакцинация обеспечивала вление специфических титров АТ, определяемых в реакциях ИФА, РН и РТГА. ггрольная группа яванских макак была интраназально заражена вирусом Н5К1 дала картину клинического заболевания гриппом с повышением температуры, цими реакциями, выделением вируса из крови и назальных смывов. Опытную ппу обезьян одно- и двукратно иммунизировали интраназально вакциной иьтрагривак», а затем через 31 и 42 сут инфицировали вирулентным штаммом N1. У вакцинированных обезьян выявляли 4-8 кратный прирост титров

ител в ИФА и РН. Двукратная вакцинация обезьян обеспечивала 100 % защиту заражения вирусом Н5!\'1. Наряду со стимуляцией системного иммунитета растания титра антител в сыворотке крови) отмечали стимуляцию козального иммунитета, оцененного по появлению в^А в носовых секретах, нократная вакцинация не обеспечивала формирование напряженного мунитета у животных. Вторая иммунизация приводила к приросту титров гител, что указывает на обоснованность использования двукратной схемы мунизации. Эти данные дают основание утверждать, что живая енуированная вакцина «Ультрагривак» для интраназального введения является ювным кандидатом для профилактики возможной пандемии гриппа, (лученные результаты позволили обосновать целесообразность проведения рвого этапа клинических исследований на ограниченном контингенте бровольцев.

Данные клинического обследования добровольцев и проведенные бораторно-инструментальные исследования свидетельствовали об отсутствии клонений в самочувствии и в результатах анализов после иммунизации бровольцев вакциной «Ультрагривак» в сравнении с фоновыми значениями.

Мппиы« рся«а*ии

3 Окгугсгзви« ГВ «авто мое

Рисунок 6 - Местные реакции на введение вакцины «Ультрагривак» Местные реакции на 4, 5 дни после первой вакцинации характеризовались катаральными явлениями в носоглотке, имели слабовыраженный транзиторный характер и исчезали на 6 день (рис.6). Местных реакций средней и сильной степени выраженности, а также системных реакций у привитых добровольцев не наблюдали. Результаты клинического, биохимического анализов крови и общего анализа мочи в процессе вакцинации не претерпели существенных изменений относительно нормальных значений.

Реизоляты проявляли и са фенотип, сохраняли изменения в генах внутренних и неструктурных белков, а также характерные для донора аттенуации биологические свойства, что свидетельствовало о генетической стабильности вакцины «Ультрагривак» (табл. 3).

Таблица 3 - Оценка генетической стабильности вакцины «Ультрагривак»

Интервал между введением Вакцинация Основные мутации в генах внугренних и неструктурных белков решолятов, характерные для [ 17/Н5]

РВ2-1459 РВ1-8191 РА-107 РА-1045 М-969 NS-798

10 сут VI Т Т С Т А А

V2 Т Т С Т А А

21 сут VI Т Т с т А А

V2 Т Т с т А А

Изучение локального иммунного ответа в носовых секретах волонтеров, привитых вакциной «Ультрагривак» показало достоверные приросты концентрации х^А в ИФА (более чем в 2 раза), по сравнению с

исходными значениями после двукратного введения препарата, независимо от интервала введения 10 или 21 сут (рис. 7).

ееейм« 1т«1Ч*1Ш -10 еут

№(т»р#а л »варения препаратов -21 еут

1в Вакцина ■ Плацебо I

Рисунок 7 - Оценка местного иммунитета на введение вакцины «Ультрагривак»

При оценке в РМН сывороток крови привитых добровольцев после двукратной вакцинации процент лиц с титром антител 21:20 составил более 70 %, с титром антител >3:40 - более 50 %, при этом кратность прироста СГТ антител соответствовала 5 (рис. 8).

о Уровень сароконвврсии «Уровень ссропротвкции офакторсорохомвврсии |

10 сут

Угътрафюак

Интервал введения 10 суток

Рисунок 8 - Оценка иммуногенных свойств вакцины «Ультрагривак»

II фаза клинических исследований вакцины «Ультрагривак» проведена с целью оценки реахтогенности, безопасности, местного, клеточного и гуморального иммунных ответов, выбора оптимальной схемы (интраназальная двукратная с интервалами 10 и 21 сут) вакцинации, а также

возможности усиления иммуногенности препарата за счет увеличения дозы с 6,9 ^ ЭИД50/0,5 мл до не менее 7,5 ^ ЭИД50/0,5 мл на двух клинических базах с участием 200 добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет.

Препарат, вне зависимости от интервала введения 10 или 21 сут, характеризовался хорошей переносимостью, безопасностью и низкой реактогенностью. Местные реакции были представлены катаральными явлениями в носоглотке, носили слабовыраженный транзигорный характер и исчезали через 1-2 суток (рис. 6). Уровни сывороточных иммуноглобулинов классов А, М, О и. Е, у всех добровольцев в течение периода исследования сохранялись в пределах нормальных значений. Получены положительные данные о выделяемое™ вируса из носовых ходов привитых, что доказывало хорошую приживаемость вакцины. Для выделения вакцинного вируса на чувствительных культурах клеток потребовалось 2-3 пассажа, что свидетельствовало о незначительном содержании вируса в мазках из полости носа привитых и подтверждало безопасность вакцины для окружающих (рис.

9).

I а VI / 21 суг Ш VI /То сут

Рисунок 9 - Оценка безопасности вакцины

Изоляции [^/Н^'йреэ сут после еахцшацик. % |ВУ2/ 21 сут ■ \'?Ц0_сут]

«Ультратривак» для окружающих

Генетическая стабильность реизолятов вакцинного вируса продемонстрирована молекулярно-биологическими методами и явилась гарантией безопасности применения вакцинного штамма у людей.

Показано, что вакцина «Ультрагривак» способна обеспечить иммунный ответ не только в отношении гомологичного вакцинного штамма

А/17/утка/Потсдам/86/92 H5N2 [17/Н5], но и в отношении других штаммов вируса гриппа птиц A (H5N1): A/Vietnam/1194/2004 и A/lndonesia/5/2005, что доказывает высокую кросс-реактивность препарата (рис. 10).

Рисунок 10 - Оценка кросс-реактивности вакцины «Ультрагривак»

В результате проведенных клинических исследований установлено, что живая гриппозная вакцина «Ультрагривак ареактогенна, безвредна для вакцинируемых, безопасна для окружающих, индуцирует развитие местного, клеточного и гуморального иммунитета. Учитывая назначение вакцины «Ультрагривак» для быстрой специфической профилактики пандемического гриппа, преимущество имеет схема двукратного введения препарата с интервалом 10 сут, обеспечивающая полноценную защиту людей от инфекции в более короткие сроки.

Доклиническое и клиническое изучение инактивированных гриппозных вакцин «ОрниФлю», «ВГИПС» и «АвиФлю»

С целью оценки безопасности и эффективности полученных вакцинных кандидатов проведены доклинические исследования на лабораторных животных. В результате выявлено, что вакцины «ОрниФлю» и «ВГИПС» нетоксичны в остром и хроническом экспериментах, хорошо переносились животными, не обладали выраженными местными и местно-раздражающими действиями, не вызывали негативного влияния на

патоморфологические, гистологические и гематологические показатели. Незначительные колебания изучаемых показателей оказались более выражеными при использовании вакцины «ВГИПС». При изучении антигенных и протективных свойств показано, что для индукции иммунитета и получения эффективной защиты животных от патогенного вируса гриппа птиц необходимо проводить не менее двух инъекций. Наиболее оптимальной схемой иммунизации животных оказался вариант, предусматривающий внутримышечное двукратное с интервалом 28 сут в дозе 15 мкг НА введение препарата. При ее использовании наблюдали выработку ИФ-АТ в титрах от 1:80 до 1:320, АГА - от 1:10 до 1:40 и ВНА - 1:20 и защиту от гибели в пределах 50 - 80 % лабораторных животных, инфицированных вирулентным штаммом вируса птичьего гриппа А/курица/Курган/Россия/2/2005 (Н5Ш) (табл. 4).

В рамках I фазы сравнительных клинических исследований на ограниченном контингенте добровольцев (241 доброволец в возрасте от 18 до 50 лет) с целью оценки реактогенности, безопасности и иммуногенности при использовании трех дозировок препаратов (15,30 и 45 мкг НА) после одно- и двукратного введения изучены инактивированные субъединичные сорбированная на алюминии гидроксиде «ОрниФлю» и в смеси с Полиоксидонием «ВГИПС» вакцины против гриппа птиц.

Оба типа вакцин отличались хорошей переносимостью, безопасностью и низкой реактогенностью. Серьезных побочных реакций на введение вакцинных препаратов не было отмечено ни в одном случае. В большинстве случаев местные реакции слабой и средней степени выраженности наблюдались как у привитых вакциной «ОрниФлю», так и вакциной «ВГИПС» и были представлены болью в месте введения вакцин (рис. 11,12).

Уровень иммуногенности, индуцированный вакциной «ОрниФлю», содержащей 15 мкг НА, соответствовал уровню иммуногенности индуцированному вакциной «ВГИПС», содержащей 45 мкг НА (рис. 13), а также, по данным литературы, показателям иммуногенности индуцированным субъединичной вакциной без адъюванта, содержащей 90

мкг НА и адсорбированной субъединичной вакциной, содержащей 30 мкг НА.

Выявленные преимущества по содержанию антигена, способного индуцировать достаточный уровень специфического иммунного ответа и доказанная безопасность вакцины «ОрниФлю» с содержанием в одной прививочной дозе 15 мкг/доза НА, позволили рекомендовать проведение П фазы клинического исследования.

Таблица 4 - Антигенные и протективные свойства инактивированных субъединичных вакцин «ОрниФшю» и «ВГИПС»

Крат ность введения вакцины Препа рат Иммуни зирую щая доза, мкг НА Величина титра антител в Количество погибших животных после заражения на... сутки Продолжи тельносгь жизни животных (х±6), сут. Доля выживш их, процент

ИФА РН РТГА 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

Однократное «ВГИ ПС» 1,0 <1:40 <1:10 <1:10 0 0 4 4 1 2 0 0 0 0 8,1±1,1 15,4 (2/13)

15,0 <1:40 <1:10 <1:10 0 0 6 5 0 1 0 0 0 0 7,7±0,9 20,0 (3/15)

«Орни Флю» 1,0 <1:40 <1:10 <1:10 0 0 9 5 0 0 0 0 0 0 7,4±0,5 6,7 (1/15)

15,0 <1:80 <1:10 <1:10 0 0 7 2 0 0 0 0 0 0 7,2±0,4 40,0 (6/15)

Двукратное «ВГИ ПС» 1,0 1:40 1:10 1:10 0 0 3 7 0 0 0 0 0 0 7,7±0,5 28,6 (4/14)

15,0 1:80 1:20 1:20 0 0 4 2 1 0 0 0 0 0 7,6±0,8 50,0 (7/14)

«Орни Флю» 1,0 1:40 <1:10 <1:10 0 0 6 7 1 0 0 0 0 0 7,б±0,6 6,7 (1/15)

15,0 1:320 1:20 1:10 0 0 3 0 0 0 0 0 0 0 7,0±0,0 80,0 (12/15)

Контроль (неиммунизированные) 0 0 1 6 3 0 0 0 0 0 8,2±0,6 0

Примечапие - заражающая доза 25 ЛД50

Рисунок 11 - Оценка местных реакций на введение вакцин «ОрниФлю» и «ВГИПС»

У* ТЪлецяуре ТЬсьц»*<ая утоьвоячмггь И Гою>сн 6а■ У у

Рисунок 12 - Оценка системных реакций на введение вакцин «ОрниФлю» и «ВГИПС»

Оценка иимуьопеиюсги в РУН

Рисунок 13 - Оценка иммуногенных свойств вакцин «ОрниФлю» и «ВГИПС»

В контролируемом проспективном рандомизированном многоцентровом двойном слепом исследовании приняли участие 360 добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет. В рамках проведенной 1 фазы исследований отмечено существенное влияние содержания алюминия гидрооксида на показатели иммуногенной активности вакцины «ОрниФлю». Принципиальным отличием данного препарата от конструкции вакцины «ОрниФлю», использованной в рамках проведения 1 фазы клинического исследования, являлось повышение концентрации алюминия гидроксида в составе препарата с 0,23 мг до 0,5 мг. В рамках II фазы исследовали вакцину «ОрниФлю» с антигенной нагрузкой 15 и 30 мкг/доза НА.

Препарат характеризовался хорошей переносимостью, безопасностью и низкой реактогенностью вне зависимости от использованной дозы. Побочных реакций сильной степени выраженности и серьезных нежелательных явлений на введение вакцины отмечено не было ни в одном случае. Местные реакции были слабой степени выраженности и наблюдались в группах лиц, привитых как вакциной «ОрниФлю», с антигенной нагрузкой НА 15 мкг/доза, так и с антигенной нагрузкой НА 30 мкг/доза. Достоверных различий по частоте возникновения местных реакций между этими группами выявлено не было. Системные реакции в основном имели слабую степень выраженности. Температурная реакция средней степени выраженности в большинстве случаев (5,9 %) наблюдалась в группе лиц, привитых вакциной «ОрниФлю», с антигенной нагрузкой НА 30 мкг/доза (рис. 14). Результаты клинического и биохимического анализа крови, а также общего анализа мочи в процессе вакцинации исследуемыми препаратами не претерпевали существенных изменений относительно нормальных значений.

до ill*

Рисунок 14 - Оценка местных и системных реакций на введение вакцины «ОрниФлю»

Учитывая отсутствие рекомендаций ВОЗ, СРМР, СНМР и ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора для оценки свойств подобного рода препаратов, полученные результаты клинических исследований позволили сформулировать следующие требования к иммуногенности вакцин против гриппа птиц, которые были утверждены Комиссией по гриппозным вакцинным и диагностическим штаммам МЗСЦ РФ: 1) препандемические вакцины должны после второй вакцинации на 21-28 сут вызывать прирост гомологичных антител в сыворотке крови в 4 и более раз не менее чем у 50 % добровольцев (сероконверсия); 2) повышение средних геометрических титров антител на 21-28 день после второй вакцинации по сравнению с исходным уровнем, выражается в кратности увеличения и должно составлять величину более 2,5 (фактор сероконверсии).

