Конструирование рекомбинантных аденовирусов и изучение их протективных свойств при иммунизации лабораторных животных против вируса гриппа A

Седова, Елена Сергеевна

Диссертации по медицине → Клиническая иммунология, аллергология

Автореферат и диссертация по медицине (14.03.09) на тему:Конструирование рекомбинантных аденовирусов и изучение их протективных свойств при иммунизации лабораторных животных против вируса гриппа A

ДИССЕРТАЦИЯ

Конструирование рекомбинантных аденовирусов и изучение их протективных свойств при иммунизации лабораторных животных против вируса гриппа A - диссертация, тема по медицине

АВТОРЕФЕРАТ

Седова, Елена Сергеевна Москва 2010 г.

Ученая степень: кандидата биологических наук

ВАК РФ: 14.03.09

Автореферат диссертации по медицине на тему Конструирование рекомбинантных аденовирусов и изучение их протективных свойств при иммунизации лабораторных животных против вируса гриппа A

004616222

На правах рукописи

СЕДОВА ЕЛЕНА СЕРГЕЕВНА

КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ АДЕНОВИРУСОВ И ИЗУЧЕНИЕ ИХ ПРОТЕКТИВНЫХ СВОЙСТВ ПРИ ИММУНИЗАЦИИ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА А

14.03.09- клиническая иммунология, аллергология 03.01.06. - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

- 9 ЛЕК 2010

Москва-2010

004616222

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России).

Научный руководитель: кандидат биологических наук

Шмаров Максим Михайлович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Атауллаханов Равшан Иноятович

доктор биологических наук Шилов Илья Александрович

Ведущая организация:

Научно-исследовательский инстшут вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита состоится « » декабря 2010 года в н часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 в ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России (123098, Москва, ул. Гамалеи, 18).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан <«#» НСйЫЛ- 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор

Русакова Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Грипп - высококонтагиозное заболевание людей, птиц и млекопитающих вирусной этиологии. В мире каждый год регистрируются сезонные подъемы заболеваемости (вспышки, эпидемии) гриппом, вызванные вирусами типа А или В, сопровождающиеся существенным повышением заболеваемости и высокими уровнями смертности (WHO/CDS/EPR/GIP/2006.2a).

Иммунизация современными гриппозными вакцинами является научно-обоснованным эффективным способом массовой профилактики гриппа. Современные вакцины против гриппа А вызывают образование, главньм образом, штамм-специфичных антител к поверхностным гликопротеинам вируса гриппа: гемагглютинину и нейраминидазе. Однако, вирусы гриппа А способны постоянно модифицировать свою структуру в результате генетических изменений. Антигенные вариации являются результатом молекулярных изменений в поверхностных гликопротеинах. Подобная генетическая вариабельность способствует изменению антигенной структуры настолько существенно, что специфический иммунитет, выработанный на полученную прививку, может быть не эффективен (Webster R.G., 1992).

При разработке новых типов вакцин против гриппа необходимо обеспечить защиту населения от эпидемиологически актуальных циркулирующих штаммов вируса гриппа А. Кроме того на сегодняшний момент большие опасения вызывают вирусы гриппа птиц, случаи заражения которыми фиксируются у людей с 1997 г. Потенциальным кандидатом на следующий пандемичный штамм является вирус гриппа птиц субтипа H5N1. Так по данным ВОЗ с 1997 г. общее количество случаев заболеваний человека этим вирусом составляет 505, из которых 300 - с летальным исходом (данные ВОЗ от 31.08.10). Вирусы гриппа птиц не способны передаваться от человека к человеку, а заболевания людей вызваны контактом с больными птицами. Однако, вирус гриппа птиц может приобрести новые свойства, что может провести к подъему заболеваемости, вызванной вирусом гриппа субтипа H5N1. Поэтому актуальным является разработка вакцины, способной защитить население от вируса гриппа птиц H5N1 для предотвращения подъемов заболеваемости, причиной возникновения которых может стать этот вирус.

Большинство современных вакцин против гриппа вводят в организм парентерально. Как альтернатива инъекционным вакцинам, рассматриваются мукозальные вакцины. Преимуществами мукозальных вакцин являются удобство их применения, исключение риска случайного заражения в процессе иммунизации, формирование иммунного ответа именно там, где находятся «входные ворота» гриппозной инфекции и формирование ответа более широкого спектра по сравнению с парентеральными вакцинами (Wong J.P., 2010).

Итак, для эффективной защиты против гриппозных инфекций необходимо создание интраназальных вакцин, которые способны одновременно защищать от различных штаммов вируса гриппа и обеспечивать напряженный и продолжительный иммунитет, устранив, таким образом, необходимость ежегодных ревакцинаций населения.

Одним из наиболее эффективных на сегодняшний день подходов для решения вышеописанных проблем является использование генетических вакцин, базирующихся на аденовирусных векторах (Zaia J.A., 2007). При введении в организм таких вакцин происходит попадание генетического материала в клетки организма и экспрессия в них генов целевых белков патогена. В результате антигены соответствующих патогенов распознаются иммунной системой, что приводит к индукции как гуморального, так и клеточного иммунного ответа (Карпов А.П., 2007, Knoblich H.V.,2000). На сегодняшний момент наиболее хорошо изученным и часто используемым для генетической вакцинации является рекомбинантный аденовирус человека пятого серотипа (Ад5). Вакцины на основе рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа имеют ряд преимуществ перед другими генетическими вакцинами. Во-первых, рекомбинантные аденовирусы являются репликативно-дефекгными и не способны вызывать заболевания. Безопасность аденовирусов человека пятого серотипа с делегированными El и ЕЗ областями генома подтверждается целым рядом клинических испытаний различных вакцинных и терапевтических препаратов на их основе (Hoelscher М.А., 2006, Van Kampen K.R., 2005). Во-вторых, рекомбинантные аденовирусы позволяют проводить интраназальную иммунизацию, и, как следствие, индуцируют образование иммунного ответа на слизистой дыхательных путей. В-третьих, на сегодняшний момент разработаны быстрые и гибкие технологии получения рекомбинантных аденовирусов, позволяющие реализацию масштабного производства различных кандидатных вакцин на основе аденовирусных векторов на одной технологической линии, без ее переоборудования и изменения регламента. Вышеперечисленные свойства делают рекомбинантные аденовирусы хорошей технологической платформой для создания широкого спектра вакцин против различных патогенов.

В связи с вышесказанным, изучение возможности использования Ад5 для создания препаратов для интраназальной вакцинации против потенциально опасных инфекций, вызванных вирусом гриппа птиц, представляет самостоятельный научный интерес.

Пель исследования. Создание рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, несущих гены поверхностных антигенов вируса гриппа птиц, и изучение их иммуногенности и протекгивных свойств при интраназальной иммунизации лабораторных животных.

В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи:

1. Конструирование репликативно-деффектных рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, содержащих гены поверхностных антигенов вируса гриппа птиц (гемагглютинин и экгодомен М2-белка) и изучение экспрессии целевых генов в составе рекомбинантных вирусов в условиях in vitro.

2. Оценка гуморального и клеточного иммунного ответа против вируса гриппа птиц у лабораторных животных, интраназально иммунизированных рекомбинантным аденовирусом, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц.

3. Исследование протекгивных свойств рекомбинантного аденовируса, несущего ген гемагглютинина вируса гриппа птиц на модели летальной инфекции вируса гриппа.

4. Изучение перекрестного иммунного ответа против разных подтипов вируса гриппа птиц при генетической иммунизации лабораторных животных рекомбинантными аденовирусом, содержащим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц.

5. Изучение возможности использования рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа как универсальной платформы для создания кандидатных вакцин на основе различных антигенов вируса гриппа с помощью оценки протекгивных свойств генетической иммунизации лабораторных животных рекомбинантным аденовирусом, несущим ген экгодомена белка М2 вируса гриппа птиц, против различных субтипов вируса гриппа птиц.

6. Оценка влияния предсуществующего иммунного ответа против аденовируса человека пятого серотипа на эффективность интраназальной иммунизации рекомбинантными аденовирусами против вируса гриппа птиц.

Научная новизна. С помощью эффективной технологии получения рекомбинантных Ад5, основанной на гомологичной рекомбинации в E.coli, был получен набор рекомбинантных аденовирусов, несущих поверхностные антигены вируса гриппа птиц: Ad5-HA5-2, несущий ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N2, Ad5-HA5-1, несущий ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N1 и Ad5-M4-Fl, несущий ген эктодомена белка М2 вируса гриппа птиц. При этом для конструирования аденовируса Ad5-HA5-2 впервые использовался ген гемагглютинина вируса гриппа птиц, адаптированного для млекопитающих.

Для создания рекомбинантного Ад5, позволяющего при иммунизации против вируса гриппа птиц получить иммунный ответ широкого спектра действия, в качестве антигена был выбран экгодомен консервативного трансмембранного М2-белка (М2е) вируса гриппа. Для достижения наиболее широкого спектра защиты от различных субтипов вируса синтезирована искусственная нуклеотидная последовательность белка М2е, консенсусная

между различными штаммами вируса гриппа птиц. Для повышения иммуногенности эктодомена М2-белка вируса гриппа птиц в созданную конструкцию включен ген лиганда для Толл-подобного рецептора 5 флагеллин (И). Впервые сконструирован рекомбинантный аденовирус Аё5-М4-П, несущий генетическую конструкцию, экспрессирующую слитный (фъюжн) белок, состоящего из четырех М2е белков и флагеллина.

Показана на культуре клеток активность рекомбинантного флагеллина, входящего в состав слитного белка, экспрессируемого аденовирусом А<15-М4-И, на линии клеток, несущих Толл-подобный рецептор 5.

Определен уровень экспрессии рекомбинантных гемагглютининов НА5-2 и НА5-1 в пермиссивных клетках, трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами Ad5-HA5-2 и Ас15-НА5-1.

Показана индукция длительного как гуморального, так и клеточного иммунного ответа против вируса гриппа птиц Н5Ш при интраназальной иммунизации лабораторных мышей рекомбинантным аденовирусом Аё5-НА5-2.

Показана защита мышей, интраназально иммунизированных рекомбинантным аденовирусом Аё5-НА5-2, экспрессирующим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N2, при заражении летальной дозой вируса гриппа птиц Н5№ (5ОЛД50) и продемонстрирована ее длительность в течение 24 недель.

Впервые показана индукция перекрестного гуморального иммунитета против вируса гриппа птиц Н5Ы2 при иммунизации мышей рекомбинантным аденовирусом, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц Н5Ш. Так же показана длительная (24 недели) перекрестная защита животных, иммунизированных аденовирусом А<15-НА5-1, против летальной дозы вируса гриппа птиц Н5№ (5ОЛД50).

Впервые продемонстрирована возможность использования рекомбинантного Ад5, как универсальной платформы для создания кандидатных вакцин с различными антигенами вируса гриппа А. Показана индукция перекрестного иммунного ответа, возникшего при иммунизации лабораторных мышей аденовирусом Аё5-М4-Н, несущим ген консенсусного между вирусами гриппа птиц белка М2е, против вируса гриппа птиц Н5Ы2 и вируса гриппа птиц Н2№ (5ОЛД50).

Впервые продемонстрировано незначительное влияние предсуществующего иммунного ответа к Ад5 на эффективность интраназальной иммунизации рекомбинантным Ад5 против вируса гриппа.

Практическая значимость. Работа представляет не только научный, но и практический интерес. Полученные в результате работы рекомбинантные

аденовирусы могут служить основой для создания кандидатных вакцин против вируса гриппа птиц.

Отдельные положения работы включены в Методические рекомендации «Оптимизация параметров наработки рекомбинантных аденовирусных векторов в полупрепаративных количествах», М.-2010, утвержденные на Совете по внедрению научных достижений в практику ФГБУ «НИИЭМ им.

H.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ, протокол №13 от 15.10.10.

Результаты, полученные в ходе выполнения диссертации, вошли в патенты Российской Федерации 2326942 «Способ создания рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации и генной терапии» и 2326943 «Способ создания рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации против вируса гриппа птиц H5N1».

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008), итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработка научно-технического комплекса России на 20072012 гг.» (Москва, 2009) и Международной конференции Koch Metschnikow Fonim (Марбург, Германия, 2010). Апробация диссертации состоялась на научной конференции отделов иммунологии, медицинской микробиологии и генетики и молекулярной биологии бактерий ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России 12 октября 2010 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, в том числе 2 патента, 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК и 4 в сборниках международных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 148 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы и список используемой литературы (213 источников, из которых 13 отечественных и 200 иностранных). Работа содержит 5 таблиц и 28 рисунков.

Основные положения, выносимые на защиту.

I. С помощью эффективной технологии, основанной на гомологичной рекомбинации в E.coli, сконструированы репликативно-дефектные аденовирусы человека пятого серотипа, содержащие гены поверхностных антигенов вируса гриппа птиц (гемагглютинин и М2е белок) для изучения их протективных свойств при интраназальной иммунизации против вируса гриппа птиц. Продемонстрирована экспрессия рекомбинантных белков полученными аденовирусами in vitro.

