Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Иммунобиологические свойства рекомбинантных аденовирусных наночастиц как универсальной технологической платформы для создания противогриппозных вакцин

На правах рукописи

ШМАРОВ МАКСИМ МИХАИЛОВИЧ

Иммунобиологические свойства рекомбинаитиых аденовирусных наночастиц как универсальной технологической платформы для создания противогриппозных вакцин

14.03.09. - клиническая иммунология, аллергология 03.01.06 - биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени доктора биологических наук

16 т ¿013

005058213

Москва-2013

005058213

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России)

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Народицкий Борис Савельевич

доктор биологических наук, профессор Официальные оппоненты: Наровлянский Александр Наумович

заведующий лабораторией цитокинов ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России

доктор биологических наук, профессор Шилов Илья Александрович

Заведующий лабораторией анализа геномов ГНУ ВНИИ

сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии

доктор медицинских наук Саядян Хачик Саркисович

профессор кафедры фармацевтической технологии и фармакологии Первого Московского Государственного

Медицинского Университета им. И.М. Сеченова

Ведущая организация: ФГБУ "ГНЦ "Институт иммунологии" ФМБА России

Защита диссертации состоится ¿¿/¿'У2013 года в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России (123098, г.Москва, ул.Гамалеи, д. 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздрава России.

Автореферат разослан'?^^' 2013 г.

Ученый секретарь Л

диссертационного совета & ^ д.м.н., профессор ^^ ^

Уі/у^

Русакова Екатерина Владимировна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время эпидемиологическая ситуация по гриппу продолжает оставаться чрезвычайно напряженной во всем мире. Ежегодно регистрируются эпидемические вспышки сезонного гриппа, а также появляются новые потенциально пандемические штаммы вируса гриппа. Ежегодно вирусом гриппа инфицируются до 1 миллиарда человек, от 3 до 5 миллионов из них болеют в тяжелой форме, от 300 до 500 тысяч человек - с летальным исходом. Пандемии гриппа возникают с неопределенной периодичностью, наиболее значимая из них наблюдалась в 1918-1919 гг., которая унесла жизни 50-100 миллионов человек во всем мире [Lambert L.C., Fauci A.S., 2010].

В начале XXI века человечество вновь столкнулось со вспышкой гриппа, вызванной новым вирусом гриппа А субтипа H1N1, которой в июне 2009 года ВОЗ присвоила 6-ю, пандемическую, степень угрозы. К пандемиям приводит появление новых субтипов вируса гриппа, возникающих из-за постоянно происходящих в геноме возбудителя мутаций. Отсутствие иммунитета у людей к новым вариантам вируса гриппа приводит к высокому уровню заболеваемости гриппом и осложняет осуществление профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Вакцинация является самым действенным способом профилактики гриппозной инфекции [Lambert L.C., Fauci A.S., 2010, Nichol K.L., Treanor J.J., 2006]. Большие надежды возлагаются на разработку иммунобиологических препаратов нового поколения, основанных на рекомбинантных технологиях, неотъемлемой частью которых является использование современных сведений по молекулярной генетике вируса гриппа. Это позволяет преодолеть сложности при изготовлении вакцин из эпидемически актуальных штаммов, связанные, в том числе и с антигенной гиперизменчивостью вирусов гриппа [Lambert L.C., Fauci A.S., 2010].

Использование нанотехнологий и наноматериалов является одним из перспективных направлений науки и техники в XXI веке. Особенности поведения веществ в виде наночастиц (размером менее 100 нанометров) дают широкие возможности в целенаправленном получении материалов с новыми свойствами, в том числе с особыми иммунобиологическими характеристиками.

В частности, использование биологических наноструктур на основе рекомбинантных вирусных частиц открывает большие перспективы доставки генетической информации в эукариотические клетки [Тутыхина И.Л. и др., 2009]. В настоящее время для медицинского применения ведутся разработки большого числа генно-терапевтических препаратов и вакцин для генетической иммунизации. Поэтому применение рекомбинантных вирусов при конструировании наноструктур для последующего применения в генной терапии и генетической иммунизации является актуальным направлением медико-биологической науки [Singh P., Gonzalez M.J., 2006].

Генетическая иммунизация основана на введении генетического материала в клетки организма и экспрессии в них генов целевых белков патогена. В результате полученные антигены соответствующих патогенов распознаются иммунной системой, что приводит к индукции как гуморального, так и клеточного иммунного ответа [Карпов А.П., Тутыхина И.Л., 2007, Knoblich H.V., Sommer S.E., Jackwood D.J., 2000]. Это дает генетическим вакцинам ряд преимуществ по сравнению с традиционными способами иммунизации. Во-первых, отпадает необходимость в получении и очистке антигенов, а значит в работе непосредственно с патогенами. Во-вторых, иммуногенность дозы генетической вакцины по сравнению с традиционной вакциной чаще выше вследствие активной и продолжительной наработки антигена самим организмом. В - третьих, экспрессия антигенов непосредственно в клетках организма позволяет сохранить их нативную структуру и, следовательно, точнее представлять антигенные эпитопы патогена иммунной системе «хозяина». В - четвертых, генетические вакцины безопасны, векторы не реверсируют в патогенную форму, так как направленно лишены соответствующих участков генома. Кроме того, применение различных векторов на основе рекомбинантных вирусов, благодаря присутствию в них молекулярных патоген-ассоциированных структур, индуцирующих врожденный иммунитет, может оказывать дополнительное иммуностимулирующее действие.

В ходе научных поисков в представленной работе было выяснено, что для получения препаратов, предназначенных для людей, в качестве векторов наиболее оптимально использовать аденовирусы человека, эффективно проникающие в человеческие клетки. На сегодняшний момент наиболее изученным и часто используемым генетическим вектором являются рекомбинантные аденовирусные наночастицы на основе аденовируса человека пятого серотипа (РАВН-Ад5). Вакцины на основе РАВН-Ад5 имеют ряд преимуществ перед другими генетическими вакцинами. Во-первых, используемые для создания вакцин, РАВН-Ад5 являются репликативно-дефектными и безопасными. Безопасность РАВН-Ад5 на основе аденовирусов человека пятого серотипа с делегированными El и ЕЗ областями генома подтверждается целым рядом проведенных клинических испытаний различных вакцинных и терапевтических препаратов на их основе [Chia W.K., Wang W.W., 2011, Van Kampen K.R., Shi Z., 2005]. Во-вторых, применение РАВН-Ад5 позволяет проводить интраназальную иммунизацию, и, как следствие, индуцировать образование мукозального иммунного ответа, что немаловажно при вакцинации против патогенов, инфицирующих слизистые оболочки. В-третьих, разработаны быстрые и гибкие технологии получения РАВН-Ад5, позволяющие реализовать масштабное производство различных кандидатных вакцин на основе РАВН-Ад5 на одной технологической линии, без ее переоборудования и изменения регламента. Вышеперечисленные свойства делают РАВН-Ад5 хорошей технологической платформой для создания вакцин против гриппа, вызванного любыми субтипами вируса гриппа.

Важной частью при разработке вакцинных препаратов является подбор возможных адъювантов, наиболее современными из которых являются молекулярные адъюванты. Способность таких адъювантов повышать иммуногенность вакцинного антигена реализуется через взаимодействие с паттерн-распознающими рецепторами, активация которых приводит к дополнительной стимуляции иммунных реакций. Использование таких молекулярных адъювантов позволяет добиться не только направленной индукции тех иммунных реакций, которые необходимы для формирования максимально результативной защиты организма против того или иного патогена, но и максимально снизить возможные побочные эффекты, которые могут привносить адъюванты. Поэтому актуальным направлением исследований при разработке современных вакцин является подбор молекулярных адъювантов, что также является частью данной диссертационной работы.

Интерес научного сообщества к проблемам гриппа значителен, продолжаются активные поиски надёжных и безопасных иммунобиологических средств защиты населения во многих странах, в том числе и в России.

Данная диссертационная работа, посвященная изучению иммунобиологических свойств РАВН, показателей эффективности и безопасности разработанных кандидатных вакцин, раскрывает новые перспективы в борьбе с гриппом. Использование РАВН для создания вакцин против гриппа является актуальным и представляет самостоятельный научный и практический интерес.

Цели н задачи исследования.

Цель работы: разработка, изучение иммунобиологических свойств и оценка безопасности новых противогриппозных вакцин, основанных на универсальной технологической платформе рекомбинантных аденовирусных наноструктур (РАВН).

В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи:

1. Сконструировать рекомбинантные аденовирусные наночастицы (РАВН) на основе аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующие гены антигенов вирусов гриппа человека и птиц.

2. Оценить иммуногенность, активацию клеточного иммунного ответа, а также протективные свойства сконструированных РАВН, экспрессирующих гены антигенов вируса гриппа.

3. Определить возможность индукции перекрестного иммунного ответа, при введении РАВН, экспрессирующей ген гемагглютинина вируса гриппа А субтипа Н5И1 и субтипа Н5Ы2 .

4. Изучить механизм и степень влияния нового молекулярного адъюванта на иммуногенность РАВН-Ад5.

5. Оценить возможность разработки универсальной противогриппозной вакцины на основе РАВН-Ад5.

6. Разработать технологию получения вакцин на основе РАВН - Ад5 с помощью биореакторов волнового типа.

7. Провести доклинические исследования эффективности и безопасности кандидатной вакцины против гриппа птиц на основе РАВН-Ад5, экспрессирующих гены гемагглютинина вируса гриппа А субтипа H5N2.

8. Провести доклинические исследования эффективности и безопасности кандидатной трехвалентной противогриппозной вакцины против сезонного гриппа на основе РАВН-Ад5, экспрессирующих гемагглютинины (далее НА) вируса гриппа А субтипов H1N1, H3N2 и вируса гриппа В, и содержащей новый молекулярный адъювант.

Научная новизна.