О ОрниФлю 1С миг НА Еэ ОрниФлю ЗО миг KAJ

Рисунок 15 - Оценка иммуногенных свойств вакцины «ОрниФлю»

Этим требованиям соответствовала вакцина «ОрниФлю», которая явилась первым препаратом для специфической профилактики гриппа птиц, рекомендованным к регистрации в РФ (рис. 15).

С целью повышения безопасности, иммуногенности и эффективности гриппозных вакцин в период с 2006 по 2008 г. на ФГУП «НПО «Микроген» разработана новая технология приготовления препарата. В результате сконструированы сезонная и макетная пандемическая йнактивированные расщепленные виросомальные вакцины.

При проведении доклинических исследований инактивированной расщепленной виросомальной сорбированной на алюминии гидроксиде вакцины «АвиФлю» показано, что препарат нетоксичен, не обладал выраженным местным и местно-раздражающим действием, не оказывал неблагоприятного воздействия на системы и органы лабораторных животных, что свидетельствовало о ее безопасности.

Проведение двукратной иммунизации белых мышей позволило индуцировать выработку антител, определяемых в ИФА, РТГА и РМН, а также защитить от гибели до 71,4 % инфицированных вирулентным штаммов вируса гриппа птиц в дозе 25 ЛД50 лабораторных животных. Кроме того выявлено, что вакцина «АвиФлю» с антигенной нагрузкой в 5 раз меньше, формировала более выраженный иммунитет чем вакцина «ВГИПС». Полученные результаты подтвердили правильность примененных конструктивных подходов в технологии создания препарата нового поколения для защиты от пандемического гриппа (табл. 5).

В открытом сравнительном контролируемом проспективном рандомизированном исследовании приняли участие 65 здоровых волонтеров (мужчины и женщины) в возрасте 18-50 лет с целью изучения реактогенности, безопасности, иммуногенности и кросс-реактивных свойств вакцины «АвиФлю». Клиническое исследование вакцины «АвиФлю» показало, что введение исследуемых серий препарата не сопровождалось развитием негативных явлений в поствакцинальном периоде, а возникшие

Кратность введения вакцины Иммуни зирую щая доза, мкг НА Величина титра ацтител в Количество погибших животных после заражения на .,. сутки Продолжительность жизни животных (х±5), сут. Доля выживших, процент

ИФА РН РТГА 5 6 7 8 9 10 И 12 13 14

Однократное 0,2 1:40 <1:10 <1:10 1 0 5 4 0 0 0 0 0 0 7,2±0,9 28,6 (4/14)

3,0 1:40 <1:10 <1:10 0 0 8 2 0 0 0 0 0 0 7,2±0,4 33,3 (5/15)

Двукратное 0,2 1:40 <1:10 1:10 0 1 2 5 1 0 0 0 0 0 7,7±0,9 35,7 (5/14)

3,0 1:160 1:20 1:40 0 0 1 2 1 0 0 0 0 0 8,0±0,8 71,4(10/14)

Контроль (неиммунизированные) 0 0 1 6 3 0 0 0 0 0 8,2±0,6 0

Примечание - заражающая доза 25 ЛД50

слабовыраженные общие и местные реакции были кратковременными и не вызывали ухудшения в состоянии здоровья привитых. В подавляющем большинстве случаев все реакции носили слабовыраженный характер и развивались в первые сутки после вакцинации (рис. 16, 17).

Рисунок 16 - Оценка местных реакций на введение вакцины «АвиФлю»

ЁЭ Ионышеммия

^лнли.иос п.

О Гиловокд^жсинс

Рисунок 17 - Оценка системных реакций на введение вакцины «АвиФлю»

Уровень сероконверсии и серопротекции при двукратной вакцинации с интервалом 28 сут достигал 100 % вне зависимости от введенной дозы и штамма препарата (рис. 18, 19).

Ш ln.li> - 15 1ТК1 Ш I !■()(> - ЗО МК1 Ш 1>исЬ - 15мкг

Рисунок 18 Уровень сероконверсии на введение вакцины «АвиФлю»

В |1мЬс. - 15 ' □ |пк> - ЗО МК1 П |Хкк- 15

Рисунок 19 — Уровень серопротекции на введение вакцины «АвиФлю» При исследовании сывороток крови привитых вакциной «АвиФлю» с гетерологичньши штаммами МВ1Ш-14 (А/У1е1пат/1194/2004) (Н5М1), А/17/утка/Потсдам/86/92 (H5N2), АЛпс1опе8*а/05/2005 (Н5Ы1) доказана высокая кросс-реактивность препарата (рис. 20).

11ЯК1111НЯ11НЯ

Рисунок 20 - Оценка кросс-реактивности вакцины «АвиФлю»

Представленные результаты свидетельствуют о том, что впервые в мировой практике получена «макетная» пандемическая вакцина, в составе которой содержится два адъюванта (виросомы-алюминия гидроксид), которая обладает низкой реактогенностью и высокой иммуногенностью, что может явиться стратегически правильным посылом в области разработки новых вакцинных препаратов.

Стратегии вакцинации населения с целью профилактики гриппозной инфекции в период подготовки к пандемии

Распространение вируса гриппа А/Н5 и А/Н1Ы18\¥1 вызывало серьезные опасения органов здравоохранения во всех странах мира. Несмотря на принимаемые правительствами стран противоэпидемические

меры и развертывание работ по созданию средств и способов защиты от возбудителя, заметных успехов в борьбе с гриппом пока не достигнуто.

Необходимо учитывать, что в настоящее время к вирусу гриппа А/ШШбху! у основной массы населения мира антитела отсутствуют, как и в случае с гриппом А/Н5, и, по-видимому, использование подходов (схем -кратности, интервалов, доз) отработанных на модели макетных вакцин А/Н5, в разработке пандемических вакцин А/НШ18ш1 может явиться реально действующей мерой, которая позволит защитить население РФ от надвигающейся новой пандемии гриппа.

Доклинические и клинические исследования «макетных» пандемических вакцин на основе серотипа А/Н5 были проведены на ведущих лабораторных и клинических базах РФ. В результате исследований отработаны схемы (кратность, интервал, дозы) применения, доказана безвредность для окружающих, безопасность, иммуногенность и эффективность вакцин (в тестах при оценке протективных свойств на лабораторных животных). Кроме того, принципиально важно, доказанная высокая кросс-реактивность «макетных» пандемических вакцин как в отношении штаммов А/Н5 циркулирующих на территории РФ, так и в отношении штаммов выделенных на других континентах мира.

Полученные результаты позволили в марте 2009 г. зарегистрировать две принципиально отличные друг от друга конструкции пандемических вакцин:

- инакгивированную субъединичную сорбированную на алюминии гидроксиде вакцину «ОрниФлю» (ЛСР-001481/09 от 03.03.2009) с содержанием 15 мкг НА в дозе;

- живую интраназальную вакцину «Ультрагривак» (ЛСР-002340/09 от 25.03.2009) с активностью не менее 7,5 ^ ЕЮ50в дозе.

В настоящее время данные вакцины официально разрешено использовать у людей в возрасте от 18 до 60 лет.

В результате внедрения в производство новых технологических подходов разработана «макетная» пандемическая инактивированная

расщепленная виросомальная вакцина «АвиФлю». При доклинических и клинических исследованиях показана безопасность, иммуногенность и высокая эффективность разработанной конструкции препарата.

Несмотря на значимый вклад вакцинопрофилактики в снижение заболеваемости гриппом, распространённость данной инфекции остаётся крайне широкой. Наиболее высокому риску заражения, развития осложнений и неблагоприятных исходов инфекции подвергаются дети, пожилые лица и лица, страдающие хронической сопутствующей патологией. Учитывая высокий пандемический потенциал новых вариантов вируса гриппа А/Н5 и А/НШ18\у1 стратегия профилактики гриппозной инфекции в период подготовки к пандемии должна предусматривать первоочередную вакцинацию следующих категорий граждан:

- работники коммунальной сферы обслуживания; работники, занятые в производстве и распределении электроэнергии; работники общественного транспорта; сотрудники федеральных органов исполнительной власти, где законодательно предусмотрена военная и (или) приравненная к ней служба.

Данную категорию желательно прививать живой интраназальной вакциной (типа «Ультрагривак») двукратно с интервалом 10 суток в дозе не менее 7,5 ^ ЭИД50, с учетом эпидемической ситуации по заболеваемости гриппом и острыми респираторными вирусными инфекциями в субъектах РФ и муниципальных образованиях. Расширение контингента прививаемых лиц живой гриппозной вакциной: детей от 3 лет и людей старше 60 лет, возможно после проведения дополнительных клинических исследований, доказывающих безопасность и иммуногенность данного препарата.

Применение инактивированных гриппозных вакцин (типа «ОрниФлю» и «АвиФлю») должно распространяться для следующих групп граждан:

- работники здравоохранения и социального обслуживания; студенты старших курсов медицинских ВУЗов; работники государственных и муниципальных образовательных учреждений (включая дома ребенка, детские дома и другие учреждения интернатного типа); лица с хроническими соматическими заболеваниями, в том числе с иммунодефицитными

состояниями; беременные 2-3 триместра; студенты начального профессионального образования, средних специальных и высших образовательных учреждений; учащиеся; дети дошкольного возраста от 6 мес; другие контингенты, имеющие отводы по медицинским и эпидемиологическим показаниям от прививок живой вакциной.

Схема вакцинации, в условиях достаточного количества препарата, должна предусматривать внутримышечное двукратное введение инактивированных вакцин с интервалом 28 дней в дозе 15 мкг НА.

Одной из основных проблем в настоящее время остается возможность увеличения производственных мощностей с целью обеспечения населения достаточным количеством пандемической вакцины против гриппа. В случае возникновения пандемии дефицит препарата может вызвать кризис здравоохранения. Для успешной реализации национальной программы защиты населения от пандемического гриппа необходимо расширить мощности по производству, увеличить объемы вакцинации населения сезонными вакцинами, при появлении пандемического гриппозного штамма использовать стратегию иммунопрофилактики, отработанную в рамках проведенных доклинических и клинических исследований «макетных» пандемических вакцин «ОрниФлю», «АвиФлю» и «Ультрагривак».

выводы

1. Сформулирована стратегия специфической профилактики гриппозной инфекции в период подготовки к пандемии, правомерность которой подтверждена экспериментальными и клиническими данными.

2. Выбраны наиболее перспективные препараты для специфической профилактики гриппа в случае пандемии: живая гриппозная вакцина «Ультрагривак», инактивированные субъединичная адсорбированная вакцина «ОрниФлю», расщепленная виросомальная адсорбированная вакцина «АвиФлю», а также изучены их физико-химические и иммунобиологические свойства.

3. Экспериментально обоснована необходимость проведения двукратной иммунизации с интервалами 10 сут - для живой и 28 сут - для инактивированных вакцин, для формирования эффективной защиты (до 80 %) от патогенного вируса гриппа.

4. Показано, что живая гриппозная вакцина «Ультрагривак», полученная на основе холодоадаптированного реассортантного штамма, генетически стабильна, апатогенна и безопасна для лабораторных животных, а так же вызывает образование системных и локальных антител не только к гомологичному вирусу, но и к дрейфовым вариантам вируса гриппа птиц Н5М1.

5. Экспериментально доказана безопасность, иммуногенность и эффективность интраназальной двукратной вакцинации с интервалом 10 сут в дозе не менее 7,5 ^ ЭИД50 живой гриппозной вакциной «Ультрагривак» с целью специфической профилактики высокопатогенного гриппа птиц.

6. Внутримышечная двукратная иммунизация с интервалом 28 сут инактивированной субъединичной адсорбированной вакциной «ОрниФлю» в дозе 15 мкг НА не оказывает неблагоприятного влияние на здоровье вакцинированных, и индуцирует образование гемагглютинирующих и вируснейтрализующих антител у 50 и 80 % привитых, соответственно, что указывает на безопасность, иммуногенность данного препарата.

7. Обоснован подход к получению новых конструкций высокоиммуногенных гриппозных вакцин, сочетающий использование адъювантных свойств виросом и алюминия гидроксида, апробированный на примере инактивированной вакцины «АвиФлю».

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Зверев В.В. Результаты сравнительного клинического исследования вакцин против вируса гриппа птиц. / Катлинский A.B., Костиков М.П., Жирова С.Н., Ерофеева М.К., Стукова М.А., Коровкин С.А., Мельников С.Я., Семченко A.B., Миронов А.Н. //Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии.- 2007,- №3. - С. 10-16.

2. Оншценко Г.Г. Тетравакцина - новый принципиальный подход к предотвращению пандемии гриппа. / Зверев В.В., Катлинский A.B., Семченко A.B., Коровкин С.А., Мельников С.Я., Миронов А.Н. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. -2007. - №4. - С. 15-19.

3. Зверев В.В. Профилактическая эффективность новой отечественной гриппозной пнактивированной вакцины Грифор®. / Михайлова H.A., Ерофеева М.К., Фельдблюм И.В., Чуйкова К.И., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. //Инфекционные болезни. -2008.-№3.-Т. 6.-С. 78-82.

4. Киселев О.И. Результаты клинического исследования реактогенности, безопасности и иммуногенносги вакцины Грифор® на пожилом контингенте (от 60 лет и старше). / Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников СЛ., Дылдина Н.В., Ерофеева М.К., Соминина

A.A., Войцеховская Е.М., Стукова М.А. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. -2008. - №4. - С. 36-39.

5. Мельников СЯ. Разработка и доклиническое исследование виросомальной расщепленной гриппозной вакцины нового поколения «Грифор®». /Зверев В.В., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Дылдина Н.В., Михайлова H.A., Файзулоев Е.Б., Лотте

B.Д. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - №1. - С. 2126.

6. Зверев В.В. Оценка реактогенности, безопасности и иммуногенносги виросомальной расщепленной инактивированной гриппозной вакцины «Грифор®» в I фазе клинического исследования. / Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников СЛ., Михайлова H.A., Костинов М.П., Дылдина Н.В., Жирова С.Н. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. -2009. - №1. - С. 26-31.

7. Зверев В.В. Клиническое исследование новой инактивированной гриппозной вакцины «Грифор®». / Киселев О.И., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников СЛ., Михайлова H.A., Костинов М.П., Ерофеева М.К., Соминина A.A., Дылдина Н.В., Жирова С.Н., Стукова М.А. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - №2. - С. 35-40.