2. Интраназальная иммунизация лабораторных мышей рекомбинантными аденовирусами человека, несущими гены поверхностных антигенов вируса гриппа птиц приводит к формированию как гуморального (в том числе мукозального), так и клеточного иммунного ответа и обеспечивает защиту животных от заражения высокими дозами вируса гриппа птиц.

3. Лабораторные животные, как двукратно, так и однократно интраназалыю иммунизированные рекомбинантным аденовирусом, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа, защищены от заражения высокой дозой вируса гриппа и через 24 недели после иммунизации.

3. Интраназальная иммунизация рекомбинантным аденовирусом, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа А, приводит к формированию перекрестного иммунного ответа против разных субтипов вируса гриппа, объединенных одним типом гемагглютинина.

4. Рекомбинантный аденовирус человека пятого серотипа является универсальной платформой для создания кандидатных вакцин на основе различных антигенов вируса гриппа А. Применение консервативных антигенов может позволить сформировать перекрестный иммунный ответ против вирусов гриппа различных субтипов.

5. Наличие предсуществующих антител к аденовирусу человека пятого серотипа незначительно влияет на эффективность интраназальной иммунизации рекомбинантным аденовирусом против вируса гриппа птиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в период с 2006 по 201Ö годы в лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ. Эксперименты по оценке антител к вирусу гриппа с помощью РТГА проводились совместно с лабораторией физиологии вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.М. Ивановского» Минздравсоцразвития РФ. Эксперимент по оценке уровня лимфопролиферации проводился совместно с лабораторией естественного иммунитета ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ.

В работе были использованы:

- вирусы гриппа птиц A/Mallard duck/PA/10218/84(H5N2) и A/black duck/New Jersey/1580/78(H2N3), вирус гриппа человека A/USSR/90/77 (H1N1), адаптированные для мышей (Smirnov Y.A., 2000), любезно предоставленные проф., д.б.н. Ю. А. Смирновым (лаборатория субвирусных структур ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.М. Ивановского» Минздравсоцразвития РФ), рекомбинантный аденовирус человека пятого серотипа Ad5-null, любезно предоставленный к.б.н. Тутыхиной И.Л.

(лаборатория молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ);

- лабораторные штаммы Esherichia coli DH5a и BJ5183, клеточные линии 293-НЕК (клетки эмбриональной почки человека), 293-TLR5 (клетки эмбриональной почки человека, экспрессирующие Толл-подобный рецептор 5 и несущие ген ß-галактазидазы под контролем NF-кВ респонсивного элемента), MDCK (клетки почки собаки) и А549 (клетки карциномы легких человека);

- плазмидные векторы pBluescript П SK (+) (Fermentas MBI), pShuttle-CMV и pAd-Easy (Stratagene), плазмидная система pGEM-T-Easy (Promega);

- коммерческие препараты специфических эндодезоксирибонуклеаз рестрикции и других ферментов фирм Fermentas MBI (Литва), Promega (США) и NE BioLabs (США).

Для анализа экспрессии генов гемагглютинина использовали набор ELISA Kit for detection of hemagglutinin (HA) of influenza A virus, H5 strain (BioAssay Systems, США). Плазмидную ДНК очищали набором JETSTAR 2.0 Plasmid Midiprep Kit (Genomed, США). Трансфекцию клеток линии 293-НЕК проводили с применением реагента Metafectene™ Pro (Biontex, Германия). Для выделения РНК применяли набор реагентов для выделения РНК/ДНК из клинического материала «Рибо-сорб» (ФГУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора). Для постановки реакции обратной транскрипции использовали набор Reverse Tpanscription System (Invitrogene, США). Синтез праймеров был выполнен в ООО «Синтол». Секвенирование генов проводилось в НПФ «Лигех». Синтез гена гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N1 и генетической конструкции, содержащей четыре гена эктодомена белка М2 вируса гриппа и ген флагеллина, был выполнен в ЗАО «Евроген». Эксперименты проводились на мышах линии BALB\c, самках, весом 7-9 грамм и куриных SPF эмбрионах.

Все генно-инженерные манипуляции проводились по стандартным методам, изложенным в руководстве Maniatis et al., 1982. Все манипуляции, связанные с работой с аденовирусами, проводили согласно Graham&Prevec, 1991. Работу с вирусом гриппа птиц проводили в соответствии WHO/CDS/CRS/NCS/2002.5.

Анализ антигенных свойств гемагглютининов гриппа птиц НА5-1 и НА5-2, экспрессируемых рекомбинантными аденовирусами, проводили с использованием методов: ИФА, РТГА и реакции вирус-нейтрализации. Оценку пролиферации иммунокомпетентных клеток проводили с помощью включения радиоактивно меченного НЗ-тимидина. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программы STATISTICA.

В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с к.б.н. Верховской Л.В., к.б.н. Лысенко A.A., к.б.н. Щебляковым

Д.В. и м.н.с. Богачевой Е.А. - сотрудниками лаборатории молекулярной биотехнологии и д.б.н., проф. Прониным A.B. - зав. лабораторией естественного иммунитета ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития РФ, к.б.н. Рудневой И.А. - сотрудником лаборатории физиологии вирусов ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.М. Ивановского» Минздравсоцразвития РФ, которым выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Конструирование рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, несущих гены гемагглютининов вирусов гриппа H5N2. H5N1 и нуклеотидную последовательность секретируемой конструкции, состоящей из 4-х белков М2е и Флагеллина.

Клонирование полноразмерного гена гемагглютинина из генома вируса гриппа птиц H5N2. Для изолирования гена гемагглютинина с помощью реакции обратной транскрипции, была получена кДНК генома вируса гриппа. В качестве матрицы для получения кДНК использовали РНК, выделенную из препарата вируса гриппа птиц A/Mallard duck/PA/10218/84(H5N2) (Gene Bank AF512925.1), адаптированного для мышей. Ген гемагглютинина получили путем амплификации кДНК с праймерами, фланкирующими последовательность гена.

Фрагмент ДНК, кодирующий ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N2, был клонирован в плазмидный вектор pGEM-T-Easy.

Получение полноразмерного гена гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N1. Ген гемагглютинина вируса гриппа птиц A/duck/Novosibirsk/56/2005(H5Nl) (Gene Bank DQ230522.1) был получен путем химического синтеза в ЗАО «Евроген». Фирмой-производителем ген был клонирован в плазмиду pGEM-T-Easy.

Получение генетической конструкции, кодирующей консенсусную между вирусами гриппа птиц последовательность эктодомена белка М2 и флагеллин Salmonella enterica. С помощью программы AliBee - Multiple Alignment была создана консенсусная между вирусами гриппа птиц аминокислотная последовательность четырех экгодоменов белка М2 (М2е) вируса гриппа, в которой аминокислота цистеин в положениях 17 и 19 каждого эктодомена была заменена на серин для того, чтобы лишить белок возможности собираться в тетрамер.

Для повышения иммуногенности М2е белка был выбран лиганд для Толл-подобного рецептора 5 флагеллин Salmonella enterica serovar dublin (GenBank AAA27081), соединенный с ним N-концом через гибкий участок (линкер). Основываясь на литературных данных (Burdelya L.G., 2008) мы использовали консервативные N и С-концевые домены белка флагеллина, исключая центральный гипервариабельный регион. Для эффективной внеклеточной

экспрессии к N-коицу фъюжн-белка был присоединен лидерный пептид LP секретируемой щелочной фосфатазы SEAP. Синтез гена, кодирующего конструкцию M4-F1, был произведен в ЗАО «Евроген». Фирмой-производителем ген был клонирован в плазмиду pGEMT Easy.

Трансгены в составе полученных плазмид бьши секвенированы и идентичность генов в составе pGEM-T-Easy нуклеотидньш последовательностям соответствующих генов (гемагглютининам вирусов A/Mallard duck/PA/10218/84(H5N2), A/duck/Novosibirsk/56/2005(H5Nl) и конструкции M4-F1) была показана.

Итак, в результате этого этапа работы бьщ получен набор плазмидных конструкций: pGEM-T-Easy-HA5-2, pGEM-T-Easy-IÍA5-l и pGEM-T-Easy-M4-F1, несущих гены гемагтлютининов вирусов гриппа птиц H5N2 и H5N1 и генетическую конструкцию, кодирующую слитный белок, состоящий из четырех белков М2е и флагеллина.

Получение рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, несущих гены гемагтлютининов вирусов гриппа птиц H5N2, II5N1 и белка М2е вируса гриппа птиц, методом гомологичной рекомбинации.

Для конструирования рекомбинантных аденовирусов, гены НА5-2, НА5-1 и M4-F1 были переклонированы из плазмид pGEM-T-Easy в челночный плазмидный вектор pShuttle-CMV, несущий концевые фрагменты генома Ад5 и экспрессирующую кассету, содержащую промотор цитомегаловируса человека (CMV) и сигнал полиаденилирования.

Рекомбинантные аденовирусы получали методом гомологичной рекомбинации в клетках E.coli штамма BJ5183, которые трансформировали методом электропорации смесью геномной ДНК аденовируса и линеаризованной ДНК соответствующего челночного плазмидного вектора. Затем плазмидная конструкция, содержащая геном рекомбинантного аденовируса с экспрессирующей кассетой, была трансформирована в компетентные клетки E.coli штамма DH5a, не способные к рекомбинации.

В результате гомологичной рекомбинации в клетках E.coli был получен набор плазмидных конструкций pAd5-HA5-2, pAd5-HA5-l и pAd5-M4-Fl, несущих геномную ДНК аденовируса человека пятого серотипа со вставкой в сайте делеции El-области экспрессирующей кассеты, содержащей соответствующий трансген. Трансгены в составе полученных плазмид были секвенированы и их идентичность нуклеотидньш последовательностям соответствующих генов была показана.

Рекомбинантные аденовирусы Ad5-HA5-2, Ad5-HA5-1 и Ad5-M4-Fl были получены в результате трансфекции соответствующей плазмидной конструкцией пермиссивной линии клеток эмбриональной почки человека 293-НЕК. Анализ последовательностей ДНК полученных аденовирусов

показал, что их геномы содержит соответствующие целевые гены. Примесей репликативно-компетентных вирусных частиц обнаружено не было.

Таким образом, были получены рекомбинантные аденовирусы Ad5-HA5-2, Ad5-HA5-1, несущие гены гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N2 и H5N1 соответственно и аденовирус Ad5-M4-Fl, несущий генетическую конструкцию, состоящую из четырех генов М2е белка вируса гриппа и гена флагеллина.

Изучение экспрессии целевых генов рекомбинантными аденовирусами в экспериментах in vitro

Изучение экспрессии генов гемагглютинина НА5-2 и НА5-1 вирусов гриппа птиц рекомбинантными аденовирусами проводили методом ИФА с использованием коммерческого набора ELISA Kit for detection of hemagglutinin (HA) of influenza A virus, H5 strain (BioAssay Systems, США). Для анализа использовали лизат клеток линии 293-НЕК, трансфецированных рекомбинантными вирусами Ad5-HA5-2 и Ad5-HA5-1. Проведенные эксперименты показали, что уровень экспрессии рекомбинантного гемагглютинина НА5-2 аденовирусом Ad5-HA5-2 составил 570 ГАЕ, а уровень экспрессии рекомбинантного гемагглютинина НА5-1 аденовирусом Ad5-HA5-1 составил 256 ГАЕ. Высокая специфичность тест-системы подтверждает соответствие антигенной конформации рекомбинантных белков и нативного гемагглютинина вируса гирппа Н5.

Изучение экспрессии гена секретируемой конструкции, состоящей из 4-х белков М2е и флагеллина, рекомбинантным аденовирусом проводили путем оценки функциональной активности флагеллина с помощью культуры клеток 293-TLR5, экспрессирующей Толл-подобный рецептор 5 и несущей ген ß-галакгозидазы под контролем NF-kB респонсивного элемента. Функциональную активность флагеллина оценивали по уровню экспрессии ß-галакгозидазы. В результате эксперимента было продемонстрировано, что при трансдукции клеточной линии 293-TLR5 аденовирусом Ad5-M4-Fl происходит активация транскрипционного фактора NF-kB, что говорит об экспрессии слитного белка, в состав которого входит флагеллин.

Изучение иммуногенности рекомбинантного гемагглютинина вируса гриппа H5N2, экспрессируемого аденовирусом Ad5-HA5-2 на лабораторных животных

Оценка гуморального иммунного ответа у лабораторных животных, интраназально иммунизированных аденовирусом Ad5-HA5-2.