Получены оригинальные РАВН на основе аденовируса человека 5 серотипа, экспрессирующие гены НА следующих вирусов гриппа: вируса гриппа А птиц H5N2 (РАВН-Ад5-НА5-2), вируса гриппа А птиц H5N1 (РАВН-Ад5-НА5-1), вируса гриппа А человека H1N1 (РАВН-Ад5-НА1-1); вируса гриппа А человека H3N2 (РАВН-Ад5-НАЗ-2), вируса гриппа В (РАВН-Ад5-НАВ), а также конструкция РАВН-Ад5-М4-Р1, экспрессирующая ген фьюжн-белка, состоящего из четырех эктодоменов М2-белка вируса гриппа А и флагеллина Salmonella enterica (лиганда для Толл-подобного рецептора 5).

Впервые показана индукция перекрестного гуморального иммунитета к вирусу гриппа А птиц H5N2 при иммунизации мышей РАВН-Ад5, несущими ген НА вируса гриппа А птиц H5N1. Показана длительная (24 недели) перекрестная защита животных, иммунизированных РАВН-Ад5-НА5-1, против летальной дозы вируса гриппа А птиц H5N2 (50ЛД50).

Впервые показана индукция гетеросубтипического иммунного ответа к вирусам гриппа А субтипов H1N1 и H2N3 при вакцинации лабораторных мышей РАВН-Ад5-НА5-2.

Впервые показана способность кислого пептидогликана, растительного происхождения с молекулярной массой 1000^10000 кДа, вызывать активацию Толл-подобного рецептора 4 (TLR4) врожденного иммунитета в условиях in vitro. Данный препарат усиливает иммуногенность РАВН-Ад5, что позволяет использовать его в качестве молекулярного адъюванта для производства противогриппозных вакцин на основе РАВН.

Впервые показана возможность создания универсальной противогриппозной вакцины на основе РАВН-Ад5, несущей фъюжн - белок, состоящий из четырех эктодоменов М2-белка вируса гриппа и лиганда для Толл-подобного рецептора 5 - флагеллина Salmonella enterica (РАВН-Ад5-М4-F1), которая обеспечивала протекцию мышей от заражения летальной дозой вируса гриппа А субтипов H5N2, H2N3, H1N1.

Впервые разработана кандидатная трехвалентная противогриппозная вакцина против сезонного гриппа на основе РАВН-Ад5, экспрессирующих НА

вируса гриппа А субтипов H1N1, H3N2, вируса гриппа В и содержащая молекулярный адъювант. В ходе доклинических исследований установлена её безопасность и эффективность.

Практическая значимость.

Полученные результаты исследований показывают, что РАВН-Ад5 могут служить универсальной технологической платформой для быстрого создания кандидатных противогриппозных вакцин, а предложенная технология - для их масштабного производства, что отвечает задачам здравоохранения РФ в отношении эпидемиологического благополучия населения по гриппу и целям биобезопасности страны.

Разработан лабораторный регламент получения активного компонента (РАВН-Ад5-НА5-2) кандидатной вакцины для специфической профилактики гриппа птиц у людей на основе рекомбинантных аденовирусных наночастиц (утвержден директором ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им.

H.Ф. Гамалеи» Минздрава России).

Отдельные результаты работы включены в методические рекомендации и указания, утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко: МР 1.2.2566-09 «Оценка безопасности наноматериалов in vitro и в модельных системах in vivo», МР 1.2.2641-10 «Определение приоритетных видов наноматериалов в объектах окружающей среды, пищевых продуктах и живых организмах», МР 1.2.2522-09 «Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека», МР 1.2.2639-10 «Использование методов контроля количественного определения наноматериалов на предприятиях наноиндустрии», МУ 1.2.2520-09 «Токсико-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов», МУ 1.2.2636-10 «Проведение санитарно-эпидемиологической экспертизы продукции, полученной с использованием нанотехнологий и наноматериалов», МУ

I.2.2745-10 «Порядок отбора проб для характеристики действия наноматериалов на лабораторных животных», МУ 1.2.2741-10 «Порядок отбора проб для выявления и идентификации наноматериалов в лабораторных животных», МУ 1.2.2634-10 «Микробиологическая и молекулярно-генетическая оценка воздействия наноматериалов на представителей микробиоценоза», МУ 1.2.2635-10 «Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов».

Результаты, полученные в ходе выполнения диссертации, вошли в патенты Российской Федерации 2326942 «Способ создания рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации и генной терапии», 2326943 «Способ создания рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации против вируса гриппа птиц H5N1», 2381272 «Способ размножения вируса», 2444570 «Способ

получения рекомбинантной вакцины», 2012107028 (заявка) «Рекомбинантная трехвалентная вакцина от гриппа человека».

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на Четвертой международной конференции из серии Наука и бизнес «Нанобио-и другие новые перспективные биотехнологии» (Москва, 2007), Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008), 9-м международном симпозиуме, посвященном аденовирусам (Стамбул, Турция, 2009), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), Итоговой конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработка научно-технического комплекса России на 2007-2012 гг.» (Москва, 2009), Международной конференции Koch Metschnikow Forum (Марбург, Германия, 2010), Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2011).

Апробация диссертационной работы состоялась на научной конференции отдела генетики и молекулярной биологии бактерий, отдела медицинской микробиологии, отдела иммунологии ФГБУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России. 01 ноября 2011 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 38 научных работ, из них 27 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 290 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и список используемой литературы (236 источников, из которых 10 отечественных и 226 иностранных). Работа содержит 50 таблиц и 57 рисунков.

Основные положения, выносимые на защиту

Генетические вакцины на основе рекомбинантных аденовирусных наночастиц, экспрессирующих гемагглютинины вируса гриппа А и В, при однократной интраназальной иммунизации индуцируют гуморальный и клеточный иммунный ответ, обеспечивающий высокоэффективную защиту лабораторных животных от гриппа.

Технологическая платформа на основе рекомбинантных аденовирусных наноструктур является универсальной и может быть использована для разработки генетических вакцин, как против сезонных, так и против пандемических штаммов вируса гриппа. Кроме того, такая технологическая платформа может быть использована для получения противогриппозных вакцин широкого спектра действия.

Кандидатные противогриппозные вакцины на основе рекомбинантных аденовирусных наночастиц по результатам проведенных доклинических

исследований являются безопасными и могут быть рекомендованы для клинических испытаний.

Разработанная технология производства противогриппозных вакцин на основе РАВН-Ад5 с использованием биореакторов волнового типа может быть использована для их масштабного производства с целью применения в рамках национального календаря прививок.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнена в лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ, различные разделы доклинических исследований кандидатных вакцин проводились при совместном взаимодействии с коллегами в ФГУ "Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А.Герцена" Минздравсоцразвития РФ, ФГБУ "Научно-исследовательский институт гриппа" Минздравсоцразвития РФ и ФГБУ «Научно-исследовательский институт медицинской приматологии» РАМН.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Вирусы и бактериальные штаммы. В работе были использованы: вирус гриппа птиц A/Mallard duck/PA/10218/84 (H5N2) [Smirnov Y.A. et al., 2000], вирусы гриппа человека штаммы A/California/07/2009(H1N1), В/Brisbane/60/2008, A/Aichi/2/68 (H3N2), A/USSR/90/77 (H1N1) и A/black duck/New Jersey/1580/78 (H2N3), адаптированные для мышей. Были использованы лабораторные штаммы Escherichia coli DH5a и BJ5183. Клеточные линии. В работе использовались: линия 293-НЕК (клетки почки эмбриона человека, human embryo kidney) [Graham F.L. et. al., 1977], суспензионная культура 293-F (клетки почки эмбриона человека, трансформированные El-областью Ад5) (Invitrogen, США), линии клеток почки эмбриона человека HEK293-hTLR2/CD14, HEK293-hTLR4/CD14-MD2, HEK293-hTLR5, HEK293-hTLR7, HEK293-hTLR8, HEK293-hTLR9 (экспрессирующие Толл-подобные рецепторы 2, 4, 5, 7, 8, 9 и несущие ген ß-галактазидазы под контролем NF-кВ респонсивного элемента), НЕК293-hTLRnull (не несущие гена толл-рецепторов и несущие ген ß-галактазидазы под контролем NF-кВ респонсивного элемента, служили контрольными клетками), линия MDCK (клетки почки собаки), А549 (клетки карциномы легкого человека).

Векторы. В работе использовались стандартные плазмидные векторы pBluescript II SK(-) (Fermentas MBI) cDNA3.1/Zeo(+) (Invitrogen, США), плазмидная система pGEM-T-Easy (Promega, США), плазмидные векторы pShuttle-CMV и pAd-Easy (Stratagene, США). Плазмида pZ35 была любезно предоставлена сотрудником лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России, к.б.н. Зубковой О.В.

Аденовирусный вектор РАВН-Ад5-пи11 (для контроля, несущий экспрессионную кассету без вставки трансгенов).

Молекулярный адъювант. Кислый пептидогликан растительного происхождения был любезно предоставлен д.м.н. Атауллахановым Р.И. Моноклональные антитела и очищенные антигены патогенов. В работе были использованы коммерческие антитела к НА вируса гриппа А H1N1/A/California/07/2009 (ProSci Inc.cat.# 5237), H3N2 (Sinobiological Inc, Китай, cat.# 11056-V08H), вируса В (Sinobiological Inc, Китай, catJ 11053-

RPOl), антитела козы к мышиному IgA (Sigma, cat.#A4789) и IgG (Sigma, cat.#A4416), и очищенный НА вируса гриппа A H1N1 (A/California/7/2009, Sion Biological Inc.cat# 11085-V08H).