8. Зверев В.В. Разработка и внедрение в практику здравоохранения РФ новой отечественной расщепленной виросомальной вакцины против гриппа. / Михайлова H.A., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Ерофеева М.К., Дылдина Н.В., Никоноров И.Ю., Максакова В.Л.// Лечащий врач. - 2008. - №9. -С. 68-70.

9. Меркулов В.А. Использование обратной генетики для получения рекомбинантных штаммов вируса гриппа, пригодных в качестве живых аттенуированных вакцин./ Лебедев В.Н., Плеханова Т.М., Максимов В.А., Коровкин С.А., Миронов А.Н. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009. - №2. - С. 111-117.

10. Мазуркова H.A. Результаты клинических испытаний реактогенности, безопасности и иммуногенносги гриппозной аллантоисной интраназальной живой вакцины «Ультрагривак» (тип A/H5N2). ДПишкина Л.Н., Сергеев A.H., Терновой В.А., Туманов Ю.В., Булычев Л.Е., Петршценко В.А., Скарнович М.О., Кабанов A.C., Рьщдюк H.H., Панченко С.Г., Алейников Р.П., Ильина Т.Н., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Кузубов В.И., Коровкин С.А., Дроздов И.Г. // Вестник РАМН (в печати).

11. Шишкина Л.Н. Проведение 2-й фазы клинических испытаний иммуногенности и безопасности гриппозной аллантоисной интраназальной живой вакцины «Ультрагривак» при двукратной иммунизации. /Мазуркова H.A., Сергеев А.Н., Терновой В.А., Туманов

10.В., Булычев Л.Е., Петрищенко В.А., Скарнович М.О., Кабанов A.C., Рындюк H.H., Панченко С.Г., Алейников P.II., Ильин Т.Н., Миронов А.И., Мельников С.Я., Кузубов

B.И., Коровкин С.А., Дроздов И.Г. //Сборник Института медицинской биотехнологии (Филиал «Вектора») «Достижения отечественной биотехнологии» (в печати).

12. Коровкин С.А. Изучение реакгогенности, безопасности и иммуногенности гриппозной инактивированной вакцины «Грифор®» при иммунизации людей старше 60 лег. / Мельников С.Я., Миронов А.Н., Дылдина Н.В. // Журнал «Аллергология и иммунология». - Том 10. - № 2. - Апрель 2009. - С. 297.

13. Миронов А.Н. «Ультрагривак» - отечественная вакцина против гриппа птиц./ Коровкин С.А., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // Журнал «Аллергология и иммунология».

- Том 10. - № 2. - Апрель 2009. - С. 298.

14. Миронов А.Н. Лабораторно-экспериментальное (доклиническое) исследование генно-инженерного Интерферона альфа-2Ъ. / Коровкин С. А., Дылдина Н. В., Мельников

C.Я. // Журнал «Аллергология и иммунология» - Том 10. - № 2. - Апрель 2009. - С. 299.

15. Коровкин С.А. «Авифлю» - новая отечественная вакцина против гриппа птиц. / Миронов А.Н., Мельников С.Я // Журнал «Аллергология и иммунология». - Том 10. - № 2. - Апрель 2009. - С. 298.

16. Миронов А.Н. «ОрниФлю» - гриппозная инактивированная субъединичная вакцина для профилактики гриппа птиц. / Коровкин С.А., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // Журнал «Аллергология и иммунология». - Том 10. - № 2. - Апрель 2009. - С. 298.

17. Катлинский A.B. Вакцина Ультрагривак - основное средство борьбы с возможной пандемией птичьего гриппа /Семченко A.B., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я. // Журнал «Эпидемиология и вакцинопрофилакгика». - №2 (45). - Март-апрель 2009. -С.50-56.

18. Катлинский A.B. Клинические исследования вакцин против «птичьего» гриппа, разработанных ФГУП «НПО «Микроген». / Семченко A.B., Коровкин С.А., Мельников С.Я, Миронов А.Н. //Шестая международная конференция «Клинические исследования лекарственных средств». - Москва. -12 октября 2007 г. - С.62.

19. Katlinsky A.V. Avian flu H5N1 vaccine. - ICCAID. / Korovkin S.A., Melnikov S.J., Mironov A.N., Krasilnikov I.V. // The Second International Congress of Central Asia Infectious Diseases. - Almaty-Kazakhstan. - 27-31 March 2008. - P. 75.

20. Дылдина Н.В. Изучение реакгогенности, безопасности и иммуногенности новой инактивированной гриппозной вакцины «Грифор». / Мельников С.Я., Миронов А.Н., Коровкин С.А. // Всероссийская научная конференция «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». - Санкт-Петербург. - 17-18 апреля 2008 г. - С.98.

21. Хамитов P.A. Изучение безопасности и эффективности вакцины гриппозной интраназальной живой (типа (H5N2), штамм А/утка/Потсдам/86/92/Н5Н2 [17/Н5] на приматах. / Мельников С.А., Максимов В.А., Мельников С.Я., Миронов А.Н., Коровкин С.А. // Всероссийская научная конференция «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекцнонных заболеваний». - Санкт-Петербург. - 17-18 апреля 2008 г. -С.100.

22. Мельников С.А. Клинические испытания живой вакщшы против гриппа птиц «Орвакс» на ограниченной группе добровольцев. / Максимов В.А., Хамитов P.A., Мельников С.Я., Миронов А.Н., Коровкин С.А., Черникова Н.К. // Всероссийская научная конференция «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний».

- Санкт-Петербург. -17-18 апреля 2008 г. - С.101-102.

23. Ерофеева М,К. Клинические исследования пандемических гриппозных вакцин в России. / Стукова М.А., Миронов А.Н., Максакова В.Л., Охапкина Е.А., Поздеев В.К., Позднякова М.Г., Кривицкая В.З., Войцеховская Е.М., Васильева A.A., Коровкин С.А., Соминина A.A., Киселев О.И. // Всероссийская научная конференция «Теоретические

основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». - Санкт-Петербург. -17-18 апреля 2008 г. - С.Юб-107.

24. Катлинский A.B. Доклинические и клинические исследования живой препандемической вакцины против гриппа птиц. / Семченко A.B., Дроздов И.Г., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В., Руденко Л.Г., Мельников С.А., Черникова Н.К., Хамитова М.Ф., Сергеев А.Н., Шишкина Л.Н., Мазуркова H.A., Кузубов В.И., РындюкМ.Н., Голубев Д.А. //IX Межгосударственная научно-практическая конференция «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств - участников Содружества. Независимых Государств». - Волгоград. - 30 сентября - 2 октября 2008 г. - С. 89-90.

25. Катлинский A.B. Сравнительное изучение реактогенносги, безопасности и иммуногенности новой инактивированной гриппозной вакцины «Грифор». / Семченко A.B., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // IX Межгосударственная научно-практическая конференция «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств - участников Содружества Независимых Государств». - Волгоград. - 30 сентября - 2 октября 2008 г. - С. 92-93.

26. Катлинский A.B. Разработка препандемических вакцин против гриппа птиц в Российской федерации. / Семченко A.B., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дыддина Н.В. // IX Межгосударственная научно-практическая конференция «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств - участников Содружества Независимых Государств». - Волгоград. - 30 сентября - 2 октября 2008 г.- С. 90-91.

27. Катлинский A.B. Разработка и внедрение в практику Здравоохранения РФ виросомальной расщепленной вакцины нового поколения «Грифор» для специфической профилактики гриппа. / Семченко A.B., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников СЛ., Дылдина Н.В. // Международная научно-практическая конференция «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа». - Новосибирская обл., Кольцово. - 9-10 октября 2008 г. - С. 83-84.

28. Зверев В.В. Конструирование и проведение исследований инакшвированной расщепленной виросомальной препандемической вакцины против гриппа птиц. / Катлинский A.B., Киселев О.И., Семченко A.B., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников СЛ., Дылдина Н.В., Михайлова H.A., Костинов М.П., Жирова С.Н., Соминина A.A., Алексеев В.В., Плеханова Н.Г., Мельников С.А., Черникова Н.К., Хамитова М.Ф. // Международная научно-практическая конференция «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа». - Новосибирская обл., Кольцово. - 9-10 октября 2008 г.. - С. 79-81.

29. Катлинский A.B. Клинические исследования и внедрение в практику здравоохранения РФ инактивированной препандемической вакцины против гриппа птиц. / Зверев В.В., Семченко A.B., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников СЛ., Дылдина Н.В., Киселев О.И., Ерофеева М.К., Стукова М.А., Соминина A.A., Михайлова H.A., Костинов М.П., Жирова С.Н. // Международная научно-практическая конференция «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа». - Новосибирская обл., Кольцово. - 9-10 октября 2008 г. - С. 81-83.

30. Полущкина A.B. Специфическая профилактика гриппа отечественной инактивированной расщепленной вакциной «Грифор». / Фельдблюм И.В., Воробьева H.H., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Дьшдина Н.В. // Научно-практическая конференция молодых ученых «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», посвященная 110-летию филиала, ФГУП «НПО «Микроген» «Пермское научно-производственное объединение «Биомед». - 18-19 июня 2008 г. - С. 37-39.

31. Позднякова М.Г. Оценка реактогенности, безопасности и иммуногенности вакцины Грифор® при однократной иммунизации взрослых от 18 до 60 лег. / Никоноров И.Ю.,

Максакова В.Л., Васильева A.A., Вакин B.C., Войцеховская Е.М., Охапкина Е.А., Дылдина Н.В., Миронов А.Н., Ерофеева М.К. // Научно-практическая конференция молодых ученых «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», посвященная 110-летию филиала ФГУП «НПО «Микроген» «Пермское научно-производственное объединение «Биомед» - 18-19 июня 2008 г. - С. 40-42.

32. Дылдина Н.В. Доклиническое изучение виросомальной гриппозной вакцины «Грифор®». / Миронов А.Н., Коровкин С.А. // Научно-практическая конференция молодых ученых «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», посвященная 110-летию филиала ФГУП «НПО «Микроген» «Пермское научно-производственное объединение «Биомед». - 18-19 июня 2008 г. - С. 39-40.

33. Дылдина Н.В. Клинические исследования реактогенносги, безопасности и иммуногенносги новой инактивированной виросомальной гриппозной вакцины «Грифор®». / Миронов А.Н., Коровкин С.А. // Научно-практическая конференция молодых ученых «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», посвященная 110-легию филиала ФГУП «НПО «Микроген» «Пермское научно-производственное объединение «Биомед». - 18-19 июня 2008 г.-С. 44-45.

34. Позднякова М.Г. Реакгогенкость, безопасность и иммуногенность гриппозной инактивированной вакцины Грифор® при иммунизации людей старше 60 лет. / Никоноров И.Ю, Васильева И.А„ Васильева A.A., Войцеховская Е.М., Максакова B.JI., Охапкина Е.А., Дылдина Н.В., Миронов А.Н., Ерофеева M.K. // Научно-практическая конференция молодых ученых «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», посвященная 110-летию филиала ФГУП «НПО «Микроген» «Пермское научно-производственное объединение «Биомед». - 18-19 июня 2008 г. - С. 42-44.

35. Коровкин С.А. Оценка иммуногенных и протективных свойств вакцин против гриппа птиц, разработанных ФГУП НПО «Микроген». / Максимов В.А., Миронов A.II., Хамитов P.A., Мельников С.Я., Мельников С.А. // VII Межгосударственная научно-практическая конференция «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении, решения Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств». - Московская область, п. Оболенск. - 3-5 октября 2006 г. - С. 45.

36. Sominina A.A. Comparative investigations of microneutralization and hemagglutination inhibition tests in evaluation of immimogenicity of inactivated influenza H5 vaccine./ Krivitskaya V.Z., Mironov A.N., Voytsekhovskaya E.M., Vasilieva A.A., Tretjakova N.V., Kiselev O.I. // Third European Influenza Conference. - Vilamoura, Portugal. - 14-17 September 2008 - P.101-102.

37. Ерофеева M.K. Гриппозные вакцины H5N1: Клинические исследования в России. / Стукова МЛ., Максакова B.JI., Охапкина EJI., Поздеев В.К., Позднякова М.Г., Кривицкая В.З., Войцеховская ЕМ., Васильева AJI., Миронов А.Н., Коровкин CA., Соминина A.A., Киселев О.И. // Международная научно-практическая конференция, посвященная 50-легию Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности НЦБ МОИ PK «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития». - Республика Казахстан, г. Алматы. - 19-21 мая 2008. - С. 453.

38. Коровкин С.А. «АвиФлю» - новая инактивированная виросомальная вакцина против гриппа птиц. / Миронов А.Н., Мельников С.Я. // Всероссийская научно-практическая конференция «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - Москва. - 11-12 ноября 2008. - С. 65-66.

39. Коровкин С.А. «Ультрагривак» - живая гриппозная вакцина против гриппа птиц./ Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // Всероссийская научно-практическая конференция «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств

профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - Москва. - 11-12 ноября 2008. - С. 66.

40. Миронов А.Н. Клинические исследования вакцины «ОрниФлю» для профилактики гриппа птиц. / Коровкин С.А., Мельников С.Я., Дылдина H.B. И Всероссийская научно-практическая конференция «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». - Москва. -11-12 ноября 2008. - С. 81.

41. Коровкин С.А. Клиническое исследование инактивированной виросомальной вакцины против гриппа птиц. / Миронов А.Н., Мельников С.Я. // «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология». Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». - Киров: ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». - 2008. - Вып.1. - С. 80-82.

42. Миронов А.Н. Клиническое исследование инактивированной субъединичной вакцины против гриппа птиц. / Коровкин С.А., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология». Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». - Киров: ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». - 2008. - Вып.1. - С. 93-94.

43. Коровкин С.А. Клиническое исследование живой гриппозной вакцины против гриппа птиц. / Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. - «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология». Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». - Киров: ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». - 2008. - Вып.1. - С. 82-83.

44. Коровкин С.А. Профилактическая эффективность вакцины «Грифор». / Мельников С.Я., Миронов А.Н., Дылдина Н.В. // X международный конгресс, посвященный 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». - г. Казань. - 20-23 мая 2009 г. - С. 8.

45. Мельников С.Я. Иммуногенность и безопасность вакцины «АвиФлю» - новой инактивированной виросомальной вакцины против гриппа птиц. / Коровкин С.А., Миронов А.Н. // X международный конгресс, посвященный 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». - г. Казань. - 20-23 мая 2009 г. - С. 10.