Лабораторные мыши были двукратно, интраназально иммунизированы Ad5-НА5-2 в дозе 10® БОЕ на животное. В качестве контрольных использовались группы мышей, получавших рекомбинантный аденовирус, не несущий трансгена, Ad5-null и физиологический раствор NaCl. Через три недели после вторичной иммунизации у животных отбирали кровь, бронхо-альвеолярные

лаважи (БАЛ) и смывы с верхних дыхательных путей (назальные смывы) для определения в них уровня антител к вирусу гриппа птиц Н5Ш методами непрямого ИФА (рис.1) и РВН. ^ ^

нйюжш» ПАШ

СЫВОрОТЫ! К|»ФВП

Рис. 1 Уровень специфичных к вирусу гриппа Н5Ш ^Си 1&А в сыворотках крови, БАЛ и назальных смывах иммунизированных АЙ5-НА5-2 мышей

Для оценки уровня антител изотипов в и А в сыворотках крови, БАЛ и назальных смывах лабораторных животных методом ИФА в качестве антигена использовали вирус гриппа птиц Н5Ы2. Для детекции связавшихся с антигеном антител использовали меченные пероксидазой хрена антитела к мышиным и ^А. В результате анализа в сыворотках крови, смывах с верхних и нижних дыхательных путей был детектирован высокий уровень ^(3 и IgA, специфичных к вирусу гриппа птиц Н5И2.

Оценку уровня вируснейтрализующих антител к вирусу гриппа птиц Н5Ы2 в сыворотках крови и смывах с дыхательных путей проводили на культуре клеток МОСК. Результат проведенной реакции вирус-нейтрализации представлены на рис. 2 и рис. 3.

О Ай-НА5*2 _ ОЛЛ-пЛ

- аы/>с:1

Рис. 2 Уровень вирус-нейтрализующих антител к вирусу гриппа Н5ОД в сыворотке крови иммунизированных мышей

Титр вирус-нейтрализующих антител в сыворотках крови иммунизированных мышей составил 11 1о&, в БАЛ и назальных смывах 7 и 51ой соответственно.

Рис. 3 Уровень вирус-нейтрализующих антител к вирусу гриппа Н5М в смывах с дыхательных путей иммунизированных мышей А - БАЛ, Б- назальные смывы

Итак, в результате интраназальной иммунизации мышей аденовирусом А<15-НА5-2, был детектирован гуморальный иммунный ответ к вирусу гриппа Н5Ш, показан высокий уровень специфических, в том числе вирус-нейтрализующих антител, как в сыворотках крови, так и в смывах с дыхательных путей.

Оценку клеточного иммунного ответа против вируса гриппа Н5Ш у лабораторных животных, интраназально иммунизированных аденовирусом А<15-НА5-2 проводили с помощью лимфопролиферативного анализа. Из грудинных и глубоких шейных лимфоузлов иммунизированных мышей была получена культура иммунокомпетентных клеток, которую стимулировали добавлением антигена (инактивированный вирус гриппа птиц Н5Ы2) и затем определяли уровень лимфопролиферации с помощью

введения НЗ-тимидиновой.метки.____________

160000 ,

« без знтмгеиэ ...........а вирусгрипа Н5М2

}

1.__________________М-наи...... к?а ......мяЛ................................. ..!

Рис. 4 Определение уровня лимфопролиферации в культуре клеток лимфоузлов иммунизированных мышей в ответ на добавление антигена

Было продемонстрировано, что Т-лимфоциты иммунизированных мышей активно включали меченый тимидин, что говорит об их пролиферации в ответ на стимуляцию антигеном. Результаты анализа показаны на рис. 4.

Исследование протективных свойств рекомбинантного аденовируса А<15-НА5-2 на модели летальной инфекции вируса гриппа у лабораторных животных

Мышей двукратно и однократно интраназально иммунизировали аденовирусом Аё5-НА5-2. Через 21 день после иммунизации мыши были заражены вирусом гриппа птиц Н5И2 (50ЛД5о). На рис. 5 представлены кривые выживаемости мышей и изменения их веса. Таким образом, интраназальная иммунизация рекомбинантным аденовирусом Ас15-НА5-2

обеспечивает защиту мышей против заражения 50ЛД50 вируса гриппа Н5Ы2 как при однократной, так и при двукратной иммунизации.

О 2 4 6 8 10 12 14 16 ДНИ _

О 2 4 б « 10 12 14 16

ДНИ

Рис. 5 Выживаемость и изменение веса мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом А<15-НА5-2 после заражения 5ОЛД50 вируса гриппа птиц Н5ГО А - диаграмма выживаемости, Б - кривая падения веса

Кроме того, была оценена длительность иммунного ответа при интраназальной иммунизации мышей аденовирусом А<15-НА5-2. Показано, что уровень антител к вирусу гриппа птиц Н5Ы2 в сыворотках крови иммунизированных животных, оцененный с помощью РТГА, снижается только к 24 неделе как после однократной, так и двукратной иммунизации. Также иммунизированные мыши через 24 недели после как однократной, так и двукратной интраназальной иммунизации были полностью защищены от заражения вирусом Н5И2 (5ОЛД50). Таким образом показана индукция длительного (до полугода) специфического иммунитета у животных в ответ на экспрессию гемагглютинина НА5-2.

Изучение гетеросубтипического перекрестного иммунного ответа при

интраназальной_иммунизации_лабораторных_животных

рекомбинантным аденовирусом человека, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа А

Для изучения гетеросубтипического иммунного ответа на той же модели летальной инфекции вируса гриппа Н5Ы2 использовали рекомбинантынй аденовирус А<15-НА5-1, несущий ген гемагглютинина вируса гриппа птиц Н5М. Мыши линии Ва1Ь/с были двукратно интраназально иммунизированны рекомбинантным аденовирусом Аё5-НА5-1 в дозе 108 БОЕ на животное. Через три недели после иммунизации у животных отбирали кровь и смывы с дыхательных путей для определения уровня перекрестных антител к вирусу гриппа птиц Н5Ы2 методами ИФА и РВН.

В результате анализа сывороток крови был детектирован высокий уровень и ^А к вирусу гриппа Н5№, что свидетельствует об индукции перекрестного гуморального иммунитета, специфичного к вирусу гриппа 1Ш2 (рис. 6).

В результате анализа БАЛ был детектирован высокий уровень и достаточно низкий уровень специфичных к вирусу гриппа Н5И2. При анализе назальных смывов не было обнаружено достоверно отличных от контрольных групп уровней как так и 1§А (данные не представлены).

Предположительно это связано с недостаточным уровнем экспрессии гемагглютинина НА5-1 рекомбинантным аденовирусом Ас15-НА5-1 в клетках млекопитающих. Планируется создание рекомбинантного аденовируса, несущего кодон-оптимизированный для экспрессии в клетках млекопитающих ген гемагглютинина вируса гриппа птиц А/ёиск/ЫоуовШггек/Зб/гООб (Н5Ш) и оценка его способности вызывать перекрестный мукозальный иммунный ответ при интраназальной иммунизации лабораторных животных.

Рис. 6 Уровень специфических к вирусу гриппа Н5Ш и ^ в сыворотках крови мышей, иммунизированных Ас1-НА5-1

Титр вирус-нейтрализующих антител в сыворотках крови иммунизированных мышей составил 8,32 1о& (рис.7). В образцах БАЛ и назальных смывов не удалось обнаружить антител к вирусу гриппа Н5Ы2 в количествах, достоверно отличающихся от контрольных групп (данные не представлены). г

Рис. 7 Уровень вирус-нейтрализующих антител к вирусу гриппа Н5Ш в сыворотке крови мышей, иммунизированных аденовирусом Ас15-НА5-1

Таким образом, в результате анализа сывороток крови мышей, интраназально иммунизированных аденовирусом Аё5-НА5-1, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц ШШ, были детектирован перекрестный гуморальный иммунный ответ к вирусу гриппа птиц Н5Ы2. Анализ смывов из легких и верхних дыхательных путей иммунизированных мышей, показал отсутствие перекрестного мукозального иммунного ответа к вирусу гриппа птиц 1Ш2.

Изучение протективных свойств перекрестного гетеросубтипического иммунного ответа при иммунизации лабораторных животных аденовирусом, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа А проводили на мышах линии ВАЬВ/с, двукратно интраназально иммунизированных аденовирусом Аё5-НА5-1, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц Н5Ш. Через 21 день после иммунизации мыши были интраназально заражены вирусом

гриппа птиц H5N2 (50ЛД50). На рис. 8. представлены кривые выживаемости мышей-илзменения шсвеса___________________________________

•-NaCI >■ Ad-null .-Ad-HAS-l

8 10 12 14

Рис. 8 Выживаемость и изменение веса мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом Ad5-HA5-1, после заражения летальной дозой вируса гриппа птиц H5N2 А - диаграмма выживаемости, Б - кривая падения веса

В результате эксперимента установлено, что мыши, интраназально иммунизированные рекомбинантным аденовирусом Ad5-HA5-1 не восприимчивы к заражению 5ОЛД50 вируса гриппа птиц H5N2.

Таким образом, интраназальная иммунизация рекомбинантным аденовирусом, несущим гемагглютинин вируса гриппа А обеспечивает перекрестную защиту мышей против вирусов гриппа А разных субтипов, объеденных одним типом гемагглютинина.

Кроме того, была оценена длительность перекрестного иммунного ответа при интраназальной иммунизации мышей аденовирусом Ad5-HA5-1. Показано, что уровень антител к вирусу гриппа птиц H5N2 в сыворотках крови иммунизированных животных, оцененный с помощью РТГА, снижается к 10 неделе после иммунизации. При этом иммунизированные мыши и через 24 недели после иммунизации были полностью защищены от заражения вирусом гриппа H5N2 (5ОЛД50) и не теряли в весе с момента заражения и в течение всего периода наблюдения. Таким образом, показана индукция длительного (до полугода) перекрестного иммунитета у животных, иммунизированных аденовирусом, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа А.

Оценка протективных свойств аденовируса Ad-M4-Fl, несущего ген. кодирующуй слитный белок, состоящий из четырех М2е белков вируса гриппа птиц и Флагеллнна Salmonella enterica. на модели летальной инфекции вируса гриппа А.

Цель этого эксперимента состояла в демонстрации возможности использования рекомбинантного аденовируса в качестве базы для создания аденовирусных препаратов, несущих различные антигены вируса гриппа А.

Изучение протективных свойств рекомбинантного аденовируса Ad5-M4-Fl проводили на модели летальной инфекции вирусов гриппа птиц H5N2 и H2N3, а также вируса гриппа человека H1N1. Для этого мышей линии BALB/c двукратно, интраназально иммунизировали аденовирусом Ad5-M4-F1 в дозе 10 БОЕ на животное. Через 21 день после иммунизации мыши

были интраназально заражены высокими дозами: 5ОЛД50 вирусов гриппа птиц Н5Ы2 и Н2ИЗ и ЮЛД50 вируса гриппа человека НШ1 . На рис. 9 представлены кривые выживаемости мышей и изменения их веса.

Выживаемость Изменение веса

Рис. 9 Выживаемость и изменение веса мышей, интраназально иммунизированных рекомбинантным аденовирусом А«15-М4-П, после заражения летальными дозами вирусов гриппа птиц №N2 и Н2Ю А - диаграмма выживаемости при заражении вирусом гриппа Н5№, Б - диаграмма выживаемость при заражении вирусом гриппа Н2ЫЗ, В - кривая изменения веса при заражении вирусом гриппа Н5Ы2, Г - кривая изменения веса при заражении вирусом гриппа Н3№

В результате эксперимента установлено, что мыши, интраназально иммунизированные рекомбинантным аденовирусом Аё5-М4-Н были на 100 и 80% защищены от 50ЛДя вирусов гриппа птиц Н5Ы2 и H2NЗ, соответственно, хотя у иммунизированных мышей после заражения как вирусом гриппа Н5Ы2, так и вирусом Н2Ю наблюдалось падение веса.

При этом мыши, интраназально иммунизированные рекомбинантным аденовирусом Аё5-М4-И не были защищены от заражения 10ЛД5о вируса гриппа человека НШ1 (данные не представлены). Итак, применение в качестве антигена при создании аденовирусного вектора консенсусной для вирусов гриппа птиц последовательности М2е белка обеспечивает защиту животных от вирусов гриппа птиц различных субтипов, но не обеспечивает защиту от вируса гриппа человека.

Результаты данного эксперимента позволяют утверждать, что рекомбинантные аденовирусы могут послужить базой для создания кандидатных вакцин против вирусов гриппа, несущих различные антигены вируса.

Изучение влияния предсуществующего иммунного ответа к аденовирусу человека пятого серотипа (А<15) на эффективность иммунизации рекомбинантным аденовирусом А<15

Применение рекомбинантных Ад5, как кандидатных вакцин сталкивается с такой проблемой, как наличие антител к Ад5 у большой части населения [Ье^игопЪ вЛ., 1999]. Присутствие их в крови может существенно снизить эффективность иммунизации. Для изучения гипотезы о том, что предсуществующие антитела не влияют на эффективность интраназальной иммунизации рекомбинантным Ас15 была разработана модель предсуществующего иммунного ответа к Аё5 на мышах. Для этого они были многократно внутрибрюшинно или внутримышечно иммунизированы аденовирусом Аё5-пи11. Уровень предсуществующих антител в сыворотках крови животных оценивали с помощью РВН. Наиболее существенный прирост антител к Ад5 наблюдался у мышей, получавших Аё5-пи11 внутрибрюшинно (9,32 ^2).