Лабораторные животные. Эксперименты проводились на мышах линии BALB\c, беспородных мышах, неинбредных крысах, хорьках, обезьянах макака - резус. Праймеры:

а) для получения гена НА вируса гриппа A H5N2 путем ОТ-ПЦР: HA2-for 5'-gtc atg gaa aga ata gtg att g-3'

HA2-rev 5'- ctg cta gat gca aat tct gca c-3'

б) гомологичные участку гена НА вируса гриппа А:

-H5N2 - HA5-2-for 5'- сса gga fac ttc aac gat tat g -3' и HA5-2-rev 5'- cca caa tat cag aag gtc ctc c-3';

-НШ1неоптимизированный-А1-Р 5'-ctc tag aaa gtt cac ccc gag -3' и Al-R 5'-gac cag cac ctc ttt ctc ctt g-3';

-H1N1 - Hl- for 5'- acccagtttacagccgt -3" и Hl-rev 5'- ggccaggatctggtagat-3'; -H3N2 - A3-F 5' - cgt gca cca tcc egg aac ag -3' и A3-R 5' - tag agt ttg teg aac tgc tc -3';

-типа В - B-F 5'- cca ttg aag tgc cct аса tct gc -3' и B-R 5' - ctc ggt gca gat gta ggg cac-3'

в) праймеры, комплементарные геному аденовирусов человека 5го серотипа: AD5-for 5'- aac ttc cag ccc atg agc mg - 3'

AD5-rev 5'- ctc aaa agt cat gtc bag cgt - 3'

г) праймеры, комплементарные делетированным участкам генома аденовирусов человека:

El-for 5' - ccc gac tct gta atg ttg geg gtg с - 3' El-rev 5' - gca aag ega аса cat aat ate tgg g - 3'

Ферменты и другие реактивы. В работе использовались коммерческие препараты специфических эндодезоксирибонуклеаз рестрикции и других ферментов фирм Boeringer, (Германия), Fermentas MBI (Литва), Promega (США) и NE BioLabs (США).

Для проведения ДНК-электрофореза в агарозном геле в качестве маркеров молекулярного веса использовали ДНК фага X (Fermentas MBI, Литва), обработанную рестриктазой Pstl или коммерческие маркеры фирмы Fermentas MBI (Литва).

Для анализа экспрессии генов НА использовали набор ELISA kit for detection of hemagglutinin (HA) of influenza A virus, H5 strain (BioAssay Systems, США).

Для приготовления буферных и других растворов использовали соли и другие реактивы фирм Serva Electrophoresis (Германия), Sigma - Aldrich (США), Merck (Германия) а также соли производства Реахим (Россия) маркировки х.ч. и о.с.ч.

Для выращивания клеток E.coli использовали бакто-триптон, бакто-агар и дрожжевой экстракт фирмы Difco (США).

Культуральные среды для выращивания вирусов: DMEM (минимальная среда Игла, модифицированная Дельбекко, HyClone, США) с 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (HyClone, США) в присутствии глутамина и смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина (ПанЭко, Россия), MEM (минимальная среда Игла, HyClone, США) с 0,2% БСА (Sigma, США) и трипсином в концентрации 1 мкг/мл и с 10% сыворотки эмбрионов крупного рогатого скота (HyClone, США) в присутствии глутамина и смеси антибиотиков пенициллина и стрептомицина (ПанЭко, Россия).

Для культивирования суспензионных клеток использовали среды CDM НЕК293 (HyClone, США), SFMHEK293 (HyClone, США) и CD293 AGT (Invitrogen, США).

Для постановки трансфекции культур клеток использовали среду OptiMEM (HyClone, США).

Для приготовления разведений вируса гриппа использовали среду Хенкса с гидролизатом лактальбумина и антибиотиком гентамицином (ПанЭко, Россия).

Плазмидную ДНК очищали набором JETSTAR 2.0 Plasmid Midiprep Kit (Genomed, США). Трансфекцию клеток линии 293-НЕК проводили с применением реагента MetafecteneTM (Pro Biontex, Германия). Для выделения РНК применяли набор реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «Рибо-сорб» (ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора). Для постановки реакции обратной транскрипции использовали набор Reverse Tpanscription System (Invitrogene, США).

Синтез праймеров был выполнен в ООО «Синтол». Секвенирование генов проводилось в НПФ «Литех». Синтез генов и адаптация кодонов для экспрессии в клетках человека были выполнены в ЗАО «Евроген». Методы.

- все генно-инженерные манипуляции проводились по стандартным методам [Sambrook at. al„ 1989];

- для получения плазмидных конструкций, несущих геном рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа и экспрессионную кассету с целевым геном, использовали клетки E.coli штамма BJ5183, которые трансформировали методом электропорации смесью геномной ДНК аденовируса и линеаризованной ДНК несущей геном целевого трансгена и челночного плазмидного вектора. Затем плазмидная конструкция, содержащая геном рекомбинантного аденовируса с экспрессионной кассетой, была перетрансформирована в компетентные клетки E.coli штамма DH5a, не способные к рекомбинации;

- РАВН на основе аденовируса человека пятого серотипа получали в результате трансфекции пермиссивной линии клеток НЕК293 плазмидной конструкцией, включающий полноразмерный геном рекомбинантного аденовируса, гидролизованный рестриктазой Рас1. В результате гидролиза вырезался фрагмент, содержащий сайт инициации репликации и ген резистентности к антибиотику, и образовывалась линейная структура, состоящая из

полноразмерного генома рекомбинантного аденовируса и экспрессионной кассеты. Трансфекцию проводили реагентом Metafectene™ (Pro Biontex, Германия). Через десять дней после трансфекции наблюдали ЦПД (цитопатогенное действие) вируса. Полученные вирусные образцы, представляющие собой суспензию заражённых клеток, хранили при температуре -70°С;

- полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили в автоматическом режиме на приборе МС-2 (ДНК-Технология, Россия. Реакционная смесь объемом 25 мкл содержала: 10х ПЦР-буфер (0,67 M трис-HCl рН 8.8, 20 мМ MgC12 и 0,15М (NH4)2S04), дНТФ до конечной концентрации 200 мМ, 10 пмоль каждого праймера, 2,5 Ед полимеразы и стерильную деионизированную воду до 25 мкл;

Параметры амплификации:

1. отжиг праймеров с матрицей - 42-65 °С - 30 сек

2. синтез комплементарных цепей - 72 °С - 30 сек

3. периодическая денатурация - 94 °С - 30 сек. Всего проводили 20-35 циклов реакции;

- для анализа экспрессии гена НА использовали коммерческий ELISA набор для детекции НА вируса гриппа А птиц штамма Н5 (BioAssay Systems, США). Экспрессию рекомбинантных НА вируса гриппа A (H1N1, H3N2, а также НВ) определяли методом Western-blotting с использованием моноклональных антител (ProSci, США);

- РГА выполняли по общепринятому методу [Шубладзе А.К., Гайдамович С.Я., 1964]. Для постановки РТГА также использовали стандартную методику [Rogers G.N., Pritchett T.J., 1983];

- реакцию вирус-нейтрализации (РВН) проводили, используя вирус гриппа в дозе, равной 100 ТЦД50. Результаты РВН учитывали на 7-е сутки для аденовируса человека и на 3-е сутки для вируса гриппа А по наступлению ЦПД в культуре клеток;

- определение титра IgA и IgG в сыворотках крови, препаратах бронхо-альвеолярных лаважей (БАЛ) и назальных смывах лабораторных животных проводили методом непрямого ИФА (иммуно-ферментный анализ), РТГА, РВН;

- для определения ЛД50 вируса гриппа А мышей заражали интраназально, под легким эфирным наркозом десятикратными разведениями вируса, по 8 мышей на каждое разведение. Учет количества павших и выживших мышей вели ежедневно в течение 14 дней. Среднее значение ЛД50 определяли, используя метод Рида и Менча [Reed L.J., Muench H.,1938]. Вирулентность вируса выражали как loglO (ЭИД50/ ЛД50) [Bangari D.S., Shukla S., 2005];

- заражение лабораторных мышей вирусами гриппа проводили интраназально под легким эфирным наркозом через три недели после иммунизации РАВН;

- статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием программы Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Конструирование рекомбинантных аденовирусных наноструктур на основе аденовируса человека пятого серотипа (РАВН-Ад5), несущих гены

НА вирусов гриппа

Конструирование любых генетических конструкций начинается с выбора типа вектора и целевого трансгена, который будет экспрессироваться. В представленной работе выбор вектора был сделан в пользу аденовируса человека 5 серотипа, как одной из самых безопасных и имеющих очевидные преимущества экспрессионных систем [Van Kampen K.R., Shi Z., 2005].

В качестве целевого антигена вируса гриппа был выбран НА. Этот поверхностный белок вируса гриппа представляет интерес для создания вакцинных препаратов, так как антитела, вырабатываемые именно на НА, составляют важнейшую часть иммунного ответа организма на возбудителя. Показано, что антитела на этот белок часто являются вирус-нейтрализующими [Sylte М„ Hubby В., 2007].

Для конструирования рекомбинантных аденовирусных наночастиц на основе аденовируса 5-го серотипа были взяты НА эпидемически актуальных на момент исследования штаммов вируса гриппа. Начиная с 1997 года вирус гриппа А птиц H5N1 циркулирует не только среди птиц, но также вызывает заболевания у людей, что свидетельствует о его пандемическом потенциале [http://www.who.int/mediacentre/factsheets/avian_influenza/ru/index.html]. Вирусы гриппа А субтипов H1N1 и H3N2, а также вирус гриппа типа В были рекомендованы ВОЗ для включения в состав вакцин в северном полушарии на сезон 2011/12 [www.who.int/influenza/vaccines/virus/201 l_12north/en/index.html].

При создании РАВН-Ад5 учитывалось, что одной из определяющих характеристик генетической конструкции является уровень экспрессии целевого гена. Существует достаточно много способов повышения уровня экспрессии трансгена. Прежде всего, это подбор правильного промотора и других составных частей экспрессионной кассеты. Для решения поставленных задач наиболее оптимальной оказалась кассета, содержащая промотор ранней области El цитомегаловируса человека и сигнал полиаденилирования гена бычьего гормона роста. Таким образом, все встраиваемые гены входили в состав вышеописанной экспрессионной кассеты.

Для разработки вакцины против гриппа птиц использовали вирус гриппа A/Mallard duck/P А/10218/84 (H5N2), так как получение гена из высокопатогенного штамма методом ОТ-ПЦР являлось затруднительным, а химический синтез на момент исследования был недоступен. Была показана экспрессия полученной конструкцией РАВН-Ад5-НА5-2 гена НА, охарактеризованы иммуногенные и протективные свойства.