46. Миронов А.Н. Доклинические и клинические исследования вакцины «ОрниФлю» для профилактики гриппа птщ / Коровкин С.А., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // X международный конгресс, посвященный 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». -г. Казань. - 20-23 мая 2009 г. - С.10-11.

47. Миронов А.Н. Иммуногенность и безопасность вакцины «Ультрагривак» - живой гриппозной вакцины против гриппа птиц / Коровкин С.А., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // X международный конгресс, посвященный 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». -г. Казань. - 20-23 мая 2009 г. - С.12-13.

48. Миронов А.Н. Доклинические исследования генно-инженерного интерферона альфа-2/3. / Коровкин С.А., Дылдина Н.В., Мельников С.Я. // X международный конгресс, посвященный 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо «Совремешше проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». г. Казань. - 20-23 мая 2009 г. - С. 470.

49. Катлинский A.B. Результаты доклинических и клинических исследований вакцины против гриппа птиц «ОрниФлю» / Зверев В.В., Семченко A.B., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В., Киселев О.И., Ерофеева М.К., Стухова М.А., Соминина A.A., Михайлова H.A., Костинов М.П., Жирова С.Н. // 7-я Российско-

итальянская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы социально-значимых вирусных инфекций». - г. Великий Новгород. -14-16 мая 2009 г. - С. 65-66.

50. Катлинский A.B. Виросомальная расщепленная вакцина нового поколения «Грифор» для специфической профилактики гриппа. / Семченко A.B., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников СЛ., Дылдина Н.В. // 7-я Российско-итальянская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы социально-значимых вирусных инфекций». - г. Великий Новгород. - 14-16 мая 2009 г. - С. 66-67.

51. Катлинский A.B. Разработка вакцин против гриппа птиц в Российской Федерации / Семченко A.B., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // 7-я Российско-итальянская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы социально-значимых вирусных инфекций». - г. Великий Новгород. -14-16 мая 2009 г. - С. 67-68.

52. Миронов А.Н. Результаты исследований живой гриппозной вакцины «Ультрагривак» для профилактики гриппа птиц. / Дылдина Н.В., Цаан A.A., Бушменков Д.С., Иванова О.Ю., Романова A.A., Коровкин A.C. // 7-я Российско-итальянская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы социально-значимых вирусных инфекций». - г. Великий Новгород. -14-16 мая 2009 г. - С. 95-96.

53. Мельников С.Я. Изучение иммуногешгости и безопасности вакцины против гриппа птиц - «АвиФлю». / Коровкин С.А., Миронов А.Н. // 7-я Российско-итальянская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы социально-значимых вирусных инфекций». - г. Великий Новгород. -14-16 мая 2009 г. - С. 96-97.

54. Катлинский A.B. Виросомальная расщепленная вакцина нового поколения «Грифор®» для специфической профилактики гриппа. / Семченко A.B., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // Международная научно-практическая конференция (14-15 мая 2009 г., Новосибирск, Россия). - Новосибирск: Изд-во «ЦЭРИС». -2009.-С. 247-248.

55. Катлинский A.B. Современное состояние разработки вакцин против гриппа птиц в Российской Федерации. / Семченко A.B., Зверев В.В., Михайлова H.A., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // Международная научно-практическая конференция (14-15 мая 2009 г., Новосибирск, Россия). - Новосибирск: Изд-во «ЦЭРИС». - 2009. - С. 249-250.

56. Рындюк H.H. Клиническое исследование живой аллантоисной интраназальной гриппозной вакцины «Ультрагривак». / Алейников Р.П., Кузубов В.И., Мазуркова H.A., Шишкина Л.Н., Сергеев А.Н., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Коровкин С.А. Международная научно-практическая конференция (14-15 мая 2009 г., Новосибирск, Россия). - Новосибирск: Изд-во «ЦЭРИС». - 2009. - С. 261.

Актуальность проблемы. Грипп - острая вирусная инфекция с воздушно-капельным путем передачи, характеризующаяся острым началом, лихорадкой, общей интоксикацией и поражением респираторного тракта. Эпидемии гриппа происходят ежегодно, поражая до 15 % населения Земного шара, значимо увеличивая смертность в группах повышенного риска, увеличивая затраты на медицинскую помощь и нанося серьезный экономический ущерб. По частоте и количеству случаев грипп и ОРВИ занимают первое место, составляя 95 % всех инфекционных заболеваний. В России ежегодно регистрируют от 27,3 до 41,2 млн. заболевших гриппом и другими ОРВИ [1-4].

Кроме ежегодных эпидемий вирус гриппа А может вызывать и пандемии. Пандемии всегда являлись событиями мирового значения. Они возникали в результате появления высококонтагиозного вируса гриппа, к которому большая часть населения не имела иммунитета, и, как следствие, практически глобальной восприимчивости людей к инфекции. Характерными особенностями пандемий являлись быстрота распространения гриппа по всем частям света, как правило, менее чем за год, и подверженность заболеванию более четверти всего населения. Помимо высокой смертности пандемии всегда отличались внезапностью возникновения вспышки заболевания, не позволяющей адекватно подготовиться к борьбе с инфекцией. В прошлом столетии отмечено три пандемии гриппа: «испанский грипп» в 1918 г., «азиатский грипп» в 1957 г. и «гонконгский грипп» в 1968 г. «Испанка» унесла от 40 до 50 миллионов человек во всем мире [5,6]. Ни сроки, ни последствия следующей пандемии невозможно предсказать определенно.

Из известных 15 подтипов вируса гриппа А подтип Н5Ш' обладает наиболее высоким пандемическим потенциалом: он быстро мутирует и вступает в рекомбинацию с вирусами, инфицирующими различные виды животных, в том числе млекопитающих [7-12]. Первый подтвержденный случай заражения людей гриппом птиц произошел в Гонконге в 1997 г., когда H5N1 вызвал тяжелое респираторное заболевание у 18 человек, из которых 6 умерло, причем заболевание было вызвано вирусом, циркулирующим в тот момент в популяции местной домашней птицы [1314].

В настоящее время активно дискутируется вопрос о возможности распространения новой пандемии гриппа [15-17]. Опасность представляет не только широкое распространение подтипа H5N1 в популяции птиц, но также высокая летальность для людей при поражении данным вирусом: из 433 случаев заболевания людей гриппом H5N1 262 закончились летальным исходом [18]. В случае с гриппом птиц H5N1 ВОЗ объявила 3 фазу предупреждения пандемии гриппа.

13 апреля 2009 г. в Мексике был подтвержден первый случай заражения новым видом вируса, который получил название «свиной грипп». Позже, когда был идентифицирован штамм возбудителя (California/07/2009), болезнь получила название грипп H1N1. Появление и циркуляция данного вируса гриппа H1N1 в популяции людей привели к объявлению 27.04.09 г. 6 фазы предупреждения о пандемии. По данным ВОЗ, на 15.06.2009 в мире случаи заражения вирусом гриппа H1N1 зафиксированы в 76 странах. Общее число заболевших составило 35928 человек, из них смертью закончились 163 случая [19-25].

Можно предположить, что причина столь быстрого распространения вируса H1N1 в человеческой популяции является отсутствие иммунитета у людей и наличие в геноме данного вируса генов от вируса гриппа птиц и вируса гриппа человека [26-29].

Для предупреждения возникшей угрозы здоровью людей вакцинация будет основным инструментом в борьбе с инфекцией. Следовательно, разработка эффективных вакцин против пандемического гриппа - вопрос первостепенной важности. Лабораторно-экспериментальные исследования, проведенные с субтипом H5N1 показали, что существует реальная проблема разработки пандемических вакцин, связанная с тем, что отработанные и принятые повсеместно схемы применения (способ введения, кратность, интервал, доза) сезонных гриппозных вакцин не эффективны в случае «птичьего» или «свиного» гриппа [30-33].

Еще одной проблемой, связанной с появлением пандемического вируса гриппа, является недостаток производственных мощностей для обеспечения вакциной всех потребностей населения.

Новые технологии должны сыграть важную роль в разработке безопасной и эффективной вакцины против пандемического гриппа для контингентов, включая беременных, грудных детей и лиц старше 60 лет. Препарат должен содержать небольшое количество антигена вируса и храниться без охлаждения. И наконец, немаловажное значение имеют масштабы производства и стоимость вакцин [34].

Стратегии выпуска иммуногенных вакцин, содержащих меньшее количество антигена, за счет включения в состав адъюванта, могут привести к значительному увеличению производственного потенциала. Для использования их в широкой практике необходимо проведение полномасштабных доклинических и клинических исследований, доказывающих безопасность и иммуногенность сконструированных препаратов.

Имея в виду изложенные аргументы, проведение целенаправленных фундаментальных и прикладных исследований по разработке и изучению свойств «макетных» пандемических вакцин против гриппа является актуальной проблемой.

Цель настоящей работы - экспериментально-клиническое обоснование выбора стратегии профилактики гриппозной инфекции в период подготовки к пандемии.

Задачи исследования:

1. Сконструировать живую и инактивированные потенциальные («макетные») препандемические гриппозные вакцины.

2. Изучить физико-химические и молекулярно-биологические свойства отечественных потенциальных («макетных») препандемических гриппозных вакцин.

3. Провести доклинические и клинические исследования живой гриппозной вакцины «Ультрагривак» и оценить их результаты.

4. Провести сравнительные доклинические и клинические исследования гриппозных инактивированных субъединичных вакцин «ОрниФлю» и «ВГИПС» и выбрать наиболее оптимальный вариант;

5. Провести доклинические и клинические исследования гриппозной инактивированной расщепленной виросомальной адсорбированной вакцины «АвиФлю» и оценить их результаты.

6. Оптимизировать стратегию вакцинации населения в период подготовки к пандемии.

Научная новизна. Впервые изучены свойства живой «Ультрагривак», инактивированных субъединичной сорбированной «ОрниФлю» и расщепленной виросомальной сорбированной «АвиФлю» потенциальных («макетных») препандемических вакцин против гриппа.

В ходе проведенных исследований впервые: выбраны наиболее перспективные варианты потенциальных («макетных») препандемических вакцин против гриппа: живая «Ультрагривак», инактивированные адсорбированные - субъединичная «ОрниФлю» и расщепленная виросомальная «АвиФлю»; экспериментально обоснована необходимость применения двукратной схемы вакцинации с целью профилактики пандемического гриппа;

- в рамках доклинических исследований на лабораторных животных экспериментально доказана безопасность и иммунологическая эффективность , живой «Ультрагривак» и инактивированных адсорбированных субъединичной «ОрниФлю» и расщепленной виросомальной «АвиФлю» потенциальных («макетных») препандемических гриппозных вакцин;

- в рамках клинических исследований экспериментально доказана низкая реактогенность, безопасность и иммуногенность живой «Ультрагривак» и инактивированных адсорбированных субъединичной «ОрниФлю» и расщепленной виросомальной «АвиФлю» потенциальных («макетных») препандемических гриппозных вакцин на добровольцах;

- определены критерии реактогенности и иммуногенности живой «Ультрагривак» и инактивированной субъединичной адсорбированной «ОрниФлю» препандемических гриппозных вакцин.

- обоснованы схемы вакцинации населения РФ с целью специфической профилактики гриппа в случае возникновения пандемии: для живой вакцины «Ультрагривак» - интраназально двукратно с интервалом 10 сут в дозе не менее 7,5 ЭИД50; для инактивированной субъединичной адсорбированной вакцины «ОрниФлю» - внутримышечно двукратно с интервалом 28 сут в дозе 15мкгНА.

Практическая значимость работы. Работа имеет большое народнохозяйственное значение. В результате проведенной работы: доказана эффективность технологических подходов при конструировании безопасных и эффективных живой и инактивированных вакцин против пандемического гриппа;

- выбраны наиболее оптимальные конструкции вакцин для защиты населения РФ от пандемии гриппа - живая вакцина «Ультрагривак»; инактивированные адсорбированные субъединичная «ОрниФлю» и расщепленная виросомальная «АвиФлю»;

- по результатам исследований оформлены НТД, зарегистрированы и разрешены к применению в РФ живая интраназальная вакцина «Ультрагривак» (ЛСР-002340/09 от 25.03.2009) и инактивированная субъединичная адсорбированная вакцина «ОрниФлю» (ЛСР-001481/09 от 03.03.2009);

- определена стратегия профилактики гриппозной инфекции в период подготовки к пандемии.

Результаты и выводы диссертации могут быть использованы при разработке средств профилактики и лечения инфекционных заболеваний, имеющих пандемический потенциал.

Положения, выносимые на защиту:

1. Использование технологий получения полуфабрикатов, отработанных при производстве сезонных вакцин против гриппа - живой «Ультравак» и инактивированной субъединичной «Гриппол», применимы для изготовления пандемических гриппозных вакцин.

2. Инактивация вакцинных штаммов вируса гриппа ультрафиолетом и последующая обработка детергентом р-октилгликозидом, позволяет приготовить новую инактивированную расщепленную виросомальную форму вакцины, которая превосходит по своим иммуногенным и протективным свойствам, существующие аналоги.

3. В рамках доклинических исследований показано, что живая гриппозная вакцина «Ультрагривак» генетически стабильна; является гиператтенуированной для кур; проявляет аттенуирующий фенотип при интраназальном введении мышам, активно репродуцируясь в верхних дыхательных путях при сниженной репродукции вируса в легких; индуцирует образование локальных и системных антител не только к гомологичному вирусу, но и к высокопатогенным вирусам подтипа Н5Ш, вызывает при двукратном с интервалом 10 сут в дозе 10 6'4 ЭИД50 введении белым мышам выработку ИФ-АТ в титре 1:1280, ВНА - 1:40 и АГ-АТ - 1:80 и защищает от гибели до 100 % лабораторных животных, инфицированных вирулентным штаммом вируса гриппа птиц А/курица/Курган/Россия/2/2005 (Н5Ш), что соответствует требованиям к медицинским средствам защиты ОТТ 8.1.112-98.