Мыши, имевшие и не имевшие предсуществующий иммунный ответ к Ад5 были однократно интраназально иммунизированы Аё5-НА5-2. Через три недели после иммунизации в сыворотках крови мышей был определен уровень нейтрализующих антител к вирусу гриппа Н5ГО. Было показано, что уровень антител к вирусу гриппа в сыворотках крови мышей, имевших титр вирус-нейтрализующих антител к Ад5 менее 91о%ъ не отличался от уровня антител в крови мышей, не имевших предсуществующего иммунного ответа. У мышей, в крови которых уровень антител к Ад5 был более 91о& (группа, получавшая Ас15-ш11 внутрибрюшинно), наблюдалось снижение титра вирус-нейтрализующих антител к вирусу гриппа птиц (рис. 10).

Несмотря на снижение уровня антител к вирусу гриппа эта группа животных, так же как и остальные иммунизированные Ас15-НА5-2 группы, была полностью защищена от заражения летальной дозой вируса гриппа птиц ГОШ. Кроме того, все группы, получившие аденовирус Аё-НА5-2 не теряли в весе с момента заражения вирусом гриппа и в течение всего периода наблюдений (данные не представлены).

I 2

В КаСЬ-АЛ-НА5-2

□ Аа-пиО •\м+А<1-НЛ5-2

□ А4-тШ »\6+А(1-НА5-2

Рис. 10 Уровень вйрус-нейтрализующих антител к вирусу гриппа птиц Н5Ш в сыворотках крови мышей, имевших (№С1) и не имевших (Ас15-пи11) предсуществующий иммунный ответ к А(15 и интраназально иммунизированных рекомбинантным аденовирусом Ас15-НА5-2

Таким образом, предсуществующий иммунный ответ к Аё5 незначительно влияет на эффективность интраназальной иммунизации рекомбинантным Ас15 против вируса гриппа птиц.

выводы

1. Сконструированы рекомбинантные репликативно-дефектные аденовирусы человека пятого серотипа, содержащие гены поверхностных антигенов вируса гриппа птиц (гемагглютинин и М2е белок) Ad-HA5-2, Ad-HA5-1, Ad5-M4-Fl.

2. Показана индукция гуморального, в том числе на слизистой дыхательных путей, и клеточного иммунного ответа к вирусу гриппа птиц H5N2 у лабораторных животных, интраназально иммунизированных рекомбинантным аденовирусом, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N2, Ad-HA5-2.

3. Продемонстрировано протективное действие рекомбинантного аденовируса Ad-HA5-2 при интраназальной иммунизации лабораторных животных против заражения летальной дозой вируса гриппа птиц H5N2. Показано, что иммунный ответ после иммунизации аденовирусом Ad-HA5-2 лабораторных мышей длится не менее 24 недель.

4. Впервые продемонстрирован перекрестный иммунный ответ против разных подтипов вируса гриппа, объединенных одним типом гемагглютинина, при иммунизации лабораторных животных рекомбинантным аденовирусом, несущим гемагглютинин вируса гриппа птиц.

5. Впервые показана возможность использования рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа как универсальной платформы для создания кандидатных вакцин с различными антигенами вируса гриппа А на примере аденовируса Ad-M4-Fl, несущего ген консенсусного между вирусами гриппа птиц эктодомена М2-белка вируса гриппа. Продемонстрирована протекция мышей, иммунизированных аденовирусом Ad-M4-Fl, от вирусов гриппа птиц H5N2 и H2N3.

6. Впервые показано, что наличие предсуществующих антител к аденовирусу человека пятого серотипа незначительно влияет на эффективность интраназальной иммунизации рекомбинантным аденовирусом против вируса гриппа птиц.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Народицкий Б.С., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Гинцбург А.Л., Верховская Л.В., Тутыхина И.Л., Шувалова Е.А., Карпов А.П., Зубкова О.В., Седова Е.С. Способ создания рекомбииантного аденовируса птиц для вакцинации и генной терапии : пат. 2326942 Рос. Федерация. №2007121785 ; заявл. 13.06.07. ; опубл. 20.06.08., Бюл. №17 23 с.

2. Народицкий Б.С., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Гинцбург А.Л., Дрыгин В.В., Верховская Л.В., Тутыхина И.Л., Шувалова Е.А., Карпов А.П., Зубкова О.В., Седова Е.С. Способ создания рекомбинантного аденовируса птиц для вакцинации против вируса гриппа птиц H5N1: пат. 2326943 Рос. Федерация. №2006147166 ; заявл. 29.12.06. ; опубл. 20.06.08., Бюл. №17 11 с.

3. Седова Е.С., Руднева И.А., Логунов Д.Ю., Шмаров М.М., Смирнов Ю.А., Дрыгин В.В., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Иммунизация рекомбинантными псевдоаденовирусными наночастицами, несущими ген гемагглютинина Н5, защищает мышей от летальной дозы вируса гриппа птиц // Тезисы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», 11-12 ноября 2008,- М.: 2008.-с. 110.

4. Шмаров М.М., Тутыхина И.Л., Седова Е.С., Зубкова О.В., Верховская Л.В., Народицкий Б.С., Гинцбург АЛ. Рекомбинантные псевдоаденовирусные наночастицы: конструирование и использование для создания новых иммунобиологических средств защиты населения от особо опасных и социально значимых инфекций// Разработка и создание вакцин нового поколения, проблемы обеспечения региональных и локальных потребностей, Москва, ноябрь 2008.- М:2008.- с. 46-50.

5. Шмаров М.М., Седова Е.С., Лысенко A.A., Барыкова Ю.А., Щербинин Д.Н., Янова A.C., Верховская Л.В., Рогожин В.Н., Тутыхина И.Л., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С., Гинцбург AJI., Рутовская М.В., Иванова Т.И., Васильев Л.А., Тиллиб C.B., Есмагамбетов И.Б., Валихов А.Ф. Разработка кандидатных вакцин иммуно-биологических препаратов для профилактики и иммунотерапии опасных вирусных заболеваний (птичий грипп, бешенство) на основе рекомбинантных и капсид-модифицированных рекомбинантных аденовирусов // Итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработка научно-технического комплекса России на 2007-2012 гг.», 25-27 ноября 2009.- М:2009,- с. 126-127.

6. Shmarov М.М., Sedova E.S., Tutykhina LL., Logunov D.Y., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Perspectives of vaccine against influenza creation based on recombinant adenoviruses // Emerging Influenza Viruses (H5N1, H1N1), Marburg, February 15-16, 2010,- 2010.- c. 32.

7. Шмаров M.M., Седова E. С., Верховская Л. В., Руднева И. А., Богачева Е.А., Барыкова Ю.А., Щербинин Д.Н., Лысенко A.A. , Тутыхина

И.Л., Логунов Д.Ю., Смирнов Ю.А., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Индукция протективного гетеросубтипического иммунного ответа против вируса гриппа при иммунизации рекомбинантными аденовирусными векторами, экспрессирующими гемагглютииин вируса гриппа Н5 // Acta Naturae.- 2010,- т.2, № 1(4).- с. 119-126.

8. Седова Е.С., Шмаров М.М., Тутыхина И.Л., Барыков Ю.А., Верховская Л.В., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Протективные свойства кандидатных генно-инженерных вакцин против вируса гриппа птиц, созданных на основе рекомбинантных аденовирусных векторов // Журн. микробиол.- 2010.- №3.- с. 44-48

Отпечатано в ООО «Компания Спутник+» ПД № 1-00007 от 25.09.2000 г. Подписано в печать 12.11.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,5 Печать авторефератов (495)730-47-74,778-45-60

Оглавление диссертации Седова, Елена Сергеевна :: 2010 :: Москва

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ.

1.1 Вирус гриппа и его вакцинопрофилактика.

1.1.1 Общая характеристика вируса гриппа А.

1.1.1.1 Структура вириона вируса гриппа А.

1.1.1.2 Распознавание вируса гриппа А и иммунный ответ на пего.

1.1.1.3 Антигенная изменчивость вирусов гриппа А.

1.1.2 Современные вакцины против вируса гриппа птиц.

1.1.2.1 Аттенуированные вакцины против вируса гриппа птиц.

1.1.2.2 Инактивированные и субъединичные вакцины против вируса гриппа птиц.

1.1.2.3 Культуральные вакцины против вируса гриппа птиц.

1.1.2.4 Рекомбинантные субъединичные вакцины против вируса гриппа птиц.

1.2 Генетические вакцины.

1.2.1 Типы вирусных векторов, используемых для создания генетических вакцин.

1.2.2 Генетические вакцины на основе рекомбинантных аденовирусов.

1.2.2.1 Структурно-функциональная характеристика аденовирусов человека.

1.2.2.2 Рекомбинантный аденовирус человека пятого серотипа, и его применение для генетической иммунизации.

2.1 Материалы и методы.

2.1.1 Материалы.

2.1.1.1 Вирусы и бактериальные штаммы.

2.1.1.2 Клеточные линии.

2.1.1.3 Плазмидные векторы.

2.1.1.4 Ферменты и другие реактивы.

2.1.1.5 Лабораторные животные.

2.1.1.6 Лабораторное оборудование.

2.1.2 Методы.

2.1.2.1 Выделение РНК из вируссодержащей жидкости.

2.1.2.2 Получение гена гемагглютинина из генома вируса гриппа птиц.

2.1.2.3 Подготовка компетентных клеток Е. coli штамма DH5a.

2.1.2.4 Подготовка компетентных клеток Е. coli штамма ВJ5183.

2.1.2.5 Трансформация компетентных клеток Е. coli штамма DH5a.

2. ] .2.6 Трансформация компетентных клеток Е. coli штамма BJ5183.

2.1.2.7 Гомологичная рекомбинация в клетках Е. coli штамма BJ5183.

2.1.2.8 Выделение аналитических количеств плазмидной ДНК.

2.1.2.9 Выделение препаративных количеств плазмидной ДНК.

2.1.2.10 Гидролиз ДНК специфическими эндодезоксирибонуклеазами рестрикции

2.1.2.11 Фракционирование фрагментов ДНК методом электрофореза в агарозном геле.

2.1.2.12 Препаративное разделение фрагментов ДНК и элюция ДНК из геля.

2.1.2.13 Лигирование фрагментов ДНК.

2.1.2.14 Идентификация рекомбинантных клонов.

2.1.2.15 Полимеразная цепная реакция.

2.1.2.16 Трансфекция культур клеток методом липофекции.

2.1.2.17 Получение рекомбинантных аденовирусов.

2.1.2.18 Накопление рекомбинантных аденовирусов. 2.1.2.19. Очистка и концентрирование рекомбинантных аденовирусов.'.

2.1.2.20 Выделение вирусной ДНК.

2.1.2.21 Титрование рекомбинантных аденовирусов.

2.1.2.22 Анализ экспрессии гена гемагглютинина вируса гриппа птиц методом ИФА

2.1.2.23 Определение функциональности флагеллина, экспрессируемого рекомбинантным аденовирусом совместно с М2е белком вируса гриппа птиц.

2.1.2.24 Накопление вируса гриппа А.

2.1.2.25 Концентрирование вируса гриппа А в сахарозе.

2.1.2.26 Титрование вируса гриппа А на куриных эмбрионах.

2.1.2.27 Реакция гемагглютинации (РГА).

2.1.2.28. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА).

2.1.2.29 Определение 50% летальной дозы вирусов гриппа А для мышей (ЛД50).

2.1.2.30 Титрование вируса гриппа А на клетках MDCK.

2.1.2.31 Иммунизация лабораторных животных рекомбинантными аденовирусами

2.1.2.32 Заражение животных летальными дозами вирусов гриппа птиц.

2.1.2.33 Постановка реакции вирус-нейтрализации.

2.1.2.34 Иммуноферментный анализ для определения титра антител к вирусу гриппа

2.1.2.35 Получение первичной культуры клеток лимфатических узлов.

2.1.2.36 Определение уровня пролиферации клеток лимфатических узлов в ответ на введение антигена.

2.1.2.37 Создание модели предсуществующего иммунного ответа к аденовирусу человека пятого серотипа у лабораторных мышей.

2.1.2.38 Статистическая обработка результатов.

2.2 Результаты исследований.

2.2.1 Конструирование рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, несущих гены гемагглютининов вирусов гриппа H5N2, H5N1 и нуклеотидную последовательность секретируемой конструкции, состоящей из 4-х М2е белков и флагеллина.

2.2.1.1 Клонирование полноразмерного гена гемагглютинина из генома вируса гриппа птиц H5N2 методом ОТ-ПЦР.

2.2.1.2 Получение полноразмерного гена гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N

2.2.1.3 Получение генетической конструкции, кодирующей консенсусную между вирусами гриппа птиц последовательность эктодомена М2 белка и флагеллин Salmonella enterica.