Последующие конструкции РАВН-Ад5 создавали с использованием химически синтезированных трансгенов. На первом этапе было выяснено, что экспрессия нативного гена НА в составе экспрессионной кассеты низкая. Из

литературных данных известно, что увеличение в составе антигена кодонов, тРНК которых наиболее часто встречаются в клетках млекопитающих, является одной из наиболее эффективных стратегий увеличения экспрессии целевого гена в организме млекопитающего [Yang J.L., Wang H.L., 2010]. Для подтверждения эффективности этой методики были созданы два варианта конструкций: РАВН-Ад5-НА 1 -1 neopt со вставкой неоптимизированного для экспрессии в клетках млекопитающих гена НА вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1) и РАВН-Ад5-НА1-1 со вставкой того же гена, но с оптимизированными для экспрессии в клетках млекопитающих кодонами. Гены НА были синтезированы химически. Сравнение иммуноблот-анализом уровней экспрессии неоптимизированного и оптимизированного генов НА вируса гриппа A H1N1 в составе кассеты с промотором ранней области El цитомегаловируса человека и сигналом полиаденилирования гена бычьего гормона роста подтвердило значительное усиление экспрессии оптимизированного гена.

На основании полученных результатов, стратегия оптимизации кодонов была применена также к генам НА вируса гриппа A/Perth/16/2009 (H3N2) и B/Brisbane/60/2008, которые затем были химически синтезированы.

Экспрессия генов НА конструкциями РАВН-Ад5-НА 1 -1, РАВН-Ад5-НАЗ-2, РАВН-Ад5-НАВ была показана на трансдуцированных ими клетках А549, которые затем были инкубированы с антителами к соответствующим НА и после фиксации в 2% параформальдегиде иммунофлуоресцентно окрашены. В результате были получены РАВН-Ад5 с высокими уровнями экспрессии целевых трансгенов (НА) (Рис.2). На рисунке 2 отрицательные контроли под номерами 1, 2, 3 (не трансдуцированные РАВН клетки А549) не имели флуоресценции, т.е. экспрессии НА не наблюдалось. Клетки, трансдуцированные созданными конструкциями РАВН (номера 4, 5, 6) имели различную яркость свечения (салатовым цветом), так же как и положительные контроли клеток, зараженных вирусами соответствующих субтипов (7, 8, 9). Уровень экспрессии генов НА РАВН-Ад5-НА1-1, РАВН-Ад5-НАЗ-2, РАВН-Ад5-НАВ в клетках оказался высоким.

Следует отметить, что после создания любых конструкций РАВН-Ад5 проверяли их подлинность методом ПЦР с использованием пар праймеров, комплементарных соответствующим целевым трансгенам, гену гексона аденовируса человека пятого серотипа, а так же El области аденовируса для контроля возможного присутствия репликативно-компетентных вирусных частиц (ревертантов «дикого типа» аденовируса).

Кроме ПЦР-анализа, первичную нуклеотидную последовательность экспрессирующих кассет в составе аденовирусов проверяли методом секвенирования, а идентичность последовательностей в составе полученных РАВН целевым генам показали сравнением их нуклеотидных последовательностей. Нуклеотидных замен в конструкциях РАВН-Ад5-НА5-2, РАВН-Ад5-НА 1 -1, РАВН-Ад5-НАЗ-2, РАВН-Ад5-НАВ обнаружено не было.

Иммуногенные и протективные свойства созданных конструкций

РАВН-Ад5 со вставками генов НА вирусов гриппа in vivo и выбор эффективного способа их введения в организм

Следующим этапом работы было изучение иммунобиологических свойств созданных конструкций РАВН-Ад5 in vivo. Первоначально были проведены опыты с конструкцией - РАВН-Ад5-НА5-2, экспрессирующей ген НА вируса гриппа А субтипа H5N2. Экспериментальными моделями служили мыши и хорьки. На основе полученных результатов предстояло определить наиболее приемлемые путь и кратность введения.

Иммуногенность определяли по титрам антител к вирусу гриппа в РВН (реакции вирусной нейтрализации), РТГА (реакции торможения гемагглютинации). Диагностическим материалом служили образцы сыворотки крови, которые брали через три недели после однократного введения материала мышам или через три недели после второй иммунизации при двукратной схеме введения. Отрицательным контролем служил ФБР (фосфатно-буферный раствор).

Полученные результаты экспериментов по оценке иммуногенности РАВН-Ад5-НА5-2 в дозе 108 БОЕ при внутримышечном введении мышам

Рис. 3. Уровни антител в сыворотке крови мышей в РВН и РТГА после внутримышечной иммунизации РАВН-Ад5-НА5-2 в дозе 108 БОЕ.

Уровни антител, и вирус-нейтрализующих, и антигемагглютинирующих (анти-НА) (11,3 Iog2 и 12 logs, соответственно) в случае двукратной иммунизации были достоверно (р<0,05) выше по сравнению с контролем. При однократном введении значения тех же антител также были высокими (9,7 log2 и 10,17 log2, соответственно) и достоверно отличались от контроля (р<0,05). Однако достоверной разницы между уровнями антител при двукратном и однократном введении не наблюдалось. Данный факт позволил выбрать однократное введение, как оптимальный способ введения РАВН-Ад5-НА5-2 в дозе 108 БОЕ.

Во второй серии опытов в качестве лабораторных животных использовали хорьков. Через 4 недели после однократной вакцинации хорьков

дозой 108 БОЕ РАВН-Ад5-НА5-2 были определены титры анти-НА и вирус-нейтрализующих антител в сыворотках крови. Кроме того, для оценки длительности иммунитета были взяты пробы сывороток крови через 3, 6, 9 месяцев и определены титры анти-НА и вирус-нейтрапизующих антител (Рис.4).

месяцы

Рис. 4. Динамика титров антител в сыворотке крови хорьков в РВН и РТГА после однократной внутримышечной иммунизации РАВН-Ад5-НА5-2 в дозе 108 БОЕ.

В РТГА было установлено, что средний геометрический титр (СГТ) анти-НА антител в сыворотке крови хорьков составлял на четвертой неделе после вакцинации 4 через 3 и 6 месяцов был наиболее высоким-5,75 и 5,5 \og2y соответственно, а через 9 месяцов был достоверно (р<0,05) снижен до 3,5 1о£2. Сходную динамику наблюдали при определении СГТ вирус-нейтрализующих антител, 1 месяц - 3,82 3-й - 7,82 ^2, 6-й - 6,57 9-й - 3 1о§2 (достоверное снижение, р<0,05). Все полученные результаты достоверно отличались от контроля (ФБР) (р<0,05).

Следовательно, длительность гуморального иммунитета после однократной внутримышечной вакцинации РАВН-Ад5-НА5-2 в дозе Ю8БОЕ у хорьков составила 9 месяцев (период наблюдения).

Представленные результаты исследования внутримышечного способа введения РАВН-Ад5-НА5-2 на лабораторных животных (мышах и хорьках) позволяют заключить, что экспрессирующийся созданной конструкцией рекомбинантный НА вируса гриппа А Н5Ш является высокоиммуногенным, введение его в организм вызывает образование длительного (не менее 9 месяцев) специфического иммунного ответа.

Целью следующих экспериментов было изучение иммуногенности интраназально введенного РАВН-Ад5-НА5-2 по уровню продукции антител, специфичных к вирусу гриппа А. Мыши были двукратно, с интервалом в три недели, интраназально иммунизированы РАВН в дозе 108 БОЕ на животное. Через три недели после вторичной иммунизации у животных брали кровь, препараты бронхо-альвеолярных лаважей (БАЛ) и делали смывы с верхних

дыхательных путей (назальные смывы) для определения в них уровня антител к вирусу гриппа А птиц Н5Ш.

Уровень специфических антител к вирусу гриппа птиц Н5№ определяли методом непрямого ИФА и с помощью РВН. Были получены следующие результаты (Рис. 5).

В результате анализа сывороток крови мышей, иммунизированных РАВН-Ад5-НА5-2, методом непрямого ИФА был детектирован высокий уровень ^О и ^А, специфичных к вирусу гриппа А птиц Н5Ш, достоверно (р<0,05) отличный от контролей (РАВН-Ад5-пи11 и 0,9% раствор №С1). Полученный результат свидетельствует об индукции специфического к вирусу гриппа А птиц Н5Ш гуморального иммунного ответа, возникшего в ответ на интраназальное введение РАВН - Ад5-НА5-2.

І8Є 1!А

■ РАВН-РД5-ИА5-І

■ РАЯН-Ад5-НА5-2

■ РАВН-АдБ-пи!

Назальные смывы

I

■ РАЗН-Ад5-НА5-2 |

I

■ РАВН-АД5-НА5-2 БАЛ

■ РА8Н-Ад5-Н А5- 2 Сыворотки

■ РАВН-Ад5-пи11 КрОВИ

Рис. 5. Уровень специфических к вирусу гриппа Н5Ш и ^А в сыворотках крови, БАЛ и назальных смывах иммунизированных РАВН-Ад5-НА5-2 мышей.

В результате анализа препаратов БАЛ и назальных смывов мышей, иммунизированных РАВН-Ад5-НА5-2, был так же детектирован достоверно (р<0,05) отличный от контролей (РАВН-Ад5-пи11 и 0,9% раствор №С1) уровень ^С и ^А к вирусу гриппа Н5Ш как в смывах с нижних, так и с верхних дыхательных путей. Результаты свидетельствовали об индукции мукозального

антител в РВН, в назальных смывах определяли титры специфических секреторных IgA, в БАЛ - IgG и IgA к штаммам вирусов гриппа A/California/07/09 (H1N1), A/Perth/16/2009 (H3N2), B/Brisbane/60/2008.

В таблице 1 приведены сравнительные данные по титрам антител в ИФА, РТГА и РВН на 28-ой день после иммунизации препаратами РАВН-АД5-НА1-1, РАВН-Ад5-НАЗ-2, РАВН-Ад5-НАВ в дозе, лучшей из двух исследованных (критерием оценки были оптимальные уровни анти-НА и нейтрализующих антител в сыворотке, а также специфических антител в назальных смывах и препаратах БАЛ). По результатам ИФА, РТГА и РВН доза препарата РАВН-АД5-НА1-1 с активностью 107 БОЕ на животное достаточна для формирования хорошего специфического гуморального ответа. Для образца РАВН-Ад5-НАЗ-2 лучшей дозой была 107 БОЕ на мышь. Для образца РАВН-Ад5-НАВ по результатам исследования лучшей дозой явилась 108 БОЕ на животное.

Таблица 1.