4. В результате клинических исследований установлено, что живая гриппозная вакцина «Ультрагривак» ареактогенна, безвредна для вакцинируемых, безопасна для окружающих, индуцирует развитие местного, клеточного и гуморального иммунитета, обладает высокими кросс-реактивными свойствами при выбранной оптимальной схеме вакцинации (интраназально двукратно с интервалом 10 сут в дозе не менее 7,5 ЭИД50), что позволило зарегистрировать препарат в Российской Федерации с целью защиты населения в случае возникновения пандемии гриппа.

5. Опыт ликвидации эпидемических вспышек особо опасных (натуральная оспа) и опасных (полиомиелит) вирусных инфекций позволяет заключить, что использование живой гриппозной вакцины «Ультрагривак» в период пандемии гриппа птиц обеспечит необходимую эпидемическую эффективность, при минимальных экономических затратах и высокой производительности биотехнологического процесса.

6. В результате проведенных доклинических исследований показано, что гриппозная инактивированная субъединичная адсорбированная вакцина «ОрниФлю» нетоксична, хорошо переносится животными, не обладает выраженными местными и местно-раздражающими действиями, не вызывает негативного влияния на патоморфологические, гистологические и гематологические показатели, при проведении внутримышечной двукратной с интервалом 28 сут в дозе 15 мкг НА иммунизации белых мышей, позволяет инициировать выработку ИФ-АТ в титре 1:320, ВНА - 1:20, и АГ-АТ -1:40 и защищает от гибели до 80 % лабораторных животных, инфицированных вирулентным штаммом вируса гриппа птиц А/курица/Курган/Россия/2/2005 (Н5Ш).

7. В результате клинических исследований установлено, что гриппозная инактивированная субъединичная адсорбированная вакцина «ОрниФлю» низкореактогенна, безопасна, обладает иммуногенными свойствами при выбранной оптимальной схеме вакцинации (внутримышечно двукратно с интервалом 28 сут в дозе 15 мкг НА), что позволило зарегистрировать препарат в Российской Федерации с целью защиты населения в случае возникновения пандемии гриппа.

8. При проведении доклинических исследований гриппозной инактивированной расщепленной виросомальной адсорбированной вакцины «АвиФлю» показано, что препарат нетоксичен, не обладает выраженным местным и местно-раздражающим действием, не оказывает неблагоприятного воздействия на системы и органы лабораторных животных, при проведении двукратной с интервалом 28 сут в дозе ниже в 3 раза, чем при исследовании субъединичных вакцин «ОрниФлю» и «ВГИПС», иммунизации белых мышей индуцирует выработку гуморальных антител, определяемых в ИФА в титре 1:160, РТГА - 1:40 и РМН - 1:20, а также защищает от гибели до 71,4 % лабораторных животных, инфицированных вирулентным штаммом вируса гриппа птиц А/курица/Курган/Россия/2/2005 (Н5Ш).

9. В результате клинических исследований гриппозной расщепленной виросомальной адсорбированной вакцины «АвиФлю» показана низкая реактогенность, безопасность, 100 % уровни сероконверсии и серопротекции, а также доказана высокая кросс-реактивность, что позволяет рассматривать данную конструкцию с двумя адъювантами, как новый перспективный подход в области разработки гриппозных вакцин.

Внедрение результатов работы. По теме работы разработана НТД (ФСП, инструкция по применению, регламент производства) на, живую гриппозную вакцину «Ультрагривак», гриппозные инактивированные адсорбированные субъединичную «ОрниФлю» и расщепленную виросомальную «АвиФлю». Технологические решения, оформленные в регламентах производства на живую гриппозную вакцину «Ультрагривак» и инактивированные адсорбированные субъединичную «ОрниФлю» и расщепленную виросомальную «АвиФлю», внедрены на филиалах ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ: в г. Иркутске «Иркутское предприятие по производству бактерийных препаратов» и г. Уфе «Иммунопрепарат».

В марте 2009 г. в РФ зарегистрированы и разрешены к применению две «макетные» пандемические гриппозные вакцины:

- инактивированная субъединичная адсорбированная «ОрниФлю» (ЛСР-001481/09 от 03.03.2009);

- живая «Ультрагривак» (ЛСР-002340/09 от 25.03.2009).

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 21-22 ноября 2006 г.), Международном семинаре-тренинге «Актуальные вопросы защиты населения от биологических угроз» (Москва, 17-19 октября

2007 г.), Шестой международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 12 октября 2007 г.), Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 17-18 апреля

2008 г.), Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирская обл., Кольцово, 9-10 октября 2008 г.), IV научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (Краснодарский край (пос. Джемете), 9-12 сентября 2008 г.), Проблемной комиссии РАМН «Грипп и гриппоподобные инфекции, включая особо опасные. Фундаментальные и прикладные аспекты изучения. (Санкт-Петербург, 19 февраля 2009 г.), VII съезде аллергологов и иммунологов СНГ. II Всемирный форум по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 26-28 апреля 2009 г.), Международной конференции «Актуальные проблемы в области развития и внедрения противогриппозных вакцин и вакцин против гриппа птиц» (г. Иркутск, 14-15 мая 2009 г.), X международном конгрессе, посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», г. Казань, 20-23 мая 2009 г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 56 печатных работ, в том числе в 15 журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 482 страницах текста и включает введение, три главы обзора литературы, пять глав собственных исследований, заключение, выводы, 129 таблиц и 34 рисунка. Список литературы содержит 317 источников, из них 24 отечественных и 293 иностранных.

ВЫВОДЫ

1. Сформулирована стратегия специфической профилактики гриппозной инфекции в период подготовки к пандемии, правомерность которой подтверждена экспериментальными и клиническими данными.

2. Выбраны наиболее перспективные препараты для специфической профилактики гриппа в случае пандемии: живая гриппозная вакцина «Ультрагривак», инактивированные субъединичная адсорбированная вакцина «ОрниФлю», расщепленная виросомальная адсорбированная вакцина «АвиФлю», а также изучены их физико-химические и иммунобиологические свойства.

3. Экспериментально обоснована необходимость проведения двукратной иммунизации с интервалами 10 сут - для живой и 28 сут - для инактивированных вакцин, для формирования эффективной защиты (до 80 %) от патогенного вируса гриппа.

4. Показано, что живая гриппозная вакцина «Ультрагривак», полученная на основе холодоадаптированного реассортантного штамма, генетически стабильна, апатогенна и безопасна для лабораторных животных, а так же вызывает образование системных и локальных антител не только к гомологичному вирусу, но и к дрейфовым вариантам вируса гриппа птиц Н5№.

5. Экспериментально доказана безопасность, иммуногенность и эффективность интраназальной двукратной вакцинации с интервалом 10 сут в дозе не менее 7,5 ^ ЭИД50 живой гриппозной вакциной «Ультрагривак» с целью специфической профилактики высокопатогенного гриппа птиц.

6. Внутримышечная двукратная иммунизация с интервалом 28 сут инактивированной субъединичной адсорбированной вакциной «ОрниФлю» в дозе 15 мкг НА не оказывает неблагоприятного влияние на здоровье вакцинированных, и индуцирует образование гемагглютинирующих и вируснейтрализующих антител у 50 и 80 % привитых, соответственно, что указывает на безопасность, иммуногенность данного препарата.

7. Обоснован подход к получению новых конструкций высокоиммуногенных гриппозных вакцин, сочетающий использование адъювантных свойств виросом и алюминия гидроксида, апробированный на примере инактивированной вакцины «АвиФлю».

Заключение

Пандемии гриппа характеризуются высокой заболеваемостью, смертностью и тяжелыми социально-экономическими последствиями. В XX веке произошли три пандемии гриппа: в 1918, 1957 и 1968 гг. В 2004 г. для человечества впервые после 1968 г. возникла реальная угроза новой пандемии.

В прошлом пандемии заявляли о себе внезапным и резким скачком заболеваемости, неожиданным для мирового сообщества. Однако на этот раз мы получили недвусмысленное предупреждение: в 2004 г. на значительных территориях Азии были зарегистрированы беспрецедентные вспышки высокопатогенного птичьего гриппа, возбудителем которого являлся вирус H5N1. Вирус преодолел видоспецифический барьер и инфицировал людей, смертность среди заболевших была очень высокой. Благодаря постоянному мониторингу, который координирует ВОЗ, удалось зарегистрировать многочисленные признаки приближения пандемии. На этот раз человечество имеет возможность защитить себя от вируса, обладающего пандемическим потенциалом, до того, как разразится пандемия.

Подготовка к пандемии представляет традиционную дилемму: стоит ли выделять силы и средства на борьбу с явлением, которое нельзя точно спрогнозировать, но которое может иметь катастрофические последствия, притом, что остаются неудовлетворенными многие насущные потребности здравоохранения. В этих обстоятельствах полезно собрать воедино все имеющиеся факты и определить, какова сегодняшняя ситуация, что может случиться завтра и какие действия в связи с этим необходимо предпринять. Вирус H5N1 не только дал ясное предупреждение о надвигающейся опасности, но и предоставил нам время на подготовку к пандемии. В 2004 г. угроза пандемии дала мощный импульс ряду мероприятий по подготовке к следующей пандемии, независимо от времени ее наступления и типа возбудителя. Тем не менее, на фоне высокой мобильности и обширных взаимосвязей современного мира человечество остается крайне уязвимым.

Никто не может сказать наверняка, удастся ли нам и на этот раз избежать опасности, или события 2004 г. явились прелюдией к первой пандемии XXI века. Если окажется верным второе предположение, пандемия не должна застать нас врасплох.

Штамм вируса птичьего гриппа H5N1 начал циркулировать в популяциях домашней птицы разных регионов Азии в какое-то время до 1997 г. и с тех пор незаметно усиливал свои позиции. Как и другие вирусы птичьего гриппа типов Н5 и Н7, вирус H5N1 сначала вызывает у птиц незначительное заболевание с такими трудно выявляемыми симптомами, как взъерошенность перьев и снижение яйценоскости. После нескольких месяцев циркуляции вируса в популяции домашних кур произошла его мутация, в результате которой возникла высокопатогенная форма, вызывающая гибель птицы через 48 ч после инфицирования при уровне смертности приближающемся к 100 %. Впервые вирус в этой высокопатогенной форме был зарегистрирован в 1997 г. и после этого больше не появлялся. Однако к концу 2003 г. H5N1 снова внезапно активизировался, причем в значительно более широком масштабе.

Сознавая всю серьезность нависшей угрозы, ВОЗ активизировала усилия по разработке планов подготовки к пандемии, разослала предупреждения по всем лабораториям и установила для групп быстрого реагирования режим готовности. ВОЗ наметила план действий при объявлении пандемии, в котором были обозначены три основные цели: прекращение разрастания пандемии; контроль за вспышками инфекции у человека и предупреждение новых случаев заболевания; проведение исследований по наблюдению за ситуацией и повышению степени готовности, в том числе ускорение разработки пандемической вакцины.

Для достижения первой цели требовалось снизить риск заражения человека от птиц за счет уничтожения вируса в организме птиц-носителей. К счастью, необходимые мероприятия были проведены энергично, кроме того, строго выполнялись рекомендации OIE и Организации по пищевым и сельскохозяйственным продуктам (ФАО). Были отобраны заразившиеся птицы и особи, контактирующие с ними, а также объявлен карантин, проведена дезинфекция, налажен контроль за перемещением животных и установлен режим строгой биологической безопасности на фермах. Кроме того, по рекомендации ВОЗ, работники, проводящие отбор инфицированных птиц, должны были носить защитную одежду и профилактически принимать противовирусные препараты. Также рекомендовалось провести вакцинацию против обычного сезонного гриппа, чтобы исключить возможность сочетанной инфекции птичьего и человеческого гриппа в этой группе высокого риска и, таким образом, не допустить обмена генами между этими вирусами.

В рамках третьей поставленной задачи данные, полученные во время вспышки 1997 г., послужили основой для более глубокого понимания учеными природы пандемических вирусов вообще и штамма Н5№ в частности. Интенсификация исследований позволила охарактеризовать штамм Н5Ш на молекулярном уровне, проследить историю его эволюции у разных видов птиц, углубить знания о патогенности вируса у человека и оценить его пандемический потенциал. К третьей неделе января лабораторные исследования показали, что вирус, зарегистрированный в 2004 г. претерпел значительные изменения по сравнению с вирусом, выявленным в Гонконге в 1997 и 2003 гг. Работу по получению вакцины против пандемического вируса Н5Ш нужно было снова начинать с нуля. Вирусы Н5]М1, выявленные в 2004 г., обладали устойчивостью к одному из двух существующих классов противовирусных препаратов. Это обстоятельство еще больше усилило опасения специалистов: в случае возникновения пандемии, человечество не имело бы достаточных резервов медикаментов для борьбы с инфекцией.

До азиатских вспышек высокопатогенный птичий грипп считался довольно редким заболеванием. С 1959 г., когда болезнь была впервые идентифицирована, до 2004 г. во всем мире была зарегистрирована всего 21 вспышка, причем главным образом в Европе и Северной Америке. Из них только семь привели к существенному распространению инфекции на несколько ферм и всего одна пересекла национальные границы.

Никогда прежде высокопатогенный птичий грипп не вызывал такого большого числа вспышек одновременно в разных странах. Никогда прежде болезнь не распространялась так стремительно и не охватывала такие огромные географические территории. Никогда прежде эпидемии не имели таких катастрофических последствий для сельского хозяйства — от крупных коммерческих ферм до мелких хозяйств, составляющих основу жизни для огромного числа сельских жителей. В некоторых странах, где бушевала эпидемия, от 50 до 80 % птицы содержится в небольших домашних хозяйствах, где птица является единственным источником дохода, примерно 30 % потребляемого белка и своего рода «страховкой» для оплаты медицинских услуг.

Во время вспышек гриппа в азиатских странах за три месяца пали или были забиты более 120 млн. голов птицы. Это число превышает общее поголовье домашней птицы, погибшей во время всех предыдущих значительных вспышек высокопатогенного птичьего гриппа, зарегистрированных во всем мире за прошедшие 40 лет.