2.2.2 Получение рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, несущих гены гемагглютининов вирусов гриппа птиц H5N2, H5N1 и белка М2е вируса гриппа птиц, методом гомологичной рекомбинации.

2.2.3 Изучение экспрессии целевых генов рекомбинантными аденовирусами в экспериментах in vitro.

2.2.3.1 Изучение экспрессии генов гемагглютинина НА5-2 и НА5-1 вирусов гриппа птиц рекомбинантными аденовирусами в культуре клеток методом ИФА.

2.2.3.2 Изучение экспрессии гена секретируемой конструкции, состоящей из 4-х белков М2е и флагеллина рекомбинантным аденовирусом в культуре пермиссивных клеток.

2.2.4 Изучение иммуногенности рекомбинантного гемагглютинина вируса гриппа H5N2, экспрессируемого аденовирусом Ad5-HA5-2 на лабораторных животных.

2.2.4.1 Оценка гуморального иммунного ответа у лабораторных животных, интраназально иммунизированных аденовирусом Ad5-HA5-2.

2.2.4.2 Изучение длительности гуморального иммунного ответа у лабораторных животных, интраназально иммунизированных аденовирусом Ad5-HA5-2.

2.2.4.3 Оценка клеточного иммунного ответа у лабораторных животных, интраназально иммунизированных аденовирусом Ad5-HA5-2.

2.2.5 Исследование протективных свойств рекомбинантного аденовируса Ad5-HA5-2 на модели летальной инфекции вируса гриппа у лабораторных животных.

2.2.6 Изучение гетеросубтипического перекрестного иммунного ответа при интраназальной иммунизации лабораторных животных рекомбинантным аденовирусом человека, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа А.

2.2.6.1 Изучение перекрестного гуморального иммунного ответа против вируса гриппа птиц H5N2 при интраназальной иммунизации лабораторных животных рекомбинантным аденовирусом Ad5-HA5-1, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N1.

2.2.6.2 Изучение длительности перекрестного гуморального иммунного ответа у лабораторных животных, интраназально иммунизированных аденовирусом Ad5-НА5-1, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N1, к вирусу гриппа птиц H5N2.

2.2.6.3 Изучение протективных свойств перекрестного гетеросубтипического иммунного ответа при иммунизации лабораторных животных аденовирусом, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа А.

2.2.7 Иммунизация лабораторных животных рекомбинантным аденовирусом, несущим генетическую конструкцию, кодирующую четыре белка М2е вируса гриппа птиц и флагеллин Salmonella enterica и оценка ее протективных свойств.

2.2.8 Изучение влияния предсуществующего иммунного ответа к аденовирусу человека пятого серотипа на эффективность иммунизации рекомбинантным аденовирусом Ad5.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации по теме "Клиническая иммунология, аллергология", Седова, Елена Сергеевна, автореферат

Актуальность проблемы. Грипп - высококонтагеозное вирусное заболевание людей, птиц и млекопитающих. В мире каждый год регистрируются- сезонные подъемы заболеваемости гриппом (эпидемии), вызванные вирусами типа А или В, приводящие к увеличению смертности и значительному экономическому ущербу. Кроме того через неравные промежутки времени происходят пандемии вируса гриппа А, сопровождающиеся, существенным повышением заболеваемости и высокими уровнями смертности [1].

Иммунизация современными гриппозными вакцинами является научно-обоснованным эффективным способом массовой профилактики гриппа. Современные вакцины против вируса гриппа А вызывают образование, главным образом, штамм-специфичных антител к поверхностным-гликопротеинам вируса гриппа: гемагглютинину и нейраминидазе. Однако; вирусы гриппа А способны постоянно модифицировать свою структуру в результате генетических изменений. Антигенные вариации являются результатом молекулярных изменений в поверхностных белках гемагглютинине и/или нейраминидазе. Подобная генетическая вариабельность способствует изменению антигенной структуры настолько существенно, что специфический иммунитет, выработанный на полученную вакцину, может быть не эффективен [201].

При разработке новых типов вакцин, против гриппа необходимо обеспечить защиту населения от максимального числа эпидемиологически актуальных циркулирующих штаммов вируса гриппа А. Кроме того на сегодняшний момент большие опасения вызывают вирусы, гриппа птиц, случаи заражения которыми фиксируются у людей с 1997 г. Потенциальным кандидатом на следующий пандемичный штамм является вирус гриппа птиц H5N1. Так по данным ВОЗ с 1997 г. общее количество случаев заболеваний человека вирусом гриппа птиц H5N1 составляет 505, из которых 300 - с летальным исходом (данные ВОЗ от 31.08.10). Вирусы гриппа птиц не способны передаваться от человека к человеку, а заболевания людей вызваны контактом с больными птицами. Однако если вирус гриппа птиц приобретет эту способность, человечество, преодолевшее не одну пандемию гриппа, может столкнуться с гораздо более тяжелой ситуацией при возникновении пандемии, вызванной вирусами субтипа Н5>Т1, способными поражать многие ткани организма и вызывать тяжелейшую инфекцию. Поэтому актуальным является разработка вакцины, способной защитить население от вируса гриппа птиц Н5Ш, уже сегодня, чтобы быть готовыми к пандемии, причиной возникновения которой может стать этот вирус.

Большинство современных вакцин против гриппа вводят в организм парентерально. Как альтернатива инъекционным вакцинам, рассматриваются интраназальные вакцины. Преимуществами интраназальных, мукозальных вакцин являются удобство их применения, исключение риска случайного заражения в процессе иммунизации, формирование иммунного ответа на слизистой дыхательных путей, то есть именно там, где находятся «входные ворота» гриппозной инфекции и формирование ответа более широкого спектра по сравнению с парентеральными вакцинами [203].

Одним из наиболее эффективных на сегодняшний день подходов для решения вышеописанных проблем является использование генетических вакцин, базирующихся на аденовирусных векторах [209]. При введении в организм таких вакцин происходит попадание генетического материала в клетки организма и экспрессия в них генов целевых белков патогена. В результате антигены соответствующих патогенов распознаются иммунной системой, что приводит к индукции как гуморального, так и клеточного иммунного ответа [4, 99]. На сегодняшний момент наиболее хорошо изученным и часто используемым для генетической вакцинации является рекомбинантный аденовирус человека пятого серотипа. Вакцины на основе рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа имеют ряд преимуществ перед другими генетическими вакцинами. Во-первых, рекомбинантные аденовирусы являются репликативно-дефектными и не способны вызывать заболевания. Безопасность аденовирусов человека пятого серотипа с делетированными Е1 и ЕЗ областями генома подтверждается целым рядом проведенных клинических испытаний различных вакцинных и терапевтических препаратов на их основе [84,191]. Во-вторых, рекомбинантные аденовирусы позволяют проводить интраназальную иммунизацию, и, как следствие, индуцируют образование мукозального иммунного ответа. В-третьих, на сегодняшний момент разработаны быстрые и гибкие технологии получения рекомбинантных аденовирусов, позволяющие реализацию масштабного производства различных кандидатных вакцин на основе аденовирусных векторов на одной технологической линии, без ее переоборудования' и изменения регламента. Вышеперечисленные свойства делают рекомбинантные аденовирусы хорошей технологической платформой для создания широкого спектра вакцин против различных патогенов.

В связи с вышесказанным, изучение возможности использования рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа для создания препаратов для интраназальной вакцинации* против потенциально опасных инфекций, вызванных вирусом гриппа птиц, представляет самостоятельный научный интерес.

Цель исследования. Создание рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, несущих гены поверхностных антигенов вируса гриппа птиц и изучение их иммуногенности и протективных свойств при интраназальной иммунизации лабораторных животных.

В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи:

1. Конструирование репликативно-дефектных рекомбинантных аденовирусов, содержащих гены поверхностных антигенов вируса гриппа птиц (гемагглютинин и эктодомен М2 белка) и изучение экспрессии целевых генов в составе рекомбинантных вирусов в условиях in vitro.

3. Исследование протективных свойств рекомбинантного аденовируса, несущего ген гемагглютинина вируса гриппа птиц на модели летальной инфекции вируса гриппа.

4. Изучение перекрестного иммунного ответа против разных субтипов вируса гриппа птиц при генетической иммунизации лабораторных животных рекомбинантными аденовирусом, содержащим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц.

5. Изучение возможности использования рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа как универсальной платформы для создания кандидатных вакцин на основе различных антигенов вируса гриппа с помощью оценки протективных свойств генетической иммунизации лабораторных животных рекомбинантным аденовирусом, несущим ген эктодомена белка М2 вируса гриппа птиц, против различных субтипов вируса гриппа птиц.

Научная новизна. С помощью эффективной технологии получения рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, основанной на гомологичной рекомбинации в E.coli, был получен набор рекомбинантных аденовирусов, несущих поверхностные антигены вируса гриппа птиц: Ad5-НА5-2, несущий ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N2, и Ad5-HA5-1, несущий ген гемагглютинина вируса гриппа птиц H5N1 и Ad5-M4-Fl, несущий ген эктодомена белка М2 вируса гриппа птиц.

Для создания рекомбинантного аденовируса человека, позволяющего при иммунизации против вируса гриппа птиц получить иммунный ответ широкого спектра действия, в качестве антигена был выбран эктодомен консервативного трансмембранного М2-белка (М2е) вируса гриппа. Для достижения наиболее широкого спектра защиты от различных субтипов вируса гриппа птиц синтезирована искусственная последовательность белка М2е, консенсусная между штаммами, вируса гриппа птиц. Для повышения иммуногенности эктодомена М2-белка вируса гриппа птиц использован ген лиганда для Толл-подобного рецептора флагеллина (Fl).

Показана на культуре клеток активность рекомбинантного флагеллина, входящего в состав слитного белка, экспрессируемого аденовирусом Ad5-M4-F1 на линии клеток, несущих Толл-подобный рецептор 5.

Определен уровень экспрессии рекомбинантных гемагглютининов НА5-2 и НА5-1 в пермиссивных клетках, трансдуцированных рекомбинантными аденовирусами' Ad5-HA5-2 и Ad5-HA5-1.

Показана индукция длительного как гуморального, так и клеточного иммунного ответа против вируса гриппа птиц Н5И2 при иммунизации лабораторных мышей рекомбинантным аденовирусом Ас15-НА5-2.

Показана защита мышей, иммунизированных рекомбинантным аденовирусом Ас15-НА5-2, экспрессирующим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц Н5Ш, при заражении мышей летальной дозой вируса гриппа птиц Н5М2 (50ЛД50) и продемонстрирована ее длительность в течение 24 недель.

Впервые показана индукция перекрестного гуморального иммунитета против вируса гриппа птиц Н5И2 при иммунизации мышей рекомбинантным аденовирусом, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц Н5№. Так же показана длительная (24 недели) перекрестная защита животных, иммунизированных аденовирусом Ас15-НА5-1, против летальной дозы вируса гриппа птиц Н5И2 (50ЛД50).

Впервые продемонстрирована возможность использования рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа, как универсальной платформы для создания кандидатных вакцин с различными антигенами вируса гриппа А. Показана индукция перекрестного иммунного ответа, возникшего при иммунизации лабораторных мышей аденовирусом Аё5-М4-Р1, несущим ген консенсусного между вирусами гриппа птиц М2е белка. Мыши, иммунизированные Аё5-М4-Р1 были на 100% защищены от летальной дозы вируса гриппа птиц Н5Ы2 (5ОЛД50) и на 80% от летальной дозы вируса гриппа птиц Н2Ш (50ЛД50).

Впервые продемонстрировано незначительное влияние предсуществующего иммунного ответа к аденовирусу человека пятого серотипа на эффективность интраназальной иммунизации рекомбинантным аденовирусом против вируса гриппа.

Практическая значимость. Работа представляет не только научный, но и практический интерес. Полученные в результате работы рекомбинантные аденовирусы могут служить основой для создания кандидатных вакцин против вируса гриппа птиц.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008), итоговой конференция по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработка научно-технического комплекса России на 20072012 гг.» (Москва, 2009) и Международной конференции Koch Metschnikow Forum (Марбург, Германия, 2010). Апробация диссертации состоялась на научной конференции отделов иммунологии, медицинской микробиологии и генетики и молекулярной биологии бактерий ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития 12 октября 2010 г.

Заключение диссертационного исследования на тему "Конструирование рекомбинантных аденовирусов и изучение их протективных свойств при иммунизации лабораторных животных против вируса гриппа A"

ВЫВОДЫ

2. Показана индукция гуморального, в том числе на слизистой дыхательных путей, и клеточного иммунного ответа к вирусу гриппа птиц Н5Ш у лабораторных животных, интраназально иммунизированных рекомбинантным аденовирусом, несущим ген гемагглютинина вируса гриппа птиц Н5М2, Ас1-НА5-2.

3. Продемонстрировано протективное действие рекомбинантного аденовируса Ас1-НА5-2 при интраназальной иммунизации лабораторных животных против заражения летальной дозой вируса гриппа птиц Н5№. Показано, что иммунный ответ после иммунизации аденовирусом Ас1-НА5-2 лабораторных мышей длится не менее 24 недель.