Титры специфических антител в сыворотке крови, назальных смывах и БАЛ на 28-е сутки после иммунизации мышей РАВН-АД5-НА1-1, РАВН-Ад5-НАЗ-2, РАВН-Ад5-НАВ

Опытные группы мышей, (доза) Титры специфических антител

Сыворотка крови БАЛ Назальны е смывы

IgG (ИФА) СГТ в РТГА СГТ в РВН IgG (ИФА) IgA (ИФА) IgA (ИФА)

РАВН-АД5-НА1-1 (Ю7БОЕ) 225280,00 ±50077,23 367,6 2785,8 13200,00 ±4378,60 1032,00 ±448,20 150,00 ±108,30

РАВН-Ад5-НАЗ-2 (107 БОЕ) 2240,00 ±568,80 1290,2 2111,2 7466,67 ±2182,20 1034,67 ±450,00 2,00 ±0,00

РАВН-Ад5-НАВ (108 БОЕ) 102400,00 ±0,00 430,5 557,2 11733,33 ±5408,50 1706,67 ±1195,90 72,00 ±45,98

Таким образом, интраназальная иммунизация мышей препаратами РАВН-Ад5-НА1-1, РАВН-Ад5-НАЗ-2, РАВН-Ад5-НАВ приводила к формированию анти-НА, вирус-нейтрализующих антител в сыворотке крови, анти-НА секреторных 1§А, появлению анти-НА в нижних отделах дыхательных путей. Уровень формирования специфических противогриппозных антител зависел от дозы вводимых РАВН. Возрастание содержания анти-НА антител наблюдалось до 42 дня после иммунизации (данные не представлены).

Для изучения протективности перекрестного иммунного ответа, через 21 день после иммунизации мыши были интраназально заражены высокой дозой (50ЛД50) вируса гриппа А птиц Н5№. Животные наблюдались в течение 14 дней после заражения. На рисунке 14 представлены кривые выживаемости мышей и изменения их веса.

I ililiHtl

lllltl

РПАН-Адэ-НА5-1

-Nad

► РПАН-Ад5-ли11

РПАН-Ая5-НА5-1

10 12 14

Рис. 14. Влияние иммунизации РАВН-Ад5-НА5-1 на выживаемость и изменение веса мышей, зараженных летальной дозой вируса гриппа птиц Н5Ш. А - диаграмма выживаемости, Б - диаграмма падения веса.

Таким образом установлено, что мыши, интраназально иммунизированные РАВН-Ад5-НА5-1, несущими ген НА вируса гриппа А птиц Н5Ш, не восприимчивы к заражению летальной дозой вируса гриппа А птиц №N2. Все животные не теряли в весе и показали 100% выживаемость. При этом в контрольной группе, получавшей физиологический раствор, наблюдалась гибель 100% мышей в течение 13 дней и падение веса более чем на 20%, а в контрольной группе, иммунизированной РАВН-Ад5-пи11, выжило 10% мышей и падение веса так же составило более 20%. Через 24 недели после иммунизации протективное действие сохранялось.

Следовательно, интраназальная иммунизация РАВН, экспрессирующими ген НА вируса гриппа А, обеспечивает перекрестную защиту мышей от вирусов гриппа А разных субтипов, объеденных одним типом НА.

Особенности гетеросубтипического иммунного ответа при введении РАВН-Ад5, экспрессирующих НА вируса гриппа А субтипа Н5Ш

Широко известно о разделении на клайды различных субтипов вируса гриппа А при филогенетическом анализе его гена НА [Биката 1, 2009]. Данный факт дает предпосылки для изучения гетеросубтипического иммунного ответа, наличие которого расширило бы спектр специфичности вакцин, содержащих ограниченное количество определенных субтипов.

Ранее сообщалось, что при введении генетических вакцин, экспрессирующих НА вируса гриппа А, перекрестный иммунитет к различным

Иммуногенные свойства консервативных антигенов вируса гриппа А и попытка создания вакцин широкого спектра действия, защищающих от вирусов гриппа А различных субтипов

Цель этого раздела работы состояла в демонстрации возможности использования РАВН - Ад5 в качестве базы для создания кандидатных вакцин широкого спектра действия, основанных на высококонсервативных антигенах вируса гриппа А, способных создать защиту от различных субтипов вируса гриппа А.

Выбор генетической конструкции для создания аденовирусного вектора, несущего консервативный антиген вируса гриппа птиц был сделан на основе публикации [Huleatt J.W. et all, 2008], согласно которой иммунизация мышей фъюжн - белком, состоящим из четырех эктодоменов М2-белка вируса гриппа А (М2е) и лиганда для Толл-подобного рецептора (TLR - Toll-like receptor) 5 -флагеллина, обеспечивала протекцию мышей от заражения летальной дозой вируса гриппа А.

Для создания консенсусной между вирусами гриппа птиц аминокислотной последовательности белка М2е был проведен анализ аминокислотных последовательностей белков М2е вирусов гриппа птиц. Так же в составе консенсусного белка М2е аминокислота цистеин в положениях 17 и 19 была заменена на серин для того чтобы лишить белок возможности собираться в тетрамер с помощью дисульфидных мостиков. Конечная генетическая конструкция кодировала фъюжн - белок, в состав которого входили четыре консенсусные последовательности белка М2е с серинами в положениях 17 и 19.

Для повышения иммуногенности белка М2е вируса гриппа птиц был выбран лиганд Толл-подобного рецептора 5 флагеллин Salmonella enterica serovar dublin (GenBank AAA27081). Основываясь на литературных данных [Burdelya L.G. et all, 2008], в качестве лиганда для Толл-подобного рецептора использовали консервативные N и С-концевые домены белка флагеллина, исключая центральный гипервариабельный регион. Для эффективной внеклеточной экспрессии к N-концу фъюжн-белка был присоединен лидерный пептид LP секретируемой щелочной фосфатазы SEAP.

Наличие экспрессии генетической конструкцией РЛВП-Ад5-М4-[;1, кодирующей фъюжн - белок, состоящий из 4-х экдоменов М2-белка вируса гриппа А птиц и флагеллина Salmonella enterica, оценивали по функциональной активности флагеллина на культуре клеток 293-TLR5, экспрессирующей Толл-подобный рецептор 5 и несущей ген Р-галактозидазы под контролем NF-kB респонсивного элемента. В качестве положительного контроля использовали белок флагеллин, отрицательным контролем служили нетрансфецированные клетки и конструкция РАВН-Ад5-М4 (без вставки гена флагеллина). Функциональную активность флагеллина оценивали по уровню экспрессии Р-галактозидазы. В результате трансфекции клеточной линии 293-TLR5 РАВН-A;i5-M4-Fl была продемонстрирована экспрессия клетками р-галактозидазы, что является следствием активации транскрипционного фактора NF-kB. Активация NF-kB говорит о том, что произошло взаимодействие флагеллина,

экспрессируемого в составе фъюжн-белка с Толл-подобным рецептором 5 клеток 293-TLR5.

Изучение протективных свойств PABH-Afl5-M4-Fl проводили на модели летальной инфекции вирусов гриппа А птиц H5N2 и H2N3, а так же вируса гриппа А человека H1N1. Для этого мышей линии BALB/c весом 7-9 грамм интраназально иммунизировали PABH-Aä5-M4-F1 двукратно с интервалом в три недели в дозе 108 БОЕ на животное. В качестве отрицательных контролей использовали РАВН без трансгена РАВН-Ад5-пи11 и физиологический раствор. Через 21 день после иммунизации мыши были интраназально заражены высокими дозами: 50 ЛД50 вирусов гриппа А птиц H5N2 и H2N3 и 10 ЛД50 вируса гриппа А человека H1N1 . Животные наблюдались в течение 14 дней после заражения.

В результате установлено, что мыши, интраназально иммунизированные рекомбинантным аденовирусом Afl5-M4-Fl, были на 100% и 80% защищены от 50ЛД50 вирусов гриппа А птиц H5N2 и H2N3, соответственно. При этом, даже в случае заражения вирусом гриппа A H5N2, когда не пало ни одно животное, и в случае заражения вирусом гриппа A H2N3, когда пало 20% животных, у мышей после заражения наблюдалось падение веса почти на 20%. Таким образом, индуцированный иммунитет против гриппа птиц не защищает животных от проявления симптомов заболевания, однако, обладает широким спектром действия среди вирусов разных субтипов, объединенных одним хозяином.

При этом мыши, интраназально иммунизированные рекомбинантным PABH-Aä5-M4-F1 пе были защищены от заражения ЮЛД50 вируса А гриппа человека Н INI.

Таким образом, применение в качестве трансгена при создании РАВН -Ад5 консенсусной для вирусов гриппа А птиц нуклеотидной последовательности экдомена белка М2е и гена флагеллина Salmonella enterica serovar dublin обеспечивает при интраназальной иммунизации защиту животных от вирусов гриппа птиц различных субтипов, но не обеспечивает защиту от гриппа человека типа А.

Определение способности молекулярного адъюванта - кислого пептидогликана - взаимодействовать с Толл-подобными рецепторами врожденного иммунитета in vitro и усиливать иммуногенность РАВН-Ад5

Целью экспериментов был поиск возможных путей повышения иммуногенности РАВН-Ад5 с помощью молекулярных адъювантов, так как при создании многовалентных вакцин возникнет необходимость в снижении единиц активности по каждому типу входящих в состав препарата конструкций РАВН-Ад5. В качестве молекулярного адъюванта изучался - кислый пептидогликан, который относится к иммуномодуляторам и активирует NK-клетки, моноциты, нейтрофильные гранулоциты, тканевые макрофаги и образование антител.

В рамках работы проводилось определение способности к взаимодействию кислого пептидогликана с Толл-подобными рецепторами,

Таблица 2.

Сравнительные характеристики базового и разработанного оптимизированного технологического процесса выработки 1 мл препарата

РАВН-Ад5.

Способ наращивания 1 мл вирусного препарата Количество клеток Объем затраченной среды, мл Титр полученных РАВН-Ад5, частиц/мл Выход, части ц/кл

Базовый 2x10' 80 5x10" 12000

Оптимизированный ЗхЮ5 1 5x10" 18000

Вторым этапом работы была отработка методов очистки препаратов РАВН-Ад5.