Многие эксперты считают, что пандемический грипп представляет наиболее значительную глобальную опасность для здоровья человека, вызванную естественными причинами. Несмотря на то, что время возникновения пандемии нельзя предугадать, совершенно ясно, что сразу после возникновения вируса с соответствующими свойствами, инфекция быстро распространиться на обширные территории. В прошлом веке пандемии распространялись по морским путям, и для того, чтобы инфекция охватила весь земной шар требовалось от шести до восьми месяцев. Теперь же, как показал пример атипичной пневмонии, распространению вируса способствуют международное воздушное сообщение, что значительно сокращает это время. Скорость распространения инфекции по разным странам мира не влияет на смертность, но может снизить эффективность мер по борьбе с пандемией в случае одновременной вспышки заболеваемости сразу в разных частях света. Многие мероприятия, разработанные службами общественного здравоохранения, успешно применялись при возникновении атипичной пневмонии, но будут неэффективными в борьбе с заболеванием, которое значительное превосходит ее по контагиозности, имеет более короткий инкубационный период и может передаваться от одного человека к другому до появления клинических симптомов.

В истории человечества описаны внезапные вспышки гриппа с высоким уровнем смертности. Возможно, они возникали в городах, где люди жили в условиях большой скученности и тесного контакта с домашними животными. Начиная с XVI века, появляются надежные исторические источники, в которых четко документированы настоящие пандемии с резким скачком заболеваемости и смертности и распространением инфекции по всему миру. С тех пор в каждом столетии в среднем возникало по три пандемии с интервалом от 10 до 50 лет.

Скорость распространения пандемий по всему земному шару хорошо иллюстрируют исторические документы тех времен, в которые переезд из одной страну в другую занимал намного больше времени, чем сейчас. Так, пандемия 1580 г., возникшая в Азии, всего за год охватила все континенты земного шара; вся Европа оказалась во власти этой пандемии менее чем за 6 месяцев.

Пандемии всегда являлись событиями мирового значения. Они возникали в результате появления высококонтагиозного вируса, к которому большая часть населения не имела иммунитета, и, как следствие, практически глобальной восприимчивости населения к инфекции. Это позволяет определить некоторые общие свойства всех пандемий. Характерными особенностями пандемий являются быстрота распространения по всем частям света, как правило, менее чем за год, и заболевание более четверти всего населения. Помимо высокой смертности пандемии отличаются внезапностью вспышки заболевания, не позволяющей адекватно подготовиться к борьбе с инфекцией.

Пандемии прошлых столетий наносили урон населению земного шара, сопоставимый с ущербом от наводнений. Они начинались внезапно, без всякого предупреждения, с огромной скоростью уничтожая население в разных странах мира. Их было невозможно остановить, они стремительно достигали максимальной интенсивности и прекращались так же внезапно, как и возникали. Однако часто наступала вторая и иногда третья волна пандемии, порой с еще более тяжелым заболеванием. Последующие волны обычно возникали одновременно в разных частях света, усиливая влияние этого бедствия на глобальном уровне.

Система наблюдения за гриппом является самой старой программой контроля заболеваний ВОЗ. Решение о создании этой системы было принято в 1947 г. по двум причинам: неизбежное повторение через неизвестный интервал времени катастрофических пандемий и серьезные социально-экономические последствия сезонных эпидемий, возникающих почти ежегодно. Эта система была создана в целях непрерывного наблюдения в глобальном масштабе за изменением вируса и определения значения этих изменений для здоровья человека. Система включает сеть лабораторий, задачей которых является изучение вирусов гриппа, циркулирующих в разных частях света, и регистрация генетических характеристик этих вирусов.

Уже через четыре года в сеть входили 60 лабораторий из 40 стран мира. В то время, когда жизнь населения земного шара не отличалась такой мобильностью и взаимозависимостью, как сейчас, органы общественного здравоохранения осознали, что бороться с гриппом можно только совместными усилиями с охватом значительных географических территорий. Начиная с момента создания до настоящего времени, сеть является примером плодотворного международного научного сотрудничества на благо здоровья населения земного шара: штаммы вирусов предоставляются другим лабораториям и производителям вакцин бесплатно сразу после выявления каких-либо необычных характеристик вируса.

Сегодня Глобальная сеть наблюдения за гриппом ВОЗ насчитывает 113 национальных центров изучения гриппа в 84 странах мира, а также четыре центра по изучению гриппа ВОЗ, расположенных в Лондоне (Англия), Атланте (США), Мельбурне (Австралия) и Токио (Япония). Пятый центр, расположенный в Мемфисе (США) ведет особые исследования вирусов гриппа у животных. Национальные центры ведут работу по сбору вирусов гриппа, циркулирующих в разных регионах мира. Затем образцы направляются в четыре лаборатории для углубленного изучения. Помимо получения общей, глобальной картины изменения активности вируса гриппа, эта работа позволяет ВОЗ выпускать два раза в год рекомендации по составу противогриппозных вакцин, которые с большей вероятностью смогут обеспечить защиту населения во время сезонных эпидемий как в южном, так и северном полушариях. Таким образом, глобальная сеть ВОЗ вносит весомый вклад в понимание эпидемиологии гриппа и помогает производителям вакцин получить препарат, содержащий наиболее подходящий вирус, а также поставляет им высокоурожайный «посевной» материал для производства вакцин.

Каждый год Центры по контролю и профилактике заболеваний (CDC) США выпускают наборы реактивов для определения типа циркулирующих вирусов в лабораториях глобальной сети. Результаты исследований направляются непосредственно в ВОЗ. В четырех центрах также осуществляется хранение образцов вирусов для исторического сравнения и диагностической поддержки в тех странах, в которых наблюдаются необычные случаи гриппа, например, вызванного штаммом H5N1. В настоящее время исследования для подтверждения диагноза инфекции вируса H5N1 проводят восемь лабораторий глобальной сети. Определение структуры вирусов 2004 г. и их сравнение с историческими образцами, полученными во время предыдущих вспышек, дали ценный материал об эволюции вируса и возможности его передачи от человека к человеку. Несмотря на то, что эта работа ведется незаметно и не привлекает особого внимания, глобальная сеть общепризнанно считается эффективной моделью эпидемиологического наблюдения и научного сотрудничества.

Несмотря на то, что время начала пандемии нельзя предугадать, продолжаются попытки оценить потенциальный ущерб от новой пандемии, в частности смертность. При составлении пандемических планов важно знать, чего нужно опасаться, однако последствия будущей пандемии в значительной степени будут определяться характером вируса, который нельзя знать заранее.

Три пандемии прошлого столетия сильно различались по уровню смертности от менее 1 млн до более 40 млн случаев. По наиболее оптимистическим сценариям, основанным на условиях слабой пандемии 1968 г., смертность во всем мире увеличится на 2-7,4 млн. Если причиной пандемии станет более вирулентный вирус, аналогичный возбудителю пандемии 1918 г., смертность будет значительно выше. Оба сценария с научной точки зрения одинаково возможны. Различия результатов определяются исходными предположениями о различной летальности вируса, которая, как показал опыт предшествующих лет, может варьировать в больших пределах. Таким образом, последствия будущей пандемии невозможно предсказать.

По сравнению с ситуацией прошлых пандемий мировое население значительно увеличилось, так же возросла доля населения, восприимчивого к инфекции. В общем, улучшилось положение с питанием и медицинским обслуживанием, в частности стало более эффективным лечение тяжелых осложнений бактериальной природы. Электронные средства обеспечивают значительно более быструю связь, позволяют проводить эффективный мониторинг в разных странах мира. Также усовершенствованы международные механизмы экстренного реагирования в случае угрозы заболевания, которые прошли строгую проверку во время вспышек атипичной пневмонии.

Однако по сравнению с началом прошлого века увеличились различия в доступности качественной медицинской помощи. Нельзя предугадать последствия пандемии гриппа в мире, насчитывающем 49 млн ВИЧ-инфицированных — людей с ослабленным иммунитетом, которые входят в группу повышенного риска серьезных осложнений гриппа во время сезонных эпидемий. Ограниченные данные о прошлых эпидемиях указывают на возможность повышения смертности в результате пандемии гриппа в странах с эндемичной малярией. Однако не установлено, вызвано ли повышение смертности каким-то взаимодействием двух болезней или (что представляется более вероятным) одна инфекция повышает вероятность тяжелого заболевания и смерти при заражении другой инфекцией.

При всей неопределенности в этих вопросах ясно одно: системы здравоохранения всех стран мира столкнутся с резким повышением потребности в медицинской помощи. Стремительное распространение инфекции, характерное для пандемий, будет еще более ускорено в сегодняшних условиях крайне высокой мобильности. Несмотря на то, что скорость распространения инфекции не влияет на заболеваемость и смертность, возникновение эпидемий одновременно в крупных популяциях внутри одной страны или в разных регионах мира может создать условия резкого дефицита медицинских услуг и лекарственных средств. В этой ситуации будет невозможной практика гуманитарной помощи, хорошо зарекомендовавшая себя в условиях, когда стихийное бедствие охватывает только одну страну или один географический регион. Опыт прошедших пандемий показывает, что хорошо отлаженная система медицинской помощи, высокий уровень санитарии и гигиены, адекватные ресурсы могут способствовать снижению смертности в результате пандемии, но не способны защитить страну от проникновения и стремительного распространения заразной болезни, вызванной вирусом, который будет чужим для иммунной системы всего населения или его большей части.

Эта комбинация неопределенности и установленных фактов создают знакомую ситуацию трудно разрешимой дилеммы для органов здравоохранения: что нужно сделать в первую очередь для подготовки к неизбежному бедствию, которое произойдет неизвестно когда, и будет иметь неизвестно какие, но возможно катастрофические, последствия? В то же время нельзя тянуть с пандемическим планированием, тем более что некоторые ключевые проблемы, такие как совершенствование системы санитарного надзора и разработка пандемической вакцины, требуют времени. Все меры, способные смягчить последствия пандемии и могут быть приняты заблаговременно, лучше реализовать сейчас, а не в обстановке хаоса пандемии. Эти меры можно разделить на три категории: (1) система оповещения о приобретении вирусом высокой трансмиссивности, (2) мероприятия на раннем этапе с целью прекращения дальнейшей адаптации и распространения инфекции в международном масштабе, (3) срочная разработка пандемической вакцины.

Когда разразится пандемия, национальные правительства будут, прежде всего, озабочены состоянием собственных граждан. Перед угрозой инфекционного заболевания, которое охватит все страны, международное сообщество должно иметь надежные системы наблюдения в странах, где может начаться пандемия для регистрации случаев заражения людей, особенно группового, которые могут стать первым сигналом эффективной передачи вируса от человека человеку. В то же время мировое сообщество должно быть уверенным, что экономически развитые страны будут вести активную работу по получению вакцины против пандемического вируса, что является чрезвычайно сложной задачей, на решение которой потребуются большие средства.

Вакцины общепризнанно считаются наиболее эффективным медицинским средством профилактики гриппа и снижения последствий для здоровья в условиях пандемии. Однако в прошлом вакцины никогда не поступали в распоряжение медиков вовремя и в достаточном количестве, чтобы каким-либо образом повлиять на уровни заболеваемости и смертности. Проблемы прошлых пандемий, связанные со специфическим характером пандемической вакцины и нехваткой производственных мощностей, еще более обострились.

За время, прошедшее после тревожных событий января 2004 г., отрасль сделала ряд шагов вперед. Несколько компаний начали разработку пандемической вакцины и моделирование различных стратегий, рассчитанных на краткосрочную и долгосрочную перспективы. Поскольку новые вакцины для сезонных эпидемий гриппа выпускаются ежегодно, практика разработки, лицензирования и производства хорошо отработана как производителями, так и регулирующими органами. Тем не менее, в процессе разработки и производства вакцины против любого пандемического вируса будут возникать специфические проблемы, связанные с тем, что все процедуры необходимо будет проходить в экстремальных условиях экстренной ситуации.

Эти проблемы еще более обострятся, если возбудителем пандемии станет вирус, подобный Н5№. Хотя некоторые компании продвигаются в направлении технологий, основанных на клеточных культурах, стандартной средой для выращивания вируса при создании противогриппозной вакцины являются и еще долго будут являться куриные яйца. Высокопатогенный вирус Н5Ш убивает куриный эмбрион, и, в связи с этим, требуется модификация технологии. Основным методом, применяемым в этих целях, является технология «обратной генетики», направленная на удаление летальных генов.

Технология обратной генетики включает ряд запатентованных процессов, в связи с чем встает вопрос о правах на интеллектуальную собственность. Специалисты фармацевтической индустрии знают, как его решить, однако результат повлияет на стоимость вакцины. В Европе вакцины, которые получают методами обратной генетики, считаются генно-модифицированными организмами, а эта категория продукции вызывает озабоченность общественности уровнем биологической безопасности производственных предприятий. Соблюдение всех мер предосторожности при производстве вакцин в этих условиях требует дополнительных затрат и не может быть обеспечено за короткое время.

Для экономии времени многие вопросы можно решать уже сейчас, и результаты этой работы послужат основой для ускоренного лицензирования и производства вакцины после объявления о начале пандемии. К ним относятся клинические исследования в целях определения оптимальной формы вакцины и незамедлительная регистрация «вакцины-макета». Можно заранее произвести и хранить защитный антиген против вируса подтипа Н5. Запастись вакциной против пандемического вируса невозможно, т.к. вакцина должна точно соответствовать штамму пандемического вируса, и производителям придется подождать, пока он возникнет.

Главная проблема состоит в нехватке производственных мощностей. Спрос будет значительно превышать предложение, особенно в начале пандемии. Оптимизация производства сезонных вакцин поможет повысить мощности для производства пандемической вакцины. Эта мера также будет способствовать снижению негативных последствий сезонных эпидемий гриппа, которые ежегодно уносят от 250 до 500 тысяч жизней, и сделает снабжение в этих целях более стабильным. Этот подход рассчитан на долгосрочную перспективу и предусматривает расширение производственной базы для всех противогриппозных вакцин, однако сейчас необходимо решать и более насущные задачи.

Признаны высокоприоритетными исследования, направленные на экономное использование антигена. Включение в состав вакцины адъювантов позволит повысить эффективность низких доз антигена и оптимизировать использование ограниченного количества антигена и производственных мощностей. Внутрикожное введение вакцины позволит увеличить выпуск вакцины в несколько раз. Эти стратегии вселяют надежду на то, что страны, не имеющие возможности производить вакцину самостоятельно, получат хоть какой-то доступ к пандемическому препарату. Сразу после начала пандемии производители прекратят производство сезонных трехвалентных вакцин (обеспечивающих защиту от трех штаммов) и начнут выпуск одновалентной вакцины, защищающей только от пандемического вируса, что позволит резко увеличить число выпускаемых доз в этот период времени. Для индукции адекватного иммунного ответа у населения, не имеющего иммунитета к вирусу, может потребоваться повторная вакцинация.