4. Впервые продемонстрирован перекрестный иммунный ответ против разных субтипов вируса гриппа, объединенных одним типом гемагглютинина, при иммунизации лабораторных животных рекомбинантным аденовирусом, несущим гемагглютинин вируса гриппа птиц.

5. Впервые показана возможность использования рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа как универсальной платформы для создания кандидатных вакцин с различными антигенами вируса гриппа А на примере аденовируса Ас1-М4-Р1, несущего ген консенсусного между вирусами гриппа птиц эктодомена М2-белка вируса гриппа. Продемонстрирована протекция мышей, иммунизированных аденовирусом Ас1-М4-Р1, от вирусов гриппа птиц Н5Ы2иН2№.

Работа была частично финансирована из средств Государственного контракта заключенного с Федеральным агентством по науке и инновациям в рамках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (ГК 02.512.11.2320).

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Седова, Елена Сергеевна

1. Стратегический план действий ВОЗ в отношении пандемического гриппа WHO/CDS/EPR/GIP/2006.2a / Всемирная организация здравоохранения.- 2007.- с. 28

2. Васильев Ю. М. Вакцины против вируса гриппа птиц: обзор // Вопросы вирусологии. 2008.- N 6.- С. 4-15.

3. Грин М. Трансформация и онкогенез, ДНК-содержащие вирусы // Вирусология под ред. Филдс Б., Найп Д.- т. 1.- Мир, 1989.- с. 329-415.

4. Кингсбери Д.У. Орто- и прамиксовирусы и их репликация // Вирусология под ред. Филдс Б., Найп Д.- т. 2.- Мир, 1989.- с. 446-487.

5. Киселев О.И., Цымбалов A.M., Покровский В.И. Состояние разработки вакцин против вируса гриппа H5N1 в мире и России //Журнал микробиол.- 2006.- №5,- с. 28-38.

6. Кочергин-Никитский К.С. Анализ взаимодействия генов при скрещивании низкопатогенного вируса гриппа птиц подтипа Н5 и высокопродуктивного штамма вируса гриппа человека: Дис. . канд. биол. наук: 03.00.03:- М., 2007.- 148 е.- Библиогр.: с. 115-147.

7. Кузнецов О. К. Применение гриппозных вакцин в периоды угрозы и развития пандемии // Эпидемиология и вакцинопрофилактика.-2007.- ,№ 1.- с. 31-37, №2.- с. 39-43.

8. Луговцев В.Ю. Классификация и номенклатура вирусов позвоночных: учеб. пособие для студентов высших учебных заведений / под ред. В.Ю Луговцева, Д.А. Васильева. Ульяновск, 2002. - 265с.

9. Львов Д.К. Популяционные взаимодействия в биологической системе: вирус гриппа А дикие и домашние животные - человек // Журн. микробиол.- 2006.- №3.- с. 96-100.

10. Львов Д.К., Забережный А.Д., Алипер Т.И. Вирусы гриппа -события и прогнозы // Природа.- 2006.- №6.

11. Львов Д.К., Ильичев В.Д. Миграция птиц и перенос возбудителей инфекций.- М.: Наука, 1979.- 270 с.

12. Львов Д.К., Ямникова С.С., Забережный А.Д., Гребенщикова Т.В. Межпопуляционное взаимодействие в системе вируса гриппа А -животные человек // Вопр. Вирусологии.- 2005.— № 4.- с. 4-11.

13. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование //М.: Мир, 1984.-480 с.

14. Степанова Л.А., Мигунов А.И., Коротков A.B., Кузнецов O.K. Научные основы и перспективы создания мукозальных инактивированных гриппозных вакцин // Медицинский академический журнал. 2006.- т. 6(4).- с. 3-16.

15. Хорвиц С.М. Аденовирусы и их репликация // Вирусология под ред. Филдс Б., Найп Д.- т. 3.- Мир, 1989.- с. 103-167.

16. Шубладзе А.К., Гайдамович С.Я. Краткий курс практической вирусологии // М.: Медгиз., 1964.- стр. 379.

17. FDA approves first human avian influenza vaccine // hhtp: //www.fda.govftbs/topics/NEWS/2007/NEW01611 .html.

18. Abdulhaqq Shaheed A., Weiner DaviB B. DNA Vaccine.-s: developing new strategies to enhance immune responses // Immunol. Res.-2008.- v. 42.-pp. 219-232.

19. Anderson C.W., Young M.E., Flint S.J. Characterization of the adenovirus 2 virion protein, mu // Virology.- 1989.- v. 172.- pp. 506-512.

20. Area E., Martín-Benito J., Gastaminza P., Torreira E., Valpuesta J.M., Carrascosa J.L., Ortin J. 3D structure of the influenza virus polymerase complex: localization of subunit domains // Proc Natl. Acad. Sci.- 2004.- v. 101.-pp. 308-313.

21. Bailey A., Mautner V. Phylogenetic relationships among adenovirus serotypes 11 Virology.- 1994.- v. 205.- pp. 438^152.

22. Balaram P., Kien P.K., Ismail A. Toll-like receptors and cytokines in immune responses to persistent mycobacterial and Salmonella infections.// Int. J. Med. Microbiol.- 2009.- v. 299(3).- pp. 177-85.

23. Bangari D.S., Shukla S., Mittal S.K. Comparative transduction efficiencies of human and nonhuman adenoviral vectors in human, murine, bovine, and porcine cells in culture // Biochem. Biophys. Res. Commun.-2005.- v. 327."- pp. 960-966.

24. Bartha A. Proposal for subgrouping of bovine adenoviruses it Acta Vet. Acad. Sci. Hung.- 1969.- v. 19.-pp. 319-321.

25. Baxi M.K., Robertson J., Babiuk L.A., Tikoo S.K. Mutational analysis of early region 4 of bovine adenovirus type 3 // Virology.- 2001.- v. 290(1).-pp. 153-63.

26. Benko M., Elo P., Ursu K., Ahne W., LaPatra S. E., Thomson-D:, Harrach B. First molecular evidence for the existence of distinct fish and snake adenoviruses//J. Virol.-2002.- v. 76.-pp. 10056-10059.

27. Benko M., Harrach B. A proposal for a new (third) genus within the Adenoviridae family // Arch. Virol.- 1998.- v. 143.- pp. 829-835.

28. Betakva T. M2 protein-a proton chanel of influenza a virus // Curr. Pharm. Des.- 2007.- v. 31.- pp. 3231-3235.

29. Bewley M.C., Springer K., Zhang Y.B., Freimuth P., Flanagan J.M. Structural analysis of the mechanism of adenovirus binding to its human cellular receptor, CAR//Science.- 1999.- v. 286.-pp. 1579-1583.

30. Blomer U., Naldini L. Kafri T., Trono D., Verma I.M., Gage F.H. Highly efficient and sustained gene transfer in adult neurons with a lentivirus vector//J. Virol.- 1997.- v. 71(9).-pp. 6641-9.

31. Boros G., Graf Z., Benko M., Bartha A. Isolation of a bovine adenovirus from fallow deer (Dama dama) // Acta Vet. Hung-. 1985.- v. 33.-pp. 119-123.i

32. Both G.W. Atadenovirus. Adenoviridae // The Springer index of viruses.- 2002,- pp. 2-8.

33. Bublot M., Pritchard N., Swayne D.E., Selleck P., Karaca K., Suarez D.L., Audonnet J.C., Mickle T.R. Development and use of fowlpox vectored vaccines for avian influenza // Ann. N Y Acad. Sci.- 2006.- v. 1081.- pp. 193201.

34. Buchschacher G.L., Wong-Staal F. Development of lentiviral vectors for gene therapy for human diseases // Blood.- 2000.- v. 95(8).- pp. 2499-2504

35. Burmeister W.P., Guilligay D., Cusack S., Wadell G., Arnberg N. Crystal structure of species D adenovirus fiber knobs and their sialic acid binding sites // J. Virol.- 2004.- v. 78.- pp. 7727-7736.

36. Cerullo V., Seiler M.P., Mane V., Brunetti-Pierri N., Clarke C., Bertin T.K., Rodgers J.R., Lee B. Toll-like receptor 9 triggers an innate immune response to helper-dependent adenoviral vectors // Mol. Ther.- 2007.-v. 15(2).-pp. 378-85.

37. Chen P., Kovesdi I., Bruder J.T. Effective repeat administration with adenovirus vectors to the muscle // Gene Ther.- 2000.- v. 7(7).- pp. 587-95.

38. Cheng C., Gall J.G., Kong W.P., Sheets R.L., Gomez P.L., King C.R., Nabel G.J. Mechanism of ad5 vaccine immunity and toxicity: fiber shaft targeting of dendritic cells // PLoS Pathog.- 2007.- v. 3(2).- e25.

39. Chirmule N., Hughes J.V., Gao G.P., Raper S.E., Wilson J.M. Role of E4 in eliciting CD4 T-cell and B-cell responses to adenovirus vectors delivered to murine and nonhuman primate lungs // J. Virol.- 1998.- v. 72(7).- pp. 61386145.

40. Choi V.W., McCarty D.M. and Samulski R.J. AAV Hybrid Serotypes: Improved Vectors for Gene Delivery // Curr. Gene Ther.- 2005.-- v. 5(3).- pp. 299-310.

41. Couch R.B. Nasal vaccination, Escherichia coli enterotoxin, and Bell's palsy //N Engl. J. Med.- 2004.- v. 350(9).- pp. 860-1.

42. Dan A., Ruzsics Z., Russell W.C., Benko M., Harrach B. Analysis of the hexon gene sequence of bovine adenovirus type 4 provides further support for a new adenovirus genus (Atadenovirus) // J. Gen. Virol.- 1998.- v. 79.- pp. 1453-1460.

43. Diebold S.S., Kaisho T., Hemmi H., Akira S., Reis e Sousa C. Innate antiviral responses by means of TLR7-mediated recognition of single-stranded RNA//Science.-2004.- v. 303(5663).-pp. 1529-31.

44. Draper S. J., Heeney J.L. Viruses as vaccine vectors for infectious diseases and cancer // Nature reviews Microbiology.- 2010.- v. 8.- pp. 62-73.

45. Ehrenfeld E., Modlin J., Chumakov K. Future of polio vaccines // Expert. Rev. Vaccines.- 2009.- v. 411(8).- pp. 899-905.

46. Eliasson D.G., El Bakkouri K., Schön K., Ramne A., Festjens E., Löwenadler B., Fiers W., Saelens X., Lycke N. CTA1-M2e-DD: a novel mucosal adjuvant targeted influenza vaccine // Vaccine.- 2008.- v. 26(9).- pp. 1243-52.

47. Evans P.S., Benko M., Harrach B., Letchworth G.J. Sequence, transcriptional analysis, and deletion of the bovine adenovirus type 1 E3 region //Virology.- 1998.- v. 244(1).-pp. 173-85.

48. Fiers W., De Filette M., El Bakkouri K., Schepens B., Roose K., Schotsaert M., Birkett A., Saelens X. M2e-based universal influenza A vaccine // Vaccine.- 2009.- v. 27(45).- pp. 6280-3.

49. Flynn K.J., Belz G.T., Altman J.D., Ahmed R., Woodland D.L., Doherty P.C. Virus-specific CD8+ T cells in primary and secondary influenza pneumonia//Immunity.- 1998.- v. 8(6).-pp. 683-91.

50. Fuchs W., Romer-Oberdorfer A., Veits J., Mettenleiter T.C. Novel avian influenza virus vaccines // Rev. sci. tech. Off. int. Epiz.- 2009.- v. 28(1).-pp. 319-332.

51. Gao G.P., Yang Y., Wilson J.M. Biology of adenovirus vectors with El and E4 deletions for liver-directed gene therapy // J. Virol-. 1996.- v. 70(12).-pp. 8934-8943.

52. Gherardi M.M., Esteban M. Recombinant poxviruses as mucosal vaccine vectors // J. Gen. Virol.- 2005.- v. 86(11).- pp. 2925-2936.

53. Gillis J.S. An avian influenza vaccine for humans targeting the polymerase B2 protein inside the capsid instead of hemagglutinin or neuramidase on the virus surface // Med. Hypotheses.- 2006.- v. 66(5).- pp. 975-7.

54. Gorman O.T., Bean W.J., Webster R.G. Evolutionary processes in influenza viruses: divergence, rapid evolution, and stasis // Curr. Top. Microbiol. Immunol.- 1992,- v. 176.-pp. 75-97.

55. Graham F.L. Transformation by and oncogenicity of human adenoviruses // In: Ginsberg H. (Ed.). The Adenoviruses.- Plenum Press, 1994,-p. 339-398.

56. Graham F.L., Smiley J., Russell W.C., Nairn R. Characteristics of a human cell line transformed by DNA from human adenovirus type 5 // J. Gen. Virol.- 1977.- v. 36(1).- pp. 59-74.