Классическая схема очистки РАВН-Ад5 с помощью центрифугирования в градиенте хлорида цезия [Green, М. et. al.,1963, Maizel J. V. J. et. al., 1968] имеет ряд недостатков, делающих её неприемлемой для производственных целей. Во-первых, хлорид цезия является токсичным веществом, во-вторых, схема получения трудоёмка и не позволяет получать большое количество конечного продукта.

Ранее были описаны альтернативные методы получения РАВН, основанные на хроматографическом разделении [Konz J.O.et. al., 2008]. Анионная хроматография является специфичным методом очистки РАВН, поскольку поверхность вируса заряжена, что в свою очередь ведёт к сильному связыванию с неподвижной средой колонки [Klemperer H.G. et. al., 1959]. Хроматографический метод очистки позволяет получить 1013 и более частиц на 1 л культуры клеток, и широко используется в лабораторных исследованиях.

Эти данные были взяты за основу для разработки описываемой ниже методики. Она включает в себя следующие стадии: сбор клеток центрифугированием, лизис при помощи детергентов и повторных циклов замораживания и оттаивания, ультрафильтрацию, анионную и эксклюзионную хроматографии, стерилизующую фильтрацию.

Разработанная схема учитывает достижения современной биотехнологической индустрии - используют наиболее совершенные сорбенты для хроматографии и оборудование, что позволяет повысить выход конечного продукта. Некоторые стадии технологически изменены, что позволило удешевить процесс и сократить время, затраченное на получение РАВН. Разработанная методика позволяет очищать РАВН из культуры инфицированных клеток объемом 25 л с возможностью последующего масштабирования этого процесса до промышленных объемов (600 л культуры клеток).

Схема очистки препаратов РАВН-Ад5 представлена на рисунке 19.

Замороженная суспензия клеток НЕК93

Лизис 1% Tweea 80, обработка Benzonase (эндонуклеазой), осаждение клеточного дебриса центрифугированием

Ультрафнл ьтрация

Неразбавленный фильтрат

Разбавление в 4 раза для снижения концентрации соли

xz:

Нанесение на анионообменную колонку

Пик при элюции

Нанесение на эксклюзнонную колонку

Пик при элюции

о

Вторая эксклюзионная хроматография

Рис. 19. Общая схема очистки РАВН - Ад5.

По результатам тестовой очистки РАВН-Ад5 были сделаны следующие выводы: 1) эксклюзионная хроматография позволяет освободиться от примесей, оставшихся после анионообменной хроматографии; 2) стадия эксклюзионной хроматографии проходит практически без потерь (выход по сравнению с анионообменной составляет около 75%); 3) на стадии эксклюзионной хроматографии возможна замена буфера на финальный буфер препарата, это позволяет избежать разбавления, дополнительной стадии обработки препарата; 4) соотношение активных РАВН к их общему количеству составляет 1:100, что удовлетворяет требованиям, предъявляемым к иммунобиологическим препаратам на основе РАВН-Ад5; 5) общее количество вирусоподобных частиц, полученных разработанным нами методом и хорошо зарекомендовавшим себя лабораторным методом очистки вирусных частиц в градиенте хлористого цезия, практически одинаково.

Препарат РАВН-Ад5, полученный при очистке из 5л клеточной культуры, представлял собой гомогенную опалесцирующую жидкость, содержал не менее 0,5х1012 активных вирусоподобных частиц с активностью 1±0,5х109 БОЕ/мл.

Стабилизирующий раствор для хранения РАВН-Ад5 выбирали на основании оценки динамики специфической активности модельных РАВН в нем, формулирование состава осуществляли по литературным данным [Robert К., Evans et. all., 2004].

Доклинические исследования эффективности и безопасности кандидатной

трехвалентной противогриппозной вакцины на основе РАВН-Ад5, экспрессирующнх НА вируса гриппа A H1N1, H3N2 и вируса гриппа В

В рамках доклинических исследований кандидатной трехвалентной противогриппозной вакцины совместно с сотрудниками ФГБУ «НИИ гриппа» изучалась специфическая активность вакцины (иммуногенные свойства и протективность), и совместно с сотрудниками НИИ Приматологии РАМН -безопасность.

В 1 дозу вакцины объемом 0,5 мл входили: РАВН-Ад5-НА1-1, РАВН-Ад5-НАЗ-2, РАВН-Ад5-НАВ по 107 БОЕ каждой, и молекулярный адъювант (кислый пептидогликан) в количестве 20 мкг.

Специфическая активность (иммуногенность и протективность) кандидатной трехвалентной вакцины на основе РАВН - Ад5, экспрессирующнх гены НА A/Califomia/07/2009 (H1N1), A/Perth/16/2009 (H3N2), B/Brisbane/60/2008, изучена при однократном интраназальном введении мышам линии Balb/c. Мышей иммунизировали интраназально однократно одной дозой вакцины. Для сравнения использовали коммерческую живую противогриппозную вакцину (далее - ЖГВ) при двукратном введении в половинной дозе 0,25 мл с интервалом 2 недели. На 14-е и 28-е сутки после начала опыта у мышей опытных и контрольных групп брали кровь, делали назальные смывы и БАЛ, затем оценивали уровень специфического гуморального и клеточного иммунитета. В сыворотке крови определяли титры специфических антител изотипа IgG и субклассов IgG (IgGl, IgG2a) в ИФА, титры анти-НА антител в РТГА, титры нейтрализующих антител в РВН. В назальных смывах определяли титры специфических секреторных slgA, в бронхоальвеолярных смывах - IgG и slgA к гомологичным штаммам вирусов гриппа. Для оценки протективности кандидатной трехвалентной противогриппозной вакцины на 28-е сутки после начала опыта мышей опытных и контрольных групп заражали гомологичными вирусами гриппа А/California/07/2009 H1N1 (в дозах 10 и ЮОЛД50) и B/Brisbane/60/2008 (в дозах 2,5 lg МИД (минимальная инфицирующая доза) и 3,5 lg МИД поскольку этот вирус не был летальным для мышей). Высокий уровень чувствительности вируса гриппа A/Perth/16/2009 (H3N2) к естественным ингибиторам не позволил использовать его для оценки протективности, поэтому проводилось заражение иммунизированных мышей антигенно отличающимся вариантом A/Aichi/2/68(H3N2) в дозах 10 и 100ЛД50 (гетерологичное заражение). Протективное действие кандидатной трехвалентной противогриппозной вакцины оценивали с помощью следующих параметров: динамика изменения массы тела мышей после заражения; выживаемость мышей после заражения; вирусовыделение из легких мышей на 4-е сутки после заражения.

Результаты изучения иммуногенности показали, что однократная иммунизация гриппозной кандидатной трехвалентной противогриппозной вакциной приводит к формированию выраженного специфического гуморального и местного иммунитета с образованием высоких титров анти-НА

и нейтрализующих антител. При этом иммуногенность кандидатной трехвалентной противогриппозной вакцины была значительно выше, чем иммуногенность ЖГВ после интраназальной двукратной иммунизации. Титры IgG к вирусу гриппа A/California/07/2009(H1N1) в сыворотке крови и препаратах БАЛ после иммунизации мышей кандидатной трехвалентной противогриппозной вакциной в 2-4 раза выше, чем после иммунизации мышей ЖГВ. Содержание анти-НА и нейтрализующих антител были в 5-7 раз выше, чем у мышей, получавших ЖГВ. Разница в уровнях секреторных IgA в назальных смывах и препаратах БАЛ между этими группами была в 32 и 8,5 раз соответственно. Различия в иммуногенности кандидатной трехвалентной противогриппозной вакцины и ЖГВ к вирусу гриппа A/Perth/16/2009 (H3N2) еще более выражены. Уровни специфических IgG в сыворотке крови и препаратах БАЛ у мышей, получивших кандидатную трехвалентную противогриппозную вакцину, были в 55-61 раз выше, чем у мышей, иммунизированных ЖГВ. Титры секреторных IgA в назальных смывах и препаратах БАЛ между группами различаются в 90 и 25 раз соответственно. К вирусу гриппа B/Brisbane/60/2008 титры IgG в сыворотке крови и препаратах БАЛ в 5 и 4 раза выше у мышей, иммунизированных трехвалентной противогриппозной вакциной, чем ЖГВ. А по отношению к секреторному IgA в назальных смывах и препаратах БАЛ эта разница составляет 9 и 8 раз. При этом тип иммунного ответа, формирующегося после иммунизации кандидатной трехвалентной противогриппозной вакциной и ЖГВ, был одинаков и зависел от штамма вируса гриппа. К НА вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1) выявлен преимущественный синтез IgG2a как в случае кандидатной трехвалентной противогриппозной вакцины, так и ЖГВ, соотношение подклассов IgG (IgGl/lgG2a) в сыворотке крови составило 0.21 и 0.27 соответственно (более выраженный Тх1 ответ). Для вируса гриппа A/Perth/16/2009 (H3N2) был характерен преимущественный синтез IgGl, соотношение подклассов IgG (IgGl/IgG2a) составило 1.4 для кандидатной трехвалентной противогриппозной вакцины и 5.9 для ЖГВ (более выраженный Тх2). Вирус гриппа B/Brisbane/60/2008 приводил к образованию равных количеств IgGl и IgG2a, соотношение lgGl/IgG2a составило 0.9 для кандидатной трехвалентной противогриппозной вакцины и 1.0 для ЖГВ (сбалансированный Тх1/Тх2 ответ).

Протективность кандидатной трехвалентной противогриппозной вакцины оценивалась по определению индекса защиты IP (отношение разницы процентов смертности в контрольной и опытной группах к проценту смертности в контрольной группе) из расчета 14 дней наблюдения. Индекс защиты кандидатной вакцины варьировал в зависимости от штамма вируса гриппа от 85,7% до 100%.

Протективность кандидатной трехвалентной противогриппозной вакцины к гомологичному вирусу гриппа B/Brisbane/60/2008 не удалось продемонстрировать по уровню гибели зараженных мышей в модели летальной гриппозной инфекции, поскольку заражающая доза вируса B/Brisbane/60/2008

была меньше 1ЛД50. В случае вируса В/ВпяЬапе/60/2008 основным показателем протективного действия считалось вирусовыделение из легких мышей. Показано, что заражающий вирус не был выделен из легких ни у одной мыши в группе кандидатной трехвалентной противогриппозной вакцины. При этом у непривитых (контрольных) мышей в эти же сроки из легких выделялся вирус В/ВпзЬапе/60/2008.