Клинические исследования помогут собрать важные данные об безопасности и эффективности препарата, а также получить ответы на некоторые вопросы о содержании антигена и оптимальной дозе, обеспечивающей достаточную защиту. Определение вариантов лекарственной формы будет задачей следующей фазы исследований. Окончательный состав вакцины будет определен по результатам этих исследований; после чего планируется в кратчайшие сроки организовать производство вакцины против пандемического вируса, подобного Н5Ш.

Мощности по производству пандемической вакцины расположены главным образом в Австралии, Европе, Японии и Северной Америке, тогда как потребность в вакцине будет глобальной. В начале пандемии страны-производители вакцины будут иметь явное преимущество и будут направлять произведенную вакцину главным образом для удовлетворения внутренних потребностей. После того, как потребность в вакцине внутри страны будет полностью удовлетворена, избыток произведенного препарата может быть направлен в другие страны. Но даже в этом случае количество вакцины будет недостаточным, при этом фактор стоимости будет ограничивать ее доступность.

В прошлом вторая волна пандемии характеризовалась более тяжелым течением заболевания. Если так будет и в будущем, мы получим какое-то время на наращивание запасов вакцины. Крупные поставки вакцины при хорошо налаженной системе снабжения могут спасти жизнь многим людям. В любом случае всем странам предстоит решать непростую задачу определения групп населения, которые должны быть обеспечены вакциной в первую очередь.

В настоящее время разработкой «макетных» пандемических вакцин занимаются несколько фирм производителей гриппозных вакцин.

К 2009 г. 10 компаний мира (Baxter, Чехия/ Австрия; Berna Biotech -Crucell, Щвейцария - Solvay, Нидерланды; Biken, Япония; Denka Seiken, Япония; Kitasato Institute, Япония; Kaketsuken, Япония; GSK Biologicals, Бельгия; Nobilon International BV, Нидерланды; Omninvest, Венгрия; Sinovac Biotech, Китай) разработали экспериментальные образцы и проводят клинические исследования инактивированных цельновирионных вакцин, 4 компании в мире (CSL Ltd, Австралия; GSK Biologicals, Бельгия; Sanofi Pasteur, Франция; Sanofi Pasteur, США) - инактивированных сплит (расщепленных) вакцин против гриппа птиц, 2 компании (Novartis V&D, Италия и Solvay Pharmaceuticals, Нидерланды) - инактивированных субъединичных вакцин против гриппа птиц, 2 компании (Medimmune, США и Novavax, США) - живых вакцин против гриппа птиц.

В результате проведенных исследований было показано, что отработанные и с успехом применяемые в настоящее время схемы профилактики сезонного гриппа не адекватны в случае пандемического гриппа. Так для успешной вакцинопрофилактики пандемического гриппа необходимо использовать не менее двух прививок с интервалом введения от трех до четырех недель, что утяжеляет и без того сложную ситуацию с достаточностью поставок вакцины в случае пандемии. Вторым ключевым моментом является необходимость использования адъюванта в составе инактивированных вакцин, либо солей алюминия, либо водно-маслянных эмульсий, что позволяет снизить содержание НА в дозе препарата, тем самым повышает возможность увеличения выпуска и обеспечения населения вакциной без потери ее иммуногенных свойств.

С 2005 г. в Российской Федерации проводятся разработка и исследования «макетных» вакцин против пандемического гриппа. В рамках лабораторно-экспериментальных исследований изучены физико-химические и иммунобиологические свойства и выбраны наиболее перспективные вакцинные кандидаты: живая интраназальная («Ультрагривак») и инактивированные субъединичные («ОрниФлю», «ВГИПС»), расщепленная виросомальная («АвиФлю»).

Позиция ВОЗ по вопросу использования вакцин сводится к тому, что наиболее надежными средствами защиты от вирусных инфекций являются вакцинные препараты и, в первую очередь, живые вакцины, формирующие при иммунизации напряженный и длительный иммунитет.

В Российской Федерации в отделе вирусологии ГУ НИИЭМ РАМН был получен штамм А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ы2)[17/Н5] для живой вакцины путем реассортации донора аттенуации А/Ленинград/17/57(Н2И2) и штамма А/утка/Потсдам/86, а затем наработаны экспериментальные серии «макетной» вакцины на Иркутском предприятии ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ.

В рамках доклинических исследований показано, что реассортантный штамм А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5№) сохраняет молекулярную структуру НА и является антигенно идентичным родительскому птичьему вирусу; является гиператтенуированным для кур; проявляет аттенуирующий фенотип при интраназальном введении мышам, активно репродуцируясь в ВДП при сниженной репродукции вируса в легких; вызывает образование системных и локальных антител не только к гомологичному вирусу, но и к высокопатогенным вирусам подтипа Н5Ш; при однократном введении создает высокий уровень резистентности к инфекции высокопатогенными вирусами подтипа А(Н5Ш). «Ультрагривак» - вакцина гриппозная живая, лиофилизат для приготовления раствора для интраназального введения, является иммунологически эффективным препаратом, вызывая выработку ИФ-АТ в титре 1:320 при однократном и 1:1280 при двукратном (с интервалом 10 сут) введении в дозе 10 б'4 ЭИД50 белым мышам массой 14-16 г, вируснейтрализующих антител в титре 1:40 при двукратном введении и гемагглютинирующих антител при однократном введении в титре 1:40, при двукратном - 1:80 и обеспечивает 100 % защиту от заражения 8 ЛД50 и 87 % защиту от 27 ЛД50 вирулентного штамма вируса гриппа птиц А/курица/Курган/Россия/2/2005 (Н5Ш).

Оценивая влияние иммунизации живой вакциной против гриппа птиц на иммунный статус обезьян, необходимо отметить, что вакцинация обеспечивает появление специфических титров АТ, определяемых в реакциях ИФА, РН и РТГА. Однократная вакцинация не обеспечивала формирование напряженного иммунитета у животных. Вторая иммунизация приводила к приросту титров антител, что указывает на обоснованность использования двукратной схемы иммунизации.

Результаты клинического обследования добровольцев и проведенные лабораторно-инструментальные исследования свидетельствовали об отсутствии отклонений в самочувствии и в результатах анализов после иммунизации добровольцев вакциной «Ультрагривак» в сравнении с фоновыми значениями. Местные реакции после первой вакцинации на 4, 5 дни были представлены катаральными явлениями в носоглотке, имели слабовыраженный транзиторный характер и исчезали на 6 день. Местные реакции средней и сильной степени выраженности, а также системные реакции у привитых добровольцев отсутствовали. Результаты клинического и биохимического анализа крови и общего анализа мочи в процессе вакцинации не претерпели существенных изменений относительно нормальных значений. Реизоляты проявляли и са фенотип, сохраняли изменения в генах внутренних и неструктурных белков, а также характерные для донора аттенуации биологические свойства, что свидетельствует о генетической стабильности вакцины «Ультрагривак».

Изучение локального иммунного ответа в носовых секретах волонтеров, привитых вакциной «Ультрагривак» показало, что достоверные приросты э^А-антител в ИФА отмечены в 30 % и 65 % случаев, при этом СГТ э^А-антител составил 10 и 16, а кратность прироста СГТ б^А - 1,7 и

2.8, соответственно после одно - и двукратного введения препарата. При определении уровня вирусспецифических 1^0 в сыворотках крови добровольцев, привитых вакциной «Ультрагривак», показано, что проведение двукратной вакцинации приводит к 2-кратному и более приросту СГТ антител в 95 % случаев и к 4-кратному и более - в 60 % случаев. При оценке в РТГА сывороток крови привитых добровольцев после двукратной вакцинации процент лиц с титром антител >1:20 составил 47 %, с титром антител >1:40 - 29 %, при этом величина СГТ антител - 15,7, а средняя кратность прироста СГТ антител - 2,8. При оценке в РМН сывороток крови привитых добровольцев после двукратной вакцинации процент лиц с титром антител >1:20 составил 75 %, с титром антител >1:40 — 50 %, при этом величина СГТ антител - 15,2, а средняя кратность прироста СГТ антител

2.9.

С целью оценки реактогенности, безопасности, местного, клеточного и гуморального иммунного ответа, выбора оптимальной схемы (интраназальная двукратная с интервалами 10 и 21 сут) вакцинации, а также возможности усиления иммуногенности препарата за счет увеличения дозы с 6,9 ^ ЭИД 50 /0,5 мл до не менее 7,5 ^ ЭИД 50 /0,5 мл на двух клинических базах с участием 200 добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет была проведена II фаза клинических исследований вакцины «Ультрагривак».

Показано, что препарат вне зависимости от интервала введения 10 или 21 сут обладает хорошей переносимостью, безопасностью и низкой реактогенностью. Местные реакции были представлены катаральными явлениями в носоглотке, носили слабовыраженный транзиторный характер и исчезали через 1-2 суток. Уровни сывороточных иммуноглобулинов класса А, в, М и Е сохранялись в пределах исходных значений у всех добровольцев в течение всего периода исследования. Получены положительные данные о выделяемости вируса из носовых ходов привитых, что свидетельствует о хорошей приживаемости вакцины. Для выделения вакцинного вируса потребовалось 2-3 пассажа на чувствительных культурах клеток, что говорит о крайне незначительном содержании вируса в мазках из полости носа привитых и может свидетельствовать о безопасности вакцины для окружающих. Генетическая стабильность реизолятов вакцинного вируса продемонстрирована молекулярно-биологическими методами, что является существенной гарантией безопасности применения применяемого вакцинного штамма на людях.

Вакцина гриппозная живая «Ультрагривак» после одно и в большей степени двукратной вакцинации индуцирует развитие местного, клеточного и гуморального звеньев иммунитета, что свидетельствует о ее высокой иммунологической эффективности. Учитывая назначение вакцины «Ультрагривак» для специфической профилактики пандемического гриппа преимущество имеет схема введения препарата с интервалом 10 сут, что позволит сократить время для обеспечения полноценной защиты людей от инфекции. Кроме того полученные данные показывают, что вакцина «Ультрагривак» способна обеспечить иммунный ответ не только в отношении гомологичного вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 Н5И2 [17/Н5], и в отношении других штаммов вируса гриппа птиц А (Н51М1): АЛ/юШатЛ 194/2004 и А/1пёопез1а/5/2005, т.е. обладает высокой кросс-реактивностью.

В результате проведенных клинических исследований установлено, что живая гриппозная вакцина «Ультрагривак ареактогенна, безвредна для вакцинируемых, безопасна для окружающих, индуцирует развитие местного, клеточного и гуморального иммунитета, что позволило зарегистрировать препарат в Российской Федерации с целью защиты населения в случае возникновения пандемии гриппа.

Опыт ликвидации эпидемических вспышек особо опасных (натуральная оспа) и опасных (полиомиелит) вирусных инфекций позволяет заключить, что использование живой гриппозной вакцины в период пандемии гриппа птиц обеспечит необходимую эпидемическую эффективность и результативность противоэпидемических мероприятий, при минимальных экономических затратах и высокой производительности биотехнологического процесса.

Использование в технологии приготовления вакцин концентрирования и очистки вируса методами высокоскоростного центрифугирования и детергента тетрадецилтри-метиламмония бромида (ТДТАБ) позволяло получать высокоочищенные субъединичные препараты, обладающие низкой реактогенностью и допустимой иммуногенностью и эффективностью. Используя отработанные технологические подходы на основе штамма №ВЯО-14 (АЛЯеШатЛ194/2004), были сконструированы прототипы пандемической инактивированной субъединичной вакцины против гриппа птиц Н5Ш («ОрниФлю», «ВГИПС»). Методом электронной микроскопии было показано, что основными морфологическими структурами полуфабриката вакцин были специфические объединения гемагглютининов (розетки), а также минивиросомы с размером от 22 до 50 нм. При проведении электрофореза в ПААГ показано, что очищенные вирионы вируса гриппа птиц Н5>11 содержали в составе как внутренние, так и наружные антигены. Проведение технологических операций приготовления субъединичной вакцины позволило получить высокоочищенный препарат, в составе которого, был определен поверхностный белок НАо и следовые количества

Для усиления иммуногенных свойств в конструкции «макетных» инактивированных субъединичных вакцин были добавлены адъюванты — алюминия гидроксид (вакцина «ОрниФлю») и Полиоксидоний (вакцина «ВГИПС»).

С целью оценки безопасности и эффективности полученных вакцинных кандидатов были проведены доклинические исследования на лабораторных животных. В результате проведенных исследований показано, что вакцины «ОрниФлю» и «ВГИПС» нетоксичны в остром и хроническом эксперименте, хорошо переносились животными, не обладали выраженными местными и местно-раздражающими действиями, не вызывали негативного влияния на патоморфологические, гистологические и гематологические показатели. Незначительные изменения изучаемых показателей более выражены были при использовании вакцины «ВГИПС». При изучении антигенных и протективных свойств показано, что для индукции иммунитета и получения эффективной защиты животных от патогенного вируса гриппа птиц необходимо проводить не менее двух иммунизаций. Наиболее оптимальной схемой иммунизации животных является внутримышечная двукратная с интервалом 28 сут в дозе 15 мкг НА, позволяющая инициировать выработку ИФ-АТ в титрах от 1:80 до 1:320, АГА - от 1:10 до 1:40 и ВНА - 1:20 и защищать от гибели от 50 до 80 % лабораторных животных, инфицированных вирулентным штаммом вируса птичьего гриппа А/курица/Курган/Россия/2/2005 (Н5Ш).

В рамках I фазы сравнительных клинических исследований на ограниченном контингенте добровольцев (241 доброволец в возрасте от 18 до 50 лет) с целью оценки реактогенности, безопасности и иммуногенности при использовании трех дозировок препаратов (15,30 и 45 мкг НА) после одно- и двукратного введения были изучены инактивированные субъединичные сорбированная на алюминии гидроксиде «ОрниФлю» и в смеси с Полиоксидонием «ВГИПС» вакцины против гриппа птиц.

Оба типа вакцин отличались хорошей переносимостью, безопасностью и низкой реактогенностью. Побочных реакций сильной степени выраженности и серьезных побочных реакций на введение вакцинных препаратов отмечено не было ни в одном случае. В большинстве случаев местные реакции слабой и средней степени выраженности наблюдались у привитых вакциной «ОрниФлю», так и вакциной «ВГИПС» и были представлены болью в месте введения вакцин.