57. Guy M., Bernard C., Mireille D. Phylogenetic analysis of fowl adenoviruses //Avian Pathol.- 2004.- v. 33.- pp. 164-170.

58. Hanahan D. Studies of transformation of Escherichia coli with plasmids // J. Mol. Biol.- 1983.- v. 166.- pp. 557-580.

59. Harrach B., Meehan B.M., Benko M., Adair B.M., Todd D. Close phylogenetic relationship between egg drop syndrome virus, bovine adenovirus serotype 7, and ovine adenovirus strain 287 // Virology.- 1997.- v. 229.- pp. 302-308.

60. Harrop R., John J., Carroll M.W. Recombinant viral vectors: cancer vaccines // Adv. Drug Deliv. Rev.- 2006.- v. 58(8).- pp. 931-47.

61. Hartman Z.C., Appledorn D.M., Amalfltano A. Adenovirus vector induced innate immune responses: impact upon efficacy and toxicity in gene therapy and vaccine applications//Virus Res.-2008.- v. 132(1-2).-pp. 1-14.

62. Heinen P.P., de Boer-Luijtze E.A., Bianchi A.T. Respiratory and systemic humoral and cellular immune responses of pigs to a heterosubtypic influenza A virus infection // J. Gen. Virol.- 2001.- v. 82(Pt 11).- pp. 2697707.

63. Hess M., Cuzange A., Ruigrok R.W.H., Chroboczek J., Jacrot B. The avian adenovirus penton: two fibres and one base // J. Mol. Biol.- 1995.- v. 252.- pp. 379-385.

64. Hillerman M.R., Werner J.H. Recovery of new agents from patientes with acute respiratory illness // Proc. Soc. Exp. Biol. Med.- 1954.- v. 85.- pp. 183-188.

65. Holmes D., Quigley M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids//Anal. Biochem.-1981.- v. 114.-p. 193.

66. Horimoto T., Kawaoka Y. Strategies for developing vaccines against H5N1 influenza A viruses // TRENDS in Molecular Medicine.- 2006.- v. 12(11).-pp. 506-514.

67. Horimoto T., Takada A., Fujii K. at al. The development and characterization of H5 influenza virus vaccines derived from a 2003 human isolate // Vaccine.- 2006.- v. 24.- pp. 3669-3676.

68. Hornung V., Ellegast J., Kim S., Brzözka K., Jung A., Kato H., Poeck H.5 Akira S., Conzelmann K.K., Schlee M., Endres S., Hartmann G. 5'-Triphosphate RNA is the ligand for RIG-I // Science.- 2006.- v. 314(5801).-pp. 994-7.

69. Janeway C.A. Jr., Medzhitov R. Innate immune recognition // Annu. Rev. Immunol.- 2002.- v. 20.-pp. 197-216.

70. Johansson B., Brett I. An inactivated subvirion influenza A (H5N1) vaccine // N. Eng. J. Med.- 2006.- v. 354.- pp. 2724-2725.

71. Kaufman S.H. Immunization against tuberculosis: new vaccination strategies or is there an alternative to BCG? // Immun. Infekt.- 1995.- v. 23(4).-pp. 119-24.

72. Kistner O., Howard M., Spruth M. et al. Cell culture (Vero) derived whol virus (H5N1) vaccine based on wild-type virus strain induces cross-protective immune responses // Vaccine.- 2007.- v. 25.- pp. 6028-6036.

73. Knowles M.K., Roberts D., Craig S., Sheen M., Nadin-Davis S.A., Wandeler A.I. In vitro and in vivo genetic stability studies of a human adenovirus type 5 recombinant rabies glycoprotein vaccine (ONRAB) // Vaccine.- 2009.- v. 27(20).- pp. 2662-8.

74. Kopecky-Bromberg S.A., Palese P. Recombinant vectors as influenza vaccines //Curr. Top. Microbiol. Immunol.- 2009.- v. 333.- pp. 243-67.

75. Kovesdi I., Brough D.E., Bruder J.T., Wickham T.J. Adenoviral vectors for gene transfer // Curr. Opin. Biotechnol.- 1997.- v. 8(5).- pp. 583589.

76. Kreijtz J.H., Suezer Y., de Mutsert G., van den Brand J.M., van Amerongen G., Schnierle B.S., Kuiken T., Fouchier R.A., Lower J., Osterhaus

77. Kristiansen I.S., Halvorsen P.A., Gyrd-Hansen D. Influenza pandemic: perception of risk and individual precautions in a general population // BMC Public. Health.- 2007.- v. 7.- pp. 48.

78. Kulkarni A.B., Morse H.C., Bennink J.R., Yewdell J.W., Murphy

79. B.R. Immunization of mice with vaccinia virus-M2 recombinant induces epitope-specific and cross-reactive Kd-restricted CD8+ cytotoxic T cells // J. Virol.- 1993.- v. 67(7).-pp. 4086-92.

80. Lagace-Wiens P.R., Rubinstein E., Gumel A. Influenza epidemiology--past, present, and future // Crit Care Med.- 2010.- v. 38.- pp. 1-9.

81. Le Goffic R., Balloy V., Lagranderie M., Alexopoulou L., Escriou N., Flavell R., Chignard M., Si-Tahar M. Detrimental contribution of the Toll-like receptor (TLR)3 to influenza A virus-induced acute pneumonia // PLoS Pathog.-2006.- v. 2(6).- e53.

82. Lee C.W., Jung K., Jadhao S.J., Suarez D.L. Evaluation of chiken-origin (DF-1) and quail-origin (QT-6) fibroblasts cell lines for replication of avian influenza viruses // J. Virol. Methods.- 2008.- v. 153.- pp. 22-28.

83. Lee D.W., Anderson M.E., Wu S., Lee J.H. Development of anadenoviral vaccine against E6 and E7 oncoproteins to prevent growth of humanipapillomavirus-positive cancer // Arch. Otolaryngol Head Neck Surg.- 2008.-v.l34(12).- pp. 1316-23.

84. Legerski R.J., Robberson D.L. Analysis and optimization of recombinant DNA joining reactions // J. Mol. Biol.- 1985.- v. 181.- pp. 297312.

85. Letchworth G.J., Rodriguez L.L., Del cbarrera J. Vesicular stomatitis // Vet. J.- 1999.- v. 157(3).- pp. 239-260.

86. Li Z., Jiang Y., Jiao P., Wang A., Zhao F., Tian G., Wang X., Yu K. et al. The NS1 gene contributes to the virulence of H5N1 avian influenza viruses // J. Virol.- 2006.- v. 80.- pp. 11115-11123.

87. Lieber A., Steinwaerder D.S., Carlson C.A., Kay M.A. Integrating adenovirus-adeno-associated virus hybrid vectors devoid of all viral genes // J. Virol.-1999.- v. 73(11).-pp. 9314-9324.

88. Lipatov A., Govorkova E., Webby R. Influenza: emergence and control // J. Virol.- 2004.- v. 430.- pp. 209-213.

89. Lockett L.J., Both G.W. Complementation of a defective human adenovirus by an otherwise incompatible ovine adenovirus recombinant carrying a functional E1A gene // Virology.- 2002-. v. 294(2).- pp. 333-41.

90. Lvov D.K. Influenza A viruses a sum of populations with a common protected gene pool. Sov. Med. Rev. E. Virol. Rev.- 1987.- v. 2.- pp. 15-37.

91. Mazanec M.B., Coudret C.L., Fletcher D.R. Intracellular neutralization of influenza virus by immunoglobulin A anti-hemagglutinin monoclonal antibodies //J. Virol.- 1995.- v. 69(2).- pp. 1339-43.

92. McDonald G.A., Zhu G., Li Y., Kovesdi I., Wickham T.J., Sukhatme V.P. Efficient adenoviral gene transfer to kidney cortical vasculature using a fiber modified vector//J. Gene Med.- 1999.- v. l.-pp. 103-110.

93. Middleton D., Bingham J., Selleck P., Lowther S., Glceson L., Lehrbach P., Robinson S., Roderiberg J. et al. Efficacy of inactivated vaccines against H5N1 avian influenza infection in ducks // Virology.- 2007.- v. 359.-pp. 66-71.

94. Molinier-Frenkel V., Lengagne R., Gaden F., Hong S.S., Choppin J., Gahery-Segard H., Boulanger P., Guillet J.G. Adenovirus hexon protein is a potent adjuvant for activation of a cellular immune response // J. Virol.- 2002.-v. 76(1).-pp. 127-35.

95. Murakami P., Havenga M., Fawaz F., Vogels R., Marzio G., Pungor E., Files J., Do L., Goudsmit J., McCaman M. Common structure of rare replication-deficient El-positive particles in adenoviral vector batches // J. Virol.- 2004.- v. 78(12).-pp. 6200-8.

96. Nakaya T., Cros J., Park M.S., Nakaya Y., Zheng H., Sagrera A., Villar E., Garcia-Sastre A., Palese P. Recombinant Newcastle disease virus as a vaccine vector//J. Virol.- 2001,-v. 75(23).-pp. 11868-11873.

97. Naldini L., Blomer U., Gallay P., Ory D., Mulligan R, Gage F.H., Verma I.M., Trono D. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector // Science.- 1996.- v. 272(5259).- pp. 263-7.

98. Nayak D.P., Hui E.K., Barman S. Assembly and budding of influenza virus // Virus Res.- 2004.- v. 106(2).- pp. 147-65.

99. Neild A.L., Roy C.R. Immunity to vacuolar pathogens: what can we leam from Legionella? // Cell Microbiol.- 2004.- v. 6(11).- pp. 1011-8.

100. Nemchinov L., Natilla A. Transient expression of the ectodomain of matrix protein 2 (M2e) of avian influenza A virus in plaints // Protein Expr. Purif.-2007.- v. 56.-pp. 153-159.

101. Neumann G., Whitt M. A., Kawaoka Y. A decade after the generation of a negative-sense RNA virus from cloned cDNA what have we learned? // J Gen. Virol.- 2002,- v. 83.- pp. 2635-2662.

102. New N., He Q., Damringwatanapokin S. et al. Expression of hemagglutinin protein from the avian influenza virus H5N1 in a baculovirus/insect cell system significantly enchanced by suspension culture // BMC. Microbiol.- 2006.- v. 6.- pp. 6-16.

103. Nguyen J.T., Wu P., Clouse M.E., Hlatky L., Terwilliger E.F. Adeno-associated virus-mediated delivery of antiangiogenic factors as an antitumor strategy // Cancer Res-. 1998,- v. 58.- pp. 5673-5677.

104. Panda A., Huang Z., Elankumaran S., Rockemann D.D., Samal S.K. Role of fusion protein cleavage site in the virulence of Newcastle disease virus // Microb. Pathog.- 2004.- v. 36(1).- pp. 1-10.

105. Paris R.M., Kim J.H., Robb M.L., Michael N.L. Prime-boost immunization with poxvirus or adenovirus vectors as a strategy to develop a protective vaccine for HIV-1 // Expert Rev. Vaccines.- 2010.- v.-9(9).- pp. 1055-69.

106. Pau M.G., Ophorst C., Koldjik M.H. et al. The human cell line PER.C6 provides a new manufacturing system for the production of influenza vaccines //Vaccine.- 2001,- v. 19.- pp. 2716-2721.

107. Pichlmair A., Schulz O., Tan C.P., Naslund T.I., Liljestrom P., Weber F., Reis e Sousa C. RIG-I-mediated antiviral responses to single-stranded RNA bearing 5'-phosphates // Science.- 2006,- v. 314(5801).- pp. 997-1001.

108. Plotkin S.A. Vaccines: The Fourth Centry // Clin Vaccine Immunol.-2009.-v. 16(12).-pp. 1709-19.

109. Publicover J., Ramsburg E., Rose J.K. A single-cycle vaccine vector based on vesicular stomatitis virus can induce immune responses comparable to those generated by a replicationcompetent vector // J. Virol.- 2005.- v. 79(21).-pp. 13231-13238.

110. Qiao C., Tian G., Jiang Y., Li Y., Shi J., Yu K., Chen H. Vaccine.-s developed for H5 highly pathogenic avian influenza in China // Ann. N Y Acad. Sci.-2006.-v. 1081,-pp. 182-92.

111. Qiao C., Yu K., Jiang Y., Li C., Tian G., Wang X., Chen H. Development of a recombinant fowlpox virus vector-based Vaccine.- of H5N1 subtype avian influenza //Dev. Biol. (Basel).- 2006,- v. 124.- pp. 127-32.

112. Reed L.J., Muench H. A simple method of estimating fifty per cent endpoints // Am. J. Hyg.- 1938,- v. 27.- pp. 493^197.

113. Renegar K.B., Small P.A. Jr., Boykins L.G., Wright P.F. Role of IgA versus IgG in the control of influenza viral infection in the murine respiratory tract//J. Immunol-. 2004,- v. 173(3).-pp. 1978-86.

114. Rimmelzwaan G., Osterhaus A. The role of adjuvants for pandemic influenza vaccines II Influenza Bull. ESWI.- 2008.- v. 23.- pp. 3-4.