Таким образом, кандидатная трехвалентная противогриппозная вакцина на основе РАВН-Ад5, экспрессирующая гены НА А/СаНЛгп¡а/07/2009 (НШ1), А/РегИтЛ 6/2009 (НЗШ), В/ВпзЬапе/60/2008, является иммуногенной и обладает высоким индексом защиты (85,7 - 100%).

Безопасность вакцины установлена при проведении исследований на приматах - самцах макака - резус возраста 5-7 лет. Показано, что при интраназальном введении кандидатной трехвалентной противогриппозной вакцины, как в суммарной дозе 0,5 мл, соответствующей терапевтической дозе для человека, так и в суммарной дозе 5 мл, соответствующей десятикратной терапевтической дозе для человека, испытуемый препарат в указанных дозах: не обладает иммунотоксичностью; не вызывает гематоксическое действие; активирует способность лимфоцитов к синтезу эндогенного ИФН-а после адекватного воздействия; не выявлено активации провоспалительных цитокинов (ИЛ-1,ИЛ-6,ФНО-а) после введения препарата, через 24ч и 8 суток эксперимента; во всех случаях, как в группе опытных, так и у контрольных обезьян через 24 ч повышается уровень СРБ (С-реактивный белок), который возвращается к норме на 8-ой день, температура тела остается на уровне нормы; патологических процессов в органах и тканях животных выявлено не было.

Заключено, что кандидатная трехвалентная противогриппозная вакцина не обладает общетоксическим действием на обезьян макака-резус. Противопоказаний для изучения препарата в клинических испытаниях не выявлено.

Таким образом, в результате проведенных исследований по теме диссертации показано наличие иммуногенности и протективности у полученных конструкций РАВН-Ад5, несущих вставку гена НА вируса гриппа различных субтипов. Показана универсальность РАВН-Ад5, как платформы для разработки противогриппозных вакцин. Разработаны состав и технология производства вакцин на основе РАВН-Ад5, позволяющие производить быструю смену продуцента целевых антигенов эпидемиологически актуального штамма вируса гриппа. Разработаны две кандидатные вакцины на основе РАВН-Ад5: против гриппа птиц и трехвалентная против сезонного гриппа, вызываемого вирусами гриппа А НШ1, Н3№ и вирусом гриппа В. В ходе доклинических исследований кандидатных противогриппозных вакцин были установлены их безопасность, высокая иммуногенность и протективность, позволяющие рекомендовать разработанные вакцины к дальнейшим исследованиям.

Выводы

1. Сконструированы рекомбинантные аденовирусные наночастицы (РАВН) на основе аденовируса человека 5 серотипа, несущие гены антигенов вируса гриппа человека и птиц; установлено, что полученные РАВН-Ад5-НА5-2, РАВН-Ад5-НА 1 -1, Р АВ Н-А д5 -Н A3 -2, РАВН-Ад5-НАВ эффективно экспрессируют рекомбинантные гемагглютинины вируса гриппа А субтипов H5N2, H1N1, H3N2 и вируса гриппа В, соответственно.

2. Полученные рекомбинантные аденовирусные наночастицы, несущие, гены антигенов вируса гриппа, обеспечивают высокий уровень антител к гемагглютининам вируса гриппа, как при внутримышечном, так и при интраназальном способе введения лабораторным животным (мышам и хорькам). Показано, что титр антител достигает максимального значения через 3 месяца после однократной интраназальной иммунизации; антигемагглютинирующие антитела в сыворотке крови животных определяются не менее 9 месяцев.

3. Установлено, что в результате интраназальной иммунизации на слизистых оболочках верхних и нижних дыхательных путей детектируется высокий уровень специфических антител IgA (9-11 log2). Показано, что антитела из назальных смывов и бронхо-альвеолярных лаважей обладают вирус-нейтрализующей активностью.

4. Показано, что однократная иммунизация рекомбинантными аденовирусными наночастицами, экспрессирующими гемагглютинины вируса гриппа, приводит к активации специфического клеточного иммунного ответа в регионарных лимфатических узлах.

5. Изучены протективные свойства рекомбинантных аденовирусных наночастиц, экспрессирующих гемагглютинин вируса гриппа А субтипа H5N2 при заражении мышей летальной дозой (50 ЛД50) гомологичного вируса гриппа; показано, что эффективность защиты достигает 100% к 4 неделе после однократной интраназальной иммунизации и сохраняется не менее 24 недель.

6. Впервые установлено, что интраназальная иммунизация рекомбинантными аденовирусными наночастицами, экспрессирующими гемагглютинин вируса гриппа А субтипа H5N1, обеспечивает 100% защиту животных от заражения гетерологичным штаммом вируса гриппа А субтипа H5N2.

7. Впервые показана возможность и раскрыт механизм повышения эффективности препаратов на основе рекомбинантных аденовирусных наночастиц с помощью молекулярного адъюванта - кислого пептидогликана растительного происхождения. В экспериментах in vitro показано, что кислый пептидогликан вызывает активацию Толл-подобного рецептора 4 (TLR4) врожденного иммунитета и усиливает иммуногенность наночастиц, что

позволяет снижать дозу РАВН-Ад5 с 108 до 107 БОЕ на мышь без потери эффективности индукции протективного иммунного ответа.

8. Впервые показана возможность получения противогриппозной вакцины широкого спектра действия на основе генетической конструкции РАВН-Ад5-M4-F1, несущей гены консервативного для вирусов гриппа птиц М2е антигена и лиганда для Толл-подобного рецептора 5 - флагеллина. При двукратной интраназальной иммунизации показана защита мышей от летальных доз вируса гриппа птиц H5N2 (100%) и вируса гриппа птиц H2N3 (80%).

9. Разработана лабораторная технология производства противогриппозных вакцин на основе РАВН-Ад5 с использованием биореакторов волнового типа, обеспечивающая возможность последующего масштабирования до промышленных объемов.

10. Впервые создана и охарактеризована эффективная кандидатная трехвалентная противогриппозная вакцина на основе рекомбинантных аденовирусных наночастиц, экспрессирующих гемагглютинины вируса гриппа А субтипов H1N1, H3N2 и вируса гриппа В, с молекулярным адъювантом; показано, что вакцина имеет высокий индекс защиты (IP) от заражения летальными дозами вирусов гриппа А и В (от 85,7 до 100% в зависимости от штамма используемого для заражения мышей вируса гриппа).

11. Проведены доклинические исследования безопасности кандидатной вакцины для специфической профилактики гриппа А птиц H5N1 у людей и кандидатной трехвалентной противогриппозной вакцины на лабораторных животных, в том числе приматах; установлено, что разработанные вакцины являются безопасными и могут быть использованы для клинических испытаний.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Lazarev V.N.,Shmarov М.М., Zahartchouk A.N., Yurov G.K., Misyurina O.U., Akopian T.A., Grinenko N.F., Grodnitskaya N.G., Kaverin N.V., Naroditsky B.S. Inhibition of influenza A virus reproduction by a targeted against PB1 mRNA // Antiviral Research. - 1999. - T.42. - №1. - C. 47-57.

2. Народицкий Б.С., Лобанов B.A., Борисов B.B., Борисов A.B., Дрыгин

B.В., Шмаров М.М., Акопиан Т.А. Анализ последовательности гена гексона аденовируса KR95 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2002. - №1. - С. 30-36.

3. Шмаров М.М., Черенова Л.В., Шашкова Е.В., Логунов Д.Ю., Верховская Л.В. Народицкий Б.С. Эукариотические векторы на основе генома аденовируса птиц CELO, несущие гены GFP и IL-2 человека // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2002. - №2. —

C. 30-35.

4. Логунов Д.Ю., Черенова Л.В., Шмаров М.М., Шашкова Е.В., Верховская Л.В., Доронин К.К., Народицкий Б.С. In vitro и in vivo

45

доставка гена секретируемой плацентарной щелочной фосфатазы (SEAP) в составе рекомбинантного аденовируса нтиц (CELO) // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2002. - №3. -С. 21-25.

5. Logunov D.Y., Ilyinskaya G.V., Cherenova L.V., Verhovskaya L.V., Shmarov M.M., Chumakov P.M., Kopnin B.P., Naroditsky B.S. Restoration of p53 tumor-suppressor activity in human tumor cells in vitro and in their xenografts in vivo by recombinant avian adenovirus CELO-p53 // Gene Therapy. - 2004. - 11(1) -C.79-84.

6. Cherenova L.V., Logunov D.Y., Shashkova E.V., Shmarov M.M., Verkhovskaya L.V. Neugodova G.L., Kazansky D.B., Doronin K.K., Naroditsky B.S. Recombinant avian adenovirus CELO expressing the human interleukin-2: characterization in vitro, in ovo and in vivo // Virus Research. - 2004. - T.100. -№2. - C. 257-261.

7. Шмаров M.M., Логунов Д.Ю., Черенова Л.В., Пикер Е.Г. Разработка технологии получения рекомбинантных аденовирусов CELO в куриных эмбрионах в препаративных количествах // Биомедицина. -2005. - №1. - С.103-107.

8. Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Черенова Л.В., Пикер Е.Г. Технология получения рекомбинантных аденовирусов CELO в куриных эмбрионах в препаративных количествах // Биомедицина. - 2005. - №1. - С.112-113.

9. Altstein A.D., Piskareva L.M., Zakharova L.G, Pashvykina G.V., Gitelman A.K., Smirnov Y.A., Zhimov O.P., Varich N.P., Shmarov M.M., Ilyinskii P.O., Shneider A.M. Immunization with influenza a np-expressing vaccinia virus recombinantprotects mice against experimental infection with human and avian influenza viruses. // Archives of Virology. - 2006. - Т. 151. - №5. - C.921 -931.

10. Шмаров M.M., Тутыхина И.Л., Логунов Д.Ю., Верховская Л.В., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Индукция протективного иммунного ответа у мышей, вакцинированных рекомбинантным аденовирусом птиц CELO, экспрессирующим гликопротеин G вируса бешенства // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2006. -№4. - С.69-71.