Уровень иммуногенности, индуцированный вакциной «ОрниФлю», содержащей 15 мкг НА и 0,5 мг алюминия гидроксида соответствовал уровню иммуногенности индуцированному вакциной «ВГИПС», содержащей 45 мкг НА и 0,75 мг Полиоксидония, а также по данным литературы показателям иммуногенности индуцированных препаратом субъединичной вакцины без адъюванта, содержащей 90 мкг НА и препаратом адсорбированной субъединичной вакцины, содержащей 30 мкг НА. Исходя из концепции создания вакцинных препаратов, предпочтение отдается вакцине, которая при минимальном количестве антигена индуцирует достаточный уровень специфического иммунного ответа у привитых добровольцев и не оказывает неблагоприятного влияния на здоровье вакцинируемых. Этим требованиям соответствует вакцина «ОрниФлю» с содержанием в одной прививочной дозе 15 мкг НА и 0,5 мг алюминия гидроксида, что дало основание рекомендовать ее для проведения II фазы клинического исследования.

В контролируемом проспективном рандомизированном многоцентровом двойном слепом исследовании приняли участие 360 добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет. В рамках проведенной I фазы исследований отмечено существенное влияние содержания алюминия гидрооксида на показатели иммуногенной активности вакцины «ОрниФлю». Поэтому, в рамках II фазы исследовали вакцину «ОрниФлю» с антигенной нагрузкой 15 и 30 мкг НА. Принципиальным отличием данного препарата от конструкции вакцины «ОрниФлю» использованной в рамках проведения I фазы клинического исследования являлось повышении концентрации алюминия гидроксида в составе препарата с 0,23 мг до 0,5 мг.

Вакцина «ОрниФлю» характеризовалась хорошей переносимостью, безопасностью и низкой реактогенностью вне зависимости от использованной дозы. Побочных реакций сильной степени выраженности и серьезных нежелательных явлений на введение вакцины отмечено не было ни в одном случае. Местные реакции были слабой степени выраженности и наблюдались в группах лиц, привитых как вакциной «ОрниФлю», с антигенной нагрузкой НА 15 мкг/доза так и с антигенной нагрузкой НА 30 мкг/доза. Достоверных различий по частоте возникновения местных реакций между этими группами выявлено не было. Местных побочных реакций сильной степени выраженности после первой и второй вакцинации отмечено не было. Системные реакции также в основном были слабой степени выраженности. Температурная реакция средней степени выраженности в большинстве случаев наблюдалась в группе лиц, привитых вакциной «ОрниФлю», с антигенной нагрузкой НА 30 мкг/доза. Результаты клинического и биохимического анализа крови и общего анализа мочи в процессе вакцинации исследуемыми препаратами не претерпевали существенных изменений относительно нормальных значений.

Учитывая отсутствие рекомендаций ВОЗ, СРМР, СНМР и ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора к оценке свойств подобного рода вакцин, полученные результаты клинических исследований позволили разработать требования к иммуногенности вакцин против гриппа птиц, которые были сформулированы и утверждены Комиссией по гриппозным вакцинным и диагностическим штаммам МЗСЦ РФ:

- препандемические вакцины должны после второй вакцинации на 2128 сут вызывать прирост гомологичных антител в сыворотки крови в 4 и более раз не менее чем у 50 % добровольцев (сероконверсия);

- повышение средних геометрических титров антител на 21-28 день после второй вакцинации по сравнению с исходным уровнем, выражается в кратности увеличения и должно составлять величину более 2,5 (фактор сероконверсии). Этим требованиям соответствует вакцина «ОрниФлю» инактивированная субъединичная с содержанием в одной прививочной дозе 15 мкг НА и 0,5 мг алюминия гидроксида, являющаяся первым препаратом для специфической профилактики гриппа птиц, рекомендованным к регистрации в РФ.

С целью повышения безопасности, иммуногенности и эффективности гриппозных вакцин с 2006 по 2008 г. ФГУП «НПО «Микроген» оценивало возможность разработки новой технологии приготовления препарата. В результате проведенных НИОКР разработана сезонная и макетная пандемическая инактивированные расщепленные виросомальные вакцины.

В отличии от технологии приготовления инактивированных субъединичных вакцин «ОрниФлю» и «ВГИПС» использовали более щадящий метод инактивации вирусов гриппа - ультрафиолетовое облучение, позволяющее сохранять в нативном состоянии структуру вирионов, новый детергент - бета октилгликозит, обеспечивающий возможность самосборки структур в форме виросом, моделирующих пространственную структуру вирионов вируса гриппа и современные методы концентрирования и очистки с использованием хромотографических установок.

При морфологическом исследовании полуфабриката расщепленной виросомальной вакцины показано наличие в материале большого количества виросом диаметром 100-180 нм. На поверхности виросом выявлялись неравномерно располагавшиеся гемагглютинины. В отличие от вирионов виросомы представлялись слабо структурированными «пустыми» частицами, состоявшими из оболочки и упомянутых выше гемагглютининов. При изучении полипептидного состава инактивированной расщепленной виросомальной вакцины «АвиФлю», приготовленной на основе штаммов АЯпёопез1а/5/2005 (Н5Ш) и А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5№)[17/Н5] показано, что препараты содержали поверхностный антиген вируса НАо и внутренние белки М1 и ЫР. Молекулярная масса полипептидов НАо отличалась взависимости от штаммов, так для штамма А/1пёопез1а/5/2005 (Н5Ш) она составляла 75 кДА, а для штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5Ы2)[ 17/Н5] - 72 кДа.

При проведении доклинических исследований инактивированной расщепленной виросомальной сорбированной на алюминии гидроксиде вакцины «АвиФлю» показано, что препарат нетоксичен, не обладает выраженным местным и местно-раздражающим действием, не оказывает неблагоприятного воздействия на системы и органы лабораторных животных, что свидетельствует о ее безопасности.

Проведение двукратной иммунизации позволило индуцировать выработку антител, определяемых в ИФА, РТГА и РМН, а также защитить от гибели до 71,4 % инфицированных вирулентным штаммов вируса гриппа птиц в дозе 25 ЛД5о лабораторных животных. Кроме того было показано, что вакцина «АвиФлю» с антигенной нагрузкой в 5 раз меньше, создала лучший иммунитет чем вакцина «ВГИПС», что свидетельствует о правильности конструктивных подходов в создании препарата нового поколения для защиты от пандемического гриппа.

В открытом сравнительном контролируемом проспективном рандомизированном исследовании приняли участие 65 здоровых волонтеров (мужчины и женщины) в возрасте 18-50 лет с целью изучения реактогенности, безопасности, иммуногенности и кросс-реактивных свойств вакцины «АвиФлю».

Клиническое исследование вакцины «АвиФлю» показало, что введение исследуемых серий препарата не сопровождалось развитием необычных явлений в поствакцинальном периоде, а возникшие слабовыраженные общие и местные реакции были кратковременными и не вызывали ухудшения в состоянии здоровья привитых. В подавляющем большинстве случаев все реакции носили слабовыраженный характер и развивались в первые сутки после вакцинации. Уровень сероконверсии и серопротекции при двукратной вакцинации с интервалом в 28 сут достигал 100 % вне зависимости от введенной дозы и штамма препарата. При исследовании сывороток крови привитых вакциной «АвиФлю» с гетерологичными штаммами NIBRG-14

АЛДеШатЛ 194/2004) (Н5Ш), А/17/утка/Потсдам/8б/92 (Н5Ш), A/Indonesia/05/2005 (Н5Ш) доказана высокая кросс-реактивности препарата.

Представленные результаты свидетельствуют о том, что впервые в мировой практике нам удалось создать «макетную» пандемическую вакцину с двумя адъювантами, которая обладает низкой реактогенностью и высокой иммуногенностыо, что может явиться стратегически правильным посылом в области разработки новых вакцинных препаратов.

Широкое распространение вируса гриппа А/(НШ1)зш1, грозящее перерасти в пандемию, вызывает серьезные опасения органов здравоохранения всех стран мира. Несмотря на принимаемые правительствами стран противоэпидемические меры и развертывание работ по созданию средств и способов защиты от возбудителя, заметных успехов в борьбе с гриппом А/(НШ1)з\у1пока не достигнуто.

Необходимо учитывать, что в настоящее время к вирусу гриппа А/(НШ1)зш1 у основной массы населения мира антитела отсутствуют, как и в случае с гриппом А/Н5, и по-видимому, использование подходов (схем -кратности, интервалов, доз) отработанных на модели макетных вакцин А/Н5, в разработке пандемических вакцин А/(НШ1)з\у1 может явиться реально действующей мерой, которая позволит защитить население РФ от надвигающейся новой пандемии гриппа. Классические подходы (трехвалентные вакцины Гриппол, Гриппол плюс и Гриппол Нео, содержащие вакцинные штаммы А/НШ1, А/НЗЫ2 и В) используемые в настоящее время для специфической профилактики сезонного гриппа, вероятно, не позволят обеспечить эффективную защиту от пандемического гриппа. И, кроме того, количество и качество вносимых изменений в действующую нормативную документацию потребует проведения новой процедуры регистрации, что затормозит процедуру внедрения препарата в практику здравоохранения.

Доклинические и клинические исследования «макетных» пандемических вакцин на основе серотипа А/Н5 были проведены на ведущих лабораторных и клинических базах РФ. В результате исследований были отработаны схемы (кратность, интервал, дозы) применения, доказана безвредность для окружающих, безопасность, иммуногенность и эффективность вакцин (в тестах при оценке протективных свойств на лабораторных животных). Кроме того, что принципиально важно, доказана высокая кросс-реактивность «макетных» пандемических вакцин как в отношении штаммов А/Н5 циркулирующих на территории РФ, так и в отношении штаммов выделенных на других континентах мира.

Полученные результаты позволили в марте 2009 г. зарегистрировать две принципиально отличные друг от друга конструкции пандемических вакцин:

- инактивированная субъединичная сорбированная на алюминии гидроксиде вакцина «ОрниФлю» (ЛСР-001481/09 от 03.03.2009) с содержанием 15 мкг НА в дозе;

- живая интраназальная вакцина «Ультрагривак» (ЛСР-002340/09 от 25.03.2009) с активностью не менее 7,5 ^ ЕШ50 в дозе. В настоящее время данные вакцины официально разрешено использовать у людей в возрасте от 18 до 60 лет.

С целью повышения безопасности, иммуногенности и эффективности гриппозных вакцин с 2006 по 2008 г. была оценена возможность разработки новой технологии приготовления препарата. В результате проведенных НИОКР разработана «макетная» пандемическая инактивированная расщепленная виросомальная вакцина «АвиФлю». В результате доклинических и клинических исследований показана безопасность, иммуногенность и высокая эффективность разработанных конструкций, превосходящие по своим свойствам существующие отечественные и зарубежные аналоги.

Одной из основных проблем в настоящее время остается возможность увеличения производственных мощностей с целью обеспечения населения пандемической вакциной против гриппа. Ориентировочный объем производства в случае перехода на выпуск моновалентной пандемической противогриппозной вакцины после расширения производства может составить: 10 миллионов доз в месяц (инактивированной моновалентной вакцины с содержанием НА 15 мкг в дозе) и 10 миллионов доз в месяц однодозовой упаковки и 20 млн. доз/мес. шестидозовой упаковки (живой моновалентной вакцины с активностью не менее 7,5 ^ ЕГО50 в дозе).

Несмотря на значимый вклад вакцинопрофилактики в снижение заболеваемости гриппом, распространённость данной инфекции остаётся крайне широкой. Наиболее высокому риску заражения, развития осложнений и неблагоприятных исходов инфекции подвергаются дети, пожилые лица и лица, страдающие хронической сопутствующей патологией. Учитывая высокий пандемический потенциал новых вариантов вируса гриппа А/Н5 и А/НШ18\у1 стратегия профилактики гриппозной инфекции в период подготовки к пандемии должна предусматривать первоочередную вакцинацию следующих категорий граждан:

- работники коммунальной сферы обслуживания; работники, занятые в производстве и распределении электроэнергии; работники общественного транспорта; сотрудники федеральных органов исполнительной власти, где законодательно предусмотрена военная и (или) приравненная к ней служба.

Данную категорию желательно прививать живой интраназальной вакциной (типа «Ультрагривак») двукратно с интервалом 10 суток в дозе не менее 7,5 ЭИД50, с учетом эпидемической ситуации по заболеваемости гриппом и острыми респираторными вирусными инфекциями в субъектах РФ и муниципальных образованиях. Расширение контингента прививаемых лиц живой гриппозной вакциной: детей от 3 лет и людей старше 60 лет, возможно после проведения дополнительных клинических исследований, доказывающих безопасность и иммуногенность данного препарата.

Применение инактивированных гриппозных вакцин (типа «ОрниФлю» и «АвиФлю») должно распространяться для следующих групп граждан:

- работники здравоохранения и социального обслуживания; студенты старших курсов медицинских ВУЗов; работники государственных и муниципальных образовательных учреждений (включая дома ребенка, детские дома и другие учреждения интернатного типа); лица с хроническими соматическими заболеваниями, в том числе с иммунодефицитными состояниями; беременные 2-3 триместра; студенты начального профессионального образования, средних специальных и высших образовательных учреждений; учащиеся; дети дошкольного возраста от 6 мес; другие контингента, имеющие отводы по медицинским и эпидемиологическим показаниям от прививок живой вакциной.

Схема вакцинации, в условиях достаточного количества препарата, должна предусматривать внутримышечное двукратное введение инактивированных вакцин с интервалом 28 дней в дозе 15 мкг НА.

Одной из основных проблем в настоящее время остается возможность увеличения производственных мощностей с целью обеспечения населения достаточным количеством пандемической вакцины против гриппа. В случае возникновения пандемии дефицит препарата может вызвать кризис здравоохранения. Для успешной реализации национальной программы защиты населения от пандемического гриппа необходимо расширить мощности по производству, увеличить объемы вакцинации населения сезонными вакцинами, при появлении пандемического гриппозного штамма использовать стратегию иммунопрофилактики, отработанную в рамках проведенных доклинических и клинических исследований «макетных» пандемических вакцин «ОрниФлю», «АвиФлю» и «Ультрагривак».