115. Rimmelzwaan G.F., Sutter G. Candidate influenza vaccines based on recombinant modified vaccinia virus Ankara // Expert Rev. Vaccines.- 2009.-v. 8(4).- pp. 447-54.

116. Roan N.R., Starnbach M.N. Immune-mediated control of Chlamydia infection // Cell Microbiol.- 2008.- v. 10(1).- pp. 9-19.

117. Ronan E.O., Lee L.N., Beverley P.C., Tchilian E.Z. Immunization of mice with a recombinant adenovirus vaccine inhibits the early growth of Mycobacterium tuberculosis after infection // PLoS One.- 2009.- v.-4(12).-e8235.

118. Rodriguez L.L. Emergence and re-emergence of vesicular stomatitis in the United States // Virus. Res.- 2002,- v. 85(2).- pp. 211-219.

119. Rogers G.N., Pritchett T.J., Lane J.L., Paulson J.C. Differential sensitivity of human, avian, and equine influenza A viruses to a glycoprotein inhibitor of infection: selection of receptor specific variants // Virology.- 1983.-v. 131.-pp. 394-408.

120. Rui W., Yi G., Zhongdong Y., Jianjun Ch., Hanzhong W., Quanjiao Ch., Zhiwei S., Fang F., Ze Ch. A live bivalent influenza vaccine based on a H9N2 virus strain II Vaccine.- 2010.- v. 28.- pp. 673-680.

121. Rux J.J., Kuser P.R., Burnett R.M. Structural and phylogenetic analysis of adenovirus hexons by use of high-resolution x-ray crystallographic, molecular modeling, and sequence-based methods // J. Virol.- 2003.- v. 7.- pp. 9553-9566.

122. Saito T., Lim W., Tashiro M. Attenuation of human H9N2 influenza virus in mammalian host by reassortment with an avian influenza virus // Arch. Virol.-2004.- v. 149.-pp. 1397-1407.

123. Shenk T. Adenoviridae: the viruses and their replication // Virology eds. Fields B.N., Knipe D.M., Howley P.M.- Fhiladelfhia: 3rd ed. LippincottRaven Publishers, 1996.- pp. 2111-2148.

124. Shi Z., Zeng M., Yang G., Siegel F., Cain L.J., van Kampen K.R., Elmets C.A., Tang D.C. Protection against tetanus by needle-free inoculation of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous vaccines // J. Virol.- 2001.- v. 75(23).-pp. 11474-82.

125. Smirnov Y.A., Lipatov A.S., Van Beek R., Gitelman A.K., Osterhaus A.D., Claas E.C. Characterization of adaptation of an avian influenza A (H5N2) virus to a mammalian host // Acta. Virol.- 2000,- v. 44,- pp.1-8.

126. Smith J.G., Wiethoff C.M., Stewart P.L., Nemerow G.R. Adenovirus // Curr. Top. Microbiol. Immunol.- 2010.-p. 30

127. Smith K.A., Colvin C.J., Weber P.S., Spatz S.J. Coussens P.M. High titer growth of human and avian influenza viruses in an immortalized chick embryo cell line without the need for ezogenous proteases // Vaccine.- 2005.-v. 26.- pp. 3778-3782.

128. Smith L.R., Wloch M.K., Ye M., Reyes L.R., Boutsaboualoy S., Dunne C.E., Chaplin J.A., Rusalov D., Rolland A.P., Fisher C.L., Al-Ibrahim

129. Song H., Nieto G., Perez D. A new generation of modified live-attenuated avian influenza viruses using a two-strategy combination as potential vaccine candidates // J. Virol.- 2007,- v. 81.- pp. 9238-9248.

130. Souza A.P., Haut L., Reyes-Sandoval A., Pinto A.R. Recombinant viruses as vaccines against viral diseases // Braz. J. Med. Biol. Res.- 2005.- v. 38(4).-pp. 509-522.

131. Stallknecht D.E., Perzak D.E., Bauer L.D., Murphy M.D., Howerth E.W. Contact transmission of vesicular stomatitis virus New Jersey in pigs // Am. J. Vet. Res.- 2001.- v. 62(4).- pp. 516-520.

132. Stephenson I., Gust I., Pervikov Y. et al. Development of vaccines against influenza H5 // Lancet Infect. Dis-. 2006.- v. 6.- pp. 458-460.

133. Stephenson I., Nicholson K, Gluck R. et al. Safety and antigenicity of whole virus and subunit influenza A/Hong Kong/1073/99 (H9N2) vaccine in healthy adults: phase I randomized trial // Lancet.- 2003.- v. 362,- pp. 19591966.

134. Stevenson P.G., Hawke S., Bangham C.R. Protection against influenza virus encephalitis by adoptive lymphocyte transfer // Virology. -1997.- v. 232(1).-pp. 158-66.

135. Swayne D.E. Principles for Vaccine.- protection in chickens and domestic waterfowl against avian influenza:emphasis on Asian H5N1 high pathogenicity avian influenza // Ann. N.Y. Acad. Sci.- 2006.- v. 1081.- pp. 174-181.

136. Swayne D.E., Perdue M.L., Beck J.R., Garcia M., Suarez D.L. vaccine s protect chickens against H5 highly pathogenic avian influenza in the lace of genetic changes in field viruses over multiple years // Vet. Microbiol.- 2000,-v. 74,- pp. 165-172.

137. Sylte M., Hubby В., Suarez D. Influenza neuraminidase antibodies provide partial protection for chickens against high pathogenic avian influenza infection // Vaccine.- 2007 v. 25.- pp. 3763-3772.

138. Takahashi I., Nochi Т., Yuki Y., Kiyono H. New horizon of mucosal immunity and vaccines // Curr. Opin. Immunol.- 2009.- v. 21(3).- pp. 352-8.

139. Talon J., Salvatore M., O'Neill R.E., Nakaya Y., Zheng H., Muster Т., Garcia-Sastre A., Palese P. Influenza A and В viruses expressing altered NS1 proteins: a vaccine approach // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 2000.- v. 97(8).-pp. 4309-4314.

140. Tamura S., Kurata T. Defense mechanisms against influenza virus infection in the respiratory tract mucosa // Jpn. J. Infect. Dis.- 2004.- v. (6).-pp. 236-47.

141. Tang D.C., Johnston S.A., Carbone D.P. Butyrate-inducible and tumor-restricted gene expression by adenovirus vectors // Cancer Gene Ther.-1994.- v. 1(1).- pp.15-20.

142. Tang D.C., Van Kampen K.R. Toward the development of vectored vaccines in compliance with evolutionary medicine // Expert Rev. Vaccines.-2008,- v. 7(4).- pp. 399-402.

143. Tang D.C., Zhang J., Toro H., Shi Z., Van Kampen K.R. Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines // Expert Rev. Vaccines.- 2009.- v. 8(4).- pp. 469-481.

144. Thomson D., Meers J., Harrach B. Molecular confirmation of an adenovirus in brushtail possums (Trichosurus vulpecula) // Virus. Res.- 2002.-v. 83.-pp. 189-195.

145. Treanor J., Wilkinson B., Masseoud F. et al. Safety and immunogenicity of a recombinant hemagglutinin vaccine for H5 influenza in humans// Vaccine.- 2001 v. 19.-pp.1732-1737.

146. Tuboly T., Nagy E. Sequence analysis and deletion of porcine adenovirus serotype 5 E3 region // Virus Res.- 2000.- v. 68(2).- pp. 109-17.

147. Van der Eb A.J., van Kesteren J.W., van Bruggen E.F.J. Structural properties of adenovirus DNAs // Biochem. Biophys. Acta.- 1969.- v. 182.-pp. 530-541.

148. Van Ginkel F.W., Nguyen H.H., McGhee J.R. Vaccines for mucosal immunity to combat emerging infectious diseases // Emerg. Infect. Dis.- 2000.-v. 6(2).- pp. 123-32.

149. Van Kampen K.R., Shi Z., Gao P., Zhang J., Foster K.W., Chen D.T., Marks D., Elmets C.A., Tang D.C. Safety and immunogenicity of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in humans // Vaccine.-2005.- v. 23(8).-pp. 1029-36.

150. Van Raaij M.J., Mitraki A., Lavigne G., Cusack S. A triple beta-spiral in the adenovirus fibre shaft reveals a new structural motif for a fibrous protein //Nature.- 1999.- v. 401.-pp. 935-938.

151. Vemula S.V., Mittal S.K. Production of adenovirus vectors and their use as a delivery system for influenza vaccines // Expert Opin. Biol. Ther.-2010.- v.-10(10).- pp. 1469-87.

152. Vigil A., Park M.S., Martinez O., Chua M.A., Xiao S., Cros J.F, Martinez-Sobrido L., Woo S.L., Garcia-Sastre A. Use of reverse genetics to enhance the oncolytic properties of Newcastle disease virus // Cancer Res.-2007.- v. 67(17).- pp. 8285-8292.

153. Wadsworth S.C., Zhou H., Smith A.E., Kaplan J.M. Adenovirus vector-infected cells can escape adenovirus antigen-specific cytotoxic T-lymphocyte killing in vivo // J. Virol-. 1997.- v. 71(7).- pp. 5189-96.

154. Wang C., Luo Y., Chen Y. et al. The cleavage of the hemagglutinin protein of H5N2 avian influenza virus in yeast // J. Virol. Meth.- 2007.- v. 146.- pp. 293-297.

155. Wang K., Holtz K., Anderson K. et al. Expression and purification of avian influenza hemagglutinin one step closer to a recombinant protein-based influenza vaccine // Vaccine.- 2006.- v. 24.- pp. 2176-2185.

156. Wang M., Shu Y., Qu J.G., Wang J.W., Hong T. Improved expression of human rotavirus G1VP7 and G3VP7 antigens in the recombinant adenoviruses by codon optimization// Zhonghua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi.- 2008.- v. 22(6).- pp. 437-9.

157. Watanabe T., Watanabe S., Kim J.H., Hatta M., Kawaoka Y. A novel approach to the development of effective H5N1 influenza A virus vaccines: the use of M2 cytoplasmic tail mutants // J. Virol.- 2007.- v. 82(5).- pp. 24862492.

158. Webster R.G., Bean W.J., Gorman O.T., Chambers T.M., Kawaoka Y. Evolution and ecology of influenza A viruses // Microbiol Rev.- 1992,- v. 56(1).-pp. 152-79.

159. Wen K., Qui L., Wang Y. et al. Expression and identification of H5 subtype hemagglutinin of avian influenza A virus in insect cells // Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao.- 2007.- v. 27.- pp. 20-23.

160. Wong J.P., Christopher M.E., Viswanathan S., Schnell G., Dai X., Van Loon D., Stephen E.R. Aerosol and nasal delivery of vaccines and antiviral drugs against seasonal and pandemic influenza // Expert Rev. Respir. Med.- 2010.- v. 4(2).- pp. 171-7.

161. Wood J., Robertson J. Development of a vaccine for humans against highly pathogenic avian influenza virus // Eurosurveillance.- 2004.- v. 9.- pp. 31-32.

162. Xu Y., jin N., Xia Z. et al. Expression of AIV subtype H5HA, H7HA and H9HA hemagglutinin gene in Pichia pastoris // Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao.-2006.- v. 22.-pp. 231-236.

163. Yang J.L., Wang H.L., Wang S.X., Yang P., Liu K.T., Jiang C.Y. High-level expression, purification and characterization of codon-optimized recombinant hemagglutinin 5 proteins in mammalian cells // Chin. Med. J. (Engl).-2010.- v. 123(8).-pp. 1073-7.

164. Yang Y., Nunes F.A., Berencsi K., Furth E.E., Gonczol E., Wilson J.M. Cellular immunity to viral antigens limits El-deleted adenoviruses for gene therapy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1994,- v. 91.- pp. 4407-4411.

165. Zabner J., Petersen D.M., Puga A.P. et al. Safety and efficacy of repetitive adenovirus-mediated transfer of CFTR cDNA to airway epithelia of primates and cotton rats //Nat. Genet.- 1994.- v. 6(1).- pp. 75-83.

166. Zaia J.A. The status of gene vectors for the treatment of diabetes // Cell Biochem. Biophys.- 2007.- v. 48(2-3).- pp. 183-90.

167. Zhou Y., Tikoo S.K. Analysis of early region 1 of porcine adenovirus type 3. // Virology.- 2001.- v. 291(1).- pp. 68-76.

168. Zubieta C., Schoehn G., Chroboczek J., Cusack S. The structure of the human adenovirus 2 penton//Mol. Cell.- 2005.- v. 17.-pp. 121-135.1. БЛАГОДАРНОСТИ

Оглавление диссертации Седова, Елена Сергеевна :: 2010 :: Москва

Введение диссертации по теме "Клиническая иммунология, аллергология", Седова, Елена Сергеевна, автореферат

Список использованной литературы по медицине, диссертация 2010 года, Седова, Елена Сергеевна

Похожие научные работы

Каталог диссертаций