11. Карпов А.П., Тутыхина И.Л., Логунов Д.Ю., Верховская Л.В., Шмаров М.М., Валихов А.Ф., Народицкий Б.С. Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, экспрессирующих гены гликонротеинов gB, gE, gl вируса болезни Марека // Биотехнология. -2007. - №5. - С. 38-44.

12. Logunov D.Y., Zubkova O.V., Karyagina-Zhulina A.S., Shmarov M.M., Shuvalova E.A., Karpov A.P..Identification of HI-like loop in CELO adenovirus fiber for incorporation of receptor-binding motifs // J. Virol. - 2007. - 81(18). - C. 9641-52.

13. Зубкова O.B., Логунов Д.Ю., Карпов А.П., Шмаров М.М., Белоусова Р.В., Народицкий Б.С. Влияние интегринсвязывающей последовательности (RGD) на прикрепление и интернализацию

аденовируса птиц CELO в клетки млекопитающих. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2008. - №2. - С. 26-30.

14. Черентаева Е.А., Шмаров М.М,. Логунов Д.Ю., Верховская Л.В., Мезенцева М.В., Народицкий B.C., Гинцбург А.Л. Продукция рекомбинантного белка интерферона-Р человека в культуре клеток птиц // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.- 2008. -№3. - С. 37-40.

15. Тутыхнна И.Л., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Грабко В.И., Севастьянова Г.А., Народицкий B.C., Гинцбург А.Л. Конструирование вектора на основе генома аденовируса птиц CELO, обеспечивающего повышенный уровень экспрессии гена секретируемой щелочной фосфатазы в непермиссивной системе in vitro и in vivo // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2008. - №4. - 26-30.

16. Logunov D., Scheblyakov D., Zubkova О., Shmarov M., Rakovskaya I., Gurova K., Tararova N., Burdelya L., Naroditsky В., Ginzburg A., Gudkov A. Mycoplasma infection suppresses p53, activates NF-кВ and cooperates with oncogenic Ras in rodent fibroblast transformation // Oncogene. - 2008. - 27(33) -C.4521-31.

17. Завалишин И.А., Бочков Н.П., Суслина 3.A., Захарова М.Н., Тарантул В.З., Народицкий B.C., Супонева Н.А., Иллариошкин С.Н., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Тутыхнна И.Л., Верховская Л.В., Седова Е.С., Васильев А.В., Брылёв Л.В., Гинцбург А.Л. Генная терапия бокового амиотрофического склероза: двухлетнее рандомизированное плацебо-контролируемое исследование // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т.145, - №4. - С. 467-471.

18. Щебляков Д.В., Логунов Д.Ю., Зубкова О.В., Шмаров М.М., Раковская И.В, Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л., Гудков А.В. Микоплазменная инфекция (M.arginini) ведет к конститутивной активации NF-kB и подавлению апоптоза в клетках, экспрессирующих Толл-подобные рецепторы TLR2/6 // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2008. - №4. - С. 6-10.

19. Tutykhina I.L., Bezborodova О.A., Shmarov М.М., Logunov D.Y., Neugodova G.L., Naroditsky B.S., Yakubovskaya R. I., Gintsburg A.L. Production of recombinant human lactoferrin in the allantoic fluid of embryonated chicken eggs and its characteristics // Protein Expression & Purification. - 2009. - №65. - p. 101-107.

20. Тутыхнна И.Л., Безбородова O.A., Верховская Л.В., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Немцова Е.Р., Народицкий Б.С., Якубовская Р.И., Гинцбург А.Л. Рекомбинантная псевдоаденовирусная наноструктура с геном лактоферрина человека: получение, изучение экспрессии и свойств лактоферрина при ее применении in vivo // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2009. - №1. - 27-31.

21. Логунов Д.Ю., Щебляков Д.В., Шмаров М.М. Липид-ассоциированные мембранные белкн M.arginini активируют NF-kB, взаимодействуя с

TLR2/1, TLR2/6 и TLR2/CD14 II Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2009 г. - №2. - С. - 25-28.

22. Нестренко Л.Н., Тутыхина И.Л., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Лунин В.Г., Народицкий B.C., Гинцбург А.Л. Перспективы использования биогенных наноструктур в медицине // 150 ЛЕТ СО ДНЯ РОЖДЕНИЯ Николая Фёдоровича Гамалеи: сборник научных трудов. - 2009. - С. 67-78.

23. Седова Е.С., Шмаров М.М., Тутыхина И.Л., Барыкова Ю.А., Верховская Л.В., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Протективные свойства кандидатных генно-инженерных вакцин против вируса гриппа птиц, созданных на основе рекомбинантных аденовирусных векторов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии . - 2010. - №3. - С.44-48.

24. Королева Е.А., Щербинин Д.Н., Шмаров М.М., Зигангирова H.A., Народицкий B.C. Конструирование рекомбинантного аденовируса, несущего ген отсВ Chlamydia trachomatis, для разработки вакцинного препарата против урогенитального хламидиоза // Международный журнал прикладных и фундамантальных исследований. - 2010. - №10. - С.38-40.

25. Тухватулип А.И., Логунов Д.Ю., Щербинин Д.Н., Шмаров М.М., Народицкий B.C., Гудков A.B., Гинцбург А.Л. ТоН-подобные рецепторы и их адапторные молекулы // Биохимия. - 2010. - Т.75 - С. 1224 - 1243.

26. Щебляков Д.В., Логунов Д.Ю., Тухватулип А.И., Шмаров М.М., Народицкий Б. С., Гинцбург А. Л. Толл-подобные рецепторы (TLR) и их значение в опухолевой прогрессии // Acta naturae. - 2010. - Т. 2. - № 3 (6). - С. 14-23.

27. Tutykhina I.L, Logunov D.Y, Shcherbinin D.N, Shmarov M.M., Tukhvatulin A.I., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Development of adenoviral vector-based mucosal vaccine against influenza // J. Mol. Med. -2011. - 89(4). -p.331-341.

28. Щербинин Д.Н., Шмаров M.M., Народицкий B.C., Рубакова Э.И., Кондратьева Т.К. Исследование вакцинных противотуберкулёзных препаратов на основе рекомбинантных аденовирусов в экспериментальной модели на мышах // Туберкулез и болезни легких. -2010. - Т.87. - № 10. - С. 50-53.

29. Якубовская Р.И., Безбородова O.A., Немцова Е.Р., Тутыхина И.Л., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Изучение биологической активности рекомбинантной псевдоаденовирусной наноструктуры с геном лактоферрипа человека в системах in vivo // Молекулярная генетика микробиология и вирусология.- 2010. - №2. - С. 28-33.

30. Шмаров М.М., Седова Е.С., Верховская Л.В., Руднева И.А., Богачева Е.А., Барыкова Ю.А., Щербинин Д.Н., Лысенко A.A., Тутыхина И.Л., Логунов Д.Ю., Смирнов Ю.А., Народицкий B.C., Гинцбург А.Л. Индукция протективного гетеросубтипического иммунного ответа против вируса гриппа при иммунизации рекомбинантными

аденовирусными векторами, экспрессирующими гемагглютинин вируса гриппа Н5 // Acta naturae. - 2010. - № 3. - С. 95-102.

31. Тутыхина И.Л., Шульнин М.И., Чвала И.А., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Щербакова Л.О., Волкова М.А., Мудрак Н.С., Борисов A.B., Дрыгин В.В., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Конструирование рекомбинантных аденовирусов CELO, экспрессирующих ген гемагглютинина вируса гриппа А птиц, и изучение возможности их использования в качестве вакцин для защиты от вируса гриппа А птиц H5N1 и H7N1 // Молекулярная генетика микробиология и вирусология. - 2011. - №1. - С. 30-35.

32. Рогожин В.Н., Белоусова Р.В., Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., Лунин

B.Г., Народицкий Б.С. Конструирование рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа с модифицированным капсидом как универсального носителя белковых лигандов // Ветеринарная медицина. - 2011. - №2. - С. 10-14.

33. Шмаров М.М., Седова Е.С., Верховская Л.В., Богачева Е.А., Барыкова Ю.А., Щербинин Д.Н., Лысенко A.A., Тутыхина И.Л., Неугодова Г.Л., Логунов Д.Ю., Смирнов Ю.А., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Исследование возможности индукции рекомбинантными аденовирусными векторами гетеросубтипического иммунного ответа против вируса гриппа А // Биопрепараты. -2011. - №1. - С.31-35.

34. Тутыхина И.Л., Щербинин Д.Н., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С. Преимущества и перспективы использования генетических вакцин для защиты от опасных и социально значимых инфекций // Вестник Российской АМН. - 2011. - №10. - С.39-47.

35. Тухватулип А.И., Д.Н. Щербинин Д.Ю. Логунов, Шмаров М.М., Народицкий Б.С. Роль паттерн-распознающих рецепторов в противоинфекцнонном иммунитете // Вестник Российской АМН. - 2011. -№10. -С. 47-54.

36. Грибова И.Ю., Тиллиб C.B., Тутыхипа И.Л., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Верховская Л.В., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Эффективная экспрессия наноантител рекомбинантным аденовирусным вектором in vitro // Acta naturae. - 2011. - T. 3. - № 3 (10). - С. 66-72.

37. Рогожин В.Н., Логунов Д.Ю., Щебляков Д.В., Шмаров М.М., Ходунова Е.Е., Гальцева И.В., Белоусова Р.В., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Эффективный способ доставки гена интерлейкина-2 в гемопоэтические клетки человека с использованием рекомбинантного аденовируса с модифицированным фибером // Acta naturae. - 2011. - T. 3. - № 3 (10). -

C. 103-110.

38. Е. С. Седова, Д. Н. Щербинин, А. И. Мигунов, Ю. А. Смирнов, Д. Ю. Логунов, M. М. Шмаров, Л. М. Цыбалова, Б. С. Народицкий, О. И. Киселев, А. Л. Гинцбург. Гриппозные рекомбинаитные вакцины // Acta naturae. - 2012. - T. 4. - № 4 (15). - С. 17-27.

Заказ № 64-П/04/2013 Подписано в печать 17.04.2013 Тираж 100 экз. Усл. пл. 2,3

"Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 V v VJ www. cfr. ru ; e-mail: info@cfr. ru